生物氧化的概念物质在生物体内进行氧化称生物氧化 (biological oxidation), 主要指糖 脂肪 蛋白质等在体内分解时逐步释放能量, 最终生成 CO 2 和 H 2 O 的过程 糖 脂肪 蛋白质 O 2 CO 2 和 H 2 O 能量 ADP+Pi ATP 热能

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1 Gannan Medical University 第八章 生物氧化 Biological Oxidation 生物化学与分子生物学教研室

2 生物氧化的概念物质在生物体内进行氧化称生物氧化 (biological oxidation), 主要指糖 脂肪 蛋白质等在体内分解时逐步释放能量, 最终生成 CO 2 和 H 2 O 的过程 糖 脂肪 蛋白质 O 2 CO 2 和 H 2 O 能量 ADP+Pi ATP 热能

3 生物氧化的一般过程 糖原甘油三酯蛋白质 葡萄糖脂酸 + 甘油氨基酸 乙酰 CoA ADP+Pi ATP 呼吸链

4 第一节 氧化呼吸链是由具有电子传递 功能的复合体组成

5 氧化呼吸链的定义生物体将 NADH+H + 和 FADH 2 彻底氧化生成水和 ATP 的过程与细胞的呼吸有关, 需要消耗氧, 参与氧化还原反应的组分由含辅助因子的多种蛋白酶复合体组成, 形成一个连续的传递链, 因此称为氧化呼吸链 (oxidative respiratory chain) 也称电子传递链 (electron transfer chain)

6 一 氧化呼吸链由 4 种具有传递电 子能力的复合体组成 酶复合体是线粒体内膜氧化呼吸链的天然存在形式, 所含各组分具体完成电子传递过程 电子传递过程释放的能量驱动 H + 移出线粒体内膜, 转变为跨内膜 H + 梯度的能量, 再用于 ATP 的生物合成

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10 人线粒体呼吸链复合体 复合体酶名称质量 多肽 功能辅基 含结合位点 (kd) 链数 复合体 Ⅰ NADH- 泛醌还原酶复合体 Ⅱ 琥珀酸 - 泛醌还原酶 FMN,Fe-S NADH( 基质侧 ) CoQ( 脂质核心 ) FAD,Fe-S 琥珀酸 ( 基质侧 ) CoQ( 脂质核心 ) 复合体 Ⅲ 泛醌 - 细胞色 素 C 还原酶 血红素 b L, b H, c 1, Fe-S Cyt c( 膜间隙侧 ) 复合体 Ⅳ 细胞色素 C 氧 化酶 血红素 a,a 3, Cu A, Cu B Cyt c( 膜间隙侧 ) * 泛醌和 Cyt c 均不包含在上述四种复合体中

11 Xiaoting Luo, Jinzi Wu, Zhen Jin, Liang-Jun Yan.. Nongradient blue native polyacrylamide gel electrophoresis. Curr. Protoc. Protein Sci doi: /cpps.21

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13 e - Cytc 胞液侧 e - Q e - e - Ⅰ Ⅱ Ⅳ Ⅲ NADH+H + 延胡索酸 H 2 O 1/2O 2 +2H + NAD + 琥珀酸 e - 线粒体内膜 基质侧

14 ( 一 ) 复合体 Ⅰ 将 NADH+H + 中的电子传递给泛醌 复合体 Ⅰ 又称 NADH- 泛醌还原酶或 NADH 脱氢 酶, 接受来自 NADH+H + 的电子并转移给泛醌 (ubiquinone) 复合体 Ⅰ 可催化两个同时进行的过程 : 电子传递 : NADH FMN Fe-S CoQ 质子的泵出 : 复合体 Ⅰ 有质子泵功能, 每传递 2 个电子 可将 4 个 H + 从内膜基质侧泵到胞浆侧

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16 烟酰胺核苷酸的作用原理 H C N + R CONH 2 H H N R CONH 2 + H + e+ H + + H + 2H H H NAD(P) + e H + +2H -2H NAD(P)H+H

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20 NADH+H + FMN 还原型 Fe-S Q NAD + FMNH 2 氧化型 Fe-S QH 2 复合体 Ⅰ 的功能

