细胞生物学

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1 细胞生物学 ( 供中医药类专业用 ) 主编赵宗江 ( 北京中医药大学 ) 中国中医药出版社 北京

2 图书在版编目 (CIP) 数据 细胞生物学 / 赵宗江主编 北京 : 中国中医药出版社, 新世纪全国高等中医药院校创新教材 ISBN Ⅰ 细... Ⅱ 赵... Ⅲ 细胞生物学 - 中医学院 - 教材 Ⅳ Q2 中国版本图书馆 CIP 数据核字 (2004) 第 号 中国中医药出版社出版发行者 : 中国中医药出版社 ( 北京市朝阳区北三环东路 28 号易亨大厦 电话 : 邮编 :100013) ( 邮购联系电话 : ) 印刷者 : 经销者 : 新华书店总店北京发行所 开 本 : 毫米 16 开 字 数 :639 千字 印 张 :27( 彩插 印张 ) 版 次 :2004 年 10 月第 1 版 印 次 :2004 年 10 月第 1 次印刷 册 数 :5000 书 号 :ISBN /R 660 定 价 :35 00 元 如有质量问题, 请与出版社发行部调换 CPTCM COM

3 新世纪全国高等中医药院校创新教材 细胞生物学 编委会 主编赵宗江 ( 北京中医药大学 ) 副主编吴勃岩 ( 黑龙江中医药大学 ) 彭成 ( 成都中医药大学 ) 王望九 ( 安徽中医学院 ) 编 委 ( 以姓氏笔画为序 ) 丁伯海 ( 浙江中医学院 ) 王明艳 ( 南京中医药大学 ) 刘黎青 ( 山东中医药大学 ) 刘小敏 ( 江西中医学院 ) 刘 昆 ( 北京中医药大学 ) 李士怡 ( 辽宁中医学院 ) 李 军 ( 陕西中医学院 ) 李相辉 ( 北京中医药大学 ) 吴 静 ( 云南中医学院 ) 宋 强 ( 山西中医学院 ) 谷海瑛 ( 北京中医药大学 ) 张新雪 ( 北京中医药大学 ) 张国红 ( 河北医科大学 ) 张 正 ( 广州中医药大学 ) 邵 悦 ( 北京中医药大学 ) 杨联河 ( 河南中医学院 ) 赵丕文 ( 北京中医药大学 ) 赵 刚 ( 湖北中医学院 ) 赵爱明 ( 湖南中医学院 ) 洪振丰 ( 福建中医学院 ) 钟振国 ( 广西中医学院 ) 徐 莉 ( 长春中医学院 ) 姬可平 ( 甘肃中医学院 ) 梁日兴 ( 中国中医研究院 )

4 新世纪全国高等中医院校教材 细胞生物学 编委会 主编赵宗江 ( 北京中医药大学 ) 副主编吴勃岩 ( 黑龙江中医药大学 ) 彭成 ( 成都中医药大学 ) 王望九 ( 安徽中医学院 ) 编写人员 ( 以姓氏笔画为序 ) 丁伯海王明艳刘黎青刘小敏刘昆李士怡李军李相辉吴静邵悦谷海瑛张新雪张国红张正宋强杨联河赵丕文赵刚赵爱明洪振丰钟振国徐莉姬可平梁日兴

5 前言 1 前 言 细胞生物学是一门揭示生命基本规律 研究细胞结构和功能的重要基础学科 目前, 细胞生物学已经形成了具有基本理论 基本知识和基本技术的一门崭新的独立学科 其研究重点侧重于阐释人体的生命活动规律, 疾病发生 发展规律, 以及与疾病诊断 防治有关的理论和技术方法, 它在医学教育中的地位愈来愈受到重视 我国于 1988 年全国生命科学前沿学术研讨会上, 将细胞生物学 分子生物学 神经生物学和生态学并列为基础科学发展规划中生命科学的四个前沿学科 20 余年来, 在我国高等医学院校基础课教学中, 细胞生物学演变为一门基础课程, 先后出版了十多种教学用书, 对细胞生物学教学的建设起着重要的奠基作用与巨大的推动作用 现在全国绝大部分高等医学院校和部分中医院校已经将 细胞生物学 列为必修课或选修课, 并成为 21 世纪的热门课程 高等中医药院校在 细胞生物学 教材建设和教学方面存在着薄弱环节, 至今还没有全国统一的教材, 大部分中医药院校本科生 尤其是七年制学生和研究生尚未开设这门课程, 这既影响了高等中医药院校生物化学 组织胚胎学 病理学和生理学等医学基础课程的教学, 又影响了中医药院校的人才培养, 从而降低了与现代医学的接轨, 以及中医院校的整体教学水平 因此, 迫切需要全国统编的 细胞生物学 教材问世 新世纪 新形势, 呼唤一部多院校 多专家参编, 多院校使用的高等中医药院校本科生 七年制学生和研究生用的全国统一的新世纪教材 细胞生物学 的问世 正是在这种形势下, 全国高等中医药教材建设研究会, 中国中医药出版社决定出版新世纪全国高等中医药院校创新教材 细胞生物学, 对于提高高等中医药院校教学质量和高级中医药人才的培养具有重要的现实意义, 也具有重要的学术价值 在充分了解和掌握国内外 细胞生物学 研究动态的情况下, 首次组织国内从事细胞生物学 组织学及分子生物学教学 科研多年, 具有丰富教学经验的专家 教授参加编写, 由北京中医药大学牵头, 黑龙江 成都 南京 广州 山东中医药大学, 安徽 河南 湖南 湖北 山西 陕西 辽宁 长春 甘肃 云南 浙江 福建 广西 江西中医学院, 以及中国中医研究院和河北医科大学等 22 所兄弟院校参编高等中医院校本科生 七年制学生和研究生用的第一部全国统编教材

6 2 细胞生物学 教材简明扼要, 通俗易懂, 以基本理论和基本知识为重点, 以适度结合中医理论为特点, 以涵盖国内外最新研究进展为特色, 深入浅出, 重点突出, 系统面向高等中医药院校本科生 七年制学生和研究生讲授细胞生物学的基本理论和基本知识, 为学习医学基础课打下坚实的基础 这既符合高等中医药院校的教学规律, 又充分体现出高等中医药院校的教学特点 细胞生物学 一书的出版, 得到了全国高等中医药教材建设研究会 中国中医药出版社领导诚心关爱, 得到了北京中医药大学领导 北京中医药大学教学管理处 研究生部以及各参编单位相关领导的大力支持, 对此, 共致谢忱 我的研究生谷海瑛 李相辉 邵悦 刘昆等同学在本书的稿件组织 图片编辑及校稿工作中付出了辛勤的劳动, 在此也向他们表示感谢 本书既是本科生 七年制学生 硕士研究生和博士研究生的教材和参考书, 也是广大科研工作者的得力助手 我们希望本书能有助于推动高等中医药院校本科生和研究生教育的发展 由于细胞生物学是一门发展迅速的学科, 许多内容日新月异, 加之时间仓促和水平所限, 教材中难免存在一些缺点和不足, 我们热诚欢迎广大读者和专家不吝赐教 赵宗江 2004 年 7 月于北京

7 目录 1 目 录 第一章 绪论 1 第一节 细胞生物学的发展简史 1 一 细胞的发现 1 二 细胞学说的建立及其发展 1 ( 一 ) 细胞学说的建立 1 ( 二 ) 原生质理论的提出 2 ( 三 ) 细胞分裂的研究 2 ( 四 ) 细胞器的发现 2 三 细胞生物学学科的形成和发展 2 第二节 细胞生物学的研究内容 3 一 细胞生物学的主要研究内容 3 ( 一 ) 细胞通讯和细胞信号转导 3 ( 二 ) 细胞增殖与细胞周期的调控 3 ( 三 ) 细胞的生长和分化 4 ( 四 ) 细胞的衰老和凋亡 4 ( 五 ) 干细胞及其应用 4 ( 六 ) 细胞工程 5 二 细胞生物学的分支学科 5 ( 一 ) 细胞形态学 5 ( 二 ) 细胞化学 5 ( 三 ) 细胞遗传学 5 ( 四 ) 细胞生理学 5 ( 五 ) 细胞社会学 5 ( 六 ) 分子细胞学 6 第三节 细胞生物学学习方法 6 一 认识细胞生物学的重要性 6 二 明确细胞生物学的研究内容 6 三 了解细胞生物学的研究方法 6 四 融会贯通 灵活掌握 6 五 不断更新知识 紧跟学科前沿 6 第二章 细胞生物学技术 7 第一节 显微镜技术 7 一 分辨率 7

8 2 细胞生物学 二 光学显微镜技术 8 ( 一 ) 普通光学显微镜 8 ( 二 ) 荧光显微镜 9 ( 三 ) 相差显微镜 9 ( 四 ) 暗视野显微镜 10 ( 五 ) 激光扫描共聚焦显微镜 11 三 电子显微镜技术 12 ( 一 ) 透射电子显微镜 12 ( 二 ) 扫描电子显微镜 13 ( 三 ) 高压电子显微镜 13 ( 四 ) 扫描隧道显微镜 15 第二节 细胞化学技术 15 一 酶细胞化学技术 15 二 免疫细胞化学技术 16 三 放射自显影技术 16 第三节 细胞组分分析方法 17 一 流式细胞术 17 二 细胞分级分离术 18 ( 一 ) 差速离心法 18 ( 二 ) 密度梯度离心法 18 第四节 细胞培养技术 20 一 体外细胞培养技术 20 二 细胞融合技术 20 ( 一 ) 细胞融合 20 ( 二 ) 单克隆抗体技术 21 第五节 分子生物学方法 22 一 原位分子杂交技术 22 二 PCR 反应技术 22 三 基因敲除与敲进 24 第三章 细胞的基本结构 26 第一节 细胞的分子基础 26 一 无机化合物 26 ( 一 ) 水 26 ( 二 ) 无机盐 27 二 有机化合物 27 ( 一 ) 有机小分子 27 ( 二 ) 生物大分子 28

9 目录 3 第二节 原核细胞与真核细胞 34 一 原核细胞 34 ( 一 ) 支原体 35 ( 二 ) 细菌 35 二 真核细胞 36 ( 一 ) 真核细胞的基本结构 36 ( 二 ) 真核细胞的形态与大小 38 三 原核细胞与真核细胞的比较 38 第四章 细胞膜与跨膜运输 40 第一节 细胞膜的化学组成 40 一 膜脂 41 ( 一 ) 磷脂 41 ( 二 ) 糖脂 41 ( 三 ) 胆固醇 43 ( 四 ) 膜脂的共同特点 44 ( 五 ) 脂质体 44 二 膜蛋白 45 ( 一 ) 镶嵌蛋白 45 ( 二 ) 外周蛋白 45 三 膜糖类 45 第二节 细胞膜的分子结构 46 一 片层结构模型 46 二 单位膜模型 46 三 液态镶嵌模型 47 四 晶格镶嵌模型 47 五 板块镶嵌模型 47 六 脂筏模型 48 第三节 细胞膜的特性 49 一 膜的不对称性 49 ( 一 ) 膜蛋白分布的不对称 49 ( 二 ) 膜脂分布的不对称 49 ( 三 ) 膜糖分布的不对称 49 二 膜的流动性 49 ( 一 ) 膜脂的流动性 49 ( 二 ) 膜蛋白的运动性 50 ( 三 ) 影响膜流动性的因素 50 ( 四 ) 膜流动性异常引起的疾病 51

10 4 细胞生物学 第四节 小分子物质的跨膜运输 51 一 被动运输 52 ( 一 ) 简单扩散 52 ( 二 ) 离子通道扩散 53 ( 三 ) 易化扩散 54 二 主动运输 55 ( 一 ) 由 ATP 直接提供能量的主动运输 运输泵 56 ( 二 ) 离子梯度驱动的主动运输 协同运输 57 三 膜运输系统异常引起的疾病 59 第五节 大分子物质的跨膜运输 59 一 内吞作用 59 ( 一 ) 吞噬作用 59 ( 二 ) 胞饮作用 59 ( 三 ) 受体介导的内吞作用 60 二 外排作用 61 三 膜流与膜的运动 62 第六节 细胞表面的特化结构和功能 63 一 细胞侧面的特化结构 细胞连接 63 ( 一 ) 封闭连接 64 ( 二 ) 锚定连接 65 ( 三 ) 通讯连接 66 二 细胞游离面的特化结构 68 ( 一 ) 微绒毛 69 ( 二 ) 纤毛和鞭毛 69 第五章 细胞外基质 71 第一节 细胞外基质的构成 71 一 胶原 72 ( 一 ) 胶原的类型和分布 72 ( 二 ) 胶原的分子结构 74 ( 三 ) 胶原的合成和降解 75 二 非胶原糖蛋白 77 ( 一 ) 纤维粘连蛋白 77 ( 二 ) 层粘连蛋白 82 ( 三 ) 其他糖蛋白 86 三 弹性蛋白 86 四 氨基聚糖与蛋白聚糖 87 ( 一 ) 氨基聚糖的理化特性 87

11 目录 5 ( 二 ) 氨基聚糖的分布和功能 88 ( 三 ) 氨基聚糖的种类和结构 89 ( 四 ) 蛋白聚糖的结构 90 ( 五 ) 蛋白聚糖的合成与降解 91 第二节 细胞外基质的功能 92 一 细胞外基质的物理学功能 92 二 细胞外基质由细胞分泌表达 92 三 细胞外基质对细胞功能的影响 92 ( 一 ) 细胞外基质与细胞的粘附过程 93 ( 二 ) 细胞外基质与细胞的迁移过程 93 ( 三 ) 细胞外基质与细胞的增殖过程 93 ( 四 ) 细胞外基质与细胞的分化过程 94 第三节 细胞粘附分子 94 一 整合素 95 ( 一 ) 整合素特性和功能 95 ( 二 ) 整合素分子结构和作用机制 96 ( 三 ) 整合素分子的分布 96 二 选择素 96 ( 一 ) 选择素分子的基本结构 96 ( 二 ) 选择素家族的组成 97 ( 三 ) 选择素的特性和功能 97 ( 四 ) 选择素分子识别的配体 97 三 免疫球蛋白 98 ( 一 ) 免疫球蛋白 IgS 特性 98 ( 二 ) 免疫球蛋白结构 98 ( 三 ) 免疫球蛋白的功能 98 四 钙粘连素 98 ( 一 ) 钙粘连素分子结构 98 ( 二 ) 钙粘连素家族的组成和分布 99 ( 三 ) 钙粘连素的特性和功能 99 五 其他未归类的粘附分子 99 第六章 细胞核与细胞遗传 101 第一节 核被膜 102 一 外核膜 102 二 内核膜 103 三 核间隙 103 四 核孔 103

12 6 细胞生物学 五 核纤层 104 第二节染色质和染色体 105 一 染色质的化学组成及种类 105 ( 一 ) 染色质的化学组成 105 ( 二 ) 染色质的种类 109 二 染色质的包装 110 ( 一 ) 染色质的一级结构 核小体 110 ( 二 ) 染色质的二级结构 螺线管 111 ( 三 ) 染色质的三级结构 超螺线管 112 ( 四 ) 染色质的四级结构 染色单体 112 三 染色体 114 ( 一 ) 染色体的形态特征 114 ( 二 ) 染色体组与核型 116 第三节核基质 118 一 核基质的形态结构和化学组成 119 二 核基质的功能 119 ( 一 ) 核基质与 DNA 的复制 119 ( 二 ) 核基质与基因表达调控 119 ( 三 ) 核基质与染色体的构建 119 第四节核仁 120 一 核仁的形态结构和化学组成 120 二 核仁的功能 121 三 核仁周期 121 第五节基因与基因转录 123 一 遗传的中心法则 123 二 基因与基因转录 123 ( 一 ) 原核细胞的基因结构 123 ( 二 ) 真核细胞的基因结构 123 ( 三 ) 原核细胞的基因转录 127 ( 四 ) 真核细胞的基因转录 129 第六节遗传信息翻译 135 一 遗传密码与 mrna 135 二 反密码子与 trna 137 三 反密码子与密码子的相互作用 138 四 核糖体与遗传信息的翻译 138 第七节真核细胞基因表达的调控 138 一 基因表达的调节途径 138

13 目录 7 二 转录水平的调节机制 140 ( 一 ) 基因调控的顺式作用元件 140 ( 二 ) 基因调控的反式作用因子 140 ( 三 ) 顺式作用元件与反式作用因子的相互作用 141 第八节细胞核与疾病 143 一 细胞核形态异常与肿瘤 143 二 染色体异常与肿瘤 143 第七章细胞骨架 146 第一节微丝 146 一 微丝的组成 147 二 微丝的形态结构 148 三 微丝的组装及影响因素 148 ( 一 ) 微丝的组装 148 ( 二 ) 影响微丝组装的因素 149 四 微丝组装的动态调节 149 五 微丝的特异性药物 150 六 微丝结合蛋白及其功能 150 ( 一 ) 收缩蛋白 ( 移动因子 ) 151 ( 二 ) 调节蛋白 152 ( 三 ) 连接蛋白 153 七 微丝的功能 154 ( 一 ) 参与细胞形态的维持 154 ( 二 ) 参与肌肉收缩 155 ( 三 ) 参与细胞分裂 156 ( 四 ) 参与细胞运动 157 ( 五 ) 参与细胞内物质运输 158 ( 六 ) 参与细胞内信号转导 158 ( 七 ) 参与受精 159 第二节微管 159 一 微管的化学组成 159 二 微管的形态结构 160 三 微管结合蛋白 161 四 微管的组装 162 ( 一 ) 微管的体外组装 163 ( 二 ) 微管的体内组装 163 五 微管组装的动态调节 非稳态动力学模型 163 ( 一 ) 体外微管组装的动态调节 164

14 8 细胞生物学 ( 二 ) 体内微管组装的动态调节 165 六 微管的特异性药物 165 七 微管的功能 166 ( 一 ) 维持细胞形态 166 ( 二 ) 构成细胞运动器官, 参与细胞运动 166 ( 三 ) 维持细胞器位置, 参与细胞器位移 169 ( 四 ) 参与细胞内物质运输 169 ( 五 ) 参与染色体运动, 调节细胞分裂 169 ( 六 ) 参与细胞内信号转导 169 第三节中间纤维 170 一 中间纤维的化学组成 170 二 中间纤维的形态结构 172 三 中间纤维的组装 173 四 中间纤维组装的动态调节 174 五 中间纤维结合蛋白及其功能 174 六 中间纤维的功能 176 ( 一 ) 中间纤维发挥功能具有时空特异性 176 ( 二 ) 增强细胞的机械强度 177 ( 三 ) 维持细胞和组织的完整性 177 ( 四 ) 与 DNA 复制有关 177 ( 五 ) 与细胞分化及细胞生存有关 177 ( 六 ) 与细胞的信号转导有关 178 第四节细胞骨架与疾病 178 一 细胞骨架与肿瘤 178 ( 一 ) 细胞骨架在肿瘤细胞中的变化 178 ( 二 ) 中间纤维与肿瘤诊断 179 ( 三 ) 微管和微丝与抗肿瘤药物 180 二 细胞骨架蛋白与神经系统疾病 180 三 细胞骨架与遗传性疾病 181 四 细胞骨架与衰老 181 第八章线粒体 183 第一节线粒体的一般性状 184 一 线粒体的形状 185 二 线粒体的大小 185 三 线粒体的数量 185 四 线粒体的分布 185 第二节线粒体的生物学特性 186

15 目录 9 一 线粒体的超微结构 186 ( 一 ) 外膜 186 ( 二 ) 内膜 186 ( 三 ) 膜间隙 187 ( 四 ) 基质 187 二 线粒体的化学组成 187 ( 一 ) 化学组成 187 ( 二 ) 线粒体中酶的定位 188 第三节线粒体基因组 188 一 线粒体基因组 189 二 人类线粒体基因组的特点 189 三 线粒体基因组与核基因组比较 190 第四节核编码蛋白质的线粒体转运 190 第五节线粒体的能量转化功能 194 一 糖酵解 194 二 三羧酸循环 197 ( 一 ) 三羧酸循环过程 198 ( 二 ) 三羧酸循环的生理意义 200 ( 三 ) 糖有氧氧化的调节 200 ( 四 ) 有氧氧化和糖酵解的相互调节 202 三 氧化磷酸化 202 ( 一 ) 电子载体 202 ( 二 ) 呼吸链复合物 205 ( 三 ) 两条主要的呼吸链 206 四 ATP 的生成 储存和利用 207 ( 一 )ATP 的生成方式 208 ( 二 ) 氧化磷酸化偶联部位的测定 208 ( 三 ) 氧化磷酸化中 ATP 生成的结构基础 210 ( 四 ) 氧化磷酸化的偶联机制 210 ( 五 ) 氧化磷酸化抑制剂 212 ( 六 ) 氧化磷酸化的调节 213 ( 七 ) 高能磷酸化合物的储存和利用 213 第六节线粒体的再生和起源 215 一 线粒体的再生 215 二 线粒体的起源 216 第七节线粒体与疾病 217 一 线粒体 DNA 突变的致病机制 217

16 10 细胞生物学 二 线粒体病的治疗进展 219 第九章细胞的内膜系统 221 第一节核糖体 221 一 核糖体的类型和化学组成 221 二 核糖体的结构 222 三 核糖体在细胞内的分布与蛋白质合成 223 ( 一 ) 核糖体在细胞内的分布 223 ( 二 ) 蛋白质的生物合成 223 ( 三 ) 蛋白质的加工修饰 225 ( 四 ) 蛋白质的定位控制 226 第二节内质网 227 一 内质网的形态结构和分类 227 ( 一 ) 粗面内质网 228 ( 二 ) 滑面内质网 228 二 内质网的化学组成 228 三 内质网的功能 229 ( 一 ) 粗面内质网的功能 229 ( 二 ) 滑面内质网的功能 233 四 内质网的病理变化 234 第三节高尔基复合体 235 一 高尔基复合体的形态结构 235 ( 一 ) 顺面高尔基网络 235 ( 二 ) 中央扁平囊 235 ( 三 ) 反面高尔基网络 236 二 高尔基复合体的化学组成 237 三 高尔基复合体的功能 238 ( 一 ) 分泌蛋白的加工与修饰 238 ( 二 ) 高尔基复合体与蛋白质的分选和运输 239 ( 三 ) 高尔基复合体与溶酶体的形成 241 ( 四 ) 高尔基复合体与细胞内膜的交通 241 四 高尔基复合体的病理变化 242 ( 一 ) 高尔基复合体的肥大或萎缩 242 ( 二 ) 高尔基复合体内容物的变化 243 ( 三 ) 癌细胞内高尔基复合体的变化 243 第四节溶酶体 243 一 溶酶体的结构和化学组成 243 ( 一 ) 溶酶体的结构特点 243

17 目录 11 ( 二 ) 溶酶体的酶 243 ( 三 ) 溶酶体的膜 244 二 溶酶体的类型 244 ( 一 ) 内体性溶酶体 245 ( 二 ) 吞噬性溶酶体 245 ( 三 ) 残余体 245 三 溶酶体的功能 246 ( 一 ) 对细胞内物质的消化 246 ( 二 ) 对细胞外物质的消化 246 ( 三 ) 溶酶体的自溶作用与器官发育 247 ( 四 ) 溶酶体与激素分泌的调节 247 四 溶酶体与疾病的关系 248 ( 一 ) 先天性溶酶体病 248 ( 二 ) 溶酶体与矽肺 248 ( 三 ) 溶酶体与类风湿性关节炎 249 ( 四 ) 溶酶体与肿瘤的关系 249 第五节过氧化物酶体 249 一 过氧化物酶体的形态结构和化学组成 249 二 过氧化物酶体的功能 250 三 过氧化物酶体的生物发生 250 第十章细胞的信号转导 252 第一节细胞信号转导的基本特点 252 一 细胞信号转导的方式 252 二 信号转导与信号分子 253 三 受体 253 四 受体的基本类型 254 ( 一 ) 酪氨酸激酶 254 ( 二 ) 配体闸门离子通道 254 ( 三 )G 蛋白偶联受体 255 ( 四 ) 细胞内受体 255 第二节 G 蛋白 255 一 G 蛋白的分子组成及其类型 255 二 PKA 系统的信号转导机制 256 三 PKC 系统的信号转导机制 257 第三节第二信使与蛋白激酶 258 一 腺苷酸环化酶与 camp 258 ( 一 ) 腺苷酸环化酶 258

18 12 细胞生物学 ( 二 )camp 及其作用 258 二 鸟苷酸环化酶与 cgmp 259 三 蛋白激酶与磷酸化作用 259 四 一氧化氮信号 260 五 甘油二酯 三磷酸肌醇和 Ca 2+ 的信号体系 260 ( 一 ) 甘油二酯活化蛋白激酶 C 260 ( 二 ) 三磷酸肌醇动员细胞内 Ca 2+ 的释放 260 六 信息传递体系之间的相互作用 261 第四节 信号转导的抑制和终止 261 一 信号的终止 261 二 某些受体和信号转导成分的抑制作用 262 三 信号转导通路的负反馈调节 262 第五节 信号转导与医学关系 262 一 受体的缺陷 262 二 G 蛋白功能异常及蛋白激酶功能异常 263 三 信号转导异常与疾病 263 ( 一 ) 信号转导异常与肿瘤 263 ( 二 ) 信号转导异常与心血管病 264 第十一章 细胞生长 分裂和细胞周期 265 第一节 细胞分裂 265 一 无丝分裂 265 二 有丝分裂 266 ( 一 ) 前期 267 ( 二 ) 中期 268 ( 三 ) 后期 268 ( 四 ) 末期 269 三 减数分裂 271 ( 一 ) 第一次减数分裂 271 ( 二 ) 减数分裂间期 275 ( 三 ) 第二次减数分裂 275 第二节 细胞周期 275 一 细胞周期各时相的动态变化 277 ( 一 )G 1 期 ( 合成前期 ) 277 ( 二 )S 期 ( 合成期 ) 278 ( 三 )G 2 期 ( 合成后期 ) 278 ( 四 )M 期 279 二 细胞周期的调控 279

19 目录 13 ( 一 ) 细胞周期蛋白 279 ( 二 ) 成熟促进因子 281 ( 三 ) 生长因子 282 ( 四 ) 抑素 283 ( 五 )RNA 剪接因子 SR 蛋白及 SR 蛋白特异的激酶 284 三 细胞周期调控的遗传基础 285 ( 一 )cdc 基因与细胞周期的调节 285 ( 二 ) 癌基因与细胞周期的调节 286 ( 三 ) 抑癌基因与细胞周期的调节 287 四 细胞周期常用的研究方法 288 ( 一 ) 细胞同步化法 288 ( 二 ) 细胞周期调控研究方法 289 ( 三 ) 3 H TdR 掺入法 290 五 细胞周期的时间测定 标记有丝分裂比率法 (PLM 法 ) 290 六 细胞周期与医学的关系 291 ( 一 ) 细胞周期与组织的再生 291 ( 二 ) 细胞周期与肿瘤 291 第十二章细胞分化 293 第一节细胞分化的基本概念 293 第二节胚胎细胞的分化 294 一 胚胎细胞的分化潜能与决定 294 二 细胞质的作用 295 三 核质的相互作用 296 ( 一 ) 细胞质对细胞核的作用 296 ( 二 ) 细胞核对细胞质的作用 296 四 细胞分化的遗传基础 297 第三节细胞分化的外在影响因素 297 一 胚胎诱导对细胞分化的作用 297 二 位置信息在细胞分化中的意义 298 三 激素对细胞分化的调节作用 298 四 胚胎干细胞及其他干细胞 300 第四节细胞分化的分子基础 300 一 专一蛋白质合成的细胞表型特化 300 二 细胞分化基因表达的调控 300 ( 一 ) 转录水平调控 300 ( 二 ) 翻译水平调控 301 第五节细胞分化与癌变 301

20 14 细胞生物学 一 原癌基因 302 二 抑癌基因 302 第十三章细胞的衰老与死亡 304 第一节细胞的衰老 304 一 细胞衰老的概念与特征 304 ( 一 ) 细胞衰老的概念 304 ( 二 ) 细胞衰老的特征 305 二 细胞衰老学说 306 ( 一 ) 自由基理论 306 ( 二 ) 神经免疫网络论 306 ( 三 ) 遗传程序论 307 ( 四 ) 其他学说 308 第二节细胞的死亡 309 一 细胞死亡的标志 309 二 细胞死亡的机制 309 ( 一 ) 细胞凋亡与细胞坏死 309 ( 二 ) 细胞凋亡与细胞坏死的比较 310 ( 三 ) 凋亡细胞的特征 312 三 细胞凋亡的分子机制 316 ( 一 ) 诱导细胞凋亡的因素 316 ( 二 ) 与细胞凋亡相关的基因 316 ( 三 ) 细胞凋亡的分子机制 318 四 细胞凋亡与医学的关系 319 ( 一 ) 细胞凋亡与机体发育 319 ( 二 ) 细胞凋亡与疾病 319 第十四章干细胞 321 第一节干细胞生物学 321 一 干细胞的分类 322 ( 一 ) 根据发生学来源分类 322 ( 二 ) 根据分化潜能分类 322 二 干细胞的形态和生化特征 323 三 干细胞的增殖特征 323 ( 一 ) 干细胞增殖的缓慢性 323 ( 二 ) 干细胞增殖系统的自稳定性 324 四 干细胞的分化特征 325 ( 一 ) 干细胞的分化潜能 325 ( 二 ) 干细胞的转分化和去分化 325

21 目录 15 五 干细胞增殖与分化的微环境 326 ( 一 ) 分泌因子 326 ( 二 ) 受体介导的细胞间相互作用 326 ( 三 ) 整合素和细胞外基质 327 第二节胚胎干细胞 327 一 人胚胎干细胞的获得与胚胎干细胞系的建立 327 二 胚胎干细胞的主要特征 328 ( 一 ) 胚胎干细胞的形态和生化特征 328 ( 二 ) 胚胎干细胞的分化潜能 329 三 胚胎干细胞生长和分化的内源性调控 330 ( 一 ) 细胞内蛋白的调控 330 ( 二 ) 转录因子的调控 330 ( 三 ) 时钟 因子 330 四 胚胎干细胞的应用前景及面临的伦理学挑战 331 ( 一 ) 胚胎干细胞可用于个体器官克隆 331 ( 二 ) 胚胎干细胞是功能基因组学研究的工具 331 ( 三 ) 胚胎干细胞是发育生物学研究的理想体外模型 332 ( 四 ) 应用胚胎干细胞指导药物的研制和应用 332 第三节精原干细胞 332 一 精原细胞的增殖和干细胞的再生 332 二 精原细胞的分化及其控制 334 三 精原细胞的凋亡 334 ( 一 )Bcl 2 家族 335 ( 二 ) p53 蛋白 335 第四节成体干细胞 335 一 造血干细胞 336 二 间充质干细胞 338 三 神经干细胞 339 四 表皮干细胞 340 五 肠干细胞 342 六 肝干细胞 342 第十五章细胞工程 343 第一节细胞融合 343 一 细胞融合技术 343 二 融合细胞的筛选 344 ( 一 ) 由抗药性细胞组成的杂种细胞的筛选 344 ( 二 ) 由营养缺陷变异型细胞组成的杂种的选择 345

22 16 细胞生物学 ( 三 ) 由温度敏感突变型细胞组成的杂种的筛选 345 第二节 B 细胞杂交瘤和单克隆抗体 346 一 B 淋巴细胞杂交瘤技术 347 ( 一 ) 细胞融合杂交瘤技术制备 McAb 的基本原理 347 ( 二 )B 淋巴细胞免疫 347 ( 三 ) 小鼠骨髓瘤细胞 347 ( 四 ) 细胞融合 348 ( 五 ) 杂交瘤细胞的筛选和克隆化 348 二 单克隆抗体的应用 348 ( 一 ) 在临床诊断中的应用 349 ( 二 ) 在疾病治疗上的应用 349 ( 三 ) 在生物工程和生化工程中的应用 350 ( 四 ) 在理论研究上的应用 350 第三节 DNA 和染色体介导的基因转移 351 一 DNA 介导的基因转移 351 ( 一 ) 显微注射法 351 ( 二 ) 磷酸钙共沉淀法 351 ( 三 ) 载体携带法 352 二 染色体介导的基因转移 352 ( 一 ) 染色体直接转移技术 352 ( 二 ) 微细胞技术 353 三 基因转移细胞的筛选 353 四 基因转移技术的应用 353 第四节 干细胞工程 355 一 干细胞的培养建系和基本特性 355 ( 一 )ES 和 EG 细胞培养建系 355 ( 二 ) 形态学特征和细胞的标志分子 356 ( 三 ) 发育全能性和分化潜能 356 二 ES/EG 细胞体外诱导分化 357 ( 一 ) 基本原理 357 ( 二 )ES 细胞和 EG 细胞定向诱导分化 358 ( 三 )ES 细胞体外可能被诱导分化的几种细胞 358 第五节 转基因动物 360 一 概述 360 二 基本原理 361 三 基本方法 361 ( 一 ) 显微注射法 361

23 目录 17 ( 二 )DNA 导入胚胎干细胞 362 ( 三 ) 逆转录病毒感染法 362 ( 四 ) 精子载体法 362 ( 五 ) 转基因动物中外源 DNA 的检测 363 第六节蛋白质工程 363 一 概述 363 ( 一 ) 蛋白质分子的结构分析 363 ( 二 ) 蛋白质的结构预测 364 ( 三 ) 基因工程 364 ( 四 ) 蛋白质纯化 功能和结构分析 364 二 蛋白质分子设计及改造 364 ( 一 ) 改造蛋白质分子中的几个氨基酸残基 366 ( 二 ) 替换蛋白质中一个肽段或者一个特定的结构域 368 ( 三 ) 蛋白质从头设计 368 三 胰岛素蛋白质工程 368 第七节细胞工程在医学中的应用 370 一 医用蛋白质 370 ( 一 ) 医用抗体 370 ( 二 ) 组织型纤溶酶原激活因子 371 ( 三 ) 水蛭素 371 ( 四 ) 生长激素 371 二 基因工程动物的应用 371 ( 一 ) 转基因动物用于生物医学基础研究 372 ( 二 ) 转基因动物用作人类疾病及基因治疗的实验模型 372 ( 三 ) 转基因动物作为生物反应器生产药用蛋白 374 三 组织工程 375 ( 一 ) 组织工程化皮肤 376 ( 二 ) 组织工程化骨骼 376 ( 三 ) 骨髓与组织工程 376 四 细胞治疗 377 ( 一 ) 概述 377 ( 二 ) 细胞治疗的临床应用 377 附录一英汉名词对照 379 附录二汉英名词对照 393 主要参考文献 407

24 第八章 线 粒 体 １８３ 第八章 线 粒 体 线粒体 ｍ 是一种基本的重要的细胞器 线粒体是活细胞生物氧化产生能 量的场所 它是细胞的能量转换器 三羧酸循环 电子传递及氧化磷酸化均在线粒体进行 故将它比作为细胞的 动力工厂 另外 线粒体有自身独特的遗传系统 但线粒体的基因 组数量有限 因此它是一种半自主性的细胞器 ｍ ｍ 图８ １ 图８ １ 线粒体结构及功能示意图 引自 Ａ １９９８ 线粒体存在于绝大多数的细胞内 不仅存在于多细胞生物 包括动物与植物 的细胞 内 而且在单细胞生物的细胞内 包括大多数的原生动物 藻类 酵母菌等细胞内均可观察 到线粒体 只有在细菌及某些厌氧的原生生物细胞内观察不到典型的线粒体结构 虽然曾报 道过有所谓细菌线粒体的存在 但并没有被进一步证实 总之 进行有氧呼吸的酵母 原生 动物和高等动植物细胞都有线粒体 但很多哺乳动物的成熟红细胞却是例外 它们的线粒体 是在红细胞发育成熟的过程中逐渐退化消失了 对线粒体的研究至今已有１５０多年的历史 大致可分为以下几个阶段 １ 早期 细胞学研究 早在１８５０年 在光学显微镜下就已观察到在不同的动物细胞

