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1 自由基及其代谢紊乱 董雷鸣

2 1 讲课内容 自由基与活性氧的基础知识 2 自由基的生物学作用 3 自由基对机体的损伤作用 4 机体的抗氧化防御系统 5 机体的抗氧化防御系统 6 机体的抗氧化防御系统

3 一 自由基 (Free Radicals) 与活性氧的概念 What are Free Radicals? 凡是具有不成对电子的原子或基团, 称为自由基或游离基

4 常见的自由基活性小分子 O 2- 超氧阴离子 1 O 2 单线态氧 HO 2 氢过氧基 3R R CO(R R CO*) 三线态羰基 H 2 O 2 过氧化氢 ONOO - 过氧化氮阴离子 HO 羟自由基 HOCl 次氯酸 RO 氧有机自由基 L 脂自由基 ROO 有机过氧基 LOO 脂过氧基 ROOH R- 氢过氧化物

5 What are reactive oxygen species (ROS)? 是指氧在代谢过程中产生的, 含有氧元素且较 O 2 活泼的自由基 或非自由基的统称

6 二 自由基的产生

7 细胞内的线粒体 内质网 细胞核 质膜和胞液中均可产生 既可在氧化还原反应中产生, 又可受放射线或其它外来物质作用而产生 1. 酶促反应产生 二 自由基的产生 黄嘌呤 +2O 2 +H 2 O 尿酸 +2O 2- +2H + 黄嘌呤 +O 2 +H 2 O 黄嘌呤氧化酶 黄嘌呤氧化酶 尿酸 +H 2 O 2 2. 线粒体在传递电子过程中, 可产生多种自由基 3. 内质网中细胞色素 P 450 的反应, 可产生自由基 4. 在质膜中还原型辅酶 Ⅱ 氧化酶, 促使 NADPH 氧化为 NADP +, 同时可使 O 2 还原为 O 2-

8 三 自由基的性质 显示极活泼的化学性质, 存留时间短 化合反应 芳香族取代 加成反应 过氧化反应 歧化反应

9 四 自由基的相互转变规律 O 2- 可以连续不断地诱发机体产生新的自由基或活性氧并可以互相转化

10 第二节自由基的生物学作用 一 自由基与重要生物活性物质合成的关系 二 自由基的解毒作用 三 自由基与机体免疫系统的关系

11 一 自由基与重要生物活性物质合成的关系 凝血酶原的合成与氧自由基的关系 O 2- +CO 2 活性碳 羧化酶 凝血酶原前体羧化 活性碳 在羧化作用中起羧化剂的作用

12 胶原蛋白合成与氧自由基的关系 酶促羟化作用需要 O 2- OH H 2 O 2 或 1 O 2 的参加 脯氨酰羟化酶起催化作用时除分子氧以外, 尚需要 Fe 2+ α- 酮戊二酸和 1 种还原剂如维生素 C 的参加 羟化酶,Fe 2+ α- 酮戊二酸 +S+O 2 琥珀酸 +CO 2 +S OH 还原剂

13 二 自由基的解毒作用 外来物质 : 药物 毒物, 如各种麻醉剂 杀虫剂 烷烃系列石油产品 致癌物质 各种药品 脂肪酸等

14 细胞色素 P 450 通过羟化作用的解毒机制 T: : 毒物 药物等

15 三 自由基与机体免疫系统的关系 吞噬细胞杀死侵入机体的有害微生物的最重要机理是能产生有毒的各种活性氧 呼吸爆发 : 当吞噬细胞进行吞噬作用时, 氧化代谢常出现突然增长 羟自由基的作用 单线态氧的作用

16 第三节自由基对机体的损伤作用 一 脂质过氧化作用对细胞的损伤 二 蛋白质过氧化作用对机体的损伤 三 糖化氧化作用对机体的损伤 四 自由基对核酸和染色体的损伤 五 NO 和 ONOOH 的生成及对机体的作用