21 ( 二 ) 复合体 Ⅱ 将电子从琥珀酸传递到泛醌 复合体 Ⅱ 是三羧酸循环中的琥珀酸脱氢酶, 又称琥珀酸 - 泛醌还原酶 电子传递 : 琥珀酸 FAD 几种 Fe-S CoQ 复合体 Ⅱ 没有 H + 泵的功能

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23 ( 三 ) 复合体 Ⅲ 将电子从还原型泛醌传递给细胞色素 c 复合体 Ⅲ 又叫泛醌 - 细胞色素 C 还原酶 人复合体 Ⅲ 含有细胞色素 b(b562, b566) 细胞色素 c1 和一种可移动的铁硫蛋白 (Rieske protein) 泛醌从复合体 Ⅰ Ⅱ 募集还原当量和电子并穿梭传递到复合体 Ⅲ 电子传递过程 :CoQH2 (Cyt bl Cyt bh) Fe-S Cytc1 Cytc

24 细胞色素 (cytochrome, Cyt) 细胞色素是一类以铁卟啉为辅基的催化电子传递的酶类, 根据它们吸收光谱不同而分类

25 复合体 Ⅲ 的电子传递通过 Q 循环 实现 复合体 Ⅲ 每传递 2 个电子向内膜胞浆侧释放 4 个 H +, 复合体 Ⅲ 也有质子泵作用 Cyt c 是呼吸链唯一水溶性球状蛋白, 不包含在复合体中 将获得的电子传递到复合体 Ⅳ

26 ( 四 ) 复合体 Ⅳ 将电子从细胞色素 C 传递给氧 人复合体 Ⅳ 又称细胞色素 C 氧化酶 (cytochrome c oxidase) 电子传递 :Cyt c CuA Cyt a Cyt a 3 CuB O 2 Cyt a 3 CuB 形成活性双核中心, 将电子传递给 O 2 复合体 Ⅳ 也有质子泵功能, 每传递 2 个电子 使 2 个 H + 跨内膜向胞浆侧转移

27 复合体 Ⅳ 的电子传递过程

28 细胞色素 c 氧化酶 CuB-Cyta3 中心使 O 2 还原成水的过程, 有强氧化性中间物始终和双核中心紧密结合, 不会引起细胞损伤

29 二 NADH 和 FADH 2 是氧化呼吸链的电子 供体 根据电子供体及其传递过程, 目前认为, 氧化呼吸链有两条途径 : 1 NADH 氧化呼吸链 NADH 复合体 Ⅰ CoQ 复合体 Ⅲ Cyt c 复合体 Ⅳ O 2 2 琥珀酸氧化呼吸链 琥珀酸 复合体 Ⅱ CoQ 复合体 Ⅲ Cyt c 复合体 Ⅳ O 2

30 NADH 氧化呼吸链 FADH 2 氧化呼吸链 琥珀酸 NADH FMN (Fe-S) FAD (Fe-S) CoQ Cyt b Cyt c1 Cyt c Cyt aa 3 O 2

31 氧化呼吸链各组分的顺序排列是由以下实验确定的 标准氧化还原电位 特异抑制剂阻断 还原状态呼吸链缓慢给氧 将呼吸链拆开和重组

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33 呼吸链中各种氧化还原对的标准氧化还原电位 氧化还原对 E 0 (V) 氧化还原对 E 0 (V) NAD + /NADN+H Cyt c1 Fe 3+ /Fe FMN /FMNH Cyt c Fe 3+ /Fe FAD /FADH Cyt a Fe 3+ /Fe Cyt b L (b H ) Fe 3+ /Fe (0.10) Cyt a3 Fe 3+ /Fe Q 10 /Q 10 H /2O 2 /H 2 O 0.816

34 第二节 氧化磷酸化将氧化呼吸链释能与 ADP 磷酸化偶联生成 ATP

35 ATP 生成方式 底物水平磷酸化 (substrate level phosphorylation) 与脱氢反应偶联, 生成底物分子的高能键, 使 ADP(GDP) 磷酸化生成 ATP(GTP) 的过程 不经电子传递 氧化磷酸化 (oxidative phosphorylation) 是指在呼吸链电子传递过程中偶联 ADP 磷酸化, 生成 ATP, 又称为偶联磷酸化