25 １８４ 细胞生物学 类型中有小颗粒结构存在 １８９０ 年 德国人 Ａ ｍ 进行了较系统的研究 并将其命名为 生命小体 他认为这种颗粒与细菌很相似 可能是共生于细胞内能独立自主生活 的细菌 这也是线粒体 内共生假说 理论的起源 １８９８ 年 Ｂ 在用光镜观察动物细胞 时 首次 将 这 种 颗 粒 命 名 为 线 粒 体 ｍ 此 词 来 源 于 希 腊 字 ｍ 线 和 颗粒 １９０４年 Ｍ 在植物细胞中也发现了线粒体 与此同时 建立了对线 粒体化学染色的鉴定方法 １９００年 Ｍ 用詹纳斯绿 Ｂ Ｊ Ｂ 对线粒体进行活 体染色 证明了线粒体可进行氧化还原反应 在这一时期 已能辨认出线粒体是普遍存在 的 具有一定结构的细胞器 但对其功能的了解仅仅是个开始 ２ 中期 确定为能量代谢的中心 １９２５ 年 Ｋ 报道了对需氧细菌中细胞色素系 统内容的重要研究 他证实了呼吸作用中细胞色素 的存在 辨认了它们在氧化还原 反应中的作用序列 １９３４ 年 Ｂ 曾尝试分离肝线粒体 但未能成功 １９４８ 与 Ｈ 年 Ｈ ｍ 等人成功地建立了用分布离心法分离线粒体 同时报道了肝肾中分离得到线 粒体的成果 这一技术的出现 对线粒体的生化功能研究起了很大的作用 促进了对线粒体 脂肪酸氧化 三羧酸循环 电子传递链和氧化磷酸化方面的研究 约在 ５０ 年代 已初步建 立了线粒体是能量代谢中心的结论 在这一阶段有两个重要的发现 一是叙述了三羧酸循环 反应 二是证实三羧酸循环的中氧化是和产生大量的 ＡＴＰ 偶联的 ３ 后期 线粒体的精细结构和遗传学研究 １９５２ 年 １９５３ 年 美国 Ｐ 和瑞典 Ｓ 各自利用电镜超薄技术观察到线粒体的精细结构 推进了对线粒体内外膜组成结构 ｊ 及其功能的研究 从此 线粒体结构和功能的研究进入一个新的阶段 即运用电镜和生物化 学结合的方法 深入展开对线粒体呼吸链氧化磷酸化基本结构和功能单位的研究 同时 有 关氧化磷酸化机理的研究也蓬勃开展起来 １９６３ 年 １９６４ 年 确定了线粒体中存在 ＤＮＡ 此后 发现还具有 ＤＮＡ 聚合酶 ＲＮＡ 聚合酶 核糖体及氨基酸活化酶等这些进行自我繁殖 所需的基本成分 说明线粒体是包含 ＤＮＡ 转录和翻译系统 具有一定自主性的细胞器 这 一发现不仅对线粒体本身 而且对整个生物学也是一个重大的突破 在此基础上 自 ７０ 年 代以来 关于线粒体自主性和生物发生的研究非常活跃 由于对一个细胞包含两套相对独立 的遗传系统的生物学意义的注意和重视 使得与此相关的线粒体起源的研究如 Ａ ｍ 的 内共生假说 重新活跃起来 从而刺激了关于真核细胞的起源 原核细胞和真核细胞亲缘 关系的讨论和研究 近年来 随着电镜技术 冰冻蚀刻方法 生化方法 分子遗传方法 分子生物学特别是 生物膜分子水平研究的提高 使得线粒体结构和功能的研究 在细胞和分子等各个层次水平 上不断深入和发展 第一节 线粒体的一般性状 关于线粒体的形状 大小 数量及排列分布 在不同细胞变动很大 就是同一细胞在不 同生理状态下也不一样 所以线粒体一直被认为是超微结构上病理检查较好的指标之一 图８ ２

26 第八章 线 粒 体 １８５ 一 线粒体的形状 线粒体通常呈圆形 卵圆形 杆状或丝状 以 卵圆形者居多 同类细胞的线粒体形状常保持一定 的稳定性 但也会因生理机能 营养状况及所在部 位的不同而有明显变化 如小肠吸收细胞核上区线 粒体呈细丝状 基部及周边则多为颗粒状 不同细 胞的线粒体则差异更大 如肝细胞和脂肪细胞的线 粒体多为球状 肾小管上皮细胞及成纤维细胞的线 粒体多呈杆状或丝状 生精细胞的线粒体则呈环 形 偶见异型线粒体 二 线粒体的大小 线粒体横径一般为 ０ １ １μｍ 长度不一 一 图８ ２ 线粒体的超微结构 Ｃ Ｄ Ｇ Ｐ 般长１ ２μｍ 有的可达 ７μｍ 骨骼肌的可长达 １０μｍ 成纤维细胞内偶见巨型线粒体 在 胰腺外分泌细胞中可长达１０ ２０μｍ 称巨线粒体 病毒性肝炎 肝癌 妊娠期黄疸 硬皮 病 钩端螺旋体病患者的肝细胞内 则可出现异常膨大的巨型线粒体 三 线粒体的数量 各种细胞的线粒体数量不等 一般是分化低 代谢迟缓 功能静止及衰退细胞的线粒体 数较少 分化高 代谢旺盛 功能活跃细胞的线粒体多 如脊髓前角神经元 心肌细胞 骨 骼肌细胞 肝细胞 胃底腺壁细胞 肾近曲小管上皮细胞等的线粒体多 结构也较复杂 据 统计肝细胞约有１０００ ２０００个线粒体 成纤维细胞 胰腺细胞 甲状腺滤泡细胞等线粒体 的数量中等 未分化细胞 表皮细胞 淋巴细胞 纤维细胞 平滑肌细胞等的线粒体少 结 构也较简单 有的肿瘤细胞线粒体少 很可能与细胞氧化活动减弱及糖酵解增强有关 有的 肿瘤细胞线粒体增多 可能是线粒体代偿性增生的结果 有的细胞因功能状态不同 其线粒 体数量有显著变化 如子宫平滑肌细胞通常含线粒体较少 但在妊娠期 细胞的线粒体数激 增 体积也相应增大 甲状腺功能亢进时滤泡上皮细胞线粒体数较正常者增多 四 线粒体的分布 线粒体大多均匀分布在细胞内 具有明显极性的细胞如胰腺细胞 肠上皮吸收细胞 肾 小管上皮细胞等 其线粒体长轴大多与细胞的长轴一致 而无极性的圆形细胞如白细胞 其 线粒体多辐射排列在中心粒外周 但某些细胞的线粒体分布与细胞的能量需求有一定关系 如骨骼肌及心肌细胞的线粒体沿肌原纤维周围分布 尤其多位于 Ｚ 线处 视杆与视锥细胞 的线粒体多位于内节远端 这与外节光感的供能有关 精子的线粒体位于尾部中段 近曲小 管上皮细胞的线粒体常纵列于基底褶间 总之 线粒体常与细胞的功能相关 经常处于动态 的变化之中 它可伸展收缩 可扭曲蠕动 可分裂或局部出芽增生 也可融合增大 具有明

27 １８６ 细胞生物学 显的可变性和可塑性 线粒体在细胞质体积中占有相当比例 如肝细胞中的线粒体占细胞质体积的 ２０ 肌 细胞中的线粒体则占５０ 第二节 线粒体的生物学特性 一 线粒体的超微结构 线粒体的结构造型很特殊 在电镜下 可以观察到 线粒体具有基本相同的结构 它是由两层单位膜构成的 封闭的囊状结构 主要 有 内 膜 外 膜 膜 间 隙 和 基 质 内室 四个功能区隔 一 外膜 ｍｍ 指线粒体最外层所包绕的一层全封闭的生物膜 表 面平滑而有弹性 较质膜薄 厚约６ｍ 化学组成多为 结构蛋白和类脂 磷脂的主要种类是卵磷脂 膜中仅有 图８ ３ 线粒体的模式图 少数酶蛋白 其中含有特殊的单胺氧化酶 可以催化各种胺类氧化物 因此将其作为外膜的 标志酶 用磷钨酸媒染时 发现外膜上有排列整齐的圆柱体 在两个圆柱体之间有小孔 孔 径为２ ３ｍ 允许分子量为１０ｋＤ 以下的分子通过它进入膜间隙 二 内膜 ｍｍ 指外膜内一层平行的单位膜 内膜较外膜稍厚 厚约７ｍ 内膜的通透性很低 一般不 允许离子和大多数带电的小分子通过 这样可建立 Ｈ 浓度梯度 驱动 ＡＴＰ 的合成 为其 行使正常的功能提供了保证 内膜的蛋白与脂的含量相当高 并且含有大量的心磷脂 约占磷脂含量的２０ 这正是其通透性低的结构基础 内膜的标志酶是细胞色素 氧化酶 内膜向内室折叠 形成大小及形状不一的线粒体嵴 ｍ 嵴的形成使 得线粒体内膜的表面积大大增加 嵴多为隔板状 与线粒体长轴垂直 隔板的长短则与细胞 的类型有关 嵴膜折叠层中的间隙称嵴内间隙或嵴内腔 嵴内间隙与膜 间隙相通 二者合称外室 ｍ 有时嵴内间隙可膨胀 而膜间隙则不改变 生物的种间差异和细胞性质的差别可由线粒体嵴的排列形式反映出来 线粒体嵴的排列 形式主要有两种 一种是板层状嵴 高等动物绝大部分细胞的线粒体嵴为这种排列形式 板 层的方向一般与线粒体的长轴垂直 也有的与长轴平行 另一种是小管状嵴 原生动物和一 些比较低等动物的线粒体嵴为这种排列形式 在人类这种类型的线粒体嵴可见于分泌固醇类 激素的细胞 如肾上腺皮质细胞 黄体细胞等 有些细胞的线粒体嵴两型都有 而以一种为 主 如肝细胞以板层为主 偶有小管状

28 第八章 线 粒 体 １８７ 嵴的长度也不一样 肝细胞线粒体嵴较长 伸至线粒体的中央处 肌细胞线粒体嵴延伸 更长 甚至达到对侧内膜 嵴的数目则与细胞的氧化代谢率成正比 癌细胞的线粒体嵴不发 达 可能与细胞的糖酵解作用超过呼吸作用有关 嵴的形状也因细胞的生理状态不同而异 嵴膜是一种变异的生物膜 其组成成分也不相同 内膜内表面有钮扣状的重复单位 以细颈附着于内膜的内面 称内膜亚单位 ｍｍ 或称内膜基粒 重复单位 三分体型基本粒子 ＡＴＰ 酶复合体等 用 电镜负染色法可显示明显的图像 这些颗粒又称基质颗粒 ｍ 或致密颗粒 直径约２０ ６０ｍ 最大可达１２０ｍ 其数目及大小随细胞种类与机能状态 而异 在肝细胞 胰腺细胞 小肠上皮细胞及白细胞等的线粒体基质颗粒较多 在转运水分 子及离子的肾小管上皮细胞则更多 成骨细胞合成间质活跃时 线粒体基质颗粒增多 骨再 生时破骨细胞的线粒体基质颗粒很显著 心肌细胞线粒体内则较少见 基质颗粒中含有 ２ 等二价阳离子 可能以磷酸盐形式存在 某些细 Ｃ２ Ｍ２ Ｍ２ Ｚ２ Ｂ２ Ｓ 胞出现病理性钙化时 基质颗粒增大并导致线粒体破裂 在该处出现结晶 所以有人认为基 质颗粒可调节线粒体内部离子环境 并与病理性钙化有关 三 膜间隙 ｍｍ 是内外膜之间的腔隙 延伸至嵴的轴心部 腔隙宽约 ６ ８ｍ 由于外膜具有大量亲水 孔道与细胞质相通 因此膜间隙的 Ｈ 值与细胞质的相似 标志酶为腺苷酸激酶 四 基质 ｍ ｘ 为内膜和嵴包围的空间 除糖酵解在细胞质中进行外 其他的生物氧化过程都在线粒体 中进行 催化三羧酸循环 脂肪酸和丙酮酸氧化的酶类均位于基质中 其标志酶为苹果酸脱 氢酶 基质具有一套完整的转录和翻译体系 包括线粒体 ＤＮＡ ｍｄｎａ ７０Ｓ 型核糖体 ＲＮＡ ＲＮＡ ＤＮＡ 聚合酶 氨基酸活化酶等 基质中还含有纤维丝和电子密度很大的致密颗粒状物质 内含 Ｃ２ Ｍ２ Ｚ２ 等离 子 二 线粒体的化学组成 一 化学组成 线粒体中脂类含量只占干重的２５ ３０ 其中磷脂占 ９０ 左右 以卵磷脂 磷脂酰 胆碱 磷脂酰乙醇胺为主 胆固醇约５ 还有一些游离脂肪酸及甘油三酯等 蛋白质含量占线粒体干重的６５ ７０ 在线粒体中 各组成部分的分布有很大差异 以大鼠肝线粒体为例 内膜的蛋白质含量为整个线粒体蛋白质含量的 ２１ ３ 外膜含量为 ４ 基质含量为６７ 线粒体的蛋白质可分为两类 可溶性和不可溶性 可溶性蛋白质大 多数是基质中的酶和一定数量的外周膜蛋白 不可溶性蛋白一般是构成膜的必要组成部分

29 １８８ 细胞生物学 有的是结构蛋白 有的是酶蛋白 线粒体的内 外膜根本区别在于脂类及蛋白质的比例不同 在外膜中所含胆固醇及磷脂都 比内膜高 外膜含有５ ２ 的脂类和４ ８ 的蛋白质 内膜含有２ ４ 的脂类和７ ６ 的蛋白质 二 线粒体中酶的定位 线粒体中已分离出１２０多种酶 组成几十种不同的酶系 如三羧酸循环酶系 脂肪酸氧 化酶系和氧化磷酸化酶系等 每个酶系至少有２０００个重复套 规则地排列在线粒体的不同 部位 由于分离方法的不断改进 可将线粒体外膜 外室 内膜和内室分离 因此对酶的分 布有了较清楚的定位 列表如下 表８ １ 线粒体中酶的定位 外膜 内膜 膜间隙 基质 细胞色素氧化酶 腺苷酸激酶 ＡＴＰ合成酶 二磷酸激酶 柠檬酸合成酶 苹果酸 脱氢酶 延胡索酸酶 异 柠檬酸脱氢酶 顺乌头酸 酶 谷氨酸脱氢酶 犬尿酸羟化酶 琥珀酸合成酶 核苷酸激酶 酰基辅酶 Ａ 合成酶 羟丁酸脱氢酶 β 单胺氧化酶 ＮＡＤＨ细 胞 色 素 Ｃ 还 原酶 对鱼藤酮不敏感 脂肪酸氧化酶系 天冬 氨酸转氨酶 蛋白质和核 酸合成酶系 丙酮酸脱氢 酶复合物 肉毒碱酰基转移酶 丙酮酸氧化酶 ＮＡＤＨ 脱氢酶 第三节 线粒体基因组 １９６３ 年 Ｍ 和 Ｓ Ｎ 发现线粒体 ＤＮＡ ｍｄｎａ 后 人们又在线粒体中发现了 ＲＮＡ ＤＮＡ 聚合酶 ＲＮＡ 聚合酶 ＲＮＡ 核糖体 氨基酸活化酶等进行 ＤＮＡ 复制 转录和蛋白 质翻译的全套装备 说明线粒体具有独立的遗传体系 虽然线粒体也能合成蛋白质 但是合成能力有限 线粒体含有的 １０００ 多种蛋白质中 自身合成的仅十余种 线粒体的核糖体蛋白 氨酰ＲＮＡ 合成酶 许多结构蛋白 都是由核 基因编码 在细胞质中合成后定向转运到线粒体的 因此称线粒体为半自主性的细胞器 线粒体是细胞中除核之外唯一含有 ＤＮＡ 的细胞器 而部分遗传密码与核密码不同 具 有原核细胞基因特点 线粒体的基因组只有一条 ＤＮＡ 称为线粒体 ＤＮＡ ｍｄｎａ 它主 要编码线粒体的ＲＮＡ ＲＮＡ 及一些线粒体蛋白质 如电子传递链酶复合体中的亚基

30 第八章 线 粒 体 １８９ 一 线粒体基因组 线粒体基因组的全序列测定已经完成 线粒体基因组序列 又称剑桥序列 共含 １６５６９ 个碱基对 为一条双链环状的 ＤＮＡ 双链中一条为重链 Ｈ 一条为轻链 Ｌ 这 是根据它们的转录本在 ＣＣＬ 中密度的不同而区分的 重链和轻链上的编码产物各不相同 利用标记氨基酸培养细胞 用氯霉素和放线菌酮分别抑制线粒体和细胞质蛋白质合成的方 法 测得人类线粒体基因组共编码了两种 ＲＮＡ 分子 用于构成线粒体的核糖体 ２２ 种 ＲＮＡ 分子 用于线粒体 ｍｒｎａ 的翻译 另外 １３ 个序列都以 ＡＴＧ 甲硫氨酸 为起始密 码 并有终止密码结构 长度均超过可编码５０ 个氨基酸多肽所必需的长度 为编码蛋白质 的基因 由这１３个基因编码的蛋白质均已确定 其中 ３ 个为构成细胞色素 Ｃ 氧化酶 ｍｃｘ ＣＯＸ 复合体催化活性中心的亚单位 这三个亚基与细胞色素 Ｃ 氧化酶 是相似的 其序列是高度保守的 还有 ２ 个为 ＡＴＰ 酶复合体 Ｆ０ 部分的 ２ 个亚基 ７ 个为 ＮＡＤＨＣＱ 还原酶复合体的亚基 还有 １ 个编码的蛋白质为 ＣＨ２细胞色素 Ｃ 还原酶复合 体中细胞色素 的亚基 图８ ４ 图８ ４ 人类线粒体基因组编码图 引自 Ｌ １９９９ 二 人类线粒体基因组的特点 人类线粒体基因组具有下列特点 １ 人类线粒体的基因排列得非常紧凑 除与 ｍ ＤＮＡ 复制及转录有关的一小段区域外 无

31 １９０ 细胞生物学 内含子序列 在３ ７个基因之间 基因间隔区总共只有８ ７ ５ 有 只占 ＤＮＡ 总长度的的０ 些基因之间没有间隔 有些基因有重叠 即前一个基因的最后一段碱基与下一个基因的第一段 碱基相衔接 因此 ｍ ＤＮＡ 的任何突变都会累及到基因组中一个重要功能区域 为高效利用 ２ ｍｄｎａ ＤＮＡ 有５个阅读框架 缺少终止密码子 ３ ｍｄｎａ 的突变率高于核中 ＤＮＡ 并且缺乏修复能力 ４ ｍｄｎａ 为母系遗传 ５ 部分 ｍｄｎａ 的密码子不同于核内 ＤＮＡ 的密码子 三 线粒体基因组与核基因组比较 遗传密码是在长期进化中形成并保持不变的 因此细胞核内所列的密码是一种通用密码 但是真核生物线粒体的密码却有若干处不同于通用密码 以人类线粒体为例 ① ＵＧＡ 不是终 止密码子 而是色氨酸的密码子 ② ＡＧＡ ＡＧＧ 不是精氨酸的密码子而是终止密码子 这样 加上通用密码中的 ＵＡＡ 和 ＵＡＧ 线粒体共有４个终止密码子 ③ 线粒体基因组序列内部甲硫 氨酸密码子有２个 即 ＡＵＧ 和 ＡＵＡ 起始甲硫氨酸密码子有４个 即 ＡＵＮ 线粒体在形态 染色反应 化学组成 物理性质 活动状态及遗传体系等方面 都很像 细菌 所以人们推测线粒体起源于内共生 按照这种观点 需氧细菌被原始真核细胞吞噬以 后 有可能在长期互利共生中演化形成了现在的线粒体 在进化过程中需氧细菌逐步丧失了 独立性 并将大量遗传信息转移到了宿主细胞中 形成了线粒体的半自主性 线粒体遗传体系确实具有许多和细菌相似的特征 如 ① ＤＮＡ 为环形分子 无内含 子 ② 核糖体为７０Ｓ型 ③ ＲＮＡ 聚合酶被溴化乙锭抑制而不被放线菌素 Ｄ 所抑制 ④Ｒ ＮＡ 氨基酰 ＲＮＡ 合成酶不同于细胞质中的相应成分 ⑤ 蛋白质合成的起始氨基酰ＲＮＡ 是 Ｎ甲酰甲硫氨酰ＲＮＡ 对细菌蛋白质合成抑制剂氯霉素敏感而对细胞质蛋白合成抑制剂 放线菌酮不敏感 第四节 核编码蛋白质的线粒体转运 线粒体的蛋白合成能力有限 大量线粒体蛋白在细胞质中合成 定向转运到线粒体 这 些蛋白质在运输以前 以未折叠的前体形式存在 与之结合的分子伴侣 属 ７０ 家族 保 持前体蛋白质处于非折叠状态 通常前体蛋白 Ｎ 端有一段信号序列称为导肽 前导肽或转 运肽 或 完成转运后被信号肽酶 ｑ ｑ 切除 就成为成熟蛋白 这种现象就叫做后转译 ５ 图８ 线粒体前体蛋白信号序列的特点是 ① 多位于肽链的 Ｎ 端 由大约 ２０ 个氨基酸构成 ②没有带负电荷的氨基酸 形成一个两性α螺旋 带正电荷的氨基酸残基和不带电荷的疏水 氨基酸残基分别位于螺旋的两侧 现在认为这个螺旋与转位因子的识别有关 ③ 对所牵引 的蛋白质没有特异性要求 非线粒体蛋白连接上此类信号序列 也会被转运到线粒体 此外 有些信号序列位于蛋白质内部 完成转运后不被切除 还有些信号序列位于前体蛋白 Ｃ 端 如线粒体的 ＤＮＡ 解旋酶 ｍ

32 第八章 线 图８ ５ 线粒体蛋白质的定向转运 Ｍ Ｂ Ｃ ４ ２００２ 表８ ２ 线粒体蛋白分选信号 信号序列 定位 转运装置 位 于 Ｎ 端 富 含带正电荷的和疏 水的氨基酸 形成 两性α螺旋 完成 转运后被切除 基质 ＴＯＭ ＴＩＭ２３ 含疏水性的停止 转移序列 被安插 到外膜 完成转运 后不被切除 含疏水性的停止 转移序列 被安插 到内膜 完成转运 后被切除 外膜 内膜 ＴＯＭ ＴＯＭ ＴＩＭ２３ 内膜 含两个信号序 列 首先转运到基 质 第一个信号序 膜间隙 列被切除 第二个 信号序列引导蛋白 进入内膜或膜间隙 结构类似于 Ｎ 端信号序列 但位 于蛋白质内部 内膜 为线粒体代谢物 的转运蛋白 如腺 苷转位酶 具有多 个内部信号序列和 停止转移序列 形 成多次跨膜蛋白 内膜 ＴＯＭ ＴＩＭ２３ ＴＯＭ ＴＩＭ２３ ＴＯＭ ＴＩＭ２２ 注 根据 Ｎ Ｐ Ａ Ｇ ２００１改编 信号序列位置 粒 体 １９１

33 １９２ 细胞生物学 蛋白质的转运涉及多种蛋白复合体 即转位因子 它是由两部 分构 成 的 受 体 和 蛋 白 质 通 过 的 孔 道 主要包括 ① ＴＯＭ 复合体 负责转运 蛋白通过外膜 进入膜间隙 在酵母中 ＴＯＭ７０负责转运内部具有信号序列的蛋 白 ＴＯＭ２０ 负责转运 Ｎ 端具有信号序 列的蛋白 这两种蛋白的功能都相当于 内质网上的 ＳＰＲ 受体 在人类线粒体中 Ｔｍ３４ 的 功 能 与 ＴＯＭ７０ 相 当 ＴＯＭ 复合 体 的 通 道 被 称 为 ＧＩＰ ｍ 就相当于内质网上的 ＳＥＣ６１ 复合 体 主 要 由 Ｔｍ４０ 构 成 还 包 括 Ｔｍ２２ Ｔｍ７ Ｔｍ６ 和 Ｔｍ５ ②ＴＩＭ 复合体 其中 ＴＩＭ２３负责将蛋白质转运 到基质 也可将某些蛋白质安插在内膜 ＴＩＭ２２负责将线粒体的代谢物运输蛋白 如 ＡＤＰ ＡＴＰ 和磷酸的转运蛋白 插入 图８ ６ 线粒体的蛋白转运装置ＴＯＭ 和 ＴＩＭ 复合体 引自Ｊ ｍｒ ｗ Ｎ ｋ Ｐ ２０００ 内膜 ③ ＯＸＡ 复 合 体 负 责 将 线 粒 体 自身合成的蛋白质插到内膜上 同样也可使经由 ＴＯＭ ＴＩＭ 复合体进入基质的蛋白质插入 内膜 图８ ６ 线粒体具有四个功能区隔 即外膜 内膜 膜间隙 基质 进入不同部位的蛋白具有不 同的转运途径 进入外膜的蛋白具有不被切除的 Ｎ 端信号序列 其后还有疏水性序列作为停止转移序 列 然后蛋白质被 ＴＯＭ 复合体安装到外膜上 如线粒体的各类孔蛋白 进入基质的蛋白质可以先通过 ＴＯＭ 复合体进入膜间隙 然后通过 ＴＩＭ 复合体进入基质 也可以通过线粒体内 外膜间的接触点 鼠肝细胞直径１μｍ 线粒体上约１ １ ５个接触点 一步进 入基质 在接触点上 ＴＯＭ 与 ＴＩＭ 协同作用完成蛋白质向基质的输入 图８ ７ 进入线粒体内膜和膜间隙的蛋白具有以下几种情况 ① 蛋白 Ｎ 端具有两个信号序列 首先被运送到基质 然后 Ｎ 端信号肽被切除 暴露出导向内膜的信号序列 在 ＯＸＡ 的帮助 下插入内膜 如果第二段信号序列被内膜外表面的异二聚体内膜蛋白酶 ｍ ｍｍ Ｉｍ １ Ｉｍ ２ 切除 则成为膜间隙蛋白 ② Ｎ 端信号序列的后面有一 段疏水序列 扮演停止转移序列的角色 能与 ＴＩＭ２３ 复合体结合 当进入基质的信号序列 被切除后 脱离转位因子复合体而进入内膜 如果插入膜中的部分又被酶切除 则成为定位 于膜间隙的蛋白 ③ 线粒体内膜上负责代谢底物 产物转运的蛋白 如腺苷转位酶是多次跨 膜蛋白 其 Ｎ 端没有可被切除的信号序列 但包含 ３ ６ 个内部信号序列 可被 ＴＩＭ２２ 复 合体插到内膜上 图８ ８

34 第八章 线 粒 体 １９３ 图８ ７ 线粒体内外膜的接触点 图８ ８ 蛋白质进入内膜和膜间隙 Ｍ Ｂ Ｃ ４ ２００２ Ａ 进入内膜和膜间隙的前体蛋白具有两个信号序列 经 ＴＯＭ ＴＩＭ２３ 进入基质后 第二个信 号序列使蛋白通过 ＯＸＡ 复合体被安插到内膜上 Ｂ 进入内膜和膜间隙的前体蛋白信号序列后具有 停止转移序列 被 ＴＩＭ２３安插在膜上 Ｃ 通过途径 Ａ Ｂ插入内膜的蛋白 被位于内膜的蛋白酶 加工 成为膜间隙的可溶性蛋白 Ｄ 线粒体代谢物的转运器为多次跨膜蛋白 被 ＴＩＭ２２ 安插到内 膜中 蛋白质的输入是一个耗能的过程 能量的来源为水解 ＡＴＰ 和利用质子动力势能 能量 消耗在线粒体外和进入线粒体基质两步上 在线粒体外去除与前体蛋白质结合的分子伴侣

35 １９４ 细胞生物学 需要通过水解 ＡＴＰ 获得能量 在通过 ＴＩＭ 复合体进入基质时利用质子动力势能作为动力 虽然还不清楚质子动力势能是如何被利用的 但解偶连剂如 ＤＮＰ 能抑制蛋白质的转运 前 体蛋白进入线粒体基质后 线粒体 ７０一个接一个的结合在蛋白质线性分子上 像齿轮一 样将蛋白质 铰进 基质 这一过程也需要消耗 ＡＴＰ 然后线粒体 ７０ 将蛋白质交给 ６０ 完成折叠 第五节 线粒体的能量转化功能 线粒体是活细胞生物氧化产生能量的场所 它是细胞的能量转换器 三羧酸循环 电子 传递及氧化磷酸化均在线粒体进行 线粒体的这种特殊功能和它含有大量的内膜有关 内膜 起着两个重要的作用 第一 电子传递过程是在内膜上进行的 它可将氧化反应释放的能量 转换成细胞可利用的 ＡＴＰ 第二 封闭的内室含有许多酶 可以催化各种细胞化学反应 没有线粒体的动物细胞则依赖无氧糖酵解制造 ＡＴＰ １个葡萄糖分子通过无氧糖酵解只能产 生２个分子 ＡＴＰ 而经过线粒体有氧氧化形成 ＣＯ２ 及 Ｈ２Ｏ 可产生 ３６ 分子或 ３８ 个分子 ＡＴＰ 所以线粒体是细胞的高效率产能细胞器 人体组织的能量主要来源于糖的分解代谢 其主要的代谢途径有四条 ① 在无氧条件 下 葡萄糖经无氧酵解生成乳酸 同时释放少量的能量 称为糖酵解或糖的无氧分解 ② 有氧条件下 葡萄糖彻底氧化分解成 ＣＯ２ 和 Ｈ２Ｏ 并释放大量的能量 称为糖的有氧氧化 ｘ ③ 生成磷酸戊糖的磷酸戊糖通路 ④ 生成葡萄糖醛酸的糖醛酸代谢 这四条氧化途径 各有复杂的化学反应过程 提供机体所必需的能量或其他物质 葡萄糖的 有氧氧化为糖分解代谢的主要方式 大多数组织中的葡萄糖有氧氧化分解在提供给机体能量 方面尤为重要 糖经有氧氧化生成 ＡＴＰ 是一个极其复杂的过程 大体可分为三个步骤 第一个步骤是 由葡萄糖生成丙酮酸 又称糖酵解途径 在胞液中进行 第二个步骤是在有氧条件下丙酮酸 进入线粒体 氧化脱羧生成乙酰 ＣＡ 然后 乙酰 ＣＡ 的乙酰基进入三羧酸循环 氧化生 成 ＣＯ２ 和 Ｈ２Ｏ 第三个步骤是前两个步骤形成的 ＮＡＤＨ Ｈ 成 ＦＡＤＨ２ 经呼吸链传递 氧化磷酸 化 产 生 ＡＴＰ 蛋 白 质 和 脂 肪 的 彻 底 氧 化 与 糖 不 同 的 是 只 在 第 一 步 骤 中 有 所 区 别 一 糖酵解 糖酵解分为两个阶段共１０个反应 每个分子葡萄糖经第一阶段共 ５ 个反应 消耗 ２ 分 子 ＡＴＰ 为耗能过程 第二阶段５个反应生成４分子 ＡＴＰ 为释能过程 １ 第一阶段 １ 葡萄糖的磷酸化 进入细胞内的葡萄糖首先在第６位碳上 被磷酸化生成６ 磷酸葡萄糖 ６ Ｇ ６ Ｐ 磷酸根由 ＡＴＰ 供给 这一过程不仅 活化了葡萄糖 有利于它进一步参与合成与分解代谢 同时还能使进入细胞的葡萄糖不再逸出

36 第八章 线 粒 体 １９５ 细胞 催化此反应的酶是己糖激酶 ｘ ｋ ＨＫ 己糖激酶催化的反应不可逆 反应需要 消耗能量 ＡＴＰ Ｍ２ 是反应的激活剂 它能催化葡萄糖 甘露糖 氨基葡萄糖 果糖进行不 可逆的磷酸化反应 生成相应的６ 磷酸酯 ６ 磷酸葡萄糖是 ＨＫ 的反馈抑制物 此酶是糖氧化 反应过程的限速酶 ｍ ｚ ｚ ｍ 或称关键酶 ｋ ｍ 它有同工酶Ⅰ Ⅳ型 Ⅰ Ⅱ Ⅲ型主要存在于肝外组织 其对葡萄糖 Ｋｍ 值为１ ０ ５ １ ０ ６Ｍ ２ ６ 磷酸葡萄糖的异构反应 ｍ ｚ ６ 这是由磷酸己糖异 构酶 磷 酸 葡 萄 糖 转 变 为 ６ 磷 酸 果 糖 ６ ｘ ｍ 催 化 ６ ６ Ｐ 的过程 此反应是可逆的 Ｆ ３ ６ 磷酸果糖的磷酸化 磷酸果 ６ 此反应是 ６ 糖第一位上的 Ｃ 进一步磷酸化生成 １ ６ 二磷酸果糖 磷酸根由 ＡＴＰ 供给 催化此反应的 酶是磷酸果糖激酶 １ ｋ １ ＰＦＫ１ ＰＦＫ１催化的反应是不可逆反应 它是糖的有氧氧化过程中最重要的限速酶 它也是变 构酶 柠檬酸 ＡＴＰ 等是变构抑制剂 ＡＤＰ ＡＭＰ Ｐ １ ６ 二磷酸果糖等是变构激活 剂 胰岛素可诱导它的生成 ４ １ ６ 二磷酸果糖裂解反应 １ ６ 醛缩酶 催化 二磷酸果糖生成磷酸二羟丙酮 和 磷酸甘油 １ ６ Ｄ ｘ ＤＨＡＰ ３ 醛 Ｇ 此反应是可逆的 ３ ＧＡＰ

37 １９６ 细胞生物学 ５ 磷酸二羟丙酮的异构反应 ｍ ｚ ｘ 磷酸丙糖异构 酶 ｍ 催化磷酸二羟丙酮转变为３ 磷酸甘油醛 此反应也是可逆的 到此１分子葡萄糖生成２分子３ 磷酸甘油醛 通过两次磷酸化作用消耗２分子 ＡＴＰ ２ 第二阶段 １ ３ 磷酸甘油醛氧化反应 ｘ ３ 此反应由 ３ 磷酸 甘油醛脱氢酶 磷酸甘油醛氧化脱氢并磷酸 ３ 催化３ 化 生成含有１个高能磷酸键的１ ３ 二磷酸甘油酸 １ ３ Ｂ １ ３ ＢＰＧ 本 反应脱下的氢和电子转给脱氢酶的辅酶 ＮＡＤ 生成 ＮＡＤＨ Ｈ 磷酸根来自无机磷酸 ２ １ ３ 二磷酸甘油酸的高能磷酸键转移反应 在磷酸甘油酸激酶 催化下 二磷酸甘油酸生成 磷酸甘油酸 同时 １ ３ ３ ３ Ｐ ｋ ＰＧＫ 其 Ｃ１上的高能磷酸根转移给 ＡＤＰ 生成 ＡＴＰ 这种底物氧化过程中产生的能量直接将 ＡＤＰ 磷酸化生成 ＡＴＰ 的过程 称为底物水平磷酸化 此激酶催 化的反应是可逆的