17 一 脂质过氧化作用对细胞的损伤 氧自由基 膜中多不饱和脂肪酸 脂质过氧化物 新的氧自由基损伤作用机制 : 使细胞的脂质受到破坏, 从而影响细胞膜的功能 产生多种活泼自由基攻击细胞中的酶和其他成分, 使之丧失功能 产物中的醛类化合物, 对细胞有毒性作用

18 脂质过氧化与一些疾病的关系

19 二 蛋白质过氧化作用对机体的损伤 自由基可以使蛋白质变性自由基可影响酶的活性 三 糖化氧化作用对机体的损伤 对蛋白质的非酶性修饰糖化氧化作用引起蛋白质氧化 四 自由基对核酸和染色体的损伤 自由基对核酸的破坏自由基对染色体的破坏

20 五 NO 和 ONOOH 的生成及对机体的作用 NO: 氮自由基 内皮细胞 神经元细胞 平滑肌细胞 巨噬细胞 中性粒细胞 血小板 成纤维细胞都能产生生物学作用扩张血管 神经传递 抑制血小板粘着 聚集和平滑肌细胞增殖 巨噬细胞和中性粒细胞介导杀伤病原体

21 NO 与超氧阴离子的反应及 ONOOH 的生成 O 2- +NO O=N-O-O - O=N-O-O - +H + O=N-O-OH NO 和 ONOOH 的生物学效应 NO 作为铁离子的配体 : NO 能可逆性地与含血红素铁 非血红素 Fe 和铁硫蛋白结合 ONOOH 对靶分子的氧化 : ONOOH 是一种强氧化剂 能使神经元羰基蛋白含量增加和谷氨酰胺合成酶活性降低, 最终导致细胞死亡 NO ONOOH 对线粒体的损伤 : 线粒体是细胞 O 2- 生成的主要地点,NO 抑制电子传递, 导致 O 2- 和 ONOOH 形成, 由此调控着线粒体对氧的摄取

22 机体的抗氧化防御系统 一 抗氧化酶 二 脂溶性抗氧化物质 三 水溶性小分子抗氧化物质 四 蛋白质性抗氧化物质

23 一 抗氧化酶 超氧化物歧化酶 (SOD) 过氧化氢酶 (CAT) 谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px)

24 超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase,sod)

25 过氧化氢酶 (Catalase,CAT) 2 H 2 O 2 2 H 2 O + O 2 血红素

26 谷胱甘肽过氧化物酶 (Glutathione Peroxidase,GPx) 谷胱甘肽还原酶

27 谷胱甘肽硫转移酶 (gluthione S-transferase,GST)

28 酶协同作用 : O - 2 能灭活 CAT 和 GSH- Px, 而 SOD 能使 O 2- 歧化生成 H 2 O 2,H 2 O 2 能灭活 CuZn- SOD, 而 CAT 和 GSH-Px 则能催化 H 2 O 2 生成 H 2 O 和 O 2 SOD 保护 CAT 和 GSH-Px 免受 O - 2 灭活, 同时 CAT 和 GSH-Px 保护 CuZn-SOD 不被 H 2 O 2 灭活

29 二 脂溶性抗氧化物质 维生素 E 它不但是 1 O 2 和 O 2- 的清除剂, 而且更重要的是脂质过氧化作用的阻断剂, 能和 GSH-Px 协同地终止脂质过氧化作用 类胡萝卜素 能直接与活性氧起反应 能增加巨噬细胞杀死癌细胞的能力 ; 能诱导致癌原失活 ; 能保护细胞免受自由基损伤 辅酶 Q 对脂质过氧化有明显的抑制作用, 可作为 β- 生育酚自由基的还原剂

30 三 水溶性小分子抗氧化物质 抗坏血酸 维生素 C 是还原剂 可很快地与 O 2- OH 和 HO 2 反应, 保护机体免受氧自由基的损伤 谷胱甘肽 GSH 是一种水溶性自由基消除剂, 保护组织细胞免受氧化损伤, 还参与使维生素 E 恢复到还原态的作用 保护蛋白巯基免受氧化损伤