36 一 氧化磷酸化偶联部位在复合体 Ⅰ Ⅲ Ⅳ 内 氧化磷酸化偶联部位 : 复合体 Ⅰ Ⅲ Ⅳ 根据 P/O 比值 自由能变化 : Gº'=-nF Eº'

37 ( 一 )P/O 比值 指氧化磷酸化过程中, 每消耗 1/2 摩尔 O 2 所生成 ATP 的摩尔数 ( 或一对电子通过氧化呼吸链传递给氧所生成 ATP 分子数 ) 线粒体离体实验测得的一些底物的 P/O 比值 底物 呼吸链的组成 P/O 比值 可能生成的 ATP 数 β- 羟丁酸 NAD + 复合体 Ⅰ CoQ 复合体 Ⅲ Cyt c 复合体 Ⅳ O 2 琥珀酸 复合体 Ⅱ CoQ 复合体 Ⅲ Cyt c 复合体 Ⅳ O 2 抗坏血酸 Cyt c 复合体 Ⅳ O 细胞色素 c (Fe 2+ ) 复合体 Ⅳ O

38 ( 二 ) 自由能变化 根据热力学公式,pH7.0 时标准自由能变化 ( G0 ) 与还原电位变化 ( E0 ) 之间有以下关系 : G0 = -nf E0 n 为传递电子数 ;F 为法拉第常数 (96.5kJ/mol V)

39 区段 电位变化 ( E º ) 自由能变化 G º =-nf E º 能否生成 ATP ( G º 是否大于 30.5KJ) NAD + ~CoQ 0.36V 69.5KJ/mol 能 CoQ~Cyt c 0.21V 40.5KJ/mol 能 Cyt aa 3 ~O V 102.3KJ/mol 能

40 氧化磷酸化偶联部位 琥珀酸 NADH FMN (Fe-S) FAD (Fe-S) CoQ Cyt b Cyt c Cyt c Cyt aa 3 O 2 ATP ATP ATP

41 二 氧化磷酸化偶联机制是产生跨线粒体内膜的质子梯度 化学渗透假说 (chemiosmotic hypothesis) 电子经呼吸链传递时, 可将质子 (H + ) 从线粒体内膜的基质侧泵到内膜胞浆侧, 产生膜内外质子电化学梯度储存能量 当质子顺浓度梯度回流时驱动 ADP 与 Pi 生成 ATP

42 化学渗透假说已经得到广泛的实验支持 氧化磷酸化依赖于完整封闭的线粒体内膜 ; 线粒体内膜对 H + OH - K + Cl - 离子是不通透的 ; 电子传递链可驱动质子移出线粒体, 形成可测定的跨内膜电化学梯度 ; 增加线粒体内膜外侧酸性可导致 ATP 合成, 而线粒体内膜加入使质子通过物质可减少内膜质子梯度, 结果电子虽可以传递, 但 ATP 生成减少

43 化学渗透假说简单示意图 线粒体膜 线粒体基质 H 2 O e ATP ADP + Pi O H + H +

44 胞液侧 2H + 4H + 4H + Cyt c Q Ⅰ Ⅱ Ⅳ Ⅲ NADH+H + NAD + 琥珀酸 基质侧 延胡索酸 F 0 H 2 O 1/2O 2 +2H + ADP+Pi F 1 ATP H +

45 化学渗透示意图及各种抑制剂对电子传递链的影响 二环己基碳二亚胺 :DCCD

46 ATP 合酶结构组成 F 1 : 亲水部分 ( 动物 :α 3 β 3 γδε 亚基复合体,OSCP IF1 亚基 ), 线粒体内膜的基质侧颗粒状突起, 催化 ATP 合成 F 0 : 疏水部分 (ab 2 c 9~12 亚基, 动物还有其他辅助亚基 ), 镶嵌在线粒体内膜中, 形成跨内膜质子通道

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49 四 ATP 在能量代谢中起核心作用 生物体能量代谢有其明显的特点 细胞内代谢反应都是依序进行 能量逐步得失 ATP 称之为高能磷酸化合物, 可直接为细胞的 各种生理活动提供能量, 同时也有利于细胞对 能量代谢进行严格调控