38 第八章 线 粒 体 １９７ ３ ３ 磷酸甘油酸的变位反应 在磷酸甘油酸变位酶 ｍ 催化 下３ 磷酸甘油酸 Ｃ３位上的磷酸基转变到 Ｃ２位上生成２ 磷酸甘油酸 此反应是可逆的 ４ ２ 磷酸甘油酸的脱水反应 由烯醇化酶 催化 ２ 磷酸甘油酸脱水的同时 能量重新分配 生成含高能磷酸键的磷酸烯醇式丙酮酸 ＰＥＰ 本反 应也是可逆的 ５ 磷酸烯醇式丙酮酸的磷酸转移 在丙酮酸激酶 ｋ ＰＫ 催化下 磷 酸烯醇式丙酮酸上的高能磷酸根转移至 ＡＤＰ 生成 ＡＴＰ 这是又一次底物水平上的磷酸化过 程 但此反应是不可逆的 丙酮酸激酶是糖的有氧氧化过程中的限速酶 具有变构酶性质 ＡＴＰ 是变构抑制剂 ＡＤＰ是变构激活剂 Ｍ２ 或 Ｋ 可激活丙酮酸激酶的活性 胰岛素可诱导 ＰＫ 的生成 烯 醇式丙酮酸又可自动转变成丙酮酸 总结糖的无氧酵解 在细胞液阶段的过程中 一个分子的葡萄糖或糖原中的一个葡萄糖 单位 可氧化分解产生２个分子的丙酮酸 此过程中产生的两对 ＮＡＤＨ Ｈ 由递氢体α 磷酸甘油 肌肉和神经组织细胞 或苹果酸 心肌或肝脏细胞 传递进入线粒体 再经线粒 体内氧化呼吸链的传递 最后氢与氧结合生成水 在氢的传递过程中释放的能量 其中一部 分以 ＡＴＰ 形式贮存 在整个细胞液阶段中的１０或１１步酶促反应中 在生理条件下有三步是不可逆的单向反 应 催化这三步反应的酶活性较低 是整个糖的有氧氧化过程的关键酶 其活性大小对糖的 氧化分解速度起决定性作用 在此阶段经底物水平磷酸化产生四个分子 ＡＴＰ 总而言之 经过糖酵解途径 一个分子葡萄糖可氧化分解产生２个分子丙酮酸 在此过 程中 经底物水平磷酸化可产生 ４ 个分子 ＡＴＰ 如与第一阶段葡萄糖磷酸化和磷酸果糖的 磷酸化消耗二分子 ＡＴＰ 相互抵消 每分子葡萄糖降解至丙酮酸净产生 ２ 分子 ＡＴＰ 若从糖 原开始 因开始阶段仅消耗１分子 ＡＴＰ 所以每个葡萄糖单位可净生成３分子 ＡＴＰ 葡萄糖 ２Ｐ ２ＮＡＤ ２ＡＤＰ ２丙酮酸 ２ＡＴＰ ２ＮＡＤＨ ２Ｈ ２Ｈ２Ｏ 二 三羧酸循环 丙酮酸进入三羧酸循环之前需先经过准备阶段 即转变为乙酰辅酶 Ａ 简称为乙酰 ＣＡ 其反应式为

39 １９８ 细胞生物学 催化氧化脱羧的酶是丙酮酸脱氢酶系 ｍ 此多酶复合体 包括丙酮酸脱羧酶 辅酶是 ＴＰＰ 二氢硫辛酸乙酰转移酶 辅酶是二氢硫辛酸和辅酶 Ａ 还 有二氢硫辛酸脱氢酶 辅酶是 ＦＡＤ 及存在于线粒体基质液中的 ＮＡＤ 多酶复合体形成了 紧密相连的连锁反应机构 提高了催化效率 此酶系受到很多因素的影响 反应中的产物乙 酰 ＣＡ 和 ＮＡＤＨ Ｈ 可以分别抑制酶系中的二氢硫辛酸乙酰转移酶和二氢硫辛酸脱氢酶 的活性 丙酮酸脱羧酶 ｘ ＰＤＣ 活性受 ＡＤＰ 和胰岛素的激活 受 ＡＴＰ的抑制 丙酮酸脱氢反应是糖有氧氧化中关键的不可逆反应 其重要特征是丙酮酸氧 化释放的自由能贮存在乙酰 ＣＡ 中的高能硫酯键中 并生成 ＮＡＤＨ Ｈ 乙酰 ＣＡ 随后进入由一连串反应构成的循环体系 被氧化生成 Ｈ２Ｏ 和 ＣＯ２ 由于这个 循环反应开始于乙酰 ＣＡ 与草酰乙酸 ｘ 缩合生成的含有三个羧基的柠檬酸 因此称之为三羧酸循环 ｘ 或柠檬酸循环 一 三羧酸循环过程 １ 乙酰 ＣＡ 进入三羧酸循环 乙酰 ＣＡ 具有高能硫酯键 乙酰基有足够能量与草酰乙酸 的羧基进行醛醇型缩合 首先从 ＣＨ３ＣＯ 基上除去一个 Ｈ 生成的阴离子对草酰乙酸的羰基碳 进行亲核攻击 生成柠檬酰 ＣＡ 中间体 然后高能硫酯键水解放出游离的柠檬酸 使 反应不可逆 该反应由柠檬酸合成酶 催化 由草酰乙酸和乙酰 ＣＡ 合成柠檬酸是三羧酸循环的重要调节点 柠檬酸合成酶是一个 变构酶 ＡＴＰ 是柠檬酸合成酶的变构抑制剂 此外 α 酮戊二酸 ＮＡＤＨ 能变构抑制其活 性 长链脂酰 ＣＡ 也可抑制它的活性 ＡＭＰ 可对抗 ＡＴＰ 的抑制而起激活作用 ２ 异柠檬酸形成 柠檬酸的叔醇基不易氧化 转变成异柠檬酸而使叔醇变成仲醇 就 易于氧化 此反应由顺乌头酸酶催化 为一可逆反应 ３ 第一次氧化脱羧 在异柠檬酸脱氢酶作用下 异柠檬酸的仲醇氧化成羰基 生成草 酰琥珀酸 ｘ 的中间产物 后者在同一酶表面 快速脱羧生成 α 酮戊二酸 α ２ 作为激活剂 和 此反应为 氧化脱羧 此酶需要 ｋ ＮＡＤＨ ＣＯ２ Ｍ β

40 第八章 线 粒 体 １９９ 此反应是不可逆的 是三羧酸循环中的限速步骤 ＡＤＰ 是异柠檬酸脱氢酶的激活剂 而 ＡＴＰ ＮＡＤＨ 是此酶的抑制剂 ４ 第二次氧化脱羧 在 α 酮戊二酸脱氢酶系作用下 α 酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酸 单酰 ＣＡ Ｓ ＣＡ ＮＡＤＨ Ｈ 和 ＣＯ２ 反应过程完全类似于丙酮酸脱氢酶系催化 的氧化脱羧 属于α 氧化脱羧 氧化产生的能量中一部分储存于琥珀酸单酰 ＣＡ 的高能硫 酯键中 α 酮戊二酸脱氢酶系也由三个酶 α 酮戊二酸脱羧酶 硫辛酸琥珀酰基转移酶 二氢硫 辛酸脱氢酶 和五个辅酶 ＴＰＰ 硫辛酸 ＨＳＣＡ ＮＡＤ ＦＡＤ 组成 此反应也是不可逆的 α 酮戊二酸脱氢酶复合体受 ＡＴＰ ＧＴＰ ＮＡＤＨ 和琥珀酸单酰 ＣＡ 抑制 但其不受磷酸化 去磷酸化的调控 ５ 底物磷酸化生成 ＡＴＰ 在琥珀酸硫激酶 ｋ 的作用下 琥珀酸单 酰 ＣＡ 的硫酯键水解 释放的自由能用于合成 ＧＴＰ 在细菌和高等生物可直接生成 ＡＴＰ 在哺乳动物中 先生成 ＧＴＰ 再生成 ＡＴＰ 此时 琥珀酸单酰 ＣＡ 生成琥珀酸 和辅酶 Ａ

41 ２００ 细胞生物学 ６ 琥珀酸脱氢 琥珀酸脱氢酶 催化琥珀酸 氧化 成为延胡索酸 Ｆｍ 该酶结合在线粒体内膜上 而其他三羧酸循环的酶则都是存在 线粒体基质中的 该酶含有铁硫中心和共价结合的 ＦＡＤ 来自琥珀酸的电子通过 ＦＡＤ 和铁 硫中心 然后进入电子传递链到 Ｏ２ 丙二酸是琥珀酸的类似物 是琥珀酸脱氢酶强有力的 竞争性抑制物 所以可以阻断三羧酸循环 帯 酶ＦＡＤ 琥珀酸幑幐 酶ＦＡＤＨ２ 延胡索酸 ７ 延胡索酸的水化 延胡索酸酶仅对延胡索酸的反式双键起作用 而对顺丁烯二酸 马来酸 则无催化作用 因而是高度立体特异性的 ８ 草酰乙酸再生 在苹果酸脱氢酶 ｍ 作用下 苹果酸仲醇基脱氢 氧化成羰基 生成草酰乙酸 ｘ ＮＡＤ 是脱氢酶的辅酶 接受氢成为 ＮＡＤＨ Ｈ 帯 苹果酸 ＮＡＤ 幑幐 草酸乙酸 ＮＡＤＨ Ｈ 三羧酸循环总结 图８ ９ ２ＣＨ２ＣＯＳＣＡ ６ＮＡＤ ２ＦＡＤ ２ＡＤＰ ２Ｐ ６Ｈ２Ｏ ４ＣＯ２ ６ＮＡＤＨ ２ＦＡＤＨ２ ６Ｈ ２ＨＳＣＡ ２ＡＴＰ 二 三羧酸循环的生理意义 １ 三羧酸循环是机体获取能量的主要方式 １个分子葡萄糖经无氧酵解仅净生成２个分 子 ＡＴＰ 而有氧氧化可净生成３８ 或 ３６ 个 ＡＴＰ 其中三羧酸循环生成 ２４ 个 ＡＴＰ 在一 般生理条件下 许多组织细胞皆从糖的有氧氧化获得能量 糖的有氧氧化不但释能效率高 而且逐步释能 并逐步储存于 ＡＴＰ 分子中 因此能量的利用率也很高 ２ 三羧酸循环是糖 脂肪和蛋白质三种主要有机物在体内彻底氧化的共同代谢途径 三羧酸循环的起始物乙酰辅酶 Ａ 不但是糖氧化分解产物 它也可来自脂肪的甘油 脂肪酸 和来自蛋白质的某些氨基酸代谢 因此三羧酸循环实际上是三种主要有机物在体内氧化供能 的共同通路 估计人体内２ ３的有机物是通过三羧酸循环而被分解的 ３ 三羧酸循环是体内三种主要有机物互变的联结机构 因糖和甘油在体内代谢可生成 α 酮戊二酸及草酰乙酸等三羧酸循环的中间产物 这些中间产物可以转变成为某些氨基酸 而有些氨基酸又可通过不同途径变成α 酮戊二酸和草酰乙酸 再经糖异生的途径生成糖或转 变成甘油 因此三羧酸循环不仅是三种主要的有机物分解代谢的最终共同途径 而且也是它 们互变的联络机构 三 糖有氧氧化的调节 如上所述糖有氧氧化分为两个阶段 第一阶段糖酵解途径的调节在糖酵解部分已探讨 过 下面主要讨论第二阶段丙酮酸氧化脱羧生成乙酰 ＣＡ 并进入三羧酸循环的一系列反应 的调节 丙酮酸脱氢酶复合体 柠檬酸合成酶 异柠檬酸脱氢酶和α 酮戊二酸脱氢酶复合体 是这一过程的限速酶

42 第八章 线 粒 体 ２０１ 图８ ９ 三羧酸循环 丙酮酸脱氢酶复合体受别位调节也受化学修饰调控 该酶复合体受它的催化产物 ＡＴＰ 乙酰 ＣＡ 和 ＮＡＤＨ 很强的抑制 这种别位抑制可被长链脂肪酸所增强 当进入三羧酸循环 的乙酰 ＣＡ 减少 而 ＡＭＰ 辅酶 Ａ 和 ＮＡＤ 堆积 酶复合体就被别位激活 除上述别位调 节 在脊椎动物还有第二层次的调节 即酶蛋白的化学修饰 丙酮酸脱氢酶 ＰＤＨ 含有两 个亚基 其中一个亚基上特定的一个丝氨酸残基经磷酸化后 酶活性就受抑制 脱磷酸化活 性就恢复 磷酸化脱磷酸化作用是由特异的蛋白激酶和磷酸蛋白磷酸酶分别催化的 它们 实际上也是丙酮酸酶复合体的组分 即前已述及的调节蛋白 激酶受 ＡＴＰ 别位激活 当 ＡＴＰ 高时 ＰＤＨ 就磷酸化而被激活 当 ＡＴＰ 浓度下降 激酶活性也降低 而磷酸蛋白磷酸 酶除去 ＰＤＨ 上的磷酸 ＰＤＨ 又被激活了 三羧酸循环中柠檬酸合成酶 异柠檬酸脱氢酶和α 酮戊二酸脱氢酶的调节 主要是通过

43 ２０２ 细胞生物学 产物的反馈抑制来实现的 而三羧酸循环 是机 体 产 能 的 主 要 方 式 因 此 ＡＴＰ ＡＤＰ 与 ＮＡＤＨ ＮＡＤ 两者的比值是其主要调节 物 ＡＴＰ ＡＤＰ 比值升高 抑制柠檬酸合成 酶和异柠檬酶脱氢酶活性 反之 ＡＴＰ ＡＤＰ 比 值 下 降 可 激 活 上 述 两 个 酶 ＮＡＤＨ ＮＡＤ 比值升高抑制柠檬酸合成酶和 α 酮 戊二酸脱氢酶活性 除上述 ＡＴＰ ＡＤＰ 与 ＮＡＤＨ ＮＡＤ 之外 其他一些代谢产物对 酶的活性也有影响 如柠檬酸抑制柠檬酸 合成酶活性 而琥珀酸单酰 ＣＡ 抑制 α 酮 戊二酸脱氢酶活性 总之 组织中代谢产 物决 定 循 环 反 应 的 速 度 以 便 调 节 机 体 图８ １０ 羧酸循环的抑制剂和激活剂 ＡＴＰ 和 ＮＡＤＨ 浓度 保证机体能量供给 图８ １０ 四 有氧氧化和糖酵解的相互调节 Ｐ 在研究酵母发酵时 发现在供氧充足的条件下 细胞内糖酵解作用受到抑制 葡萄糖消耗和乳酸生成减少 这种有氧氧化对糖酵解的抑制作用称为巴斯德效应 Ｐ 产生巴斯德效应主要是由于在供氧充足的条件下 细胞内 ＡＴＰ ＡＤＰ 比值升高 抑制了 ＰＫ 和 ＰＦＫ 使６ 磷酸果糖和６ 磷酸葡萄糖含量增加 后者反馈抑制己糖激酶 ＨＫ 使葡 萄糖利用减少 呈现有氧氧化对糖酵解的抑制作用 Ｃ 效应与巴斯德效应相反 在癌细胞发现给予葡萄糖时不论供氧充足与否都呈现 很强的酵解反应 而糖的有氧氧化受抑制 称为 Ｃ 效应或反巴斯德效应 这种现象较 普遍地存在于癌细胞中 此外也存在于一些正常组织细胞如视网膜 睾丸 颗粒白细胞等 一般认为 具 Ｃ 效应的细胞 其酵解酶系 如 ＰＫ ＰＦＫ ＨＫ 活性强 而线 粒体内氧化酶系如细胞色素氧化酶活性则较低 它们在争夺 ＡＤＰ Ｐ 及 ＮＡＤＨ Ｈ 方面线 粒体必然处于劣势 因而缺乏进行氧化磷酸化的底物 即使在供氧充足的情况下 其有氧氧 化生成 ＡＴＰ 的能力仍低于正常细胞 呈现 Ｃ 效应 三 氧化磷酸化 一 电子载体 呼吸链电子载体主要有 黄素蛋白 铁硫蛋白 泛醌 细胞色素 铜原子等 １ ＮＡＤ 即烟酰胺嘌呤二核苷酸 ｍ 是体内烟酰胺脱 氢酶类的辅酶 连接三羧酸循环和呼吸链 其功能是将代谢过程中脱下来的氢传递给黄素蛋 白 图８ １１

44 第八章 线 粒 体 ２０３ 图８ １１ ＮＡＤ 的结构和功能 ＮＡＤ Ｒ Ｈ ＮＡＤＰ Ｒ ＰＯ２ ３ ２ 黄素蛋白 含 ＦＭＮ 或 ＦＡＤ 图８ １２ 的蛋白质 每个 ＦＭＮ 或 ＦＡＤ 可接受 ２ 个电 子２个质子 呼吸链上具有以 ＦＭＮ 为辅基的 ＮＡＤＨ 脱氢酶 以 ＦＡＤ 为辅基的琥珀酸脱氢 酶 图８ １３ 图８ １２ ＦＭＮ ｍ 的分子结构 图８ １３ ＦＡＤ 的分子结构

45 ２０４ 细胞生物学 ３ 铁硫蛋白 在其分子结构中每个铁原子和 ４ 个硫原子结合 通过 Ｆ２ Ｆ３ 互变进 行电子传递 有２Ｆ ２Ｓ和４Ｆ ４Ｓ两种类型 图８ １４ 图８ １４ 铁硫蛋白的结构 引自 Ｌ １９９９ ４ 泛醌 是脂溶性小分子量的醌类化合物 通过氧化和还原传递电子 有 ３ 种氧化还 原形式即氧化型醌 Ｑ 还原型氢醌 ＱＨ２ 和介于两者之者的自由基半醌 ＱＨ 图８ １５ 图８ １５ 泛醌 ５ 细胞色素 细胞色素分子中含有血红素辅基 以共价形式与蛋白结合 通过 Ｆ３ Ｆ２ 形式变化传递电子 呼吸链中有５类 即 细胞色素 ３ １ 其中 ３ 含有 铜原子 图８ １６ ６ 三个铜原子 位于线粒体内膜的一个蛋白质上 形成类似于铁硫蛋白的结构 通过 Ｃ２ Ｃ 的变化传递电子

46 第八章 线 粒 体 ２０５ 图８ １６ 血红素的结构 二 呼吸链复合物 利用脱氧胆酸 ｘ 一种离子型去污剂 处理线粒体内膜 分离出呼吸链的 ４ 种复合物 即复合物Ⅰ Ⅱ Ⅲ 和 Ⅳ 泛醌和细胞色素 Ｃ 不属于任何一种复合物 泛醌位 于内膜 细胞色素 Ｃ 位于线粒体内膜的膜间隙侧 Ｃ 侧 属于膜的外周蛋白 １ 复合物Ⅰ 即 ＮＡＤＨ 脱氢酶 哺乳动物的复合物 Ⅰ 由 ４２ 条肽链组成 呈 Ｌ 型 含 有一个 ＦＭＮ 和至少６ 个铁硫蛋白 分子量接近 １ＭＤ 以二聚体形式存在 其作用是催化 ＮＡＤＨ 的２个电子传递至泛醌 同时将 ４ 个质子由线粒体基质 Ｍ 侧 转移至膜间隙 Ｃ 侧 电子传递的方向为 ＮＡＤＨ ＦＭＮ Ｆ Ｓ Ｑ 总的反应结果为 ＮＡＤＨ ５ＨＭ Ｑ ＮＡＤ ＱＨ２ ４ＨＣ 即琥珀酸脱氢酶 至少由 ４ 条肽链组成 含有一个 ＦＡＤ 和 ２ 个铁硫蛋 ２ 复合物 Ⅱ 白 其作用是催化电子从琥珀酸转至泛醌 但不转移质子 电子传递的方向为 琥珀酸 ＦＡＤ Ｆ Ｓ Ｑ ３ 复合物 Ⅲ 即细胞色素 Ｃ 还原酶 由至少１１条不同肽链组成 以二聚体形式存在 每个单体包含两个细胞色素 ５６２ ５６６ 一个细胞色素 Ｃ１ 和一个铁硫蛋白 其作用是催 化电子从泛醌传给细胞色素 Ｃ 每转移一对电子 同时将 ４ 个质子由线粒体基质泵至膜间 隙 总的反应结果为 ２还原态 Ｃ １ ＱＨ２ ２ＨＭ ２氧化态 Ｃ １ Ｑ ４ＨＣ 复合物Ⅲ 的电子传递比较复杂 和 Ｑ 循环 有关 图 ８ １７ 泛醌能在膜中自由扩 散 在内膜 Ｃ 侧 还原型泛醌 氢醌 将一个电子交给 Ｆ Ｓ 细胞色素 Ｃ１ 细胞色素 Ｃ 被氧化为半醌 并将一个质子释放到膜间隙 半醌将电子交给细胞色素 ５６６ ５６２ 释放另 外一个质子到膜间隙 细胞色素 ５６６得到的电子为循环电子 传递路线为 半醌 ５６６ ５６２ 泛醌 在内膜 Ｍ 侧 泛醌可被复合体 Ⅰ 复合体 Ⅱ 或细胞色素 ５６２还原为氢醌 一对 电子由泛醌到复合物Ⅲ的电子传递过程中 共有四个质子被转移到膜间隙 其中两个质子是 泛醌转移的

47 ２０６ 细胞生物学 图８ １７ Ｑ 循环示意图 Ｌ １９９９ ４ 复合物 Ⅳ 即细胞色素 Ｃ 氧化酶 以二聚体形式存在 其作用是将从细胞色素 Ｃ 接 受的电子传给氧 每转移一对电子 在基质侧消耗 ２ 个质子 同时转移 ２ 个质子至膜间隙 每个单体由至少１３条不同的肽链组成 分为三个亚单位 亚单位Ｉ Ｉ 包含两个 血红素 １ ３ 和一个铜离子 Ｃ２ 血红素３ 和 Ｃ２ 形成双核的 Ｆ Ｃ中心 亚单位 Ⅱ Ⅱ 包含两个铜离子 Ｃ２ 构成的双核中心 其结构与 ２Ｆ ２Ｓ 相似 亚单 位Ⅲ Ⅲ 的功能尚不了解 电子传递的路线为 Ｃ ＣＡ ｍ ３Ｃ２ Ｏ２ 总的反应结果为 ４还原态 Ｃ ８ＨＭ Ｏ２ ４氧化态 Ｃ ４ＨＣ ２Ｈ２Ｏ 三 两条主要的呼吸链 复合物Ⅰ Ⅲ Ⅳ组成主要的呼吸链 催化 ＮＡＤＨ 的脱氢氧化 复合物 Ⅱ Ⅲ Ⅳ 组 成另一条呼吸链 催化琥珀酸的脱氢氧化 对应于每个复合物 Ⅰ 大约需要 ３ 个复合物 Ⅲ ７个复合物Ⅳ 任何两个复合物之间没有稳定的连接结构 而是由泛醌和细胞色素 Ｃ 这样的 可扩散性分子连接 图８ １８ 呼吸链各组分有序 使电子按氧化还原电位从高向低传递 能量逐级释放 呼吸链中的 复合物Ⅰ Ⅲ Ⅳ都是质子泵 可将质子由基质转移到膜间隙 形成质子动力势能 ｍ 驱动 ＡＴＰ 的合成 实验证明人为提高线粒体膜间隙的质子浓度 能使线粒体 合成 ＡＴＰ 呼吸链组分及 ＡＴＰ 酶在线粒体内膜上呈不对称分布 如细胞色素 Ｃ 位于线粒体内膜的 Ｃ 侧 而 ＡＴＰ 酶位于内膜的 Ｍ 侧 对于呼吸链组分在内膜上的分布主要依靠用亚线粒体颗粒和冰冻蚀刻电镜技术来研究 将线粒体用超声波破碎 线粒体内膜碎片可形成颗粒朝外的小膜泡 称亚线粒体小泡或 亚线粒体颗粒 这种小泡具有正常的电子传递和磷酸化的功能 用细胞色素 Ｃ 的抗体能够 抑制完整线粒体的氧化磷酸化 但不能抑制亚线粒体颗粒的氧化磷酸化 说明细胞色素 Ｃ 位于线粒体内膜的 Ｃ 侧

48 第八章 线 粒 体 ２０７ 图８ １８ 两条主要的呼吸链 Ｌ １９９９ 四 ＡＴＰ 的生成 储存和利用 ＡＴＰ几乎是生物组织细胞能够直接利用的唯一能源 在糖类 脂类及蛋白质等物质氧 化分解中释放出的能量中 相当大的一部分能使 ＡＤＰ 磷酸化成为 ＡＴＰ 从而把能量保存在 ＡＴＰ 分子内 ＡＴＰ 为一种游离核苷酸 由腺嘌呤 核糖与三分子磷酸构成 磷酸与磷酸间借磷酸酐 键相连 当这种高能磷酸化合物水解时 磷酸酐键断裂 自由能变化 Ｇ 为 ３０ ５ＫＪ ｍ 而一般的磷酸酯水解时 磷酸酯键断裂 自由能的变化只有 ８ 至 １２ＫＪ ｍ 因此称此磷酸 酐键为高能磷酸键 但实际上这样的名称是不够确切的 因为一种化合物水解时释放自由能 的多少取决于该化合物整个分子的结构 以及反应的作用物自由能与产物自由能的差异 而 不是由哪个特殊化学键的破坏所致 但为了叙述及解释问题方便 高能磷酸键的概念至今仍 被生物化学界采用 ＡＴＰ是一高能磷酸化合物 当 ＡＴＰ 水解时首先将其分子的一部分 如磷酸 Ｐ 或腺 苷酸 ＡＭＰ 转移给作用物 或与催化反应的酶形成共价结合的中间产物 以提高作用物 或酶的自由能 最终被转移的 ＡＭＰ 或 Ｐ 将被取代而放出 ＡＴＰ 多以这种通过磷酸基团等 转移的方式 而非单独水解的方式 参加酶促反应提供能量 用以驱动需要加入自由能的吸 能反应 ＡＴＰ 水解反应的总结如下 ＡＴＰ ＡＤＰ Ｐ

49 ２０８ 细胞生物学 或 ＡＴＰ ＡＭＰ ＰＰ 焦磷酸 一 ＡＴＰ 的生成方式 １ 底物水平磷酸化 底物分子中的能量直接以高能 键形式转移给 ＡＤＰ 生成 ＡＴＰ 这个过程称为底物水平磷酸化 这一磷酸化过程在胞浆和线 粒体中进行 ２ 氧化磷酸化 ｘ 氧化和磷酸化是两个不同的概念 氧化是 底物脱氢或失电子的过程 而磷酸化是指 ＡＤＰ 与 Ｐ 合成 ＡＴＰ 的过程 在结构完整的线粒 体中氧化与磷酸化这两个过程是紧密地偶联在一起的 即氧化释放的能量用于 ＡＴＰ 合成 这个过程就是氧化磷酸化 氧化是磷酸化的基础 而磷酸化是氧化的结果 机体代谢过程中能量的主要来源是线粒体 既氧化磷酸化 也有底物水平磷酸化 以前 者为主要来源 胞液中底物水平磷酸化也能获得部分能量 实际上这是酵解过程的能量来 源 对于酵解组织 红细胞和组织相对缺氧时的能量来源是十分重要的 二 氧化磷酸化偶联部位的测定 确定氧化磷酸化偶联部位通常用两种方法 １ Ｐ Ｏ 值测定 Ｐ Ｏ 值指在氧化磷酸化过程中消耗一克原子氧所消耗的无机磷的克原 子数 或者说消耗一克原子氧所生成的 ＡＴＰ 的克分子数 Ｐ Ｏ 值实质上指的是呼吸过程中 磷酸化的效率 测定 Ｐ Ｏ 值的方法通常是在一密闭的容器中加入氧化的底物 ＡＤＰ Ｐ 氧饱和的缓 冲液 再加入线粒体制剂时就会有氧化磷酸化进行 反应终了时测定 Ｏ２ 消耗量 可用氧电 极法 和 Ｐ 消耗量 或 ＡＴＰ 生成量 就可以计算出 Ｐ Ｏ 值了 在反应系统中加入不同的底 物 可测得各自的 Ｐ Ｏ 值 结合我们所了解的呼吸链的传递顺序 就可以分析出大致的偶 联部位了 表８ ２ 离体线粒体的 Ｐ Ｏ 比值 底物 呼吸的组成 Ｐ Ｏ 比值 生成 ＡＴＰ数 １ β 羟丁酸 ＮＡＤ ＦＭＮ ＣＱ Ｃ Ｏ２ ２ ４ ２ ８ ３ ２ 琥珀酸 ＦＡＮ ＣＱ Ｃ Ｏ２ １ ７ ２ ３ 抗坏血酸 Ｃ Ｃ ３ Ｏ２ ０ ８８ １ ４ 细胞色素 Ｃ Ｃ ３ Ｏ２ ０ ６１ ０ ６８ １ 从上表可以看出 Ｐ Ｏ 值为小数 由于线粒体的偶联作用在离体条件下不能完全发挥 故可认为实际的 ＡＴＰ 生成数是他们所接近的整数值 比较表中的 １ 和 ２ 呼吸链传递的差异是在 ＣＱ 之间 两者 ＡＴＰ 的生成数相差

50 第八章 线 粒 体 ２０９ １ 所以这个 ＡＴＰ 的生成部位一定在 ＮＡＤ ＣＱ 之间 比较表中 ２ 和 ３ 呼吸链传递的差异是在 Ｃ 之间 两者 ＡＴＰ 的生成数相差 １ 所以这个 ＡＴＰ 的生成部位在 ＣＱ Ｃ 之间 比较表中 ３ 和 ４ 生成的 ＡＴＰ 数均为 １ 呼吸链传递的区别是在 Ｃ Ｃ ３ 故 Ｃ ３ 不存在偶联部位 而在 Ｃ ３ Ｏ２ 之间存在着一个偶联部位 ２ 根据氧化还原电位计算电子传递释放的能量是否能满足 ＡＴＰ 合成的需要 氧化还原 反应中释放的自由能 Ｇ０ 与反应底物和产物标准氧化还原电位差值 Ｅ ０ 之间存在下述 关系 Ｇ０ Ｆ Ｅ ０ 式 中 为 氧 化 还 原 反 应 中 电 子 转 移 数 目 Ｆ 为 法 拉 第 常 数 ２３ ０６２千卡 克分子 伏特 或９６５００库仑 克分子 一克分子 ＡＴＰ 水解生成 ＡＤＰ 与 Ｐ 所释放的能量为 ７ ３ 千卡 凡氧化过程中释放的能 量大于７ ３千卡 均有可能生成一克分子 ＡＴＰ 就是说可能存在有一个偶联部位 根据上 式计算 当 ２时 Ｅ ０ ０ １５８３Ｖ 时可释放７ ３千卡能量 所以反应底物与生成物的标 准氧化还原电位的变化大于０ １５８３Ｖ 的部位均可能存在着一个偶联部位 在 ＮＡＤ ＣＱ Ｃ Ｃ 和 Ｃ ３ Ｏ２ 处可能存在着偶联部位 必须明确 这种 计算的基础是反应处在热力学平衡状态 温度为 ２５ Ｈ 为 ７ ０ 反应底物和产物的浓度 均为１克分子 这种条件在体内是不存在的 因此这一计算结果只能供参考 图８ １９ 图８ １９ 呼吸链中电子对传递时自由能的变化 综上所述 呼吸链中电子传递和磷酸化的偶联部位可用图８ ２０表示 呼吸链磷酸化的全过程可用下述方程式表示 ＮＡＤＨ Ｈ ３ＡＤＰ ３Ｐ １ ２Ｏ２ ＮＡＤ ３ＡＴＰ ４Ｈ２Ｏ ＦＡＤＨ２ ２ＡＤＰ ２Ｐ １ ２Ｏ２ ＦＡＤ ２ＡＴＰ ３Ｈ２Ｏ

51 ２１０ 细胞生物学 图８ ２０ 偶联部位示意图 三 氧化磷酸化中 ＡＴＰ 生成的结构基础 ＡＴＰ 是由位于线粒体内膜上的 ＡＴＰ 合 成酶催化 ＡＤＰ 与 Ｐ 合成的 ＡＴＰ 合成酶是 一个大的膜蛋白质复合体 分子量 ５００ｋＤ 是由两个主要分子 或称因子 构成 一是 疏水的 Ｆ０ 另一是亲水的 Ｆ１ 又称 Ｆ０Ｆ１ 复 合体 在电子显微镜下观察线粒体时 可见 到线粒体内膜基质侧有许多球状颗粒突起 这就是 ＡＴＰ 合成酶 其中球状的头与茎是 Ｆ１ 部 分 分 子 量 为 ３６０ｋＤ 由 α３ β３ γ δ ε等 ９ 种多肽亚基组成 β与 α亚基上有 ＡＴＰ结合部位 γ 亚基被认为具有控制质子 通过的闸门作用 δ亚基是 Ｆ１ 与膜相连所必 需 其中心部分为质子通路 ε亚基是酶的 调节部分 Ｆ０ 是 由 ３ 个 大 小 不 一 的 亚 基 组 成 其中有一个亚基称为寡霉素敏感蛋白质 ｍ ＯＳ ＣＰ 此 外 尚 有 一 个 蛋 白 质 部 分 为 分 子 量 图８ ２１ 线粒体内膜上三联体 三分子体 结构示意图 引自 Ｌ １９９９ ２８ｋＤ 的因子 Ｆ０ 主要构成质子通道 图８ ２１ 四 氧化磷酸化的偶联机制 有关氧化磷酸化的偶联机理已经作了许多研究 目前氧化磷酸化的偶联机理还不完全清 楚 ５０年代 Ｓ 及 Ｌ 提出了化学偶联学说 １９６４ 年 Ｂ 又提出了构象变化偶联 学说 这两种学说的实验依据不多 支持这两种观点的人已经不多了 目前多数人支持化学 渗透学说 ｍ ｍ 这是英国生化学家 Ｐ Ｍ 于１９６１年提出的 当时 没有引起人们的重视 １９６６年他根据逐步积累的实验证据和生物膜研究的进展 逐步地完 善了这一学说 氧化磷酸化的化学渗透学说的基本观点如下