31 四 蛋白质性抗氧化物质 铜篮蛋白 CP 是抗氧化剂 防止过渡金属 Fe 2+ 和 Cu 2+ 催化 H 2 O 2 形成 OH 白蛋白结合的胆红素 胆红素能有效地清除 1 O 2 O 2- 和过氧基 金属硫蛋白 MT 可结合铜离子防止其引起的氧化损伤, 可清除活性氧

32 氧自由基与疾病的相关性 一 氧自由基生成过多引起的病理变化 二 清除氧自由基能力减弱引起的病理变化 三 呼吸爆发与疾病的关系 四 组织缺血再灌流的活性氧损伤 五 活性氧与细胞因子的关系 六 氧应激损伤与疾病的关系 七 活性氧与细胞凋亡的关系

33 一 氧自由基生成过多引起的病理变化

34 吞噬细胞数增多, 呼吸爆发增强的病理变化 组织缺血再灌注的病理变化 其他 : 体内铁过多 ; 肾上腺素自氧化产生自由基 ; 血脂过高者

35 二 清除氧自由基能力减弱引起的病理变化 机体抗氧化营养素摄入不足 有关酶先天缺陷 老年人清除酶活性降低, 酶诱导生成减少

36 三 呼吸爆发与疾病的关系 呼吸爆发 : 在吞噬过程中伴随着活性氧的大量产生,NADPH 氧化酶能将单电子传递给 O 2 形成 O 2-, 继而产生 H 2 O 2 OH HOCl 1 O 2 等氧代谢物, 以杀死微生物 呼吸爆发缺陷的遗传性疾病 : 慢性肉芽肿病 葡萄糖 -6- 磷酸脱氢酶缺乏 髓过氧酶缺乏等 吞噬细胞呼吸爆发引起的疾病 : 细菌 病毒或其它微生物侵入机体即诱导炎症反应, 以此消除入侵者 炎症反应时氧代谢物产生的量过多与机体的抗氧化系统失去平衡时, 即成为致病的因素 肺气肿 类风湿性关节炎 红斑性狼疮 肾小球肾炎 成人呼吸窘迫综合征等

37 四 组织缺血再灌流的活性氧损伤 缺氧组织有利于再灌流 O 2 转变为 O 2- 心肌梗死和脑梗塞的治疗, 心胸外科手术和体外循环, 器官移植以及各种原因所致的休克等, 都必然经历一个缺血再灌流的过程 活性氧是再灌流组织损伤的主要原因

38 五 活性氧与细胞因子的关系 细胞因子与自由基之间相互影响的关系是免疫调节的重要机制之一 细胞因子影响细胞活性氧的产生活性氧影响细胞因子的生成及活性细胞因子与抗氧化作用

39 六 氧应激损伤与疾病的关系 氧应激 : 机体的氧自由基生成增多和抗氧化防御能力降低, 使机体处于持续的应激状态, 造成细胞成分损伤, 由此导致蛋白质分子键的断裂 交链 聚合和沉积 氧应激与阿尔茨海默病氧应激与帕金森病

40 七 活性氧与细胞凋亡的关系 细胞凋亡是不同于细胞坏死的细胞死亡方式, 它具有特征性形态和生化改变, 是细胞主动死亡的过程 活性氧与衰老密切相关, 而衰老细胞的死亡实质上就是细胞凋亡 能引起细胞氧化的因素均能引起细胞凋亡

41 自由基检测指标的评价 一 脂质过氧化反应产物检测的评价 二 谷胱甘肽过氧化物酶活性测定的评价 三 超氧化物歧化酶测定的评价 四 过氧化氢酶测定的评价 五 一氧化氮测定的评价 六 还原型谷胱甘肽测定的评价

42 一 脂质过氧化反应产物检测的评价 生物氧化检测指标对疾病的诊断均缺乏特异性, 但对多种疾病的发病机制以及病情和预后判断具有重要的临床价值 生化特性 脂质过氧化是一个自由基链式反应 LH L L +O 2 LOO + LH LOO L +LOOH 脂质过氧化物可以分解成醛 酮 醚 羧酸及烷烃等产物 产生的醛类化合物具有毒性