50 高能磷酸键 水解时释放的能量大于 25KJ/mol 的磷酸酯 键, 常表示为 P 高能磷酸化合物 含有高能磷酸键的化合物

51 一些重要有机磷酸化合物水解释放的标准自由能 化合物 kj/mol E 0 (kcal/mol) 磷酸烯醇式丙酮酸 (-14.8) 氨基甲酰磷酸 (-12.3) 1,3- 二磷酸甘油酸 (-11.8) 磷酸肌酸 (-10.3) ATP ADP+Pi (-7.3) 乙酰辅酶 A (-7.5) ADP AMP+Pi (-6.6) 焦磷酸 (-6.6) 葡糖 -1- 磷酸 (-5.0)

52 ( 一 )ATP 是体内能量捕获和释放利用的重要分子 ATP 是体内最重要的高能磷酸化合物, 是细胞 可直接利用的能量形式 ATP 在生物能学上最重要的意义在于, 通过其 水解反应释放大量自由能和需要供能的反应偶 联, 使这些反应在生理条件下完成

53 ( 二 )ATP 是体内能量转移和磷酸核苷化合物相互转变的核心 腺苷酸激酶的作用 ADP + ADP ATP + AMP 核苷二磷酸激酶的作用 ATP + UDP ATP + CDP ATP + GDP ADP + UTP ADP + CTP ADP + GTP

54 ( 三 )ATP 通过转移自身基团提供能量 因为 ATP 分子中的高能磷酸键水解释放能量多, 易释放 Pi PPi 基团, 很多酶促反应由 ATP 通过共价键与底物或酶分子相连, 将 ATP 分子中的 Pi PPi 或者 AMP 基团转移到底物或酶蛋白上而形成中间产物, 经过化学转变后再将这些基团水解而形成终产物

55 ( 四 ) 磷酸肌酸是高能键能量的储存形式 磷酸肌酸作为肌肉和脑组织中能量的一种贮存形式

56 ATP 的生成 储存和利用 ATP 肌酸 磷酸肌酸 氧化磷酸化 底物水平磷酸化 ADP 生物体内能量的储存和利用都以 ATP 为中心 机械能 ( 肌肉收缩 ) 渗透能 ( 物质主动转运 ) 化学能 ( 合成代谢 ) 电能 ( 生物电 ) 热能 ( 维持体温 )

57 第三节 氧化磷酸化的影响因素

58 一 体内能量状态可调节氧化磷酸化速率 氧化磷酸化是机体合成能量载体 ATP 的最主要 的途径, 因此机体根据能量需求调节氧化磷 酸化速率, 从而调节 ATP 的生成量

59 二 抑制剂可阻断氧化磷酸化过程 ( 一 ) 呼吸链抑制剂阻断电子传递过程 复合体 Ⅰ 抑制剂 : 鱼藤酮 (rotenone) 粉蝶霉素 A(piericidin A) 及异戊巴比妥 (amobarbital) 等阻断传递电子到泛醌 复合体 Ⅱ 的抑制剂 : 萎锈灵 (carboxin)

60 复合体 Ⅲ 抑制剂 : 抗霉素 A(antimycin A) 阻断 Cyt bh 传递电子到泛醌 (Q N ) ; 粘噻唑菌醇则作用 Q P 位点 复合体 Ⅳ 抑制剂 :CN - N 3- 紧密结合中氧化型 Cyt a 3, 阻断电子由 Cyt a 到 CuB- Cyt a 3 间传递 CO 与还原型 Cyt a 3 结合, 阻断电子传递给 O 2

61 各种呼吸链抑制剂的阻断位点 琥珀酸 抗霉素 A 二巯基丙醇粘噻唑菌醇 CO CN - N 3 - 及 H 2 S NADH FMN (Fe-S) FAD (Fe-S) CoQ Cyt b Cyt c Cyt c Cyt aa 3 O 2 鱼藤酮粉蝶霉素 A 异戊巴比妥

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63 ( 二 ) 解偶联剂阻断 ADP 的磷酸化过程 解偶联剂 (uncoupler) 可使氧化与磷酸化的偶联相互分离, 基本作用机制是破坏电子传递过程建立的跨内膜的质子电化学梯度, 使电化学梯度储存的能量以热能形式释放,ATP 的生成受到抑制 如 : 二硝基苯酚 (dinitrophenol, DNP) ; 解偶联蛋白 (uncoupling protein,ucp1)