52 第八章 线 粒 体 ２１１ １ 线粒体的内膜中电子传递与线粒体释放 Ｈ 是偶联的 即呼吸链在传递电子过程中释 放出来的能量不断地将线粒体基质内的 Ｈ 逆浓度梯度泵出线粒体内膜 这一过程的分子机 理还不十分清楚 见图８ ２２ 图８ ２２ 电子传递与质子传递偶联 注 复合物Ⅱ未显示 ２ Ｈ 不能自由透过线粒体内膜 结果使得线粒体内膜外侧 Ｈ 浓度增高 基质内 Ｈ 浓度降低 在线粒体内膜两侧形成一个质子跨膜梯度 线粒体内膜外侧带正电荷 内膜内侧 带负电荷 这就是跨膜电位 ψ 由于线粒体内膜两侧 Ｈ 浓度不同 内膜两侧还有一个 Ｈ 梯度 Ｈ 膜外侧 Ｈ 较基质 Ｈ 约低 １ ０ 单位 底物氧化过程中释放的自由能就储存于 ψ和 Ｈ 中 若以 Ｐ 表示总的质子移动力 那么三者的关系可用下式表示 Ｐ ψ ５９ Ｈ 可以通过线粒体内膜上的三分子体顺着 线粒体外的 Ｈ Ｈ 浓度梯度进入线粒体基质 ３ 中 这相当于一个特异的质子通道 Ｈ 顺浓度梯度方向运动所释放的自由能用于 ＡＴＰ 的合 成 寡霉素能与 ＯＳＣＰ 结合 特异阻断这个 Ｈ 通道 从而抑制 ＡＴＰ 合成 有关 ＡＴＰ 合成 的分子机制目前还不十分清楚 ４ 解偶联剂的作用是促进 Ｈ 被动扩散通过线粒体内膜 即增强线粒体内膜对 Ｈ 的通 透性 解偶联剂能消除线粒体内膜两侧的质子梯度 所以不能再合成 ＡＴＰ 总之 化学渗透学说认为在氧化与磷酸化之间起偶联作用的因素是 Ｈ 的跨膜梯度 每对 Ｈ 通过三分子体回到线粒体基质中可以生成一分子 ＡＴＰ 以 ＮＡＤＨ Ｈ 作底 物 其电子沿呼吸链传递在线粒体内膜中形成三个回路 所以生成 ３ 分子 ＡＴＰ 以 ＦＡＤＨ２ 为底物 其电子沿琥珀酸氧化呼吸链传递在线粒体内膜中形成两个回路 所以生成两个 ＡＴＰ 分子 自从 Ｍ 提出化学通透学说以来 已为大量的实验结果验证 为该学说提供了实验 依据 美国 Ｃ 等人于 １９７８ 年使用完整的大鼠肝细胞作实验材料 以核磁共振

53 ２１２ 细胞生物学 ｍ ＮＭＲ 的方法直接观察到完整细胞中胞液与线粒体基质之间存在 Ｈ 跨 膜梯度 胞液的 Ｈ 值比线粒体基质的 Ｈ 值低 ０ ３ 单位 用解偶联剂处理 或用氮气代替 氧气切断氧的供应 那么胞液和线粒体基质之间的 Ｈ 梯度消失 嗜盐菌 ｍ ｍ 是一种能在高浓度盐溶液中生长的细菌 该菌中有一 种结合蛋白质 称为菌紫质 菌紫质能将光能转换成化学能 有人使用 嗜盐菌做实验 在无 Ｏ２ 的情况下用光照射嗜盐菌 尽管无氧化作用 菌体内仍维持一定的 ＡＴＰ浓度 若加入解偶联剂或加入磷酸化抑制剂 ＤＣＣ 则菌体内 ＡＴＰ 浓度降低 而加入呼 吸抑制剂抑制电子传递 即不影响 ＡＴＰ 合成 ＡＴＰ 浓度不变 这说明电子传递和 Ｈ 运动 是可以分开加以研究的 嗜盐菌为研究化学渗透学说的 Ｈ 运动提供了一个理想的模型 于 是 有人分离嗜盐菌的菌紫质 并将其重组在人工脂质体中 然后用光照射 可测得跨膜电 位为 １２０ｍＶ 内负外正 同时膜外侧 Ｈ 浓度增高 膜内外 Ｈ 约为 １ ８ 单位 可以算 出总的质子移动力约为 Ｐ １２０ｍＶ ５９ １ ８ｍＶ ２２６ｍＶ 若再将牛心线粒体内膜重组 在此脂质体中 光照后可使 ＡＤＰ Ｐ 生成 ＡＴＰ 这说明质子跨膜梯度可以经过线粒体内膜 的三分子体将 Ｈ 跨膜梯度中储存的能量转变为 ＡＴＰ 分子中的化学能 五 氧化磷酸化抑制剂 氧化磷酸化抑制剂可分为三类 即呼吸抑制剂 磷酸化抑制剂和解偶联剂 １ 呼吸抑制剂 这类抑制剂抑制呼吸链的电子传递 也就是抑制氧化 氧化是磷酸化 的基础 抑制了氧化也就抑制了磷酸化 呼吸链某一特定部位被抑制后 其底物一侧均为还 原状态 其氧一侧均为氧化态 这很容易用分光光度法 双波长分光光度计 鉴定 重要的 呼吸抑制剂有以下几种 鱼藤酮 系从植物中分离到的呼吸抑制剂 专一抑制 ＮＡＤＨ ＣＱ 的电子传 递 抗霉素 Ａ ｍ Ａ 由霉菌中分离得到 专一抑制 ＣＱ Ｃ 的电子传递 ＣＮ ＣＯ ＮＮ３ 和 Ｈ２Ｓ均抑制细胞色素氧化酶 ２ 磷酸化抑制剂 这类抑制剂抑制 ＡＴＰ 的合成 抑制了磷酸化也一定会抑制氧化 寡霉素 ｍ 可与 Ｆ０ 的 ＯＳＣＰ 结合 阻塞氢离子通道 从而抑制 ＡＴＰ 合成 二环己基碳二亚胺 ｘ ｍ ＤＣＣ 可与 Ｆ０ 的 ＤＣＣ 结合蛋白结合 阻断 Ｈ 通道 抑制 ＡＴＰ 合成 栎皮酮 ｑ 直接抑制参与 ＡＴＰ 合成的 ＡＴＰ 酶 ３ 解偶联剂 解偶联剂使氧化和磷酸化脱偶联 氧化仍可以进行 而磷 酸化不能进行 解偶联剂作用的本质是增大线粒体内膜对 Ｈ 的通透性 消除 Ｈ 的跨膜梯 度 因而无 ＡＴＰ 生成 解偶联剂只影响氧化磷酸化而不干扰底物水平磷酸化 解偶联剂的 作用使氧化释放出来的能量全部以热的形式散发 动物棕色脂肪组织线粒体中有独特的解偶 联蛋白 使氧化磷酸化处于解偶联状态 这对于维持动物的体温十分重要 常用的解偶联剂有 ２ ４ 二硝基酚 ＤＮＰ 羰基氰对三氟甲氧基苯肼 ＦＣＣＰ 双香豆素 ｍ 等 过量的阿司匹林也使氧化磷酸化部分解偶联 从而使 体温升高

54 第八章 线 粒 体 ２１３ 过量的甲状腺素也有解偶联作用 甲状腺素诱导细胞膜上 Ｎ Ｋ ＡＴＰ 酶的合成 此 酶催化 ＡＴＰ 分解 释放的能量将细胞内的 Ｎ 泵到细胞外 而 Ｋ 进入细胞内 Ｎ Ｋ ＡＴＰ酶的转换率为１００个分子 ＡＴＰ 秒 酶分子数增多 单位时间内分解的 ＡＴＰ 增多 生 成的 ＡＤＰ 又可 促 进 磷 酸 化 过 程 甲 亢 病 人 表 现 为 多 食 无 力 喜 冷 怕 热 基 础 代 谢 率 ＢＭＲ 增高 因此也有人将甲状腺素看作是调节氧化磷酸化的重要激素 六 氧化磷酸化的调节 机体的氧化磷酸化主要受细胞对能量需求的调节 １ ＡＴＰ ＡＤＰ 值对氧化磷酸化的直接影响 线粒体内膜中有腺苷酸转位酶 催化线粒体 内 ＡＴＰ 与线粒体外 ＡＤＰ 的交换 ＡＴＰ 分子解离后带有 ４ 个负电荷 而 ＡＤＰ 分子解离后带 有３个负电荷 由于线粒体内膜内外有跨膜电位 ψ 内膜外侧带正电 内膜内侧带负 电 所以 ＡＴＰ 出线粒体的速度比进线粒体速度快 而 ＡＤＰ 进线粒体速度比出线粒体速度 快 Ｐ 进入线粒体也由磷酸转位酶催化 磷酸转位酶催化 ＯＨ 与 Ｐ 交换 磷酸二羧酸转位 ２ 酶催化 Ｐ 与二羧酸 如苹果酸 交换 当线粒体中有充足的氧和底物供应时 氧化磷酸化就会不断进行 直至 ＡＤＰ Ｐ 全部 合成 ＡＴＰ 此时呼吸降到最低速度 若加入 ＡＤＰ 耗氧量会突然增高 这说明 ＡＤＰ 控制着 氧化磷酸化的速度 人们将 ＡＤＰ 的这种作用称为呼吸受体控制 机体消耗能量增多时 ＡＴＰ 分解生成 ＡＤＰ ＡＴＰ 出线粒体增多 ＡＤＰ 进线粒体增多 线粒体内 ＡＴＰ ＡＤＰ 值降低 使氧化磷酸化速度加快 ＡＤＰ Ｐ 接受能量生成 ＡＴＰ 机体 消耗能量少时 线粒体内 ＡＴＰ ＡＤＰ 值增高 线粒体内 ＡＤＰ 浓度减低就会使氧化磷酸化速 度减慢 ２ ＡＴＰ ＡＤＰ 值 的 间 接 影 响 ＡＴＰ ＡＤＰ 值 增 高 时 使 氧 化 磷 酸 化 速 度 减 慢 结 果 ＮＡＤＨ 氧化速度减慢 ＮＡＤＨ 浓度增高 从而抑制了丙酮酸脱氢酶系 异柠檬酸脱氢酶 α 酮戊二酸脱氢酶系和柠檬酸合成酶活性 使糖的氧化分解和 ＴＣＡ 循环的速度减慢 ３ ＡＴＰ ＡＤＰ 值对关键酶的直接影响 ＡＴＰ ＡＤＰ 值增高会抑制体内的许多关键酶 如 变构抑制磷酸果糖激酶 丙酮酸激酶和异柠檬酸脱氢酶 还能抑制丙酮酸脱羧酶 α 酮戊二 酸脱氢酶系 通过直接反馈作用抑制糖的分解和 ＴＣＡ 循环 七 高能磷酸化合物的储存和利用 无论是底物水平磷酸化还是氧化磷酸化 释放的能量除一部分以热的形式散失于周围环 境中之外 其余部分多直接生成 ＡＴＰ 以高能磷酸键的形式储存 同时 ＡＴＰ 也是生命活 动利用能量的主要直接供给形式 １ 高能化合物 人体存在多种高能化合物 但这些高能化合物的能量并不相同 体外实验中 在 Ｈ７ ０ ２５ 条件下 每克分子 ＡＴＰ 水解生成 ＡＤＰ Ｐ 时释放的能量 为７ １千卡或３０ ４千焦耳 在体内 Ｈ７ ４ ３７ ＡＴＰ ＡＤＰ Ｐ Ｍ２ 均处于细胞内 生理浓度的情况下 每克分子 ＡＴＰ 水解生成 ＡＤＰ Ｐ 时释放的能量为３３ ５ ５０千焦耳或８ １２千卡 表８ ４

55 ２１４ 细胞生物学 表８ ４ 几种常见高能化合物水解时释放的能量 化合物 千焦耳 克分子 千卡 克分子 磷酸烯醇式丙酮酸 ６２ １ １４ ８ １ ３ 二磷酸甘油酸 ４９ ５ １１ ８ 磷酸肌酸 ４３ ９ １０ ５ 乙酰 ＣＡ ３１ ４ ８ ２ ＡＴＰ ３０ ４ ７ ３ Ｓ 腺苷蛋氨酸 ２９ ３ ７ ０ Ｆ ６ Ｐ １５ ６ ３ ８ 谷氨酰胺 １４ ２ ３ ４ Ｇ ６ Ｐ １３ ４８ ３ ３ 卫生学规定 中度体力劳动者每日每公斤体重需供给能量 ３４ ４０ 千卡 若一成人重 ７０ｋ 从事中度体力劳动 则每日应供应含能量２４５０千卡的食物 其中 ４０ 的能量转变成 化学能储存于 ＡＴＰ 分子的高能键中 这一部分能量应为２４５０ ０ ４ ９８０ ０千卡 按每克分 子 ＡＴＰ 水解生成 ＡＤＰ Ｐ 释放 ７ ３ 千卡能量计算 应当合成 ９８０ ７ ３ １３４ ３ 克分子 ＡＴＰ ＡＴＰ 的分子量为５０７ ２２ 所以１３４ ３克分子 ＡＴＰ 重达６８ １２ｋ 这足以表明 ＡＴＰ 在 体内的代谢十分旺盛 ＡＴＰ 在能量代谢中之所以重要 就是因为 ＡＴＰ 水解时的标准自由能变化位于多种物质 水解时标准自由能变化的中间 它能从具有更高能量的化合物接受高能磷酸键 如接受磷酸 烯醇式丙酮酸 １ ３ 二磷酸甘油 磷酸肌酸分子中的 Ｐ 生成 ＡＴＰ ＡＴＰ 也能将 Ｐ 转移 给水解时标准自由能变化较小的化合物 如转移给葡萄糖生成 Ｇ ６ Ｐ ２ ＡＴＰ 能量的转移 ＡＴＰ 是细胞内的主要磷酸载体 ＡＴＰ 作为细胞的主要供能物质参 与体内的许多代谢反应 还有一些反应需要 ＵＴＰ 或 ＣＴＰ 作供能物质 如 ＵＴＰ 参与糖原合 成和糖醛酸代谢 ＧＴＰ 参与糖异生和蛋白质合成 ＣＴＰ 参与磷脂合成过程 核酸合成中需 要 ＡＴＰ ＣＴＰ ＵＴＰ 和 ＧＴＰ 作原料合成 ＲＮＡ 或以ＡＴＰ ＣＴＰ ＧＴＰ 和ＴＴＰ 作原料 合成 ＤＮＡ 作为供能物质所需要的 ＵＴＰ ＣＴＰ 和 ＧＴＰ 可经下述反应再生 ＵＤＰ ＡＴＰ ＵＴＰ ＡＤＰ ＧＤＰ ＡＴＰ ＧＴＰ ＡＤＰ ＣＤＰ ＡＴＰ ＣＴＰ ＡＤＰ ＮＴＰ 由 ＮＤＰ 的生成过程也需要 ＡＴＰ 供能 ＮＤＰ ＡＴＰ ＮＴＰ ＡＤＰ ３ 磷酸肌酸 ＡＴＰ 是细胞内主要的磷酸载体或能量传递体 人体储存能量的方式不是 ＡＴＰ而是磷酸肌酸 肌酸主要存在于肌肉组织中 骨骼肌中含量多于平滑肌 脑组织中含 量也较多 肝 肾等其他组织中含量很少 磷酸肌酸的生成反应如下

56 第八章 线 粒 体 ２１５ 帯 肌酸 ＡＴＰ幑幐 磷酸肌酸 ＡＤＰ 肌细胞线粒体内膜和胞液中均有催化 该反应的肌酸激酶 它们是同工酶 线粒 体内膜的肌酸激酶主要催化正向反应 生 成的 ＡＤＰ 可促进氧化磷酸化 生成的磷 酸肌酸逸出线粒体进入胞液 磷酸肌酸所 含的能量不能直接利用 胞液中的肌酸激 酶主要催化逆向反应 生成的 ＡＴＰ 可补 充肌肉收缩时的能量消耗 而肌酸又回到 线粒体用于磷酸肌酸的合成 此过程可用 图８ ２３表示 图８ ２３ 磷酸肌酸的生成与利用 肌肉中磷酸肌酸的浓度为 ＡＴＰ 浓度的 ５ 倍 可储存肌肉几分钟收缩所急需的化学能 可见肌酸的分布与组织耗能有密切关系 ＡＴＰ 的生成 储存和利用可用下图表示 图８ ２４ 图８ ２４ ＡＴＰ的生成 储存和利用总结示意图 ＣＰＫ 肌酸磷酸激酶 第六节 线粒体的再生和起源 一 线粒体的再生 细胞内的线粒体一直在不断更新 衰老的和病变的线粒体可由溶酶体消化分解 新的线 粒体不断再生 关于线粒体是如何再生的 意见有分歧 但普遍认为线粒体依靠本身分裂进 行增殖 有人在脉孢菌的培养基中加入３Ｈ胆碱 它是磷脂的前身物 可以使线粒体上磷脂 进行标记 然后移到没有标记物的培养基中 经过几代的生长 用放射自显影测定 结果发 现 细胞分裂时线粒体的数目按比例增加 而且所有的线粒体均被标记 但每个线粒体所含 的标记物的量随时间而减少 这个实验证实了线粒体是从原先存在的线粒体经过生长与分裂 而来的 在形态上可以看到线粒体分裂的几种形式 １ 间壁分离 分裂时先由内膜向中心皱褶 将线粒体分为两个 常见于鼠肝和植物产 生组织中 图８ ２５

57 ２１６ 细胞生物学 图８ ２５ 线粒体的间壁分裂 引自 Ｗ Ｊ Ｌ Ｊ Ｃ Ｂ ２ 收缩后分离 分裂时通过线粒体中部缢缩并向两端不断拉长然后分裂为两个 见于 蕨类和酵母线粒体中 图８ ２６ ８ ２６ 线粒体的收缩分裂 引自 Ｗ Ｊ Ｌ Ｊ Ｃ Ｂ ３ 出芽 见于酵母和藓类植物 线粒体出现小芽 脱落后长大 发育为线粒体 二 线粒体的起源 关于线粒体的进化起源有以下两种学说 这均需进一步研究证实 １ 内共生起源学说 早在１９世纪末 根据光学显微镜观察发现细胞内的一种结构 线 粒体 与细菌相似 认为这是一种独立自主的有机体共生于细胞内 到 ６０ 年代初 一些学 者先后明确地提出线粒体由共生于细胞内的细菌演变而来 还认为 最初的原始真核细胞吞 噬了需氧细菌 细菌没有被消化掉 留在细胞内 以后宿主细胞就利用这种寄生细菌的呼吸作 用来获得能量 而这些细菌后来发展成为线粒体 已经证实线粒体和细菌有许多相似之处

58 第八章 线 粒 体 ２１７ ２ 非共生起源学说 认为线粒体是由需氧细菌的呼吸器进化而成的 这种学说认为真 核细胞的前身是一种进化程度较高的需氧细菌 比典型的原核细胞大 其呼吸链和磷酸化系 统位于细胞膜和细胞膜内凹的结构上 在进化过程中进一步分化 这种结构逐渐演变成线粒 体 第七节 线粒体与疾病 线粒体病是由线粒体 ＤＮＡ 异常所致 例如缺失 重复 突变 肌肉 心脏和大脑等 需要高能量的组织特别容易发生线粒体病 但是听觉器官 胰腺和肝脏也有风险 组织受累 的类型和特殊的染色体 ＤＮＡ 变化相关 例如慢性进行性外眼肌麻痹 它的变体有多系统 Ｋ Ｓ 综合征 慢性进行性外眼肌麻痹 心传导阻滞 色素性视网膜炎 中枢神经系 统变性 Ｐ 综合征 含铁幼红细胞性贫血 胰腺功能不足以及出生后几个月内开始 常导致婴儿死亡的进行性肝病 Ｌ 遗传性视神经病 程度不同但常是严重的双侧视力 丧失 常见于十几岁少年 由线粒体 ＤＮＡ 的点突变引起 ＭＥＲＲＦ 肌阵挛性癫痫 粗糙 红纤维 痴呆 共济失调 肌病 和 ＭＥＬＡＳ 线粒体性脑肌病 乳酸酸中毒 卒中样发 作 线粒体病可见于许多常见病中 例如帕金森病病人基底神经节细胞中大的线粒体缺失 各种肌病 随年龄增长而不断累积的线粒体 ＤＮＡ 缺失 母体遗传是线粒体 ＤＮＡ 异常的特点 因为所有的线粒体都是通过母系遗传的 因此 受累女性的所有子女都可能传到异常线粒体 而受累男性的子女均无风险 临床表现常不一 致 部分原因可能是因为细胞和组织中有突变和正常染色体基因组 遗传异质性 的不同程 度组合 有许多人类疾病的发生与线粒体功能缺陷相关 如线粒体肌病和脑肌病 线粒体眼 病 老年性痴呆 帕金森病 Ⅱ 型糖尿病 心肌病及衰老等 有人统称为线粒体疾病 自 １９８８年以来 线粒体疾病的发生被认为与氧化磷酸化过程相关基因的突变有关 线粒体疾 病主要分为两大类 遗传性和获得性疾病 前者病因包括核 ＤＮＡ 损害 线粒体 ＤＮＡ 损害 和基因组间的通讯障碍 后者主要由毒素 药物和衰老引起 目前的主要研究集中于线粒体 ＤＮＡ 突变与线粒体疾病临床表型的相互关系上 一 线粒体 ＤＮＡ 突变的致病机制 １ 线粒体 ＤＮＡ 丢失 自 １９９１ 年以来 已有 １０ 例病人被报道有线粒体 ＤＮＡ 的丢失 通过印迹杂交 原位杂交和免疫组化分析 线粒体 ＤＮＡ 丢失率可达 ８３ ９８ Ｌ 等发现本病患者转录因子 Ａ Ａ ＴＦＡ 表达减低 线粒体 ＤＮＡ 的复制需要 ＤＮＡ 聚合酶 γ及一个短的 ＲＮＡ 引物 这个引物由轻链的转录产物切除而 成 可见转录是线粒体 ＤＮＡ 复制的先决条件 线粒体 ＴＦＡ 表达减少的机制可能是由于翻译 过程受损 进入线粒体障碍和 ＴＦＡ 的不稳定性 Ｂ 等将线粒体 ＤＮＡ 拷贝数减少的细 胞脱核后 与无线粒体 ＤＮＡ 的癌细胞进行融合 发现融合细胞的线粒体 ＤＮＡ 拷贝数恢复 证实线粒体 ＤＮＡ 丢失与某些核基因有关 ２ 大规模线粒体 ＤＮＡ 重排 线粒体 ＤＮＡ 重排包括缺失 和重复

59 ２１８ 细胞生物学 主要见于 Ｋ Ｓ 综合征 慢性进行性眼外肌瘫痪及 Ｐ 综合征 已有 １２０ 余种线粒体 ＤＮＡ 缺失被报道 这些缺失有如下特征 是自发性散在发生的 无家族史 症 状随患者年龄增加而恶化 缺失区域一般不包括线粒体 ＤＮＡ 的复制起始点 在已发现的各 种重排中 普通缺失 ｍｍ 最为常见 缺失区域从线粒体 ＤＮＡ 第８４８２位到 １３４６０位 Ｃ 等发现正常人卵母细胞里可检测到微量的 普通缺失 如果某些拥有线粒 体 ＤＮＡ 缺失的卵母细胞逃过 退化消除 ｍ 缺失分子的克隆扩增 就可能成为一个致病因素 Ｍ 等认为患者体内野生型线粒体 ＤＮＡ 的减少在发病中起主 导作用 Ｆ 等则认为突变型线粒体 ＤＮＡ 的增加在发病中起主导作用 主要依据是 野 生型线粒体 ＤＮＡ 不仅不减少 在许多组织甚至是增加的 突变型线粒体 ＤＮＡ 与野生型同 时增加 细胞色素 Ｃ 氧化酶功能减退与突变型线粒体 ＤＮＡ 的数量相关 缺失型线粒体 ＤＮＡ 因其较短 复制较快 拷贝数增加 突变型线粒体 ＤＮＡ 能被转录 但不被翻译 蛋白质产 物明显减少 特别是细胞色素 Ｃ 氧化酶阴性肌纤维的数量增加 使线粒体及其 ＤＮＡ 呈代偿 性增加 许多缺失型线粒体 ＤＮＡ 分子的 Ｄ 环区可检测到２６５的基因重复 提示有基因重 复的分子易于发生缺失 其机制未明 线粒体 ＤＮＡ 多发性缺失是一种常染色体显性遗传疾病 其基因缺失多发生在两个复制 起始点之间 也有报道缺失区域涉及到轻链的复制起始点和重链启动子 多发性缺失与线粒 体 ＤＮＡ 复制有关 线粒体 ＤＮＡ 复制是受核基因控制的 Ｋ ｋ 发现常染色体显性遗传 的进行性眼外肌瘫痪基因与 １０ｑ２３ ３ ２４ ３ 连锁 另一个意大利家系的基因与 ３１４ １ ２１ ２连锁 ３ 线粒体 ＤＮＡ 结构基因的突变 有两种疾病被发现有线粒体 ＤＮＡ 结构基因的突变 即 Ｌ 遗传性视神经病 ＬＨＯＮ 及 Ｌ 病 许多线粒体 ＤＮＡ 的突变与 ＬＨＯＮ 有关 这些突变均位于结构基因上 在已发现的１０ 多种突变中 有三个点突变被认为与发病最相 关 分别位于线粒体 ＤＮＡ 第 １１７７８ ３４６０ 及 １４４８４ 位 这些突变改变了保守序列 在非 ＬＨＯＮ 家系中未查到类似突变 线粒体 ＡＴＰ 合成障碍可能是 ＬＨＯＮ 的原发性损害 在 Ｌ 病患者的线粒体 ＤＮＡ８９９３位有胸腺嘧啶到鸟嘌呤的点突变 这是一个位于高 度保守区域的突变 在 ＡＴＰ 酶６个亚单位的第四个跨膜区造成一处由亮氨酸到精氨酸的突 变 突变是异质性的 与疾病的严重程度呈正相关 但只有突变型线粒体 ＤＮＡ 达到一定阈 值时才导致 Ｌ 病 体外培养含有９５ 的突变型线粒体 ＤＮＡ 的淋巴细胞内 ＡＴＰ 合成能 力仅占正常对照的５２ ６７ 对 Ｌ 病发病中能量减少可能起主要作用 ４ 线粒体转移 ＲＮＡ 基因突变 肌阵挛性癫痫合并破碎红纤维 ｍ ＭＥＲＲＦ 一般被认为是由于线粒体 ＤＮＡ 上ＲＮＡＬ 基因上第 ８３４４ 处腺 嘌呤到鸟嘌呤的点突变 Ａ８３４４Ｇ 引起 这个突变位于ＲＮＡ 基因 ＴψＣ 环处 突变的发 生机制仍有待查明 Ｈ 等通过培养患者的成肌细胞的研究发现 线粒体 ＤＮＡ 的转录过 程正常 蛋白质翻译过程受损 Ｅ ｚ等进一步研究认为 Ａ８３４４Ｇ 引起线粒体内ＲＮＡＬ ｑ 的数量减少１６ ３３ 氨基酸酰化能力减少３７ ４９ 二者加起来使ＲＮＡＬ 转运赖 氨酸的能力减少５０ ６０ Ａ８３４４Ｇ 并不导致ＲＮＡ 的成熟过程如 ＣＣＡ 加尾等受损 可 能由于点突变造成ＲＮＡＬ 的次级或四级结构改变 使ＲＮＡＬ 更易受核酸酶的攻击 在

60 第八章 线 粒 体 ２１９ 参与蛋白质翻译延长的几个反应中 氨基酰化反应是较为特异的 每个氨基酰ＲＮＡ 合成酶 催化特定的氨基酸与ＲＮＡ 结果这个反应过程最易受ＲＮＡ 变化的影响 特别是在哺乳动 物中 ＲＮＡ 的结构差异大 序列长度 次级结构 延长因子及核糖体的结构不同 互补作 用不强 Ａ８３４４Ｇ 不影响ＲＮＡ 与氨基酰ＲＮＡ 合成酶的结合位点 但有可能影响ＲＮＡＬ 的高级结构 妨碍其转运功能 随着蛋白质中赖氨酸残基的增加 蛋白质合成速度也越来越 低 在每个赖氨酸密码子或其附近 蛋白质翻译序列终止 不完整的蛋白质释放出来 氨基 酰ＲＮＡＬ 的减少是这种现象最可能的原因 这些终止位点可能是 Ｌ Ｘ Ｌ 结构域 接 近于肽链的 Ｃ 末端 线粒体脑肌病伴乳酸血症和卒中样发作 ＭＥＬＡＳ 主要由线粒体 ＤＮＡ 上的ＲＮＡＬ ＵＵＲ 基因第３２４３处发生胸腺嘧啶到鸟嘌呤的点突变引起 主要证据是 这个突变在不 同种族的病人中均可被检测到 正常人无此突变 细胞融合试验证实 细胞的突变型 ＤＮＡ 达到９０ 时可导致线粒体蛋白质翻译功能受抑制 细胞色素 Ｃ 氧化酶活动减弱 单肌纤维 分析表明 不整红边纤维中突变型 ＤＮＡ 明显比正常肌纤维高 显示突变型 ＤＮＡ 在发病机 制中起着重要作用 ＭＥＬＡＳ中有细胞色素 Ｃ 氧化酶活动不正常的小动脉 每一个动脉内不 同部位的收缩和舒张功能不均一 微环境的氧供应受到损害 代谢功能失调 最终导致脑血 管意外发生 Ｋ 等的细胞融合试验证实 ＭＥＬＡＳ 患者的线粒体内尚未加工的转录产物 ＲＮＡ１９增加 这种产物使线粒体核糖体 ＲＮＡ 功能减退 从而抑制了蛋白质翻译 ＭＥＬＡＳ 突变还可导致１６Ｓ ＲＮＡ 转录终止过程受损 终止蛋白与终止序列的结合数量减少一半 １６ 基因转录产物的正确加工 剩余的终止蛋白可能与 Ｓ ＲＮＡ 的合成过程异常 影响ＲＮＡＬ 环区域终止序列结合 引起 环区域复制的异常终止 Ｄ Ｄ ５ 线粒体核糖体 ＲＮＡ 基因的突变 第一个被发现的线粒体核糖体 ＲＮＡ 基因突变是 １２ Ｓ ＲＮＡ 基因上第１５５５位 Ａ 到 Ｇ 的突变 这个突变导致了母系遗传的氨基甙类诱导的耳聋 和家族性耳聋 氨基甙类通过连接到突变的核糖体亚单位上而影响蛋白质的翻译过程 二 线粒体病的治疗进展 Ｓ 等认为线粒体病的治疗可以从三个方面进行 代谢治疗 成肌细胞互补和基因 治疗 代谢治疗包括 氧化磷酸化辅助因子的补充 建立代谢旁路 刺激丙酮酸脱氢酶 防 止氧自由基对线粒体内膜的损害 已有一些成功的治疗报告 Ｍ ｗ通过研究 １０ 例线粒 体肌病的治疗发现 ＣＱ１０多种维生素治疗线粒体肌病是无效的 成肌细胞移植是近年来兴起的一种治疗方法 细胞生物学研究表明成肌细胞相互融合成 肌小管而发育成成熟的肌纤维 如将患者肌细胞与正常肌细胞在体外融合 然后输入到患者 体内 一般选用多点肌肉注射的方式 患者体内就可能有更多的野生型线粒体 ＤＮＡ 但目 前尚未见成功的成肌细胞移植治疗线粒体病的临床报道 Ｃ ｚ ｗ ｋ 提出了三种线粒体病的基因治疗途径 第一是将克隆有正常线粒体 ＤＮＡ 的表达载体导入到核染色体内 在细胞质表达蛋白质产物 然后定向进入线粒体 胞质蛋白 进入线粒体的一个必须条件是其 Ｎ 末端必须连接有前导序列 引导蛋白质进入线粒体 然 后被蛋白酶切除 由于线粒体 ＤＮＡ 与核基因组的遗传密码不同 应通过定点诱变技术改造

61 ２２０ 细胞生物学 目的基因的遗传密码 使之能被核基因表达系统所接受 第二种基因治疗途径是转野生型 ＤＮＡ 或 ＲＮＡ 进入线粒体 造成顺式或反式调控作用 所谓反式互补是导入的核酸特异地与 突变型线粒体 ＤＮＡ 重组 成为野生型线粒体 ＤＮＡ 顺式互补是将外源基因通过表达载体系 统导入线粒体 使之表达野生型的基因产物 以弥补其不足 外源核酸进入线粒体也需要前 导肽的引导 Ｓ 等成功地将一段与前导肽结合的寡核苷酸导入了鼠肝线粒体 初步证实 了这种途径的可行性 第三种基因治疗途径是除去突变的线粒体 ＤＮＡ 在线粒体 ＤＮＡ 复制 时单链形成期 将反义的序列特异的寡核苷酸与之结合 可抑制突变型的复制

62 第九章 细胞的内膜系统 ２２１ 第九章 细胞的内膜系统 细胞内膜系统 ｍｍ ｍ 是真核细胞的特有结构 是细胞完成各种复杂 生命过程所必需的结构 通常把胞质内在功能和发生上具有相互联系的膜性结构统称为细胞 的内膜系统 包括内质网 高尔基复合体 溶酶体 过氧化物酶体以及各种膜性小泡等 这 些膜性细胞器都是封闭的区室 ｍ ｍ 区室之间为细胞质溶胶 内膜系统是细胞进 化过程中膜性结构高度分化和特化的产物 它的出现使细胞的结构复杂化 为细胞生命活动 提供了丰富的膜表面 使细胞的功能活动区域化 生化反应互不干扰 大大提高了细胞的代 谢效率 同时各细胞器间以及细胞器与胞质间又彼此相互依存 高度协调地进行各种细胞内 的代谢过程及生命活动 蛋白质的合成和分选是内膜系统的主要功能 由于核糖体既是蛋白质合成的场所 又是 内膜系统粗面内质网的组成部分 所以有关核糖体的内容也在本章介绍 第一节 核 糖 体 核糖体 ｍ 是核糖核蛋白体的简称 也叫核蛋白体 是由核糖体 ＲＮＡ ＲＮＡ 和蛋白质组成的一种非膜性的细胞器 它是细胞中蛋白质合成的重要场所 除了病毒和哺乳 动物的成熟红细胞等极个别高度分化的细胞外 核糖体存在于一切细胞内 是细胞最基本的 不可缺少的结构 此外 核外膜 线粒体和叶绿体中也存在着核糖体 一 核糖体的类型和化学组成 生物体内含有两种基本类型的核糖体 一种是 ７０Ｓ Ｓ为沉降系数单位 的核糖体 存 在于原核细胞和真核细胞的叶绿体细胞器内 另一种是８０Ｓ的核糖体 存在于真核细胞 此 外 真核细胞线粒体中的核糖体为５５Ｓ 核糖体均由大小不同的两个亚基组成 大的称大亚 基 小的称小亚基 核糖体大小亚基在细胞内一般以游离状态存在 只有当小亚基与 ｍｒ ＮＡ 结合后 大亚基才与小亚基结合 形成完整的核糖体 核糖体的大 小亚基之间的结合与分离是依环境条件和生理状态而定 其中 Ｍ２ 浓度 有着重要的作用 当 Ｍ２ 浓度大于１ｍｍ Ｌ 时 大 小两个亚基即结合起来 成为一个核 ２ 糖体 若 Ｍ 浓度再增加１０倍 两个单核糖体可以形成１００ 的二聚体 而当 Ｍ２ 浓度降 低时 二聚体可变为单核糖体 核糖体也可以分解成大小二个亚基 在真核细胞和原核细胞中 核糖体的主要化学成分是蛋白质和ＲＮＡ 但是各自ＲＮＡ