43 标本 天 血清 PRO<100g/L, 唾液酸 <2.5g/L, 对结果无干扰 ;GLU>100g/L 蔗糖 >125g/L 游离血红蛋白 >10g/L TBIL>150mg/L Fe 3+ >8.61mmol/L 对测定有明显干扰 EDTA 枸橼酸 NaF 草酸可使结果偏低 测定方法丙二醛测定 : 降解产物丙二醛 (MDA), 可与硫代巴比妥酸 (TBA) 形成红色产物 若 Ex515nm,Em553nm, 可用荧光法进行微量测定 乙烷的测定 : 气相色谱法 荧光产物的测定 : 丙二醛与磷脂 蛋白质 核酸等含氨基的物质反应, 可生成能产生荧光的 Schiff 碱

44 二 谷胱甘肽过氧化物酶活性测定的评价 生化特性 GSH-Px 不仅具有清除自由基和衍生物的作用, 还与 CAT PH-GSH-Px 和 GST 构成还原有机氢过氧化物系统 标本 4 3 天,-70 3 个月 溶血使结果偏高 脂血使浊度增加, 灵敏度下降 GSH 与 H 2 O 2 能发生自氧化作用 测定方法在 GSH 的存在下,GSH-Px 可使 ROOH 还原为 ROH, 同时 GSH 氧化为 GSSG 在 GSSG-R 作用下 NADPH 还原 GSSG 的反应偶联, 根据 340nm 光吸收, 检测出 GSH-Px 活性

45 三 超氧化物歧化酶测定的评价 生化特性 标本 CuZn-SOD 有 SOD 1 和 SOD 2 两条区带, 大部分是 SOD 1 纯合子, 极少数是纯合子 SOD 2 Mn-SOD 对热和化学试剂敏感, 氯 仿和乙醚处理即遭破坏 肝素抗凝血, 红细胞抽提液 4 1 月后活性下降 8.4% 测定方法 化学法细胞色素 C 还原法 : 黄嘌呤 +O 2 +H 2 O 尿酸 +H 2 O 2 黄嘌呤 +2O 2 +H 2 O 尿酸 +2O 2- +2H + 电泳法基于光化学法与 NBT 还原法原理 SOD 的鉴别

46 四 过氧化氢酶测定的评价 生化特性 CAT 能将细胞代谢产生的毒性物质 H 2 O 2 迅速清除, 从而起到和 GSH-Px 共同保护巯基酶 膜蛋白和解毒作用 标本完整红细胞及未稀释溶血液 2 数天稳定 5 1~5 天后, 肝素抗凝血几乎完全丧失 血清标本室温 3 天 CAT 活性降低 64.7%,4 则下降 10.5%,-15 天下降 3.5% 应避免溶血 测定方法 滴定法 分光光度法

47 五 一氧化氮测定的评价 生化特性当病原微生物入侵和肿瘤发生时, 能诱导活化巨噬细胞产生大量 NO, 抑制杀伤肿瘤细胞和病原微生物 标本样品应及时检测 防止溶血和红细胞混入 维生素 C Na 2 HPO 4 对测定有干扰 测定方法 NO - 2 /NO - 3 法荧光分光光度法

48 六 还原型谷胱甘肽测定的评价 生化特性 GSH 是 GSH-PxGST 两种酶作用的底物 标本血浆中 GSH 含量甚微 新鲜血液中 GSH 稳定 4 小时 测定方法二硫代双硝基苯甲酸速率法

49 谢谢!

第一章 图 1 1 传染病的特征 9 T h1 T h2 细胞调节机制简图 正调节 负调节 细胞因子与细菌的相互作用机制目前尚未完全明了 有实验表明 细胞因子与细菌之间 存在有互利和互抑双重效应 例如 T N Fα 和 IFNγ 可抑制放线菌的生长而 IL 6 的作用则 反之 IL 1 2 和 GM CSF 可促进某些致病性大肠杆菌生长而 IL 1ra 可抑制之 研究表 明 某些致病性大肠杆菌有与

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