64 解偶联蛋白作用机制 ( 棕色脂肪组织线粒体 ) 热能 胞液侧 Cyt c 解偶联蛋白 Q 基质侧 ADP+Pi ATP

65 ( 三 )ATP 合酶抑制剂同时抑制电子传递和 ATP 的生成 这类抑制剂对电子传递及 ADP 磷酸化均有抑制 作用 例如寡霉素 (oligomycin) 可结合 F 0 单位, 二 环己基碳二亚胺 (dicyclohexyl carbodiimide, DCCP) 共价结合 F 0 的 c 亚基谷氨酸残基, 阻断质子从 F 0 质 子半通道回流, 抑制 ATP 合酶活性 由于线粒体内 膜两侧质子电化学梯度增高影响呼吸链质子泵的功 能, 继而抑制电子传递

66 寡霉素 (oligomycin) 可阻止质子从 F0 质子通道回流, 抑制 ATP 生成 ATP 合酶结构模式图

67 二环己基碳二亚胺 :DCCD

68 三 甲状腺激素可促进氧化磷酸化和产热 Na +,K + ATP 酶和解偶联蛋白基因表达均增加

69 四 线粒体 DNA 突变可影响机体氧化磷酸 化功能 线粒体 DNA(mtDNA) 呈裸露的环状双螺旋结构, 缺乏蛋白质保护和损伤修复系统, 容易受到损伤而发生突变, 其突变率远高于核内的基因组 DNA

70 五 线粒体的内膜选择性协调转运氧 化磷酸化相关代谢物 线粒体外膜通透性高, 线粒体对物质通 过的选择性主要依赖于内膜中不同转运蛋白 (transporter) 对各种物质的转运

71 线粒体内膜的某些转运蛋白对代谢物的转运 转运蛋白 进入线粒体 出线粒体 ATP-ADP 转位酶 ADP 3- ATP 4- 磷酸盐转运蛋白 H 2 PO H + 二羧酸转运蛋白 HPO 2-4 苹果酸 α- 酮戊二酸转运蛋白 苹果酸 α- 酮戊二酸 天冬氨酸 - 谷氨酸转运蛋白 谷氨酸 天冬氨酸 单羧酸转运蛋白 丙酮酸 OH - 三羧酸转运蛋白 苹果酸 柠檬酸 碱性氨基酸转运蛋白 鸟氨酸 瓜氨酸 肉碱转运蛋白 脂酰肉碱 肉碱

72 ( 一 ) 胞浆中 NADH 通过穿梭机制进入线粒体氧化呼吸链 胞浆中 NADH 必须经一定转运机制进入线粒体, 再经呼吸链进行氧化磷酸化 转运机制 : α- 磷酸甘油穿梭 (α-glycerophosphate shuttle) 苹果酸 - 天冬氨酸穿梭 (malate-asparate shuttle)

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74 NADH+H + CH 2 OH C=O CH 2 OH C=O 呼吸链 α- 磷酸甘油脱氢酶 CH 2 O- Pi 磷酸二羟丙酮 CH 2 OH CH 2 O- CH 2 OH Pi FADH 2 FAD NAD + CHOH CHOH CH 2 O- Pi CH 2 O- Pi α- 磷酸甘油 线粒体外膜 膜间隙 线粒体内膜 线粒体基质

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76 NADH +H + NAD + 草酰乙酸 苹果酸脱氢酶 O H 3 N + - OOC-CH2 -C-COO - H H 3 N + - OOC-CH2 -CH 2 -C-COO - H O 线粒体内膜 谷氨酸 - 天冬氨酸转运体 - OOC-CH2 -CH 2 -C-COO - 谷氨酸 H 3 N + H O H 3 N + - OOC-CH2 -C-COO - -OOC-CH 2-C-COO- -OOC-CH2-CH2-C-COO- -OOC-CH2-CH2-C-COO- H α- 酮戊二酸 O -OOC-CH 2-C-COO - 谷草转氨酶 天冬氨酸 呼吸链 NADH +H + NAD + OH -OOC-CH 2-C-COO - OH -OOC-CH 2-C-COO- H 苹果酸 苹果酸 -α- 酮戊二酸转运体 H 胞液 基质