63 ２２２ 细胞生物学 分子的长度 蛋白质数量以及所形成的大小亚基是不相同的 表 ９ １ 在真核细胞 ８０Ｓ 核 糖体中 大亚基为６０Ｓ 由２８Ｓ ５ ８Ｓ和５ＳＲＮＡ 分子与４９种蛋白质组成 小亚基为４０Ｓ 由１８ＳＲＮＡ 与３３种蛋白质结合组成 在原核细胞 ７０Ｓ 核糖体中 大亚基为 ５０Ｓ 由 ２３Ｓ ５ＳＲＮＡ 分子与３４种蛋白质组成 小亚基为 ３０Ｓ 由 １６ＳＲＮＡ 与 ２１ 种蛋白质结合组成 ＲＮＡ 约占核糖体的 ６０ 蛋白质约占 ４０ 蛋白质分子主要分布在核糖体的表面 而 ＲＮＡ 则位于内部 二者靠非共价键结合在一起 核糖体中的 ＲＮＡ 主要构成核糖体的骨 架 将蛋白质串联起来 并决定蛋白质的定位 表９ １ 原核细胞与真核细胞核糖体成分的比较 核糖体类型 大小 亚基 ＲＮＡ 蛋白质 真核细胞 ８０Ｓ 大亚基６０Ｓ ２８Ｓ ５ ８Ｓ ５Ｓ ４９种 小亚基４０Ｓ １８Ｓ ３３种 大亚基５０Ｓ ２３Ｓ ５Ｓ ３４种 小亚基３０Ｓ １６Ｓ ２１种 原核细胞 ７０Ｓ 二 核糖体的结构 在电子显微镜下 核糖体是直径为１５ ２５ｍ 的圆形致密小颗粒 存在于细胞质中 没 有被膜包裹 属于非膜性的细胞器 核糖体具有一定的三维形态 且每一核糖体均由大 小两个亚基构成 图 ９ １ 肝核 糖体做负染色显示 大亚基略呈半圆形 直径约为 ２３ｍ 在一侧伸出三个突起 中央为一 凹陷 小亚基呈长条形 大小为２３ １２ｍ 在约 １ ３ 长度处有一细的缢痕 将小亚基分为 大小两个区域 当大小亚基结合在一起形成核糖体时 其凹陷部位彼此对应 从而形成一个 隧道 为蛋白质翻译时 ｍｒｎａ 的穿行通路 此外 在大亚基中还有一垂直于该隧道的通道 在蛋白质合成时 新合成的肽链由此通道穿出 可保护新生肽链免受蛋白水解酶的降解 图９ １ 不同侧面观的核糖体立体结构模式图 引自 Ｈ Ｌ

64 第九章 细胞的内膜系统 ２２３ 三 核糖体在细胞内的分布与蛋白质合成 一 核糖体在细胞内的分布 细胞质中的核糖体可以游离存在于细胞质基质中 称为游离核糖体 ｍ 也 可附着在内质网膜或核膜的表面 称为附着核糖体 附着在内质网膜上 ｍ 的核糖体是以其大亚基的圆锥形尖部与膜接触 游离核糖体常见于未分化的细胞 如血母细 胞 淋巴细胞以及蛋白质代谢旺盛的细胞等 而且分布是比较均匀的 附着于内质网膜上的 核糖体 其附着情况也有所不同 在某些细胞中 核糖体是均匀地附着于细胞质中某一部分 的内质网膜上 如浆细胞 有的却集中地附着于细胞质中某部分的内质网膜上 如分泌酶原 的胰腺腺泡细胞 无论是附着的或游离的核糖体 在蛋白质合成过程中 都常常是几个甚至几十个集结在 一起参加活动 由直径１０ １５ｍ 的 ｍｒｎａ 细丝将它们串联在一起 这样的一个功能单位 称为多聚核糖体 ｍ 是蛋白质合成的标志 多聚核糖体中各单位的间距并不均 等 约３０ ３５ｍ 如幼红细胞的多聚核糖体常常是 ５ 个核糖体聚集在一起 多聚核糖体的 形状可以为针簇 菊花形或念珠形的长链 多聚核糖体中核糖体的数目是由 ｍｒｎａ 分子的 长度与它所合成的蛋白质分子的大小来决定的 蛋白质分子越大 所需多聚核糖体的核糖体 数目就越多 串联它们的 ｍｒｎａ 分子就愈长 反之亦然 游离核糖体主要合成结构蛋白质 内源性蛋白质 多分布在细胞质基质中或供细胞本 身生长代谢所需要 附着核糖体主要合成输出蛋白质 分泌蛋白质 和膜蛋白 分泌蛋白质 可从细胞中分泌出去 如抗体 酶原和蛋白质类激素 二 蛋白质的生物合成 核糖体是细胞内合成蛋白质的细胞器 当核糖体沿着 ｍｒｎａ 分子链移动时 就按 ｍｒ ＮＡ 上的遗传密码 将ＲＮＡ 转运来的各个氨基酸连接成多肽链 最终完成蛋白质的合成 蛋白质的生物合成机理十分复杂 涉及到 ｍｒｎａ ＲＮＡ ＲＮＡ 及一系列酶 蛋白质 因子 此外 还要有能量物质 ＡＴＰ 和 ＧＴＰ 整个过程分为四个阶段 即氨酰 ＲＮＡ 的合 成 肽链合成的起始 肽链的延长 肽链的终止与释放 第一阶段在细胞质中完成 后三个 阶段在核糖体上进行 核糖体合成蛋白质的功能与其上的六个活性部位有着密切的关系 图 ９ ２ ① 供体部 位 又称 Ｐ 位或肽酰基部位 位于大亚基上 是肽酰 ＲＮＡ 结合的位置 ② 受体部位 又 称 Ａ 位或氨酰基部位 位于大亚基上 是接受氨酰 ＲＮＡ 的部位 ③ Ｅ 部位 位于大亚基 上 是ＲＮＡ 脱离核糖体的部位 ④ Ｔ 因子位 是肽基转移酶位 位于大亚基上 其作用 是催化氨基酸与氨基酸间形成肽键 ⑤ Ｇ 因子位 是 ＧＴＰ 酶位 位于大亚基上 能分解 ＧＴＰ 分子并将肽酰 ＲＮＡ 由 Ａ 位移到 Ｐ 位 ⑥ 与 ｍｒｎａ 的结合位点 位于小亚基上 １ 氨酰 ＲＮＡ 的合成 由于 ｍｒｎａ 上的密码子不能直接识别氨基酸 所以作为蛋白质 合成原料的氨基酸只有与相应的ＲＮＡ 结合形成氨酰 ＲＮＡ 复合物后运输到核糖体 才能通

65 ２２４ 细胞生物学 过ＲＮＡ 反密码子环上的反密码子解读 ｍｒｎａ 上的相应密码子 氨酰 ＲＮＡ 的合成是在特 异性的氨酰 ＲＮＡ 合成酶的作用下完成的 这种酶能激活氨基酸 使之与ＲＮＡ 结合 这个 过程需要消耗 ＡＴＰ 以提供能量 图９ ２ 核糖体上三个 ＲＮＡ 结合位点 引自 Ｂ Ａ 等 ２ 肽链合成的起始 游离于细胞质中的小亚基在三种起始因子 ＩＦ 参与下形成起始 复合物 其中ＩＦ３参与 ｍｒｎａ 同 ３０Ｓ 小亚基的结合 并阻止 ５０Ｓ 的大亚基与小亚基结合 ＩＦ１和ＩＦ２促使ＲＮＡ 结合到 ｍｒｎａ 的 ３０Ｓ小亚基复合物上 ｍｒｎａ 上的起始密码子 ＡＵＧ 可为特定的ＲＮＡ 的反密码子所识别 这种特定的ＲＮＡ 在原核生物可携带甲酰甲硫氨酸 而在真核生物中则携带甲硫氨酸 那么这样就形成由小亚基 ｍｒｎａ 和甲酰甲硫氨酸ＲＮＡ 或甲硫氨酸ＲＮＡ 所构成的起始复合物 在这之后 ５０Ｓ的大亚基与起始复合物中的 ３０Ｓ 亚基结合 形成７０Ｓ的完整的核糖体与 ｍｒｎａ 的起始复合物 同时 ＧＴＰ 水解释放三种起 始因子 ３ 肽链的延伸 ① 氨酰 ＲＮＡ 进入 Ａ 位 在多肽链合成起始时 甲酰甲硫氨酰 ＲＮＡ 已结合到 Ｐ 位 Ａ 位尚空闲 Ａ 部位暴露出 ｍｒｎａ 上的三联体密码子 决定第二个氨酰 ＲＮＡ 是以与延伸因子 ＥＦ 和 ＧＴＰ 形成的复 ＲＮＡ 的种类 核糖体所接纳的第二个氨酰 合物的形式存在的 在延伸因子的作用下将相应的氨酰 ＲＮＡ 安置到 Ａ 部位 到位后 ＧＴＰ 水解 ＥＦ 连同结合在一起的 ＧＤＰ 离开核糖体 此时 Ｐ 部位和 Ａ 部位均被相应的氨酰 Ｒ 所占据 肽链的形成 在核糖体上肽基转移酶作用下把 部位的氨酰 的羧基 ＮＡ ② Ｐ ＲＮＡ 与 Ａ 部位的第二个氨酰 ＲＮＡ 的氨基酸的氨基结合 形成肽键 肽键形成后 Ｐ 部位上的 氨酰 ＲＮＡ 卸下氨基酸而成为无负载的ＲＮＡ 这时 Ａ 位点上的ＲＮＡ 负载的是一个二肽 ③ 移位和肽链的延伸 在移位酶和 ＧＴＰ 的参与下核糖体沿着 ｍｒｎａ５ ３ 的方向相对移动 一个三联体密码子的距离 二肽酰 ＲＮＡ 从 Ａ 部位移到 Ｐ 部位 Ｐ 部位移到 Ｅ 部位 空载 的转运 ＲＮＡ 从核糖体 Ｅ 部位脱离下来 Ａ 位点被空出 新空出的 Ａ 位点再接纳下一个新来 的氨酰 ＲＮＡ 肽链以同样的方式不断地延伸 ４ 肽链合成的终止及释放 当 Ａ 部位出现 ｍｒｎａ 上三个终止密码 ＵＡＡ ＵＡＧ 和 ＵＧＡ 中的任何一个时 它不能被任何氨酰 ＲＮＡ 所识别 释放因子 终止因子 识别 ｍｒｎａ 分子上出现在核糖体 Ａ 部位上的终止密码子 并与之结合 并活化肽基转移酶 Ｔ 因子 使肽链从ＲＮＡ 上水解下来 ＲＮＡ 离开核糖体 核糖体此时也与 ｍｒｎａ 分离 并 解离成为大 小两个亚基 贮存在细胞质中 以备另一次蛋白质的合成 原核细胞中小亚基

66 第九章 细胞的内膜系统 ２２５ 仍与ＩＦ３结合 再次进入下一次循环中 因此 多肽链的合成终止 所形成的肽链上的氨基 酸顺序就完全按照 ｍｒｎａ 上密码子的顺序排列 而 ｍｒｎａ 上的密码子则由 ＤＮＡ 转录而来 合成后的多肽链在终止因子 ＲＦ 作用下从核糖体上释放出来 被释放出来的多肽链按照 各自遗传的特定方式加工 折叠成为一定空间结构的蛋白质 以上叙述的仅是单个核糖体上蛋白质合成的情况 其实细胞内蛋白质的生物合成是由多 聚核糖体合成的 当一个个核糖体先后从同一个 ｍｒｎａ 的起始密码子开始移动 一直到终 止密码子为止时 就可合成一条条相同的多肽链 这样可提高蛋白质的合成效率 图９ ３ 图９ ３ 多聚核糖体上蛋白质的合成过程示意图 引自 Ｂ Ａ 等 核糖体是一种动态结构 只有在蛋白质合成过程中 大 小亚基才结合在一起 当蛋白 质合成结束时 大 小亚基分开而游离于胞质中 三 蛋白质的加工修饰 细胞内核糖体所合成的蛋白质 大多数还需经过加工修饰后才具有生物活性 如某些酶 蛋白 刚合成时是不具催化活性的酶原分子 当经过加工修饰后才成为具有催化活性的酶 另一些蛋白质如胰岛素作为一种蛋白激素 刚合成时不具活性 为胰岛素原 当经修饰去掉 一部分肽段后 才形成有活性的胰岛素分子

67 ２２６ 细胞生物学 四 蛋白质的定位控制 细胞内的所有蛋白质的合成都从胞质溶胶中核糖体开始的 少数线粒体和叶绿体的蛋白 质例外 但大多数线粒体和叶绿体的蛋白质还是在胞质溶胶中合成然后输入的 对于膜性细 胞器来说 在其从胞质溶胶或其他细胞器输入蛋白质时 采用不同的方法来实现 但全都需 要消耗能量 蛋白质从胞质溶胶移到核内是通过穿过核外膜和核内膜的核孔转运的 核孔起选择性通 道的作用 它主动转运特定的大分子 但也允许小分子自由扩散通过 图 ９ ４ ⑴ 蛋白质 从胞质溶胶到内质网 线粒体 叶绿体或过氧化物酶体是通过位于膜内的蛋白质转运体运过 细胞器膜的 与通过核孔的转运不同 被转运的蛋白质分子通常必须伸展以穿过膜 图 ９ ４ ⑵ 细菌在其质膜内也有类似的蛋白质转运体 蛋白质从内质网或从一个内膜系统的区室 到另一个区室的转运采用与上述两种根本不同的机理 它们是用转运小泡转运的 转运小泡 从一个区室的内部间隙 或称 腔 装载蛋白质 从膜上长出并离开 这些小泡然后用膜 融合的方法将所包被的蛋白质卸到第二个区室中去 图 ９ ４ ⑶ 在这个过程中膜脂和膜蛋 白也从第一区室转到第二区室 图９ ４膜被细胞器输入蛋白质的三种主要机制 引自 Ｂ Ａ 在转运机制１ ３中 蛋白质在转运过程中保持折叠状态 但通常 在机制２中则为伸展状态 所有转运过程都需能量

68 第九章 细胞的内膜系统 ２２７ 膜性细胞器输入蛋白质的这三种主要机制都是在信号序列的指导下 把蛋白质运到正确 的区室中去的 第二节 内 质 网 内质网 ｍ ｍ ＥＲ 在细胞内膜系统中占有中心地位 约占细胞内膜 系统的５０ 左右 广泛存在于除哺乳动物红细胞以外的所有真核细胞的细胞质内 １９４５ 年 Ｐ 等应用电子显微镜首次对培养的小鼠成纤维细胞进行观察 发现细胞质内存在由一些 小管和小泡样结构连接成网状的结构 故命名为内质网 一 内质网的形态结构和分类 内质网是由一层单位膜围成的小管 小泡 和扁囊 ｍ 这三种 基本形态所构成 小管 小泡和扁囊可视为内质网的 单位结构 膜厚 ５ ６ｍ 这些小管 小泡和扁囊互相分枝吻合连通成三维网状膜系统 图 ９ ５ 内质网膜与 核膜外膜相连续 内质网腔与核膜腔相通 图９ ５ 内质网立体结构模式图 引自 Ｅ Ｄ Ｐ ＤＲ 等 引自 Ｒ Ｖ Ｋ 内质网的形态结构 分布状态和数量多少在不同的细胞中各不相同 这常与细胞类型 生理状态以及分化程度等有关 内质网的形态结构在不同细胞中差异很大 有些细胞中小 管 小泡 扁囊三种单位结构全有 而另一些细胞中只有其中一种或二种 如鼠肝细胞中的 内质网以扁囊和小管状结构为主 扁囊成组排列 并与细胞质外质区的小管相连 而睾丸间 质细胞中的内质网则由大量的小管连接成网状 内质网的分布状态和数量多少与细胞中的生 理功能相关 执行分泌功能的细胞内质网比较发达 随生理功能的不同 同一细胞在不同发 育时期 其内质网也不相同 例如 胚胎细胞的内质网常比较小 相对地不发达 但随着细 胞的分化 内质网的结构变得复杂起来 根据内质网膜外表面有无核糖体颗粒附着将内质网分为两大类 即粗面内质网 ｍ ｍ ＲＥＲ 和滑面内质网 ｍ ｍ ｍ ＳＥＲ

69 ２２８ 细胞生物学 一 粗面内质网 粗面内质网又称颗粒内质网 ｍ ｍ ＧＥＲ 图 ９ ６ 因其膜 外表面有大量颗粒状核糖体附着而命名 图９ ６ 内质网立体结构模式图 引自 Ｂ Ａ 等 粗面内质网多为互相连通的扁囊 也有少数的小泡和小管 粗面内质网的形态在不同类 型的细胞中有所不同 例如 浆细胞和胰腺外分泌细胞都是分泌活动旺盛的细胞 它们的粗 面内质网由许多扁囊平行排列 往往形成同心层板状结构 而滑膜细胞和软骨细胞的粗面内 质网则为不规则的囊泡 粗面内质网是一种可变的细胞器 可根据发达程度作为判断细胞功能状态和分化程度的 形态指标 如高度分化的胰腺外分泌细胞在分泌旺盛时 粗面内质网增加 静止时减少 未 分化或未成熟的细胞 如干细胞和胚胎细胞等 粗面内质网则不发达 肿瘤细胞中也是如 此 如在实验性大白鼠肝癌中 凡分化程度高 生长慢的癌细胞粗面内质网很发达 反之在 分化程度低 生长快的癌细胞中 则偶见少数粗面内质网 二 滑面内质网 滑面内质网又称无颗粒内质网 ｍ ｍ ＡＥＲ 膜表面光滑 无核糖体颗粒附着 滑面内质网的结构常由分支小管和小泡构成 很少有扁囊状 汗腺细 胞 皮脂腺细胞以及分泌甾类激素的细胞中滑面内质网比较丰富 两种类型的内质网在不同细胞中的分布有所不同 在胰腺外分泌细胞中 全部为粗面内 质网 在肌细胞中全为滑面内质网 而在肾上腺皮质细胞中则两种类型并存 二 内质网的化学组成 对内质网化学组成方面的研究 需要把内质网从细胞质中分离出来 应用蔗糖密度梯度 离心方法 可以从组织细胞匀浆中分离出微粒体 ｍ ｍ 微粒体不是细胞内的一种固

70 第九章 细胞的内膜系统 ２２９ 有结构 而是内膜系统中各组分的膜断片自然卷曲而成的封闭小泡 表面附有核糖体的为粗 面微粒体 表面光滑没有核糖体附着的为滑面微粒体 通过进一步离心 可以把粗面微粒体 和滑面微粒体分离开 因此 可以把微粒体作为研究内质网的材料 通过对微粒体的生化分析 了解到内质网膜化学成分是由脂类和蛋白质组成 脂类约占 １ ３ 蛋白质约占２ ３ 其中滑面内质网的脂类比粗面内质网多一些 内质网膜脂类成分中主要为磷脂 此外还有中性脂 缩醛脂和神经节苷脂等 各类磷脂 的比例大致为 磷脂酰胆碱为 ５５ 磷脂酰乙醇胺为 ２０ ２５ 磷脂酰丝氨酸为 ５ １０ 磷脂酰肌醇为５ １０ 鞘磷脂为４ ７ 可见内质网膜含有丰富的磷脂酰胆碱 卵磷脂 而鞘磷脂的含量很少 内质网膜的蛋白质含量比细胞膜多 如大鼠肝细胞的内质网 通过聚丙酰胺凝胶电泳研 究 至少可 见 ３３ 条 多 肽 泳 带 胰 腺 细 胞 的 内 质 网 膜 有 ３０ 条 泳 带 分 子 量 从 １５０００ １５００００ 内质网膜含有大量的酶类 其中葡萄糖 ６ 磷酸酶作为内质网膜的标志酶 另一类 内质网膜的标志酶是电子传递体系 ｍ 如细胞色素 ５ ＮＡＤＨ细 胞色素 ５还原酶 ＮＡＤＰＨ细胞色素还原酶 细胞色素 Ｐ４５０以及 ＮＡＤＰＨ细胞色素 Ｐ４５０ 还原酶 在这些酶中 除细胞色素 Ｐ４５０是跨膜蛋白之外 其他的一些酶则是内质网的嵌入 蛋白 此外 内质网也含有参与各种脂类合成的酶系 三 内质网的功能 一 粗面内质网的功能 粗面内质网主要负责蛋白质的合成 修饰和加工 分选与转运 １ 粗面内质网与蛋白质合成 粗面内质网膜上附着有核糖体颗粒 核糖体是蛋白质合 成的场所 内质网膜为核糖体附着提供了支架 附着于粗面内质网膜上的核糖体合成的蛋白 质主要为分泌蛋白 内质网腔可溶性驻留蛋白 溶酶体蛋白和膜蛋白等 合成的蛋白质是如何进入粗面内质网腔或被整合到粗面内质网膜中 在这方面有比较深入的 研究 颇受支持的是１９７５ 年提出的信号假说 该假说认为 ① 来自细 胞核的 ｍｒｎａ 带有合成蛋白质的密码 它进入细胞质以后 同若干核糖体结合 成为多聚 核糖体 进行蛋白质合成活动 核糖体首先由 ｍｒｎａ 上特定的信号密码 翻 译合成一短肽 信号肽 它由１８ ３０个疏水氨基酸组成 ② 在细胞质基 质中存在着信号识别颗粒 ＳＲＰ 图９ ７ Ｂ 它由６条肽链和 ７Ｓ的 ＲＮＡ 组成 结构上分为不同功能区域 ＳＲＰ 既能识别露出核糖体之外的信号肽 又能 识别粗面内质网膜上的 ＳＲＰ 受体 ③ 当 ＳＲＰ 与信号肽识别并结合形成 ＳＲＰ 信号肽核糖体 复合物时 核糖体的蛋白质合成暂时终止 结合的 ＳＲＰ 信号肽核糖体复合物由 ＳＲＰ 介导引 向粗面内质网膜上的 ＳＲＰ 受体 并与之结合 核糖体则以大亚基与附着于内质网膜上的核 糖体结合蛋白 Ⅰ和Ⅱ结合 ④ ＳＲＰ 受体在内质网膜上是一种停泊蛋白 ｋ ＳＲＰ 与 ＳＲＰ 受体的结合是临时性的 当核糖体附着于内质网膜上之后 ＳＲＰ

71 ２３０ 细胞生物学 便离去 图９ ７ Ａ ⑤ 当能合成信号肽的核糖体与内质网膜结合之后 核糖体的信号肽 便经由内质网膜插入膜腔内 而先前处于暂停状态的蛋白质活动又恢复 进入内质网腔的信 号肽 由位于内质网膜内表面的信号肽酶切掉 与之相连的合成中的肽链继续进入内质网 腔 直至肽链合成终止 最后核糖体脱离内质网 重新加入 核糖体循环 图９ ７ ＳＲＰ Ｂ ＳＲＰ与核糖体结合与分离模式图 引自 Ｂ Ａ 等 如果内质网上核糖体合成的是可溶性蛋白 多肽链则全部穿过内质网膜 进入内质网腔 中进行折叠 蛋白质折叠需要内质网腔内的可溶性驻留蛋白如蛋白二硫异构酶 ＰＤＩ 结 合蛋白 Ｂ 的参与 分子伴侣能特异 等分子伴侣 ｍ 地识别新生肽链或部分折叠的多肽并与之结合 帮助这些多肽进行折叠 装配和转运 但其 本身并不参与最终产物的形成 只起陪伴作用 故而得名 分子伴侣能检查多肽的折叠状 态 可以与不正确折叠的多肽结合 并把它们滞留在内质网腔内 内质网分子伴侣具有热休 克蛋白 ｋ ＨＳＰ 的特性 在各种应急状态下如错误折叠蛋白质和非糖基 化蛋白的积聚 其表达明显升高 内质网分子伴侣之所以能滞留于内质网腔内 是由于其 Ｃ 末端存在一个驻留信号肽 其氨基酸序列为丝氨酸赖氨酸亮氨 酸 又称 ＫＤＥＩ序列 该序列能与内质网膜上的 ＫＤＥＩ受体结合 在内质网上合成的蛋白质有两种类型 一类是在合成过程中全部穿过内质网膜 进入内 质网腔成为可溶性蛋白 这类蛋白包括分泌蛋白 溶酶体蛋白及内质网驻留蛋白 另一类是 插入内质网膜中的膜蛋白 内质网膜上的膜蛋白的嵌插取决于合成蛋白质上的穿膜信号 起 始和终止信号 嵌插于内质网膜内的膜蛋白可随运输小泡转移而移行至细胞表面 成为细

72 第九章 细胞的内膜系统 ２３１ 胞膜或其他膜性细胞器的膜 关于跨膜蛋白插入内质网膜的过程比较复杂 一种比较简单的机制就是单次跨膜蛋白的 嵌插 它的信号肽位于新生肽链的氨基末端 信号肽是疏水的起始转移序列 用以启动转 运 转运过程被多肽链中的另一个疏水的终止转移序列所终止 并固定在膜上形成单次α 螺 旋的跨膜节段 同时 氨基端的信号肽被信号肽酶切除 结果 这个被转运的蛋白质最后成 为插入内质网膜中的单次跨膜蛋白 它有一个确定的取向 即氨基端在膜的腔内侧 羧基端 在胞液侧 图９ ８ 在多次跨膜蛋白的多肽链来回穿行于脂质双层 是因为在这样的多肽 链中疏水的信号序列是成对起作用的 另一种机制是合成蛋白的信号肽并不在氨基末端 而 是一个多肽链内部的起始转移序列 内信号肽 用来启动转移 而 且是不被切除的 一个内部的信号序列 起始转移序列 用来启动多肽链的转移 一直继续 到遇到一个终止转移序列为止 这样两个α 螺旋疏水的序列都镶嵌在了脂质双层中 起始序 列和终止序列都不被切除 整个多肽链作为穿膜两次的跨膜蛋白定位在膜中 图 ９ ９ 在 一些复杂的在膜中来回穿行多次的蛋白质中 许多肽段穿行在脂双层中 这就需要更多的终 止和起始序列对而起作用 这些疏水序列依次完成穿膜运动 这样 跨膜多次的蛋白质就一 针针缝在脂双层上 因此 起始和终止信号决定跨膜蛋白在脂双层中的排列 图９ ８ 跨膜蛋白形成 引自 Ｂ Ａ 等 ２ 粗面内质网与蛋白质糖基化 在糖基转移酶催化下 寡聚糖链与蛋白质的氨基酸残 基共价连接的过程称为蛋白质糖基化 大多数分泌蛋白和膜嵌入蛋白等都是糖蛋白 蛋白质 的糖基化主要在高尔基复合体中进行 粗面内质网腔内也进行部分糖基化 粗面内质网腔中 进行的糖基化主要是 Ｎ连接糖基化 即寡聚糖链与蛋白质的天冬酰胺残基侧链上的ＮＨ２ 连 接 寡聚糖先与粗面内质网膜上一种特殊脂类 多萜醇 分子连接 形成活化 型寡聚糖 一旦新合成的肽链出现天冬酰胺 Ａ 残基 粗面内质网膜上的糖基转移酶即 催化低聚糖链转位于该残基上 形成 Ｎ连接的糖蛋白 图９ １０

73 ２３２ 细胞生物学 图９ ９ 多次跨膜蛋白 引自 Ｂ Ａ 等 图９ １０ Ｎ连接糖基化 引自 Ｂ Ａ 等 ３ 粗面内质网与分泌蛋白质运输 在粗面内质网核糖体上合成的分泌蛋白大多数经由 高尔基复合体排出细胞 由核糖体合成的分泌蛋白进入内质网腔之后 经过折叠和糖基化作 用 又被包裹于由内质网分离下来的小泡之内 再经由高尔基复合体变为浓缩泡 之后再由 浓缩泡发育成酶原颗粒而被排出细胞外 这是分泌蛋白质常见的排出途径 另一种途径是含 有分泌蛋白质的小泡由内质网脱离后直接形成浓缩泡 再由浓缩泡发育成酶原颗粒而被 排出 ４ 粗面内质网与脂类的合成 内质网是脂类合成的一个重要场所 包括粗面内质网与 滑面内质网都能合成脂类 但合成的种类和数量均有差异 构成细胞膜和细胞内膜系统的膜 脂如磷脂和胆固醇等 大部分是在粗面内质网合成的 在粗面内质网合成的主要磷脂是卵磷 脂 即磷脂酰胆碱 磷脂合成的每一步所需要的酶均存在于内质网膜上 在内质网膜的胞液

74 第九章 细胞的内膜系统 ２３３ 面有其活性位点 合成磷脂所需要的底物存在于胞液中 因此 磷脂的合成只发生在内质网 脂双层胞液面的一侧 以下从卵磷脂的生物合成过程来描述脂类的组装原理 卵磷脂由脂肪 酸 磷酸甘油和胆碱在三种酶的催化下 经过三个步骤合成 首先由酰基转移酶将细胞质中 的脂肪酸和磷酸甘油缩合成磷脂酸 磷脂酸为非水溶性化合物 合成后则直接插入脂质双层 的细胞质胞液面 其次在磷脂酸酶的催化下 以磷脂酸和磷酸甘油为原料合成二脂酰甘油 酯 最后在胆碱磷酸转移酶的催化下 由二脂酰甘油酯和 ＣＤＰ 胆碱合成卵磷脂 新合成的 磷脂分子最初只位于内质网膜细胞质胞液面 后来在结合于内质网膜上的脂类转移蛋白 即 翻转酶 的作用下 选择性地将磷脂分子从细胞质胞液面翻转到内质网腔面 从而 使脂质双层能平行伸展 新合成的脂类中 有一部分如同上述那样 嵌入到内质网脂类双层 中 构成内质网膜 另一部分则输送到其他细胞器 二 滑面内质网的功能 虽然在大多数细胞中 滑面内质网的形态相似 但其化学组成 酶的种类和含量等均有 差异 因此 不同类型细胞中滑面内质网的功能各有不同 １ 脂质和固醇的合成与运输 合成脂类和固醇激素是滑面内质网最主要的功能 在滑 面内质网膜上也有脂类合成有关的酶类 可合成甘油三酯 磷脂和胆固醇等 在内质网膜脂 双层靠近细胞质一侧 可在酶的催化下利用细胞质中的底物合成脂类 图９ １１ 图９ １１ 磷脂酰胆碱在内织网膜上合成过程的示意图 引自 Ａ １９９４ 在肾上腺皮质细胞 睾丸间质细胞 卵巢黄体细胞等分泌类固醇激素的细胞中 滑面内 质网非常发达 实验证明 滑面内质网含有合成胆固醇所需的全套酶系和使胆固醇转化为类 固醇激素 如肾上腺激素 雄性激素 雌性激素 的酶类 滑面内质网还具有脂类运输的作用 如小肠上皮细胞的滑面内质网可将甘油一酯和脂肪

75 ２３４ 细胞生物学 酸合成脂肪 并与蛋白质结合生成脂蛋白 通过高尔基复合体加工转运出细胞 ２ 糖原的合成与分解 肝细胞中滑面内质网常与糖原相伴而存在 当糖原丰富时 滑 面内质网被遮盖不易分辨 而当动物饥饿几天后 糖原颗粒减少 滑面内质网清晰可见 这 说明糖原的合成与滑面内质网有关 但是另有实验得出与此相反的结果 如尿苷二磷酸葡萄 糖 ＵＤＰＧ 糖原转移酶并不与内质网膜结合 而是结合在糖原颗粒上 如果把 ＵＤＰＧ糖 原转移酶加到引物糖原上 便可参与糖原的合成 这说明糖原的合成与滑面内质网无关 已有实验证明滑面内质网也参与糖原的分解 在肝细胞内的滑面内质网膜上含有 ６ 磷 酸葡萄糖酶 该酶可将肝糖原降解产生的 ６ 磷酸葡萄糖分解为磷酸和葡萄糖 然后将葡萄 糖释放到血液中 ３ 解毒作用 肝的解毒作用主要是由肝细胞的滑面内质网来完成 滑面内质网含有参 与解毒的各种酶系 如 ＮＡＤＨ细胞色素 ５ 还原酶 ＮＡＤＨ细胞色素 还原酶 细胞色素 Ｐ４５０以及 ＮＡＤＰＨ细胞色素 Ｐ４５０还原酶等 如果给动物服用大量苯巴比妥 可见肝细胞内 滑面内质网增生 同时与解毒作用有关的酶含量也明显增多 肝细胞的解毒作用 主要通过 滑面内质网膜上的氧化酶系对药物和毒物进行氧化和羟化反应 使药物转化或消除其毒性 并且易于排出体外 ４ 肌肉的收缩 滑面内质网在肌细胞中形成一种特殊结构称为肌质网 ｍ ２ ２ ｍ 肌质网的作用是调节肌细胞中 Ｃ 的浓度 肌质网释放 Ｃ 于肌纤维丝之间 通过肌钙蛋白等一系列相关蛋白的构象改变和位置变化引起肌肉收缩 当肌肉松弛时 肌质 网上的 Ｃ２ 泵将 Ｃ２ 泵回肌质网 故肌细胞中的滑面内质网通过释放和摄取 Ｃ２ 参与肌肉 的运动 四 内质网的病理变化 内质网是比较敏感的细胞器 在各种因素如缺氧 射线 化学毒物和病毒等作用下 会 发生病理变化 如内质网肿胀 肥大和某些物质的累积 内质网肿胀是一种水样变性 主要是由于水分和钠的流入 使内质网形成囊泡 这些囊 泡还可互相融合而扩张成更大的囊泡 如果水分进一步聚集 便可使内质网肿胀破裂 肿胀 是粗面内质网发生的最普遍的病理变化 内质网腔扩大并形成空泡 继而核糖体从内质网膜 上脱落下来 这是粗面内质网蛋白质合成受阻的形态学标志 当某些感染因子刺激某些特定细胞时 会引起这些细胞的内质网变得肥大 这反映了内 质网具有抗感染作用 例如 当 Ｂ 淋巴细胞受到抗原物质 如病菌 刺激时 可转变成浆 细胞 此时 浆细胞内的内质网肥大 免疫球蛋白的分泌增加 巨噬细胞的内质网肥大 表 现为溶解酶的合成增强 当细胞在药物的作用下 常会出现内质网的代偿性肥大 对药物进 行解毒或降解 由基因突变造成的某些遗传病中 可观察到蛋白质 糖原和脂类在内质网中的累积 例 如 在α １ 抗胰蛋白酶缺乏症患者的血清中 缺乏α １ 抗胰蛋白酶 而在肝细胞的粗面内质网 和滑面内质网中却贮留着 α １ 抗胰蛋白酶 α １ 抗胰蛋白酶在内质网中的累积 是由于 α １ 抗 胰蛋白酶的分子结构发生了异常改变所致

76 第九章 第三节 细胞的内膜系统 ２３５ 高尔基复合体 １８９８ 年 Ｃｍ Ｇ 应 用 银 染 等 方 法 首次在猫和猫头鹰的神经细胞中观察到一种 网状结构 命名为内网器 后来在 很 多 动 植 物 细 胞 中 都 发 现了这 种 结 构 并 称 之 为 高 尔 基 体 Ｇ 本世 或高尔基器 Ｇ 纪５０年代 电镜技术证实高尔基体是一组 复合结 构 故 改 称 为 高 尔 基 复 合 体 Ｇ ｍ ｘ 图９ １２ 高尔基复合体普遍存在于真核细胞中 是细胞内一种固有的细胞器 它在细胞的蛋 白质加工和分泌过程中有着重要的作用 图９ １２ 高尔基体电镜图 引自 Ｂ Ａ 一 高尔基复合体的形态结构 在光镜下 可见脊椎动物大多数细胞的高尔基复合体呈复杂的网状结构 在电镜下 高尔基复合体是由重叠的扁平囊 小囊泡和大囊泡三种基本形态所组成的一 种比较复杂的膜性结构 膜的表面光滑 无核糖体附着 其显著特征是重叠的扁平囊堆积在 一起 形成高尔基堆 Ｇ ｋ 构成了高尔基体的主体结构 图 ９ １３ 扁平囊呈弓 形 也有的呈半球形或球形 扁平膜囊周围有大量的大小不等的囊泡结构 高尔基复合体具 有极性 扁平囊凸面朝向细胞核或内质网为顺面 也称形成面 ｍ 扁 平囊凹面朝向细胞膜为反面 也称成熟面 ｍ 一 顺面高尔基网络 Ｇ ｗ ｋ ＣＧＮ 在扁平囊的顺面 常可见到许多直径约４０ ８０ｍ 膜厚６ｍ 的小泡 称高尔基复合体 小囊泡 一般认为小囊泡是由附近粗面内质网 芽生 而来 载有粗面内质网合 成的蛋白质和脂类 通过膜融合将内含物转运到扁平囊中 并不断补充扁平囊的膜结构 此 种小囊泡也称为运输小泡 接受来自内质网新合成的物质分选后 将大部 分物质转入高尔基复合体中央扁平囊 小部分蛋白质和脂类再返回内质网 运输小泡与高尔 基复合体扁平囊泡融合 使高尔基复合体膜成分得到不断补充 二 中央扁平囊 中央扁平囊 为高尔基复合体中最富特征性的一种结构 扁平囊一般为 ３ ８ 个平行排列在一起 扁平囊呈盘状 中央部分较窄 边缘部分稍宽大 弯曲似弓形 扁平囊

77 ２３６ 细胞生物学 图９ １３ 高尔基复合体立体结构模式图 引自 Ｂ Ａ 腔宽１０ １５ｍ 囊间距２０ ３０ｍ 扁平囊的中央部分较平 称中央板状区 其上有孔 可 与相邻扁平囊通连 高尔基复合体是具有极性的细胞器 高尔基复合体的顺面和反面 在形 态 化学组成及功能上均有所不同 顺面膜较薄约 ６ｍ 与内质网膜相似 反面膜较厚约 ８ｍ 与细胞膜厚度相仿 因此 从发生和分化的角度看 无论在形态方面还是功能方面 高尔基扁平囊均可视为内质网与细胞膜的中间分化阶段 目前认为 高尔基扁平囊片层至少可分为三个区隔 ｍ ｍ 各由一个或多个扁 平囊组成 每个区隔含有不同的酶 行使不同的功能 例如 顺面扁平囊含有磷酸转移酶 催化磷酸基团加到溶酶体蛋白上 高尔基复合体的顺面主要功能是筛选由内质网新合成的蛋 白质和脂类 并将其大部分转入高尔基复合体的中间扁囊区 一小部分再返回内质网 中间 扁平囊含有 Ｎ乙酰葡萄糖胺转移酶 主要进行蛋白质的糖基化修饰 糖脂形成及多糖合成 而反面扁平囊则含有半乳糖基转移酶 执行蛋白质的分选功能 三 反面高尔基网络 Ｇ ｗ ｋ ＴＧＮ 在扁平囊的反面 成熟面 常有体积较大 直径约１００ １５０ｍ 膜厚８ｍ 数量不等 的大泡 称高尔基复合体大囊泡 主要功能是对蛋白质进行修饰 分选 包装 最后从高尔基复合体中输出的功能 一般认为大囊泡是由扁平囊的末端或局部膨大形成 并 带着扁平囊所形成的物质离去 在分泌细胞中 这种大囊泡又称分泌泡或浓缩泡 随着分泌物而被排到细胞外 大囊泡的膜却掺入到细胞膜 因而细胞膜得到补 充和更新 可见内质网 小囊泡 扁平囊 大囊泡和细胞膜之间存在着一种膜移动的动态 平衡 高尔基复合体的形态结构因细胞类型不同而有较大差异 在分泌细胞 浆细胞和神经细 胞等有典型的扁平囊 小囊泡和大囊泡三种基本形态结构 但在肿瘤细胞和培养细胞则仅有 少量的扁平囊结构 高尔基复合体的分布状态在不同细胞中有很大差异 这与细胞的生理功能有关 在胰腺 细胞 甲状腺细胞 肠上皮粘液细胞以及输卵管的内壁细胞等 高尔基复合体常分布在细胞

78 第九章 细胞的内膜系统 ２３７ 核的附近并趋于细胞的一极 而肝细胞的高尔基复合体则是沿着胆小管分布在细胞的边缘 神经细胞的高尔基复合体是围绕着细胞核分布 少数细胞如卵细胞 精子细胞以及大多数无 脊椎动物细胞和植物细胞的高尔基复合体呈分散状 根据细胞分化程度和功能状况不同 高尔基复合体的数量不同 在分化程度高 分泌功 能旺盛的细胞中 高尔基复合体数量多 如杯状细胞 胰腺外分泌细胞 浆细胞等 而在一 些未分化的胚胎细胞 干细胞或分泌功能不旺盛的淋巴细胞 肌细胞中高尔基复合体数量 少 但也有例外 在成熟的红细胞和粒细胞中 高尔基复合体消失或显著萎缩 综上所述 高尔基复合体是一个结构复杂和高度组织化的细胞器 每一个部分都有其独 特的结构和酶系统 它们在高尔基复合体的功能活动中起着不同的作用 二 高尔基复合体的化学组成 从大鼠肝细胞分离的高尔基复合体约含 ６０ 的蛋白质和 ４０ 的脂类 应用蛋白质凝胶 电泳分析结果显示 高尔基复合体与内质网含有某些共同的蛋白质 但高尔基复合体的蛋白 质含量比内质网膜少 高尔基复合体脂类含量介于内质网膜和细胞膜之间 说明高尔基复合体是一种过渡型的 细胞器 高尔基复合体含有多种酶 如催化糖及蛋白质生物合成的糖基转移酶 催化糖脂合成的 磺基糖基转移酶以及酪蛋白磷酸激酶 甘露糖苷酶 催化磷脂合成的转移酶 磷脂酶等 表９ ２ 其中糖基转移酶被认为是高尔基复合体的特征性酶 表９ ２ 动物细胞高尔基复合体中的各种酶 种类 糖基转移酶 功能 参与糖蛋白合成 唾液酸转移酶 ＵＤＰ 半乳糖 Ｎ乙酰葡萄糖胺半乳糖基转移酶 糖蛋白β 半乳糖基转移酶 ＵＤＰ Ｎ乙酰葡萄糖胺糖蛋白 Ｎ乙酰葡萄糖氨基转移酶 磺基糖基转移酶 参与糖脂的合成 半乳糖脑苷脂硫酸转移酶 ＣＭＰ ＮＡＮＡ ＧＭ１唾液酸基转移酶 ＣＭＰ ＮＡＮＡ ＧＭ３唾液酸基转移酶 ＵＤＰ Ｇ ＮＡＣ ＧＭ２Ｎ乙酰葡萄糖氨基转移酶 转移酶 溶血卵磷脂酰基转移酶 磷酸甘油磷脂酰转移酶 参与磷脂合成

79 ２３８ 细胞生物学 续表 种类 功能 氧化还原酶 ＮＡＤＨ细胞色素 Ｃ 还原酶 ＮＡＤＰＨ细胞色素还原酶 磷酸酶 ５ 核苷酸酶 腺苷三磷酸酶 硫胺素焦磷酸酶 激酶 酪蛋白磷酸激酶 甘露糖苷酶 α 甘露糖苷酶 磷脂酶 磷脂酶 Ａ１ 磷脂酶 Ａ２ 三 高尔基复合体的功能 高尔基复合体的主要功能是参与细胞的分泌活动 对内质网合成的蛋白质进行糖基化等 加工修饰 并将各种蛋白产物进行分选和发送 此外 高尔基复合体在细胞内膜系统的运输 过程中起着重要交通枢纽作用 一 分泌蛋白的加工与修饰 １ 糖蛋白的合成及修饰 细胞的糖蛋白主要存在于分泌泡 溶酶体和细胞膜中 糖蛋 白是由粗面内质网合成的蛋白质经糖基化修饰后形成的 蛋白质糖基化有两种连接 即 Ｎ 连接糖基化和 Ｏ连接糖基化 蛋白质的糖基化是通过糖基转移酶的催化作用而完成的 Ｎ 连接糖基化是由２分子 Ｎ乙酰葡萄糖胺 ９分子甘露糖和３分子葡萄糖构成的寡糖 共价地 结合到蛋白质的天冬酰胺残基侧链的氨基基团的 Ｎ 原子上 而形成 Ｎ连接的寡糖糖蛋白 Ｏ连接糖基化是寡糖与蛋白质的酪氨酸 丝氨酸和苏氨酸残基侧链的羟基基团共价结合 而形成 Ｏ连接的寡糖糖蛋白 Ｏ连接糖基化是在不同的糖基转移酶催化下 每次加上一个 单糖 Ｎ连接的糖基化发生在粗面内质网中 Ｏ连接的糖基化主要或全部发生在高尔基复 合体内 而在内质网腔内合成的 Ｎ连接的寡糖蛋白还必须在高尔基复合体内进行进一步的 加工修饰 一些寡糖残基如大部分的甘露糖被切除 然后又补加上其他一些糖残基如半乳 糖 唾液酸 Ｎ乙酰葡萄糖胺等 图９ １４ 由此形成的糖蛋白的寡糖链在结构上呈现多样

80 第九章 细胞的内膜系统 ２３９ 化差异 因此 高尔基复合体在蛋白质糖基化中起着重要的修饰加工作用 图９ １４ 高尔基体与糖蛋白的加工 引自 Ａ １９８９ 糖基化可以为各种蛋白质打上不同的标志 以利于高尔基复合体的分类和包装 同时保 证糖蛋白从粗面内质网向高尔基复合体膜囊单方向进行转移 糖基化还会帮助蛋白质在成熟 过程中折叠成正确的构象 此外 蛋白质经过糖基化后使其稳定性增加 ２ 蛋白质的加工 由粗面内质网上合成的蛋白质有些是无生物活性的前体物 称为蛋 白原 ｍ 这类蛋白原需经过加工水解为成熟的蛋白 才具有生物活性 如胰岛素 最初以无活性的胰岛素原存在 由８６个氨基酸组成 含 Ａ Ｂ Ｃ 三个肽链 在高尔基复合 体内其中的 Ｃ 肽链被切除 余下的 Ａ Ｂ 链以二硫键连接成有生物活性的胰岛素 二 高尔基复合体与蛋白质的分选和运输 Ｒ ｍ 等通过密度梯度离心 得到了三个不同密度的高尔基复合体碎片 化学分析表 明 每个中密度的碎片均含有一组加工酶类 如密度最大的碎片含有磷酸转移酶 它能催化 磷酸基团加到溶酶体蛋白上 中等密度的碎片含有甘露糖苷酶和 Ｎ乙酰葡萄糖胺转移酶 密度最低的碎片含有半乳糖基转移酶及唾液酸基转移酶 高尔基复合体的层状扁平囊结构具有不同的生化区隔 每个区隔含有完成蛋白质修饰的 特有酶类 对蛋白质的寡糖链按顺序修饰 这种顺序修饰有利于糖蛋白的分选 使粗面内质 网合成的蛋白质成为分泌蛋白 跨膜蛋白和溶酶体蛋白 蛋白质的合成是从胞液中的核糖体上开始 穿过内质网膜 将新合成的蛋白质运输到内 质网腔 经过折叠和糖基化 内质网以出芽方式形成小泡 将分泌蛋白从内质网运输到高尔 基复合体中 经高尔基复合体的糖基化进行分选 把蛋白质由高尔基复合体输送到靶部位是 由运输小泡完成的 运输小泡首先从高尔基复合体的反面形成 并由衣被包裹 衣被小泡中 包含有经分选的特异蛋白 分选蛋白一般与运输小泡膜上的特异受体结合 衣被小泡在运输 过程中 其中的衣被逐渐消失 并返回到高尔基复合体反面 当运输小泡到达靶部位的细胞

81 ２４０ 细胞生物学 膜或溶酶体膜时 以膜融合的方式将内容物排出 细胞输送小泡向靶部位的运输可能也是由 受体介 导 的 靶 向 运 输 此 外 分 选 过 程 有 时 也 会 发 生 错 误 这 时 特 异 的 挽 救 受 体 能识别由于错误分选而丢失的蛋白 并将它们运回高尔基复合体 图９ １５ 图９ １５ 蛋白质在高尔基体内分选示意图 引自 凌诒萍 ２００２ Ａ 运输小泡出芽和蛋白产物分选 Ｂ 错误分选成分的挽救机制 在所有真核细胞中 有一个稳定的小泡流 这些运输小泡从高尔基复合体外侧网络芽生 出来并与质膜融合 图９ １６ 这一结构性的胞吐通道连续不断地工作 向质膜提供新合成 的脂质和蛋白质 这是分裂前细胞增大时质膜生长的一个途径 它也把将对外释放的蛋白质 运载到细胞表面 某些释放出的蛋白质粘附在细胞表面 成为质膜的周边蛋白 有些掺入细 胞外基质 还有一些扩散到细胞外液内 去营养其他细胞或给其他细胞以信号 除了在所有真核细胞中连续工作的结构性胞吐途径外 还有一个调节性胞吐途径 只有 在细胞特化 专门进行分泌时才运作 图 ９ １６ 特化的分泌细胞产生大量特定产物 如激 素 粘液或消化酶 它们贮藏在分泌小泡中 这些小泡自高尔基复合体外侧网络上芽生出来 并在近质膜处积累 它们仅在细胞受到细胞外刺激时才向外释放其内含物 例如 血糖增加 就给了胰岛细胞一个分泌胰岛素的信号

82 第九章 细胞的内膜系统 ２４１ 图９ １６ 高尔基复合体与分泌活动 引自 Ｂ Ａ 等 三 高尔基复合体与溶酶体的形成 一般认为 溶酶体是从高尔基复合体反面以出芽方式形成的 溶酶体中含有酸性磷酸酶 和各种水解酶 溶酶体的酶都是糖蛋白 这些酶在粗面内质网核糖体上合成并形成 Ｎ连接 的糖蛋白 而后移入内质网腔内 通过运输小泡转运到高尔基复合体内进行加工修饰 在高 尔基复合体顺面膜囊内寡糖链上的甘露糖残基磷酸化形成 ６ 磷酸甘露糖 Ｍ ６ Ｐ Ｍ ６ Ｐ 是溶酶体水解酶分选的重要识别信号 在高尔基复合体的反面膜囊内有识别 Ｍ ６ Ｐ 的受体 能特异地与溶酶体酶糖链末端的 Ｍ ６ Ｐ 结合 引导溶酶体酶聚集形成有被小囊 在有被小 囊出芽与高尔基复合体分开时 小囊就脱掉了包涵素被 其成分为网格蛋 白 成为特异的运输囊泡 然后与晚胞内体 ｍ 融合 晚胞内体内的 Ｈ 值为 ６ ０ 在酸性环境中水解酶从 Ｍ ６ Ｐ 受体上分离下来 然后去磷酸化成为溶酶体的酶 最后 形成溶酶体 通常将这种状态下的溶酶体称为内体性溶酶体 ｍ Ｍ ６ Ｐ 受体释 放其结合的溶酶体酶后又被回收 在晚胞内体内经出芽 运输囊泡返回到高尔基复合体反面 膜囊再利用 图９ １７ 四 高尔基复合体与细胞内膜的交通 高尔基复合体不仅是蛋白质加工修饰的场所 也是细胞内合成物质的转运站 在转运物 质的过程中 高尔基复合体的膜也发生了变化和转移 所以高尔基复合体是一个不断变化的 动态结构 从膜的厚度和化学成分显示 高尔基复合体膜的厚度和化学组成介于内质网膜和细胞膜 之间 高尔基复合体的顺面与内质网膜的厚度接近 反面与细胞膜接近 这说明细胞内存在

83 ２４２ 细胞生物学 图９ １７ 溶酶体的形成 引自 Ｂ Ａ 膜转变的过程 高尔基复合体参与细胞分泌活动已经得到多方面的证实 特别是对胰腺外分泌细胞的研 究更具典型意义 胰腺外分泌细胞能分泌多种消化酶和酶原 如胰蛋白酶原 糜蛋白酶原 胰淀粉酶和胰脂肪酶等 应用放射自显影技术 可以追踪这些分泌性蛋白质从合成到释放的 全过程 以豚鼠胰腺外分泌细胞为材料 注射３Ｈ 标记的亮氨酸 ３ 分钟后 放射性同位素 标记的氨基酸 就出现在粗面内质网中 １７ 分钟后 已从粗面内质网到高尔基复合体 １１７分钟后 细胞顶端酶原颗粒有标记出现 实验说明 分泌蛋白质在粗面内质网的核糖体 上合成后 进入内质网腔运行 经运输小泡把合成的蛋白质运送到高尔基复合体 在高尔基 复合体进行浓缩 加工形成分泌颗粒 最后与细胞膜融合 把分泌物排到细胞外 可见高尔 基复合体在细胞分泌活动中 起着重要的加工修饰和转运作用 同时 在细胞内膜泡蛋白运 输中起着重要的交通枢纽作用 四 高尔基复合体的病理变化 高尔基复合体在各种病理条件下会发生不同程度的形态和数量变化 一 高尔基复合体的肥大或萎缩 高尔基复合体的肥大或萎缩 包括数量的增减以及囊泡的扩张或塌陷 高尔基复合体的 肥大见于功能亢进或代偿性功能亢进的情况 如大鼠实验性肾上腺皮质再生过程中 在垂体 前叶分泌促肾上腺皮质激素 ＡＣＴＨ 的细胞内 高尔基复合体显著肥大 而当再生完毕 时 促肾上腺皮质激素水平下降 高尔基复合体又恢复正常大小 高尔基复合体的萎缩 破 坏和消失 常见于中毒等病理情况下的肝细胞 这是由于脂蛋白合成及分泌功能障碍所致

84 第九章 细胞的内膜系统 ２４３ 二 高尔基复合体内容物的变化 由于高尔基复合体与脂蛋白的形成 分泌有关 因此在肝细胞的高尔基复合体中 常可 见到电子密度不等的颗粒 电子密度低的 反映了其中所含的脂肪酸是饱和的 而电子密度 高的则说明其脂类成分中是不饱和脂肪酸 当某些中毒因素 如四氯化碳 引起脂肪肝时 肝细胞内充满大量脂质体 高尔基复合体中含脂蛋白的颗粒消失 形成大量扩张或断裂的大 囊泡 又如骨关节炎患者的滑膜细胞内 高尔基复合体明显地小而少 而附近细胞中的高尔 基复合体大而多 三 癌细胞内高尔基复合体的变化 在生长迅速 分化程度低的癌细胞中 高尔基复合体常不发达 如人胃低分化腺癌细 胞 而分化程度较高的癌细胞中 高尔基复合体则比较发达 有时在癌细胞内还可以看到高 尔基复合体的肥大和变形 如人的肝癌细胞 第四节 溶 酶 体 溶酶体 Ｌ ｍ 是细胞内一种膜性结构的细胞器 内含多种酸性水解酶 能分解各 种内源性或外源性物质 被称为细胞内的消化器官 溶酶体几乎存在于所有的动物细胞中 只有极少数的细胞例外 如哺乳动物成熟红细胞 植物细胞内也有与溶酶体功能类似的细胞 器 圆球体及液泡 典型的动物细胞中约含有数百个溶酶体 但在不同的细胞中溶酶体的 数量和形态有很大差异 即使在同一种细胞内 溶酶体的大小 形态也有很大区别 这主要 是由于每个溶酶体处于其不同生理功能阶段的缘故 溶酶体对细胞生理 病理以及细胞分化与衰老过程都起着重要作用 因此越来越受到人 们的重视 一 溶酶体的结构和化学组成 一 溶酶体的结构特点 溶酶体是由一层单位膜围界而成的球形或卵圆形囊状结构 图 ９ １８ 大小不一 常见 直径在０ ２ ０ ８μｍ 之间 最小的为０ ０５μｍ 最大可达数微米 溶酶体由一层厚约 ６ｍ 的 单位膜包围 内含物的电子密度较高 故着色深 因此易与其他泡状细胞器区别 溶酶体含 有丰富的酸性水解酶 特别是所有的溶酶体中均含酸性磷酸酶 因而将酸性磷酸酶作为溶酶 体的标志酶 溶酶体的形态和体积不仅在不同细胞中不同 即使在同一细胞中也不一样 二 溶酶体的酶 溶酶体中含有４０余种酸性水解酶 主要有酸性磷酸酶 酸性 ＲＮＡ 酶 酸性 ＤＮＡ 酶 蛋白磷酸酶 组蛋白酶 氨基肽酶 胶原酶 α 葡萄糖苷酶 磷酯酸磷酸酶 脂酶 磷脂酶

85 ２４４ 细胞生物学 和芳香基硫酸酯酶等 这些酶能将蛋白质 多糖 脂类和核酸等水解为小分子物质 图９ １８ 小鼠脾脏巨噬细胞中溶酶体 引自朴英杰 用电镜细胞化学技术显示其中含有的酸性磷酸酶 Ｍ 线粒体 Ｌ 溶酶体 不同类型细胞内溶酶体酶的种类和比例不同 即使在同一细胞内不同的溶酶体中 酶的 种类和数量也不相同 三 溶酶体的膜 溶酶体膜比质膜薄 厚约 ６ｍ 脂质双层中以鞘磷脂居多 溶酶体膜上有多种载体蛋 白 可将经水解消化后的产物向外转运 这些分解产物进入胞质内可被细胞再利用 或者被 排出于细胞外 溶酶体酶在 Ｈ 值３ ０ ６ ０的酸性环境中具有水解活性 最适 Ｈ 值为 ５ ０ Ｈ 值大 于７ ０时 溶 酶 体 酶 失 去 活 性 溶 酶 体 膜 上 含 有 一 种 特 殊 的 转 运 蛋 白 质 子 泵 泵入溶酶体内 从而维持腔内的酸性 质子泵可利用 水解时释放出的能量将 ＡＴＰ Ｈ ｍ 值 使水解酶发挥最有效的作用 Ｈ 构成溶酶体膜的蛋白质是高度糖基化的 其糖基朝向溶酶体内 这可保护溶酶体膜免受 溶酶体内蛋白酶的消化 溶酶体膜的破裂将导致细胞致命损害 在正常情况下 溶酶体膜有屏障作用 可防止水 解酶与胞质接触 以免细胞结构被破坏而造成细胞死亡 一旦溶酶体膜破裂 所含水解酶进 入胞质 细胞将被分解 如水解酶到达细胞间质时 还可破坏间质成分 导致机体组织自 溶 二 溶酶体的类型 根据溶酶体的形成过程和功能状态可将溶酶体分为内体性溶酶体和吞噬性溶酶体

86 第九章 细胞的内膜系统 ２４５ 一 内体性溶酶体 ｍ 内体性溶酶体是由高尔基复合体扁平囊边缘膨大而分离出来的泡状结构和内体合并而 成 不含作用底物 仅含水解酶 一般体积较小 直径约０ ２５ ０ ５０μｍ 二 吞噬性溶酶体 ｍ 吞噬性溶酶体是由内体性溶酶体和将被水解的各种吞噬底物融合形成的 其中含有消化 酶 作用底物和消化产物 细胞中所见的溶酶体大多数属于吞噬性溶酶体 根据底物的来源 和性质不同 吞噬性溶酶体又可分为异噬性溶酶体和自噬性溶酶体 １ 异噬性溶酶体 ｍ 异噬性溶酶体的作用底物来源于细胞外 包 括细菌 异物及坏死组织碎片等 细胞首先以内吞方式将外源物质摄入细胞内 形成吞噬体 或吞饮泡 然后与内体性溶酶体融合形成异噬性溶酶体 ２ 自噬性溶酶体 ｍ 自噬性溶酶体是指作用底物来源于细胞内 如细胞内的衰老和崩解的细胞器以及细胞质中过量贮存的糖原颗粒等 这些物质可被细胞本 身的膜如内质网膜包围 形成自噬体 ｍ 自噬体与内体性溶酶体融合而形成 自噬性溶酶体 三 残余体 在吞噬性溶酶体到达末期阶段时 还残留一些未被消化和分解的物质 并保留在溶酶体 内 形成残余体 在电镜下残余体呈现为电子密度较高 色调较深的物质 常 见的残余体有脂褐质 多泡体 髓样结构和含铁小体等 图９ １ ９ 这些残余体有的能将其残 余物通过胞吐作用排出细胞外 有的则长期存留在细胞内不被排出 如脂褐质 图９ １９ 次级溶酶体形成的各种残余体

87 ２４６ 细胞生物学 脂褐质 为形状不规则 由单位膜包围的小体 其内容物电子密度较高 常 含有浅亮的脂滴 一般见于神经细胞和心肌细胞中 神经细胞内的脂褐质随着年龄的增长 其数量也逐渐增多 多泡体 ｍ 由单位膜包围 内含许多小泡 直径约 ０ ２ ０ ３μｍ 由 于多泡体的基质电子密度不同 而呈现出浅淡或致密的多泡体 通常可见于神经细胞 盐酸 细胞和卵母细胞中 髓样结构 ｍ 是由膜性成分排列呈同心层状 板状和指纹状的结构 常见 于巨噬细胞系统 肿瘤细胞和病毒感染细胞中 含铁小体 ｍ 是由单位膜包裹的内部充满电子密度高的含铁颗粒 直径 ５０ ６０ｍ 光镜下表现为含铁血黄素颗粒 常见于单核吞噬细胞系统中 当机体摄入大量铁质 时 肝和肾等器官的吞噬细胞中可出现许多含铁小体 三 溶酶体的功能 溶酶体是细胞内消化的主要场所 可消化多种内源性和外源性物质 此外还参与机体的 某些生理活动和发育过程 一 对细胞内物质的消化 １ 自噬作用 溶酶体消化细胞自身衰亡或损伤的各种细胞器的过程称自噬作用 细胞内衰老或损伤的细胞器 首先被来自滑面内质网或高尔基复合体的膜所包 围 形成自噬体 并与内体性溶酶体的膜融合 形成吞噬性溶酶体并完成消化作用 图 ９ ２０ 溶酶体对细胞内衰老破损的细胞器进行消化分解 可供细胞再利用 对细胞结构的更 新具有十分积极的意义 ２ 异噬作用 溶酶体对细胞外源性异物的消化过程称为异噬作用 这些 异物包括作为营养成分的大分子颗粒 以及细菌 病毒等 异物经吞噬作用进入细胞 形成 吞噬体 ｍ 或经胞饮作用形成吞饮泡 ｍ 吞噬体或吞饮泡进入细胞后 其膜与内体性溶酶体膜相融合 成为吞噬性溶酶体 异物在吞噬性溶酶体中被水解酶消化分 解成小分子 透过溶酶体膜扩散到细胞基质中供细胞利用 不能被消化的成分仍然留在吞噬 性溶酶体内形成残余小体 多数的残余小体经出胞作用排出细胞外 但是某些细胞如神经细 胞 肝细胞 心肌细胞等的残余小体不被释放 仍蓄积在细胞质中形成脂褐质 图９ ２０ 二 对细胞外物质的消化 某些情况下溶酶体可通过胞吐方式 将溶酶体酶释放到细胞之外 消化细胞外物质 这 种现象体现在受精过程和骨质更新方面 例如 溶酶体能协助精子与卵细胞受精 精子头部 的顶体 ｍ 实际上是一种特化的溶酶体 顶体内含有透明质酸酶 酸性磷酸酶及蛋 白水解酶等多种水解酶类 当精子与卵细胞的外被接触后 顶体膜与精子的质膜融合并形成 孔道 此时顶体内的水解酶可通过孔道释放出来 消化分解掉卵细胞的外被滤泡细胞 并协 助精子穿过卵细胞各层膜的屏障而进入卵内实现受精 在骨骼发育过程中 破坏骨质的破骨

88 第九章 细胞的内膜系统 ２４７ 细胞与造骨的成骨细胞共同担负骨组织的连续改建过程 其中破骨细胞的溶酶体释放出来的 酶参与陈旧骨基质的吸收 消除 是骨质更新的一个重要步骤 图９ ２０ 溶酶体的消化功能 引自 Ｂ Ａ 三 溶酶体的自溶作用与器官发育 在一定条件下 溶酶体膜破裂 水解酶溢出致使细胞本身被消化分解 这一过程称为细 胞的自溶作用 如两栖类蛙的变态发育过程中 蝌蚪尾部逐渐退化消失 这 是尾部细胞自溶作用的结果 在尾部开始退化时 尾部细胞内溶酶体显著增加 溶酶体中的 组织蛋白酶能消化尾部退化的细胞 直到尾部消失 在非正常生理条件下 例如在死亡细胞内溶酶体膜破裂得十分迅速 高等动物死亡后消 化道粘膜很快就腐败 也正是由于溶酶体膜破裂的结果 在多细胞动物机体正常生命过程 中 一些细胞死亡后 其内的溶酶体膜破裂 对于死亡细胞的清除是有意义的 当细胞突然 缺氧或受某种毒素作用时 溶酶体膜可以在细胞内破裂 其中大量的水解酶释放到细胞质 中 消化了细胞自身 同时向细胞外扩散 造成组织损伤或坏死 四 溶酶体与激素分泌的调节 在分泌激素的腺细胞中 当细胞内激素过多时 溶酶体与细胞内部分泌颗粒融合 将其

89 ２４８ 细胞生物学 消化降解以消除细胞内过多激素 参与分泌过程的调节 把溶酶体分解胞内剩余的分泌颗粒 的作用称粒溶作用 或分泌自噬 如母鼠在哺乳期 乳腺细胞机能旺盛 细胞 中分泌颗粒丰富 一旦停止授乳 这种细胞内多余的分泌颗粒 即与内体性溶酶体融合而被 分解 重新利用 此外 某些激素如甲状腺激素也是在溶酶体的参与下完成的 在甲状腺滤 泡上皮细胞内合成的甲状腺球蛋白 分泌到滤泡腔内被碘化后 又重新吸收到滤泡上皮细胞 内 通过上皮细胞胞吞作用 形成大胶滴 大胶滴与溶酶体融合 由蛋白水解酶将甲状腺球 蛋白分解 形成 大 量 的 甲 状 腺 激 素 四 碘 甲 状 腺 原 氨 酸 Ｔ４ 和 少 量 三 碘 甲 状 腺 原 氨 酸 Ｔ３ 甲状腺素再由细胞转入血液中 四 溶酶体与疾病的关系 溶酶体异常与许多疾病的发生有着密切的关系 一 先天性溶酶体病 溶酶体中酸性水解酶的合成 和其他蛋白质生物合成一样 是由基因决定的 若基因缺 陷可引起酶蛋白合成障碍 缺乏某种溶酶体酶 导致相应的作用底物不能被分解而积累于溶 酶体内 造成溶酶体过载 从而引起各种病理变化 这种先天性代谢病称为溶酶体积累病 现已发现有４０多种先天性溶酶体病是由于溶酶体缺乏某些酶而引起的 例如 Ⅱ 型糖原累 积病 Ⅱ 是人类最早发现的先天性代谢病 这种病是由于患 者的常染色体隐性基因缺陷 不能合成α 葡萄糖苷酶 致使糖原无法被分解而大量积累于溶 酶体内 造成代谢障碍 此种情况可出现于患者肝 肾 心肌及骨骼肌中 严重损伤这些器 官的功能 此病多见于婴儿 症状为肌无力 进行性心力衰竭等 病孩一般在 ２ 周岁内死 亡 台萨氏病 Ｔ Ｓ 又称黑蒙性先天愚病 是由于患者神经细胞溶酶体内缺 少β 氨基己糖苷酶 Ａ 致使单涎酰基鞘氨醇三己糖苷 神经节苷脂 无法降解而积累在溶酶 体中 患者表现为渐进性失明 痴呆和瘫痪 对于因溶酶体缺乏某种酶而引起的溶酶体积累 过载 病 有人设想将溶酶体所缺失的 酶包裹在人工脂质体内 由细胞的吞噬作用将脂质体吞入细胞内 当脂质体与溶酶体并合 后 脂质体被水解 内含的酶便进入溶酶体内 但此法尚存在些问题 有待进一步研究 二 溶酶体与矽肺 矽肺是工业上的一种职业病 其形成原因主要是由于溶酶体膜的破裂 当人体的肺吸入 空气中的矽尘颗粒 二氧化矽 Ｓ Ｏ２ 后 矽尘颗粒便被肺部的巨噬细胞吞噬形成吞噬小 体 吞噬小体与内体性溶酶体融合形成吞噬性溶酶体 二氧化矽在吞噬性溶酶体内形成矽酸 分子 与溶酸体膜结合而破坏溶酶体膜的稳定性 造成大量水解酶和矽酸流入细胞质内 引 起巨噬细胞死亡 由死亡细胞释放的二氧化矽再被正常巨噬细胞吞噬 如此反复 巨噬细胞 的不断死亡诱导成纤维细胞的增生并分泌大量胶原物质 而使吞入二氧化矽的部位出现了胶 原纤维结节 导致肺的弹性降低 肺功能受到损害 矽肺病人常出现吐血 这是由于血小板内的溶酶体在二氧化矽的作用下 膜发生了破

90 第九章 细胞的内膜系统 ２４９ 裂 释放出来的酸性水解酶溶解了气管的微血管壁 而造成了血液的外流 克矽平类药物能 治疗矽肺 治病机制是该药中的聚α 乙烯吡啶氧化物能与矽酸分子结合 代替了矽分子与溶 酶体膜的结合 从而保护了溶酶体膜不发生破裂 三 溶酶体与类风湿性关节炎 对于类风湿性关节炎的发病原因目前虽然尚不清楚 但由该病所引起的关节软骨细胞的 侵蚀 被认为是由于细胞内的溶酶体膜脆性增加 溶酶体酶局部释放 被释放出来的酶中有 胶原酶 它能侵蚀软骨细胞 消炎痛 ｍ 和肾上腺皮质激素 具有稳 定溶酶体膜的作用 所以被用来治疗类风湿性关节炎 四 溶酶体与肿瘤的关系 溶酶体与恶性肿瘤的关系 目前引起人们的关注 有人应用电镜放射自显影技术 观察 到致癌物质进入细胞之后 先贮存于溶酶体内 然后再与染色体整合 也有人提出 作用于 溶酶体膜的物质有时也能诱发细胞异常分裂 还有人证实 致癌物质引起的染色体异常和细 胞分裂的机制障碍等 可能与细胞受到损伤后溶酶体释放出来的水解酶有关 上述研究资料 虽然认为溶酶体与恶性肿瘤的发生有关 但究竟是否有直接关系 尚需深入研究 第五节 过氧化物酶体 过氧化物酶体 ｘ ｍ 又称微体 ｍ 是于 １９５４ 年用电镜观察小鼠肾的 近曲小管上皮细胞时首次被观察到的结构 直径约 ０ ５μｍ 由一层膜包被 以后经过 １０ 余 年的研究 认为该结构普遍存在于高等动物和人体细胞内 常见于哺乳动物的肝细胞和肾细 胞中 内含氧化酶和过氧化氢酶 是真核细胞中的一种细胞器 一 过氧化物酶体的形态结构和化学组成 过氧化物酶体是由一层单位膜包裹的球形或卵 圆形小体 图 ９ ２１ 直径约 ０ ５μｍ 小体中央常 含有电子密度较高 呈规则的结晶状结构 称类核 体 类核体为尿酸氧化酶的结晶 人类 和鸟类的过氧化物酶体不含尿酸氧化酶 故没有类 核体 在哺乳动物中 只有在肝细胞和肾细胞中可 观察到典型的过氧化物酶体 如大鼠每个肝细胞中 约有７０ １００个过氧化物酶体 过氧化物酶体中含有 ４０ 多种酶 如尿酸氧化 酶 Ｄ 氨基酸氧化酶以及过氧化氢酶 每个过氧化 物酶体所含氧化酶的种类和比例不同 但是过氧化 图９ ２１ 过氧化物酶体的电镜图 引自 Ｂ Ａ