77 化磷酸化胞液 AH 2 2H A 代谢物产物 α- 磷酸甘油穿梭苹果酸天冬氨酸穿梭 RCOOH E CO 2 +RH 氧化 氧2H 呼吸链 1 + O 2 2 H 2 O ADP+H 3 PO 4 ATP+ H 2 O 能量 线粒体

78 两种穿梭系统的比较 α- 磷酸甘油穿梭苹果酸 - 天冬氨酸穿梭 穿梭物质 α- 磷酸甘油磷酸二羟丙酮 苹果酸 谷氨酸天冬 aa α- 酮戊二酸 进入线粒体后转变成的物质 FADH 2 NADH+ H + 进入琥珀酸 NADH 呼吸链氧化呼吸链氧化呼吸链 生成 ATP 数 存在组织 骨骼肌 神经组织 肝脏和心肌组织 相同点将胞浆中 NADH 的还原当量转运到线粒体内

79 ( 二 )ATP-ADP 转位酶协调转运 ADP 进入和 ATP 移出线粒体

80 每分子 ATP 4- 和 ADP 3- 反向转运时, 向内膜外净 转移 1 个负电荷, 相当于多 1 个 H + 转入线粒体基质 ADP 3- ATP 4- H + H 2 PO - 4 H + 胞液侧 F 0 基质侧 腺苷酸转运蛋白 ATP 4- F 1 H 2 PO 4 - 磷酸转运蛋白 H + ADP 3- H +

81 第四节 其他氧化与抗氧化体系

82 一 线粒体氧化呼吸链也可产生活性氧 反应活性氧类 (reactive oxygen species, ROS) O 2 e - O -2 e - +2H + H 2 O 2 e - +H + OH H 2 O e - +H + H 2 O 反应活性氧类

83 ROS 主要来源 线粒体 : 超氧阴离子 O -2, 是体内 O -2 的主要来源 ; O -2 在线粒体中再生成 H 2 O 2 和 OH 过氧化酶体 :FAD 将从脂肪酸等底物获得的电子交给 O 2 生成 H 2 O 2 和羟自由基 OH 胞浆需氧脱氢酶 ( 如黄嘌呤氧化酶等 ) 也可催化生成 O -2 细菌感染 组织缺氧等病理过程, 环境 药物等外源因素也可导致细胞产生活性氧类

84 二 抗氧化酶体系有清除反应活性氧类 的功能 需氧脱氢酶和氧化酶 不需氧脱氢酶 受氢体辅酶 辅酶 ( 辅基 ) 产物 需氧脱氢酶 O 2 FMN 或 FAD H 2 O 2 氧化酶 O 2 含 Cu H 2 O

85 抗氧化酶体系 1. 过氧化氢酶 (catalase) 又称触酶, 其辅基含 4 个血红素 过氧化氢酶 2H 2 O 2 2H 2 O + O 2

86 2. 谷胱甘肽过氧化物酶 (glutathione peroxidase,gpx) H 2 O 2 + 2GSH 2 H 2 O +GS-SG 2GSH + R-O-OH GS-SG + H 2 O + R-OH

87 含硒的谷胱甘肽过氧化物酶 H 2 O 2 (ROOH) 2G SH NADP + 谷胱甘肽过氧化物酶 H 2 O (ROH+H 2 O) G S S G 谷胱甘肽还原酶 NADPH+H + 此类酶可保护生物膜及血红蛋白免遭损伤

88 3. 超氧化物歧化酶 2O H + SOD H 2 O 2 + O 2 过氧化氢酶 H 2 O + O 2 SOD: 超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase)

89 三 微粒体细胞色素 P450 单加氧酶催化底物分子羟基化 细胞色素 P450 单加氧酶 (cytochrome P450 monooxygenase), 又称混合功能氧化酶 (mixedfunction oxidase) 或羟化酶 (hydroxylase) RH + NADPH + H + + O 2 ROH + NADP + + H 2 O 上述反应需要细胞色素 P450 (Cyt P450) 参与

90 细胞色素 P450 单加氧酶作用机制

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