91 ２５０ 细胞生物学 氢酶则存在于所有细胞的过氧化物酶体中 所以过氧化氢酶可视为过氧化物酶体的标志酶 二 过氧化物酶体的功能 各种过氧化物酶体的功能有所不同 但氧化多种作用底物 并催化过氧化氢生成使其分 解的功能却是共同的 在氧化底物的过程中 氧化酶能使氧还原成为过氧化氢 而过氧化氢 酶能把过氧化氢还原成水 过氧化物酶体可使相应作用底物以氧为受氢体 通过两步反应将 底物氧化 过氧化氢为中间产物 其最终被过氧化氢酶分解 第一步反应中氧化酶的作用底物 ＲＨ２ 如尿酸 Ｌ 氨基酸 Ｄ 氨基酸等作为供氢体而 被氧化 产生中间产物 Ｈ２Ｏ２ Ｈ２Ｏ２ 对细胞有毒害作用 故第二步由过氧化氢酶分解 Ｈ２Ｏ２ 而解毒 反应过程中供氢体 Ｒ Ｈ ２ 为甲醇 乙醇 亚硝酸盐或甲酸盐等小分子 因此 过量饮酒造成的酒精中毒 约有一半是经过过氧化物酶体的氧化分解来解毒的 所以过氧化 物酶体在肝 肾细胞内主要的功能是防止产生过量的过氧化氢 以免引起细胞中毒 对细胞 起着保护作用 三 过氧化物酶体的生物发生 过去一般认为过氧化物酶体的蛋白质是在粗面内质网的核糖体上合成的 然后移至内质 网腔 通过内质网的特定区域以出芽方式形成过氧化物酶体 应用电镜可以观察到过氧化物 酶体常在接近于内质网的切面上分布 或者与内质网连接在一起 现在有实验证明 过氧化物酶体基质的蛋白质 各种酶 是在胞液中游离的核糖体上合 成的 在许多过氧化物酶体酶蛋白近羧基端有一特异的 ３ 个氨基酸序列 丝氨酸赖氨酸亮 氨酸 是输入信号 如果实验性地将这一序列连到胞液中的蛋白质上 这种蛋白质便被输入 到过氧化物酶体中 推测过氧化物酶体膜的胞液面具有识别该输入信号的受体蛋白 通过受 体蛋白识别酶蛋白的输入信号 而引导胞液中合成的酶蛋白输入到过氧化物酶体中 现在也有证据提出 新的过氧化物酶体是由已存在的过氧化物酶体通过生长与分裂形成 的 综上所述 细胞内膜性结构的细胞器彼此有一定的联系 并可相互转变 如内质网的膜 与核膜相连 高尔基复合体的膜与内质网膜又有密切联系 现在知道活细胞的膜系统是处于 一种积极的动态平衡状态 也就是说 细胞的膜性成分可以更新 可以相互转移 这种细胞 膜性结构中膜性成分的相互移位和转移的现象称为膜流 ｍｍ ｗ 细胞通过膜 流 进行物质分配和运输 图９ ２２ 例如 某种膜嵌入蛋白 如膜受体 最初以特定的方 式插入内质网膜上 通过膜流也就是内质网以 芽生 方式产生小囊泡 使嵌有该膜受体的 膜片转移至高尔基复合体 然后经高尔基复合体形成分泌泡 在完成分泌时将其并入质膜 成为质膜的受体蛋白 相反 细胞通过吞噬 吞饮作用也可将质膜的一部分带进细胞内 当 与溶酶体融合时成为内膜系统的一部分 不同部位的膜 各自有其特异结构 可以设想细胞

92 第九章 细胞的内膜系统 ２５１ 图９ ２２ 膜流 引自 Ｂ Ａ 必然有某些机制来保障膜的转化 现在认为引导膜流和保持膜转化的机制与膜受体和膜内笼 形蛋白有关 膜流现象不仅说明细胞膜系统经常处于运动和变化状态 使膜性细胞器的膜成 分不断得到补充和更新 并与外界相适应 以维持细胞的生存和代谢 而且在物质运输上起 着重要的作用

93 ２５２ 细胞生物学 第十章 细胞的信号转导 细胞可识别各种理化信号 并通过受体与之结合 将这些信号传入细胞内 产生各种各 样的信号分子 导致有规律的级联反应 以改变胞内某些代谢过程 这种细胞对外源信息所 产生的应答反应过程称为信号转导 细胞能进行增殖 生长 代谢 防御 分化和凋亡等复杂的生命活动 这些生命活动的调控是通过细胞间通讯和细胞的信号 转导实现的 一旦信号转导过程异常 细胞功能受到影响 个体便会发生疾病 第一节 细胞信号转导的基本特点 细胞信号转导系统 ｍ 包括受体 相应的信号转导通路及其作用终 端 人体的信号分子和受体种类繁多 信号转导通路错综复杂也各不相同 但不同的信号转 导通路相互联系 互相协调 形成网络系统 调节机体新陈代谢 保证机体生命活动的正常 进行 生物体在进行生命活动过程中会释放信号分子 并通过这些信号分子作用于细胞膜表面 的受体进一步激发细胞内信号转导通路 触发离子通道开放 蛋白质磷酸化及基因表达等 因而产生一系列的生物效应 一 细胞信号转导的方式 细胞信号通过受体或类似于受体的物质与信号分子结合 激活胞内信号转导通路 最终 引起一系列生物效应 根据受体位置的不同 细胞信号转导方式可分为膜受体介导的跨膜信 号转导通路和胞内受体介导的信号转导通路 前者包括 ＡＭＰ 蛋白激酶途径 Ｃ２ 依赖性 蛋白激酶途径 ＧＭＰ 蛋白激酶途径 酪氨酸蛋白激酶途径和核因子 κｂ 途径 后者细胞内 受体可分为核内受体和胞浆内受体 这两种受体所结合的信号分子不同 作用方式也有所不 同 每一种细胞都有特定的受体和相应的信号转导系统 细胞对信号的反应与其受体的特异 性及细胞的固有特征有关 如同样是信号分子乙酰胆碱 Ａ 它既可引起骨骼肌收缩又 可降低心肌收缩频率 还可引起唾腺细胞分泌等不同的效应 有时不同的信号如肾上腺素 胰高糖素 能产生促进肝糖原降解 升高血糖的相同效应

94 第十章 细胞的信号转导 ２５３ 二 信号转导与信号分子 生物通过信号分子调节生命活动 细胞间信号分子通常由特定的细胞释放 经扩散或经 血液循环到达靶细胞 与靶细胞膜上受体结合后产生效应 细胞间信号分子包括氨基酸及衍生物 甲状腺素 肾上腺素等 蛋白质及肽类 细胞 因子 生长因子等 脂酸衍生物 前列腺素等 类固醇激素 性激素等 和一氧化氮等 这些信号分子对细胞生物效应起着重要的作用 如生长因子 细胞因子 激素等可作为调节 细胞增殖的信号 甾体激素等可诱导细胞分化 神经递质在神经细胞间传递神经冲动 信号 分子可根据其特点和作用方式分为如下几类 １ 激素 由内分泌细胞分泌后可作用于靶细胞 大多数激素对靶细胞的作用时间较长 激素可分为含氮激素和甾体激素两大类 常见的激素有 甲状腺素 肾上腺素 胰岛素和性 激素等 它们通过血液循环而到达靶细胞 ２ 神经递质 由神经突触前膜释放 作用时间较短 常见的神经递质有乙酰胆碱 去 甲肾上腺素等 与突触后膜上的受体结合而发挥作用 ３ 局部化学介质 某些细胞分泌的化学介质不进入血液循环而是通过扩散作用到达邻 近靶细胞 生长因子 一氧化氮等属于此类分子 除生长因子外其他分子作用时间短 上述细胞间信号分子被称为第一信使 ｍ 此外细胞内还存在着传递 ｍ 信号的物质 如无机离子 核苷酸 糖类和脂类衍生物 这些在细胞内传递信息的小分子或 离子如三磷酸肌醇 ＩＰ３ 甘油二酯 ＤＡＧ ＡＭＰ ＧＭＰ 等称为第二信使 第二信使 的作用是对胞外信号起转换和放大的作用 Ｃ２ 也是第二信使 但也有人将 Ｃ２ 称为第三 信使 因为 Ｃ２ 的释放有赖于第二信使 细胞内信号分子通常通过酶促级联反应传递信息 最终改变细胞内有关酶的活性 影响 细胞内离子通道及核内相关基因表达 以达到调节细胞内代谢 控制细胞生长 繁殖和分 化 在完成信息传递过程后 所有信号分子通过酶促作用而发生降解 三 受体 受体 是细胞膜上或细胞内一类特殊的蛋白质 个别受体为糖脂 能够特异 识别并结合生物活性分子 进而引起种种生物学效应 能与受体进行特异性结合的生物活性 分子称为配体 细胞间信号分子就是一类最常见的配体 此外 某些药物 维生素 和毒物也可作为配体而发挥作用 受体与配体结合具有高度专一性 高度亲和力 可饱和性 和可逆性等特点 受体在细胞信息传递过程中起着极为重要的作用 目前已发现多种细胞受体 位于细胞 浆和细胞核中的受体被称为胞内受体 图 １０ １ 为 ＤＮＡ 结合蛋白 多为反式作用因子 当与相应配体结合后 能与 ＤＮＡ 的顺式作用元件结合 调节基因转录 能与此类受体结合 的信号分子有类固醇激素 甲状腺素和维甲酸等 存在于细胞质膜上的受体称为细胞膜受体 图１０ ２ 信号分子绝大部分为镶嵌糖蛋白 细胞因子受体 Ｇ 蛋白偶联受体等属于细胞受 体 这些受体虽然结构不同 但本质是相同的 它们一方面通过胞浆内信号分子将胞外信号

95 ２５４ 细胞生物学 传递到细胞核内 以调节基因表达 引起细胞代谢和功能改变 另一方面经胞浆内信号分子 传递将信号反馈到细胞膜 以引起细胞某些特性的改变 图１０ １ 细胞内受体 图１０ ２ 细胞膜受体 四 受体的基本类型 一 酪氨酸激酶 酪氨酸蛋白激酶受体 Ｒ ｋ ＲＴＫ 包括近二十种不同的受体家族 如 胰岛素受体 多种生长因子受体以及与其有同源性的癌基因产物 ＲＴＫ 的结构包括胞外段 跨膜区段和胞内段三部分 其胞外区是结合配体结构域 其胞内段具有酪氨酸蛋白激酶 Ｐ ｋ ＰＴＫ 活性 当 ＲＴＫ 与配体结合后 受体自身构象改变 发生聚 合 形成同源或异源二聚体 进一步磷酸化 可激活受体本身的酪氨酸蛋白激酶活性 与这 类受体结合的配体是可溶性或膜结合的多肽或蛋白类激素 主要有细胞因子 如白介素 生长因子和胰岛素等 酪氨酸蛋白激酶受体在细胞生长 分化 代谢及机体的胚胎发育过程中起着重要作用 １９８７年 Ｈ 等克隆得到了 ＲＴＫ 类 Ｅ基因家族的第 一个 成 员 ＥＡ１ 至 今 Ｅ 基 因 家 族 已 成 为 最 大 的 ＲＴＫ 亚族 该亚族的大多数成员主要在神经系统以独 特的重叠模式表达 广泛分布于正常组织及肿瘤细胞 中 最 近 Ｅ 受 体 的 配 体 家 族 已 克 隆 有 ８ 个 成 员 Ｅ受体和其配体间的相互作用参与了胚胎发育模式的 许多过程 如在神经轴突导向 血管发生和肿瘤形成等 方面具有重要功能 二 配体闸门离子通道 配体闸门离子通道 图 １０ ３ 是一类自身为离子通道的受体 这类受体既是受 体又是离子通道 这种离子通道由多个亚基共同围成离 子通道 每个亚基是由单一多肽链反复 ４ 次穿过细胞膜 图１０ ３ 离子通道

96 第十章 细胞的信号转导 ２５５ 形成 Ｐ２Ｘ 例外 其开启和关闭取决于该通道型受体与配体的结合状态 当受体与配体结 合可直接导致通道开放 Ｎ Ｋ Ｃ２ 等跨膜流动转导信息 这类受体在主要存在于肌 肉 神经等细胞 在神经冲动的快速传递中起作用 三 Ｇ 蛋白偶联受体 Ｇ 蛋白偶联受体 Ｇ ＧＰＣＲ 又称为七次跨膜受体 是由４００ ６００个氨基酸残基组成的单链糖蛋白 由１条单肽链形成 ７ 个 α螺旋区横跨细胞膜 ７ 次 此 类受体被配体激活后 均需与鸟苷酸结合蛋白 简称 Ｇ 蛋白 相偶联 影响相应的效应酶活性 使胞内产生信使分子 实现跨膜信息传递 目前认为至少有１００多种膜受体与 Ｇ 蛋白偶联 因此 Ｇ 蛋白偶联受体为数量庞大的超 家族 包括多种肽类激素 神经递质等的受体 四 细胞内受体 糖皮质激素受体 盐皮质激素受体 雄激素受体 雌激素受体等类固醇激素受体以及甲 状腺素受体存在于胞浆或胞质内 为胞内受体 胞内受体的特点是 有相似的高级结构 在受体 Ｃ 端有激素结合域 可与激素结合 中央区是 ＤＮＡ 结合域 Ｎ 端是调节区 是受体的转录激活区之一 这三个基本结构区域 中 ＤＮＡ 结合域富含半胱氨酸 碱性氨基酸 并重复出现半胱Ｘ２半胱Ｘ１３ １５半胱Ｘ２赖 序列 各种受体中这段序列高度同源 而 Ｎ 端调节区的氨基酸组成和长度变化大 这种 Ｎ 端序列的差异对于选择不同的靶基因有着一定的意义 胞内受体有活性和非活性两种状态 被激活的受体结合于相应靶基因的 ＤＮＡ 序列上 起调节作用 第二节 Ｇ 蛋白 一 Ｇ 蛋白的分子组成及其类型 Ｇ 蛋白 Ｇ 即鸟苷酸结合蛋白 一般指任何与鸟苷酸结合蛋白的总称 但通常 所说的 Ｇ 蛋白仅仅是信号转导途径中与受体偶联的鸟苷酸结合蛋白 同时也是位于细胞膜 胞浆面的外周蛋白 介于膜受体与效应蛋白之间 能偶联膜受体并传导信息 其活性受 ＧＴＰ 调节 图１０ ４ Ｇ 蛋白由三个亚基组成 分别是 α亚基 ４５ｋＤ β亚基 ３５ｋＤ γ 亚基 ７ｋＤ α 亚基是决定 Ｇ 蛋白功能的主要亚基 可分为 Ｇ Ｇ Ｇｑ Ｇ１２ 四个亚家族 β和 γ 亚单位 一般以β γ聚合体形式存在 蛋白有两种构象 一种为非活化型 另一种为活化型 这两种构象在一定的条件下是 Ｇ 可以互相转化的 在基础状态时 Ｇ 蛋白以非活化型形式存在 α β γ三亚基形成异源三 聚体 此 时α亚 基 上 结 合 有 ＧＤＰ结 合 当 配 体 与 受 体 结 合 后 Ｇ蛋 白 转 化 为 活 化 型

97 ２５６ 细胞生物学 其过程为 配体结合并激活受体 活化的受体与 Ｇ 蛋白作 用 使α亚基与 β γ 亚基解离 α 亚 基 释 放 出 ＧＤＰ 而 结 合 ＧＴＰ 形成有活性的 Ｇα ＧＴＰ 进一步对其下游的效应蛋白 产生作 用 传 递 信 号 最 后 α 亚 基 上 的 ＧＴＰ 在 其 内 源 性 ＧＴＰ 酶的作用下水解成 ＧＤＰ 形成无活性的 Ｇα ＧＤＰ Ｇα 与效应蛋白分开 重新与 亚基形成异源三倍体 γ ＧＤＰ Ｇ β 蛋白的激活与失活构成了 Ｇ 蛋白循环 图１０ ５ Ｇ 蛋白的效应蛋白主要有腺苷酸环化酶 磷脂酶 Ｃ 鸟 苷酸环化酶和磷酸二酯酶等 近来的研究发现 Ｇ 蛋白除了 α亚基有活性外 β γ亚单位同样作为一个功能单位参与信号 传递过程 β γ 亚单位不仅能够介导独立的信号传递通路 而且可能为 Ｇ 蛋白与其他信号通路交互转导的调控点 机体内有多种 Ｇ 蛋白 根据 α亚基的功能可将 Ｇ 蛋白 分为有激动型 Ｇ 蛋白 ｍ Ｇ 可激活 Ｇ 环化酶 抑制型 Ｇ 蛋白 Ｇ 可抑制 Ｇ 环化酶 磷脂酶 Ｃ 型 Ｇ 蛋白 ＰＩ ＰＬＣＧ Ｇ 可 激活磷脂酶 Ｃ 不同的 Ｇ 蛋白能使受体与其相适应的效应 酶特异地偶联起来 图１０ ４ Ｇ 蛋白 图１０ ５ Ｇ 蛋白循环 Ｈ 激活 ＡＣ 的激素 Ｈ 抑制 ＡＣ 的激素 二 ＰＫＡ 系统的信号转导机制 蛋白激酶 Ａ ｋ Ａ ＰＫＡ 在体内分布广泛 是一种由四聚体 Ｒ２Ｃ２ 组 成的别构酶 分子量约１５０ １７０ｋＤ 包括２个相同的调节亚基 Ｒ 和２个相同的催化亚基 Ｃ Ｃ 亚基具有激酶的催化活性 能催化底物蛋白质某些特定丝 苏氨酸残基磷酸化 Ｒ 亚

98 第十章 细胞的信号转导 ２５７ 基具有和ＡＭＰ 结合的部位 具有调节功能 当 Ｒ 和 Ｃ 亚基结合时 由于 Ｃ 亚基上的底物 蛋白结合部位被 Ｒ 亚基掩盖 因此 ＰＫＡ 无催化活性 反之当 Ｒ 亚基上的２个ＡＭＰ 结合位 点被ＡＭＰ 结合后 Ｒ 亚基变构并与 Ｃ 亚基解聚 使 Ｃ 亚基游离 具有催化活性 可催化 细胞内许多蛋白酶的丝氨酸或苏氨酸残基的羟基发生磷酸化修饰 产生各种生物学效应 活化的 ＰＫＡ 可催化胞内许多酶的磷酸化修饰 以调节细胞代谢过程及基因表达 以肾上腺素调节作用为例 当机体受到刺激作用时 肾上腺素分泌增加 肾上腺素与其 相应受体结合 进而激活 Ｇ 蛋白 即 Ｇ 蛋白释出 ＧＤＰ 而结合 ＧＴＰ 活化的 Ｇ 蛋白通过激 活腺苷酸环化酶 ＡＣ 使 ＡＴＰ 形成 ＡＭＰ 以激活 ＰＫＡ ＰＫＡ 一方面可使磷酸化酶激酶 转变为有活性的磷酸化酶激酶 后者催化磷酸化酶转化为有活性的磷酸化酶 磷酸化酶 可促使肝糖原降解成１ 磷酸葡萄糖而提供血糖 另一方面 ＰＫＡ 又可使糖原合成酶磷酸化 而失活 以抑制１ 磷酸葡萄糖形成糖原 此外 ＰＫＡ 还可以激活脂肪细胞内的激素敏感性脂 肪酶 促进脂肪分解成脂肪酸以提供能量 ＡＭＰ应答元件结合蛋白 ＡＭＰ ｍ ＣＲＥＢ 约由 ３４１ 个 氨基酸残基构成 分子量为４３ ４５ｋＤ 能与基因转录调控区的ＡＭＰ 应答元件 ＡＭＰ ｍ ＣＲＥ 作用 参与多种基因的表达 ＰＫＡ 通过使 ＣＲＥＢ 发生磷酸化 以调 节基因表达 其一般过程是 首先肽类激素作用于膜受体 通过上述过程产生 ＡＭＰ 而活 化 ＰＫＡ 使 ＰＫＡ 解聚 当 ＰＫＡ 催化亚基进入细胞核后 催化 ＣＲＥＢ 中丝氨酸和 或 苏 氨酸残基发生磷酸化修饰 形成同源二聚体 与 ＣＲＥ 结合 以激活基因转录 磷酸化的 ＣＲＥＢ 也可受到蛋白磷酸酶 ＰＰ １ 的催化 去磷酸基而失活 使基因关闭 此外 ＰＫＡ 还可使细胞核内的部分蛋白 如组蛋白 微管蛋白 核蛋白体蛋白等 磷 酸化 使这些蛋白质的功能受到影响 三 ＰＫＣ 系统的信号转导机制 蛋白激酶 Ｃ ｋ Ｃ ＰＫＣ 由 １ 个大基因家族编码 已发现 １２ 种 ＰＫＣ 同工 酶 ＰＫＣ 均为单链多肽 含调节结构域和催化结构域 一般状态时 调节域对催化域有抑 制作用 调节结构域和催化结构的活性中心部分嵌合 当调节域与 ＤＡＧ 磷脂酰丝氨酸和 Ｃ２ 结合 可使催化域暴露而被活化 因此典型 ＰＫＣ 的激活依赖于 ＤＡＧ 磷脂酰丝氨酸和 Ｃ２ 的协同作用 ＰＫＣ 广泛存在于机体组织细胞中 影响机体的代谢 基因表达和细胞分化等 ＰＫＣ 对 代谢有调节作用 ＰＫＣ 通过使糖原合成酶磷酸化失活 使磷酸化酶 激酶磷酸化而激活 抑制糖原合成 促进糖原分解 ＰＫＣ 可通过使 ＨＭＧＣＡ 还原酶磷酸化失活 抑制胆固醇 合成 ＰＫＣ 能调节多种生理过程 能催化质膜 Ｃ２ 通道磷酸化 使 Ｃ２ 进入细胞 也能使 肌质网 Ｃ２ ＡＴＰ 酶磷酸化 使 Ｃ２ 进入肌质网 减少胞浆中 Ｃ２ ＰＫＣ 可使多种胞内多 种受体侧肽链上的 Ｓ Ｔ 残基磷酸化 与相应信号分子结合能力下降 信息传递受到抑 制 参与调节细胞的生长 ＰＫＣ 对基因表达有一定的调节作用 通常某些信号分子与膜受体结合 通过 Ｇ 蛋白介 导 激活 ＰＬＣ ＰＬＤ 使 ＰＣ 或 ＰＩＰ２ 水解 ＤＡＧ ＤＡＧ 使 ＰＫＣ 被激活 随即活化的 ＰＫＣ 进入

99 ２５８ 细胞生物学 细胞核 激活磷酸酶 活化的磷酸酶又使核内激活蛋白 １ １ ＡＰ １ 脱磷 酸而变构 变构活化的 ＡＰ １可与 ＤＮＡ 特定序列相结合 调节相应基因表达 ＰＫＣ 有着广泛的调节功能 可使肌钙蛋白 微管蛋白等骨架蛋白磷酸化 也可使多种 酶蛋白磷酸化 第三节 第二信使与蛋白激酶 一 腺苷酸环化酶与ＡＭＰ 一 腺苷酸环化酶 腺苷酸环化酶 Ａ ＡＣ 为跨膜 １２ 次的糖蛋白 相对分子量为 １５０ｋＤ 在有 Ｍ２ 或 Ｍ２ 存在的情况下 腺苷酸环化酶能催化 ＡＴＰ 生成ＡＭＰ 腺苷酸环化酶的活性受 Ｇ 蛋白调节 当激素等配体与细胞膜受体结合后 通过激动型 Ｇ 蛋白 Ｇ 激活腺苷酸环化酶 导致 ＡＭＰ 的产生 而抑制型 Ｇ 蛋白 Ｇ 则抑制腺苷 酸环化酶 使ＡＭＰ 减少 二 ＡＭＰ 及其作用 ＡＭＰ 是最早被发现的第二信使 １９５９年 Ｓ 阐 明 了 肾 上 腺 素 的 第 二 信 使 是 ＡＭＰ 后来进一步实验证明许多激素都能使细胞内产生 ＡＭＰ Ｓ 等在 １９６５ 年提出了第二信使 学说 １９７１年荣获诺贝尔医学生理学奖 ＡＭＰ 由 ＡＴＰ 水 解 产 生 在 ＡＣ 催 化 下 ＡＴＰ 发生水解 脱去 β 焦磷酸 形成 ３ ５ 环 腺苷酸 ＡＭＰ ＡＭＰ 又受磷酸二酯酶 ５ 环被打开 生 ＰＤＥ 作用 ３ 成５ ＡＭＰ 因此 ＡＭＰ 浓度受 ＡＣ 和 ＰＤＥ 的 双重调节 ＡＭＰ 对 细 胞 增 殖 与 分 化 有 调 节 作 用 ＡＭＰ 对神经系统也有调节作用 激素能使其靶细胞中产生 ＡＭＰ ＡＭＰ 在 细胞内进一步 ＰＫＡ ＰＫＡ 可使胞内其他酶磷酸 化而 被 激 活 引 起 各 种 生 物 效 应 该 途 径 为 ＡＭＰ ＰＫＡ 通路 在该通路中ＡＭＰ 的生物活性 通过 ＰＫＡ 来实现 图１０ ６ 图１０ ６ ＡＭＰ ＰＫＡ 途径

100 第十章 细胞的信号转导 ２５９ 二 鸟苷酸环化酶与ＧＭＰ 鸟苷酸环化酶 ＧＣ 有两种存在形式 一种存在于细胞膜上 为膜结 合型 另一种存在于胞浆中为可溶性酶 前者分子量为１２０ｋＤ 有４种亚型 存在三个结构 域 Ｎ 端位于细胞外侧 是激素的结合区 Ｃ 端位于细胞内侧 为催化区 后者由 α β两 个亚基组成 分子量为１５０ｋＤ 活性中心含 Ｆ２ 其活性受 ＮＯ 激活 是 ＮＯ 作用的靶酶 ＧＣ 的作用是使 ＧＴＰ 水解 环化生成ＧＭＰ ＧＭＰ 为第二信使 能与依赖ＧＭＰ 的蛋 白激酶 Ｇ ＰＫＧ 结合并使之激活 活化的 ＰＫＧ 能使靶蛋白上的丝氨酸 苏氨酸残基磷酸 化 以产生效应 ＧＭＰ 在视觉 嗅觉系统和肾脏中的作用主要是通过调节离子通道而实 现 ＧＭＰ 在 许 多 组 织 细 胞 中 的 作 用 可 通 过 调 节 磷 酸 二 酯 酶 ＰＤＥ 活 性 而 实 现 图１０ ７ 图１０ ７ ＧＭＰ信息通路 三 蛋白激酶与磷酸化作用 蛋白激酶是一类磷酸转移酶 根据其作用底物的不同可分为丝氨酸 苏氨酸蛋白激酶 酪氨酸蛋白激酶 组 赖 精氨酸蛋白激酶 半胱氨酸蛋白激酶 天冬氨酸 谷氨酸蛋白激酶 五种类型 许多蛋白激酶是被第二信使激活的 根据第二信使的不同蛋白激酶可分为蛋白激 酶 Ａ 依赖于ＡＭＰ 蛋白激酶 Ｇ 依赖于ＧＭＰ 和蛋白激酶 Ｃ 依赖于 Ｃ２ 蛋白激酶能将 ＡＴＰ 的磷酸基团转移至底物特定的氨基酸残基上 使蛋白质发生磷酸

101 ２６０ 细胞生物学 化 以调节蛋白质的活性 蛋白激酶的底物也可能是另一种蛋白激酶 因此可通过蛋白质的 依次磷酸化 而使信号逐级放大 从而引起细胞效应 四 一氧化氮信号 １９９８年 Ｒ Ｆ 等三位美国科学家因发现一氧化氮 ＮＯ 作为信号分子而获得了 诺贝尔医学与生理学奖 ＮＯ 是一种新型的 不典型递质的 可进入细胞内部的信号分子 能快速透过细胞膜 作用于相邻细胞 在免疫系统 神经系统和心血管系统等方面起着重要 的调节作用 机体内的 ＮＯ 是由一氧化氮合酶 ｘ ＮＯＳ 催化 Ｌ 精氨酸 Ｌ Ｌ Ａ 分解形成的 ＮＯ 没有专门的储存及释放机制 细胞中 ＮＯ 的多少与 ＮＯ 的合 成有关 ＮＯ 极不稳定 可被氧自由基 血红蛋白等迅速灭活 而失去生物活性 ＮＯ 是亲脂性的气体小分子 以自分泌或旁分泌方式 通过在胞间和胞内扩散对自身细 胞或相邻细胞发生作用 ＮＯ 的作用主要是激活鸟苷酸环化酶 ＧＣ ＮＯ 通过与胞质鸟苷 酸环化酶活性中心的 Ｆ２ 结合 激活 ＧＣ 使细胞内产生大量的ＧＭＰ 从而导致一系列生 物效应 ＮＯ 对心血管系统有作用 内皮细胞产生的 ＮＯ 能透过细胞膜作用于邻近的血管平滑肌 细胞 使 ＧＣ 激活 产生ＧＭＰ ＧＭＰ 激活蛋白激酶 Ｇ ＰＫＧ 最终引起平滑肌松弛 调 节血管张力 以调整局部组织的血流和血压 ＮＯ 可调节血液凝固 ＮＯ 对神经系统也有作 用 能促进神经递质 如乙酰胆碱 多巴胺 的释放 ＮＯ 介导嗅觉 视觉及痛觉的传入 并可能与吗啡耐受有关 ＮＯ 还在免疫细胞间发挥信息传递作用 五 甘油二酯 三磷酸肌醇和 Ｃ２ 的信号体系 一 甘油二酯活化蛋白激酶 Ｃ 当某种信号分子作用于靶细胞相应受体时 由 Ｇ 蛋白介导 活化膜中磷脂酶 Ｃ ＰＬＣ 该酶可使膜中磷脂酰肌醇二磷酸 ＰＩＰ２ 分解为两个细胞内信使甘油二酯 ＤＡＧ 和三磷酸 肌醇 ＩＰ３ ＤＡＧ 能激活蛋白激酶 Ｃ ｋ Ｃ ＰＫＣ 活化的 ＰＫＣ 可催化细胞许 多生理活动 该信号通路为 ＤＡＧＰＫＣ 途径 由于 ＰＫＣ 由一个大基因家族编码 各种 ＰＫＣ 结构不同 被激活的方式也不同 大多数 ＰＫＣ 的激活依赖于 ＤＡＧ 也有少数 ＰＫＣ 只需磷脂酰丝氨酸激活 图１０ ８ 二 三磷酸肌醇动员细胞内 Ｃ２ 的释放 三磷酸肌醇 ＩＰ３ 是 水 溶 性 小 分 子 它 在 细 胞 质 中 能 识 别 内 质 网 膜 上 相 应 的 受 体 Ｃ２ 通道 并与之结合 被结合后的受体构象发生变化 Ｃ２ 通道开放 Ｃ２ 从内质网中 释放出来 因此ＩＰ３ 与胞内 Ｃ２ 动员有关 Ｃ２ 进入细胞质后作为第二信使 进一步传递 信息 引起细胞内多种生物效应 Ｃ２ 能 活 化 各 种 钙 结 合 蛋 白 例 如 钙 调 蛋 白 Ｃ ｍ ＣＭ 肌 钙 蛋 白

102 第十章 细胞的信号转导 ２６１ Ｃ 膜联蛋白 ｘ 家族等 其中 ＣＭ 由单一 肽链构成 有四个钙离子结合部位 当 ＣＭ 与钙离子结 合后其构象发生改变而被活化 Ｃ２ ＣＭ 进一步激活钙 调素 依 赖 性 激 酶 ＣＭＫ Ｃ２ ＣＭ 既 能 激 活 ＡＣ 又能激活 ＰＤＥ 因而能控制 ＡＭＰ 的生成和水解 调节胞内ＡＭＰ 浓度 Ｃ２ ＣＭ 通过激活肌球蛋白轻链激酶 使肌球蛋白 磷酸化并与肌动蛋白结合引起肌肉收缩 Ｃ２ ＣＭ 可作 用于质膜和肌质网 Ｃ２ 泵 降低细胞内 Ｃ２ 浓度 使肌 肉松弛 此外 Ｃ２ ＣＭ 可通过激活神经递质合成酶系而 调节神经递质的合成 Ｃ２ ＣＭ 能调节血管平滑肌的松 弛作用 细胞对 Ｃ２ 的反应与细胞内钙调素依赖性激酶和钙 结合蛋白的种类有关 图１０ ８ ＤＡＧ 蛋白激酶 Ｃ 途径 六 信息传递体系之间的相互作用 细胞内存在多种信号传递系统 各种信号传递系统间 的关系非常密切 它们相互调节 互相制约 构成了细胞内的通讯网络 共同完成将细胞外 信息传入胞内 逐级放大 产生生物效应的作用 ＡＭＰ 系统和肌醇磷脂系统是细胞信息传 递的两大系统 二者相似处在于 配体与受体结合后 均通过 Ｇ 蛋白介导 活化与 Ｇ 蛋白 偶联的酶 ＡＣ 和 ＰＬＣ 分别产生第二信使ＡＭＰ 和 ＤＡＧ ＩＰ３ 在某些情况下二者相互影响 其中ＡＭＰ 可抑制 ＰＩＰ２ 的水解 ＰＩＰ２ 的水解伴随着ＡＭＰ 含量的降低 Ｃ２ 与ＡＭＰ 系统 及肌醇磷脂系统间也有作用 如 ＰＬＣ 对 Ｃ２ 有依赖性 Ｃ２ 又可反馈调节ＩＰ３ Ｃ２ 可对 ＡＭＰ 的浓度有影响 第四节 信号转导的抑制和终止 细胞信号转导系统是细胞生命活动的重要组成部分 该系统受到细胞严格的调控 如果 没有严密的控制 细胞代谢活动会过于剧烈 导致不良的后果 因此细胞中既有信号转导的 进行 也信号转导的抑制和终止 二者对于细胞来说同样重要 一 信号的终止 信号的终止受许多因素的影响 可发生在信号转导的许多环节 如配体的浓度降低 受 体与配体解离 受体数量减少 活化的 Ｇ 蛋白因其上的 ＧＴＰ 水解成 ＧＤＰ 而转为非活性型 被激活的信号转导蛋白在蛋白磷酸酶作用下去磷酸而失活 形成的第二信使被降解等 这些 情况都会使信号转导发生终止

103 ２６２ 细胞生物学 信号的终止是信号转导的重要方面 信号终止障碍会使信号大量积累 引起各种疾病 二 某些受体和信号转导成分的抑制作用 细胞中某些受体对信号转导有一定的抑制作用 有些虽能与配体结合 但不能诱导效 应 具有拮抗剂样作用 细胞内的信号转导蛋白也存在着某些成分互相间起拮抗或抑制作 用 三 信号转导通路的负反馈调节 信号转导通路的负反馈调节是指信号转导通路中诱导生成的分子或激活的成分对信号转 导有反馈抑制作用 在受体介导的信号转导通路中 被激活的蛋白激酶可反过来使受体发生磷酸化 以降低 受体与配体间的亲和力 另外受体信号通路诱导的抑制性成分也有抑制信号转导和效应 第五节 信号转导与医学关系 信号转导的正常进行是保障人体进行生命活动不可缺少的条件 信号转导异常可导致或 促进疾病的发生 信号转导异常通常出现在配体水平 受体水平或受体后信号转导通路中的 各个环节 现代研究表明 炎性疾病 肿瘤 心血管病 糖尿病等许多疾病的发病与信号转 导异常有关 信号转导异常与疾病的关系是目前医学上人们关注的一大热点问题 一 受体的缺陷 受体是由基因编码的 如果细胞中编码受体的基因发生突变 不能形成相应的受体 细 胞的代谢过程会发生障碍 同样受体数量减少 受体后信号转导过程发生变化 受体配体结 合区发生突变 导致受体与配体的结合能力丧失或使受体配体结合的特异性发生改变 都会 导致细胞对特定配体的反应性降低或丧失 造成细胞相应的代谢与功能障碍 另外有些具有 酶活性的受体其激酶区发生突变可导致酶活性降低或丧失 也可使受体功能丧失 细胞代谢 过程受到干扰 这些情况最终都会使个体表现出疾病的症状 家族性高胆固醇血症为常见的遗传性受体异常病 该病是由于细胞膜上低密度脂蛋白受 体缺陷 使胆固醇不能被肝组织摄取 患者血浆中胆固醇 甘油三酯增高 导致冠心病 心 肌梗死 先天性肾性尿崩症也属于受体异常病 患者对抗利尿激素的反应降低 有多尿 口 渴 多饮症状 其病因可能是体内抗利尿激素受体缺陷 睾丸女性化综合征由于决定雄性激 素受体的基因突变 雄性激素受体缺陷 个体有睾丸 但外形像女性 有阴道无子宫 此外 生长激素抵抗性侏儒症 Ｌ 型侏儒症 雄激素抵抗症等也都属于受体先天性缺陷的遗 传性受体病 胰岛素抵抗性糖尿病是由于胰岛素受体的基因突变 目前已发现约 ５０ 多种胰岛素受体 的基因突变类型 该突变以点突变为主 具有异质性 突变造成胰岛素受体 ＩＲ 合成障碍 受体向细胞膜运输受阻 受体与胰岛素亲和力下降 酪氨酸激酶活性

104 第十章 细胞的信号转导 ２６３ 降低及受体降解加快等 影响了胰岛素的信号转导 使靶细胞抵抗胰岛素或对胰岛素的反应 性降低 该病包括 Ａ 型胰岛素抵抗症 Ｌ ｍ 综合征和 Ｒ Ｍ 综合征 患者 临床表现为严重的高血糖和高胰岛素血症 多数伴有黑色棘皮及多毛症 面容丑陋 胰岛素 抵抗性糖尿病可继发于肥胖 由主动脉缩窄 心肌病 心肌肥厚和机械牵张引起的心肌细胞肥大患者 作为血管紧张 素受体 ＡＴ 和 ＡＴ２有不同程度上调 受体属于蛋白质 当机体免疫机能发生紊乱时 会直接以受体为抗原产生抗受体抗体 这种情况属于自身免疫性受体病 研究发现乳头状瘤病毒 Ｅ２ 与胰岛素受体 脊髓灰质炎病 毒 ＶＦ２与乙酰胆碱受体 结肠炎耶尔森菌与促甲状腺激素受体均有同源序列 当这些病原 体侵入人体时 可能导致相应的自身免疫性受体病 甲状腺功能亢进病由于自身抗体与受体 的结合 刺激了细胞的活动 在重症肌无力患者体内发现有抗 Ｎ 型乙酰胆碱受体 ＡＣＲ 的抗体 该抗体能阻止 运动终板上的 ＡＣＲ 与乙酰胆碱结合 使肌肉收缩发生障碍 系统性红斑狼疮患者血中可 测到以阻断型为主的抗胰岛素受体的抗体 因此患者表现出糖尿病症状 此外 受体本身正常 但与受体功能有关的受体相关因子或辅助因子缺陷 也可导致受 体功能异常 二 Ｇ 蛋白功能异常及蛋白激酶功能异常 Ｇ 蛋白是细胞膜受体信号转导重要的偶联体 Ｇ 蛋白功能异常可造成信号转导异常 如 霍乱和百日咳的发生与 Ｇ 蛋白异常有关 心衰患者的 Ｇ 蛋白也有改变 Ｇ 蛋白增多 伴有 心肌肥厚的慢性心衰患者 Ｇ水平降低 蛋白激酶是信号转导中的关键酶 蛋白激酶功能异常 底物无法磷酸化 相应的效应便 无法产生 三 信号转导异常与疾病 信号转导异常可导致或促进疾病的发生发展 而在疾病状态中也会出现继发性信号转导 异常 这种异常参与了疾病的发展或者会导致另一种病理变化 现已证实多种常见病及危害 人类健康的重大疾病与信号转导异常有关 一 信号转导异常与肿瘤 肿瘤属于非常典型的信号转导异常性疾病 在肿瘤的发生发展过程中都涉及到细胞信号 转导改变的问题 这些信号转导的异常表现在 肿瘤细胞可自身分泌生长因子 生长因子受 体 激素受体 细胞因子受体等异常 受体后信号转导成分异常 目前对于肿瘤了解最多的是因信号转导异常导致的肿瘤增殖过度和凋亡减弱 研究结果 表明 各种致癌因素通过不同的信号转导通路 作用于细胞周期调控蛋白 影响细胞周期 使细胞异常增殖 某些生长因子受体表达异常增多 或生长因子受体等突变导致它们持续性

105 ２６４ 细胞生物学 激活 使促进增殖的信号转导过强 细胞中促进凋亡的信号转导通路减弱 使肿瘤细胞的生 长负调控机制削弱 肿瘤转移是个复杂的过程 细胞粘附分子 血管生成因子 生长因子等参与肿瘤转移过 程 肿瘤的侵袭转移能力与这些成分的改变或其受体的改变有关 肿瘤细胞对抗癌药物的敏感性也与肿瘤细胞受体和信号转导的改变有关 因此了解肿瘤 细胞中受体及信号转导通路的情况对提高临床疗效有一定的作用 二 信号转导异常与心血管病 心血管细胞中存在着离子通道和受体 一些化学信号 机械信号等可通过离子通道和受 体经信号转导系统整合 以调节心血管的舒缩活动 信号转导通路异常与心衰 动脉粥样硬 化 高血压等的发生和发展密切相关 由于心肌超负荷工作 心肌梗死 炎症等使心肌收缩 力降低 造成组织长期灌注不足 使血管紧张素 Ⅱ 去甲肾上腺素等神经内分泌激素及 ＴＮＦ α等细胞因子过度表达 起一定程度的代偿作用 如果长期过度表达可引起有害的效 应 １ 促进心肌的增生 心肌负荷的增加使儿茶酚胺和血管紧张素 Ⅱ 等神经内分泌激素分 泌增多 激活 ＰＫＣ 等信号转导通路 造成心肌细胞中 Ｃ２ 浓度增高 影响基因表达 使蛋 白质合成增加 导致心肌肥大 ２ 促进心肌细胞凋亡 由于神经内分泌激素及 ＴＮＦ α等细胞因子的过度增高 对心肌 产生毒性作用 使心肌细胞凋亡或坏死 个体发生心衰 ３ 受体的继发性改变 心衰患者交感神经机能亢进 血中去甲肾上腺素浓度过高可使 受体下调 受体与 Ｇ 蛋白解偶联 细胞内ＡＭＰ 的生成受影响 使去甲肾上腺素的正性肌 β 力作用减弱 促进心衰的发展

106 第十一章 细胞生长 分裂和细胞周期 ２６５ 第十一章 细胞生长 分裂和细胞周期 生长和增殖是生物的基本特性 无论是单细胞的生物还是多细胞的生物 每个细胞都必 须进行生长和分裂 细胞生长可以表现为细胞大小的增加 细胞干重的增加 蛋白质及核酸 含量的增加 就多细胞生物而言 细胞间质的增加也是细胞大小增加的一种形式 在个体发 育期 细胞的生长尤为明显 如人的心肌细胞在出生时直径为 ７μｍ 到成熟时则增加到 １４μｍ 大鼠肝细胞在出生后 蛋白质含量可增加５倍 细胞质量大约可增加４倍 细胞的生长要受到细胞表面积与体积的比例 细胞核质比例等因素的限制 随着细胞的 不断生长 其表面积与体积的比例逐渐变小 当生长到达一定阶段 细胞表面将不能适应细 胞内外物质交换的需要 同时 胞核与胞质之间也逐渐失去平衡 细胞处于不稳定状态 在 这种情况下 细胞发生分裂 来恢复正常的表面积与体积的比例及核与质之间的平衡 之后 细胞再进行生长 如此分裂和生长反复进行 细胞数量增加 即增殖 以保证生命的延续 细胞生长与细胞分裂交替进行的周期即为细胞周期 在一个细胞周期中 细胞发生一系列复 杂的变化 同时还要接受来自机体内 外多种因素的影响 近几年生物学家 细胞生物学家及遗 传学家们在不同的领域 从不同的角度 用不同的材料对细胞周期的调控进行了阐述 细胞周期 的研究不仅是基础细胞生物学的重要研究课题 而且对于癌症的研究也有十分重要的意义 第一节 细 胞 分 裂 无论是原核生物还是真核生物都必须通过细胞分裂一代代繁衍下去 但是 两者的细胞 分裂有极明显的区别 原核细胞的分裂方式简单 直接一分为二 细胞周期较短 而真核细 胞的分裂远较原核细胞的分裂复杂 本节将主要叙述真核细胞的分裂 真核细胞的分裂方式 可分为 无丝分裂 ｍ 有丝分裂 ｍ 和减数分裂 ｍ 在分裂过程 分 裂后子细胞的遗传特性等方面 三种方式各有其特点 彼此之间也有一定的联系 一 无丝分裂 早在１８４１年 Ｒ Ｒｍ ｋ首先在鸡胚血细胞中观察到无丝分裂 无丝分裂的过程是处于间 期的细胞核拉长 中央部分变细呈哑铃形 随后胞质一分为二 形成两个子细胞 这一过程 中 细胞核变化比较简单 既没有染色体组装 也没有纺锤体形成 仅是细胞核和细胞质直 接分裂 所以又称直接分裂 但是 分裂后遗传物质不一定平均分配给子 细胞 因此其遗传的稳定性和机制等问题仍有待研究 无丝分裂的显著特点是分裂迅速 能

107 ２６６ 细胞生物学 量消耗少 分裂中细胞仍可继续执行其功能 使得无丝分裂对于细胞适应外界环境变化有着 特殊的意义 无丝分裂是低等生物增殖的主要方式 在高等生物中很少见 而人体的一些组织细胞 在 受到创伤或发生病变 衰老时 也能进行无丝分裂 至于无丝分裂是否存在于正常细胞中 现 在多数学者认为 无丝分裂是一种正常的细胞分裂方式 如中国第一位细胞学博士汪德耀 １ ９ ５ ７ １ ９ ６ １ １ ９ ６ ４ 的研究表明 无丝分裂不仅在体细胞中存在 而且在生殖细胞中也同样 存在 又如离体培养的细胞中也可发生无丝分裂 同时 在一定条件下 无丝分裂与有丝分裂 可以相互转化 如汪德耀在兔的子宫粘膜细胞中就观察到这两种分裂交替进行的现象 二 有丝分裂 有丝分裂又称为间接分裂 是高等真核生物细胞分裂的主要方式 分 别由弗勒明 Ｆ ｍｍ １８８２ 在动物和施特拉斯布格 Ｓ １８８０ 在植物中发 现 细胞在进行此种分裂时 必须经过两个明显的连续过程 首先 经复制后的染色体必须 移向细胞相对的两极 其次 细胞质必须按一定方式分裂 这样保证每个子细胞不仅接受一 套染色体 而且还接受包含必需的细胞质成分和细胞器 在有丝分裂中有专门执行细胞分裂功能的临时性细胞结构形成 即有丝分裂器 ｍ 细胞通过这一结构精确地将复制好的染色体平均分配到两个子细胞中去 从 而保证了细胞在遗传上的稳定性 根据分裂细胞形态和结构的变化 可将连续的有丝分裂过 程分为前 中 后 末四个时期 表１１ １ 表１１ １ 细胞有丝分裂各期的特点 细胞周期 分 裂 间 期 各时期的主要特点 Ｇ１ 期 相关蛋白质的合成 ＲＮＡ 的合成 Ｓ期 染色体 ＤＮＡ 的合成复制 Ｇ２ 期 每个染色体形成了两个染色单体 染色质螺旋化 烄前期 １ 细胞核内染色质形成染色体 核膜 核仁消失 ２ 细胞两极发出纺锤丝 并有规律的排列在赤道面位置上 中期 １ 纺锤体清晰可见 分 裂 期 Ｍ 期烅 ２ 着丝点两极发出纺锤丝 形成纺锤体 ３ 可辨认染色体的形态和数目 后期 １ 每条染色体着丝点分裂 成两条染色单体 ２ 纺锤丝收缩将染色单体均匀分为两组 逐渐向两极移动 烆末期 １ 到达两极的染色体变成细长丝状的染色质 ２ 出现核膜 核仁 ３ 赤道面位置出现细胞板 逐渐形成细胞膜 最后由一个细胞形成两个子细胞

108 第十一章 细胞生长 分裂和细胞周期 ２６７ 一 前期 前期 细胞发生变化的主要特征是 染色质凝集 核仁解体 核膜破裂 纺 锤体形成及染色体向赤道面运动 １ 染色质凝集 前期开始的第一个标志特征是染色质不断浓缩 实质上是染色质纤维 螺旋化 折叠 形成棒状或杆状的染色体 每条染色体由两条染色单体构成 单体间靠着丝 粒 ｍ 相连 着丝粒两边附着着由多种蛋白质组成的一种复合结构 称为动粒 ｋ 电镜下呈板状或杯状 染色质凝集的同时 组蛋白也发生着磷酸化 因组蛋 白参与核小体的组装 所以其磷酸化被认为有助于染色质的凝集 ２ 核仁解体 在染色质凝集过程中 核仁开始逐渐分解 并最终消失 其原因可能与 染色质上的核仁组织中心组装到了染色体中 ＲＮＡ 合成停止有关 ３ 核膜破裂 发生于前期末 原因与核纤层蛋白磷酸化有关 脊椎动物细胞中有 ３ 种 类型的核纤层蛋白 Ａ Ｂ Ｃ 核纤层蛋白 Ａ 和 Ｃ 是由同一个转录单位编码的 通过可变剪 接形成不同的 ｍｒｎａ 它们在肽链上的差别是 核纤层蛋白 Ａ 的羧基端比核纤层蛋白 Ｃ 的 羧基端多１３３个氨基酸残基 核纤层蛋白 Ｂ 是由另一个转录单位编码的 通过最后的修饰 在羧基端添加了疏水的异丙基 添加的脂肪酸帮助核纤层蛋白 Ｂ 插入到核膜的内脂层 三 种类型的核纤层蛋白都以二聚体的形式存在 有球形的头和尾部结构以及一个杆状的 Ｑ 螺 旋中心 这些核纤层蛋白二聚体以头头 尾尾相接的方式形成核纤层 在有丝分裂早期 成熟促进因子使三种核纤层蛋白的特定丝氨酸残基磷酸化 引起核纤层的去聚合 磷酸化的 核纤层蛋白 Ａ 和 Ｃ 被释放出来进入溶液中 而磷酸化的核纤层蛋白 Ｂ 由于异丙基的作用仍 然与核膜相连 核纤层的解体 导致核被膜破裂形成小囊泡 散布于胞质中 ４ 纺锤体 形成 在前期末时细胞中出现一种纺锤样的结构 是由星体微管 极间微管 动粒微管纵向排列组成 它的形成过程是由前期开始的 细胞原先的一对中心粒 复制成两对中心粒 彩图 ３ 每对中心粒周围出现放射状的星体微管 ｍ 这种结构被称为星体 两个星体并排于核膜附近 与此同时中心粒之间也有微管形 成 这些微管由纺锤体的一极通向另一极 大多数是不连续的 在纺锤体赤道面处从两极来 的微管彼此重叠 侧面相连 这种微管被称为极间微管 ｍ 然后星体微管 和极间微管远离中心粒的一端 Ａ 端 加入微管蛋白二聚体 两种微管变长 使中心粒向细 胞两极运动 两对中心粒连同其组装的星体沿核膜外边彼此远离 达到相对位置时决定了细 胞分裂极 此时 双极的纺锤体形成 ５ 染色体向赤道面的运动 在核膜开始破裂时 纺锤体一极发出一些微管进入细胞核 这些微管通过靠近中心粒的一端 Ｄ 端 加入微管蛋白二聚体使自身延长 最终微管远离中 心粒的一端会附着到染色体的动粒上 形成染色体纤丝 这些微管被称为动粒微管 ｋ ｍ 染色体纤丝从每条染色体的两边向相反方向放射出来 与纺锤体其他组 成成分相互作用 而使染色体振荡摇摆 逐渐向细胞中央的赤道面运动 彩图 ４

109 ２６８ 细胞生物学 二 中期 中期 ｍ 的主要特点是染色体达到最大程度的凝集 并排列在细胞中央的赤 道面上 构成赤道板 彩图 ５ 一般小的染色体排列在内侧 大的排列在边缘 染色体的 着丝粒处在同一水平面 此时期因为动粒微管作用于染色体上的相反方向的力量达到平衡 所以使染色体排列在赤道面上 如果用药物 如秋水仙碱 抑制微管聚合 破坏纺锤体的形 成 细胞就会被阻断在有丝分裂的中期 此期细胞中出现的由染色体 星体 中心粒及纺锤体所组成的结构 称为有丝分裂器 ｍ 是有丝分裂所特有的 有丝分裂器在维持染色体的平衡 运动 分配中 起着重要作用 三 后期 后期 的主要特征是随着着丝粒的分开染色单体开始向两极移动 彩图 ６ 在这一时期 每条染色体上成对的着丝粒开始分离 两条染色单体分别以同样的速度慢 慢地被拉向纺锤体的两极 染色体被拉向两极是受两种力的作用 一种是动粒微管去装配产 生的拉力 另一种是极间微管的聚合产生的推力 根据所使用的力 有丝分裂的后期可分为 两个阶段 后期 Ａ Ａ 和后期 Ｂ Ｂ 图１１ １ 在后期 Ａ 染色体运动 的力主要是由动粒微管的去装配产生的 此时的染色体运动称为向极运动 在后期 Ｂ 染色 体运动的力主要是由极间微管的聚合产生的 此时的运动称为染色体极极分离运动 图１１ １ 后期 Ａ 染色体分离 后期 Ｂ 两极延伸 这两种运动产生力的机制是不同的 有两种假说 １ 微管去聚合作用假说 主要是用于解释后期 Ａ 向极运动而提出的一种模型 这一模

110 第十一章 细胞生长 分裂和细胞周期 ２６９ 型的特点是动粒微管不断解聚缩短 将染色体拉向两极 解离下来的微管蛋白然后在极间微 管末端聚合 使极间微管加长 合理利用细胞质中微管蛋白库的动态平衡 促使染色体分 开 这种模型可能的机制是微管的正端插入动粒的外层 微管蛋白分子和动粒蛋白分子有亲 和性 微管蛋白在此端可以去组装 在动粒中 ＡＴＰ 分子水解可以提供能量 驱动微管上 的动力蛋白向两极移动 结果是将染色体拉向两极 ２ 纺锤体微管滑动假说 是关于后期 Ｂ 染色体极 极分离机制的一种假说 这种假说 同动粒微管的去聚合假说完全不同 极 极分离是由极间微管的两种不同类型的变化引起 的 首先 极间微管在正端添加微管二聚体进行聚合延长 使两极的极间微管产生重叠带 第二 极间微管间产生滑动 形成将两极分开的力 由于 ＡＴＰ 能够诱导微 ｚ 管的滑动 说明纺锤体上结合有能够利用 ＡＴＰ 产生力并驱动重叠极间微管滑动的发动机蛋 白 图１１ ２ 图１１ ２ 发动机蛋白和微管系统共同协作 使染色体分离 到后期末时 子代染色体被分成相等的两组 分别移到了纺锤体的两极 染色体在两极 合并成团 在这两组染色体团之间 仍然残留有纺锤体部分 四 末期 末期 开始的标志是两组染色体不再向两极迁移 此期的主要特点是子细胞 核出现及胞质分裂 彩图 ７ 在有丝分裂的后期 分散在胞质中的核膜小泡与染色质表面相连 并相互融合 在每一 组染色单体周围重新开始形成核膜 蛋白质介导的蛋白酶解系统将 Ｃ ２ 蛋白 细胞周期蛋 白 Ｂ 降解 使成熟促进因子 ＭＰＦ 失活 由于 ＭＰＦ 失去活性 使得一些在有丝分裂开 始被磷酸化的蛋白质去磷酸化 核纤层蛋白在前期就被磷酸化 当 ＭＰＦ 失活后 一些磷酸 酶很快激活并将核纤层蛋白脱磷酸 去磷酸化的核纤层蛋白又结合形成核纤层 并连接于核

111 ２７０ 细胞生物学 膜上 核孔复合体重新组装 核膜重建 核被膜重建之后 由于核解体而散布在细胞质中的 核蛋白通过核定位信号 经由核孔的选择性输入 进入新的细胞核中 有了核被膜和核蛋 白 再加上染色体组蛋白 Ｈ１ 去磷酸化 使得染色体发生解螺旋 解凝聚 染色质纤维重新 出现 一些ＲＮＡ 基因首先开始转录 一个新的细胞周期又将开始 在后期末或末期开始 胞质中纺锤体逐渐解体 子细胞核之间的细胞中部 出现由微管 及一些囊泡组成的结构 称为中体 在中部质膜的下方 肌动蛋白 肌球蛋白大量聚集 形 成环状结构 称为收缩环 图 １１ ３ 收缩环可因肌动蛋白 肌球蛋白间 相互滑动而发生不断缢缩 使与其相连的细胞膜逐渐内陷 形成分裂沟 ｗ 分裂沟可不断加深直至中体 构成了两个子细胞间暂时的连接桥 最终细胞可在此断裂 完 成胞质分裂 上述过程所需要的能量是由 ＡＴＰ 提供 图１１ ３ 动物细胞的胞质收缩环 胞质分裂与核分裂是一个过程的两个阶段 如在高等植物的根尖分生组织以及其他体细 胞组织中 通常在核分裂结束后 立即进行胞质分裂 甚至有时在核分裂结束以前就已经发 生 在细胞内开始胞质分裂的部分 纺锤丝还未消失 因此认为纺锤体与胞质分裂有很密切 的联系 高等植物的胞质分裂是从细胞板的形成开始 在末期终了时 纺锤体在子细胞核的 附近逐渐消失 中间微管保留 并数量增加 在赤道面地区加宽形成桶状的成膜体 ｍ 其后 来自于高尔基体的囊泡沿微管转运到成膜体中间 融合形成大的 由膜包 裹的原盘状结构 称为初级细胞板 其内含有的多糖装配成新细胞壁基质 并不断向两侧扩大直到与原有的细胞质膜结合 同时也将细胞质分成两半 图 １１ ４ 在低 等植物和动物细胞中 胞质分裂是以缢束或起沟的方式来完成的 缢束的动力是由于在边围 的细胞质中 存在着一条条微丝组成的收缩环 像钱袋上的线拉紧收缩一样 把细胞缢束 分裂为二 如果用细胞松弛素处理 破坏微丝 则分裂缢束的细胞又可变成圆球状 当松弛 素去掉 则又恢复原来缢束状态 这说明缢束型的胞质分裂是由微丝的收缩所致 在时间方

112 第十一章 细胞生长 分裂和细胞周期 ２７１ 面 胞质分裂也并不是完全紧接在核分裂之后 有的往往要等到上一次有丝分裂的所有征象 消失后才发生胞质分裂 在被子植物的胚乳中 当同时形成许多胚乳细胞时 在进行有丝分 裂的核之间形成初生纺锤体 而在不同核之间形成次生纺锤体同时形成许多细胞板 将胚乳 分裂成许多细胞 另外在有丝分裂中 不仅要保证新形成的子细胞得到 全套的遗传物质 同时要保证子细胞得到其他必需的细胞 结构 包括膜结合细胞器 例如植物细胞由于线粒体和叶 绿体等不能自我装配 只能靠已有的线粒体和叶绿体的生 长和分裂增殖 所以 线粒体和叶 绿 体 与 细 胞 分 裂 同 步 使数量加倍 其他的膜结合细胞器 如内质网 高尔基复 合体等要生长并断成片段 这样才能增加均等分配的机会 总之 有丝分裂通过核分裂及胞质分裂两个过程 将 染色质与细胞质平均分配到子细胞中 其中染色质 凝 集 纺锤体及收缩环出现是有丝分裂活动中的三个重要特征 蛋白质的磷酸化与去磷酸化是细胞许多形态变化产生的分 子基础 此外 蛋白质磷酸化状态还可影响分裂细胞的粘 图１１ ４ 植物细胞成膜体的形成 附性 三 减数分裂 减数分裂是一种特殊的有丝分裂 发生于有性生殖个体或生物的生殖细胞中 通过减数 分裂 染色体数目减少一半 即由２变为 受精后 又由 恢复为 ２ 这样保证了有性 生殖生物在世代交替中染色体数目的恒定 减数分裂也是遗传变异产生的主要原因 因为在减数分裂过程中 非同源染色体重新组 合的同时 同源染色体间也会发生部分交换 这种结果致使生殖细胞的遗传基础多样化 从 而产生的后代变异范围扩大 对外界环境条件的变化适应能力也增强 每种生物在个体发育 中 减数分裂发生的时间和部位是一定的 即受精卵经过若干次有丝分裂后 在生物体的一 定部位到发育的一定时期 细胞由有丝分裂周期转而进入减数分裂过程 但不同种类生物 它们减数分裂发生的时间和部位却有极大的差异 表现出明显的多样性 减数分裂包括两次分裂过程 图 １１ ５ 分别称为第一次减数分裂 ｍ Ｉ 及第二 次减数分裂 ｍ Ⅱ 每次分裂同样包括前期 中期 后期 末期 两次分裂之间有一 个短暂的间期 此间期不进行 ＤＮＡ 合成 第一次减数分裂相对重要 此过程中发生染色体 数目减半及遗传物质的交换 一 第一次减数分裂 第一次减数分裂有两个主要特点 ① 一对同源染色体分开 分别进入两个子细胞 在 同源染色体分开之前发生交换和重组 ② 在染色体组中 同源染色体的分离是随机的 染 色体组要发生重新组合

113 ２７２ 细胞生物学 图１１ ５ 减数分裂模式图 １ 前期 Ｉ 在此期细胞中出现一些显著的特征 为减数分裂所特有 即同源染色体进 行配对 交换 胞核显著增大 持续时间长 前期Ｉ又可细分为五个亚期 １ 细线期 染色质开始凝集 螺旋化成为细线状的染色体 但辨认 不出两条染色单体 在细线上 可见成串的念珠状小圆粒 称为染色粒 ｍｍ 细 线期染色体已开始复制 并且核及核仁的体积开始增大 可能与 ＲＮＡ 蛋白质合成有关 ２ 偶线期 ｚ 亦称配对期 此期细线状的染色体进一步凝 集 并且来自父方的一条染色体和来自母方的 一条形态大小相同的同源染色体开始两两配对 完全配对 此过程称为联会 的同源染色体被称为二价体 因其共 有四条染色单体 又被称为四分体 联 会一般是从靠近核膜的一端开始 或者从染色体 纵长的各个不同部位开始 最后扩展到染色体的 全长 在联会的同源染色体之间 沿纵轴方向 图１１ ６ 一种昆虫的联会复合体 存在一种特殊的结构 即联会复合体 ｍ ｍ ｘ ＳＣ 图１ １ ６ 在电镜下可见 ＳＣ 由三个平行的部分组成 两侧为侧生成分 电子密度较高 由宽约 ７ １ ０ｍ 的纤维组成 成 分主要为 ＤＮＡ 同时还包括 ＲＮＡ 和组蛋白 两侧侧生成分之间 为宽约１ ０ ０ｍ 电子密度较低 的中间区 由横向排列的蛋白质纤维组成 主要成分为非组蛋白 在中间区的中间有一电子密 集的梯状结构 宽约３ ０ｍ 仍由蛋白质纤维组成 称为中央组分

114 第十一章 细胞生长 分裂和细胞周期 ２７３ 完全配对的同源染色体被称为二价体 因其共有四条染色单体 又被称为四 分体 联会复合体的作用主要在于稳定二价体中同源染色体紧密的配对 而在联会 的起始阶段 当染色质凝集程度较低时 同源染色体之间的接触主要依赖于其特定位点上的 碱基之间的互补性配对 随着染色质进一步的凝集 联会复合体逐渐形成 联会复合体形成 的具体过程是 在减数分裂前受减数分裂信号刺激 ＳＣ 的单体在胞质中合成之后 通过核 膜进入核内 在核内达到高浓度 再加上受到和染色体结合的一些因子的作用 促使亚单位 组成侧生组分轴心 通过横切面的细致分析 可以见到有一条侧生组分的轴心位于两条姐妹 染色单体之间的缝隙中 而且和染色质密切联系 两条侧生组分轴心逐渐靠拢 直到距离达 １００ｍ 左右时 二者借大量横向垂直伸出的纤维 互相交错形成中央组分 继而单链 Ｚ 顺序或 与蛋白质顺序识别分子组合到 之中 进一步促进同源染色体的紧密地 ＤＮＡ ＲＮＡ ＳＣ 整列 这时 ＳＣ 便可提供有组织的网络 稳定联会 提供分子配对和重组活动有关的因子及 酶 由于同源染色体联会的结果 细胞染色体就由 ２条单价体 变成了 条二 价体 同源染色体的相互识别是其配对的前提 但其机制还不清楚 染色体附 着于核膜上可能与此相关 ３ 粗线期 又称重组期 ｍ 该阶段开始于同源染 色体联会之后 染色体继续变粗变短 至少缩短了 １ ４ 呈粗线状 这是由于染色体的进 一步凝集及同源染色体的配对 此期可见染色体形态是一个明显的四分体 四分体间的 ＳＣ 中央 还可见到一些椭圆形或球形 直径约为 ９０ｍ 富含蛋白质及酶的结构 此结构被称 为重组节 ｍ 这一时期细胞中进行着同源染色体片段的交换及重组 其实从联会开始 即已发生交 换 但因同源染色体间紧密结合在一起 所以无法观察到交换 到双线期时 交换的结果会 使同源染色体中非姊妹染色单体之间的某些部位相互间形成接触点 这些接触点被称为交叉 ｍ 当双线期观察到这些交叉时 同源染色体已经完成了交换并开始分离了 交叉 的数目决定于物种的类型及染色体的长度 在人类 平均每对染色体的交叉数为 ２ ３ 个 若染色体较长 则交叉数也会较多 交叉标志着非姊妹染色单体之间彼此发生了遗传物质的 交换 是同源染色体之间 ＤＮＡ 片段的交换 结果产生了新的等位基因的重新组合 关于发 生交叉的机制 目前已提出了两种断裂重接的重组模型进行解释 ①单链断裂重组模型 在 该模型中 同源染色体在联会期间 一对同源染色体中各有一条单链 ＤＮＡ 断裂 然后要发 生重接 不过在重接的过程中发生了错误 不是原来断开的染色体重新连接起来而是交换连 接 并且要通过一种 Ｈ 中间结构的变化最后形成不同类型的重组体 在此过程中需要 特殊的 ＤＮＡ 重组蛋白 Ｒ Ａ 蛋白的参与 这一模型是 Ｈ 提出的 所以又称为 Ｈ 重组模型 ② 双链断裂重组模型 在该模型中 一条染色体的两条链都发生了断裂 断裂是由内切核酸酶水解磷酸二酯键的结果 ＤＮＡ 断裂之后由外切核酸酶扩大缺口 接着 是断裂链的游离端插入到具有完整双链的同源染色体中 形成 Ｄ 环结构 在 ＤＮＡ 聚合酶的 作用下 断裂两条链分别以完整链为模板开始合成 最后再通过断裂重接过程完成重组 在粗线期 细胞中还存在着 ＤＮＡ 的合成 Ｙ Ｈ 等人 １９６６ 在百合属和延龄草属

115 ２７４ 细胞生物学 中发现 粗线期合成大约０ ３ 的 ＤＮＡ 称为合线期 ＤＮＡ ｚ ＤＮＡ 或粗线期 ＤＮＡ Ｐ ＤＮＡ １９９１年 中国科学院上海原子核所应用自己研制成功的 ＳＴＭ 与上海细胞生物学所 前苏联科学院分子生物学所合作 获得了 Ｐ ＤＮＡ 的 ＳＴＭ 图像 直观地显示了 Ｐ ＤＮＡ 的结 构特征 右手螺旋和链的等距间隔 现推测 Ｐ ＤＮＡ 在 ＤＮＡ 断裂的再结合过程中对断口的 修复可能起一定的作用 ４ 双线期 染色体长度进一步变短 此期的主要特点有 ① ＳＣ 因发 生去组装而逐渐消失 染色体去凝聚 形成多个核仁并进行 ＲＮＡ 活跃的合成 某些特殊的 染色体合成于此期 如灯刷染色体 ② 二价体中两条同源染色体开始分开 但分开不完全 出现交叉 ③ 此期持续时间很长 几周 几月 几年都有可能 如 人卵母细胞的双线期 就可持续５０年之久 随着双线期的进行 交叉开始远离着丝粒 并逐渐向染色体臂的端部移动 交叉的数目 也由此减少 此现象称为交叉端化 ｍ ｚ 交叉端化的机制目前尚不清楚 可能 与同源染色体着丝粒间存在某种排斥有关 ５ 终变期 ｋ 又称再凝聚期 此期二价体显著收 缩变粗 染色体螺旋化达到最高程度 并向核的四周边缘移动 在核内较均匀地分散开 同 源染色体进一步互相排斥 端化继续进行 由于交叉数目和端化进程的差异 终变期二价体 的形态可表现出多样性 到最后四分体只靠端部交叉使其结合在一起 姐妹染色单体通过着 丝粒连接在一起 并且在此期核仁消失 纺锤体形成 随着核膜破裂 纺锤体侵入核区 在 纺锤体的作用下 染色体开始移向细胞中部的赤道面上 ２ 中期Ⅰ 纺锤体侵入核区 均匀分散于核内的纺锤体开始向中部移动 不同于有丝 分裂的是 此时四分体上有４个着丝粒 一侧纺锤体只和同侧的两个着丝粒相连 最后染色 体排列在赤道板上 在大多数真核生物中 中期Ｉ仍然能够见到排列在赤道板上同源染色体 的交叉 ３ 后期Ⅰ 同源染色体在两极纺锤体的作用下分开 并逐渐移向两极 由于每条染色 体仍含有两条染色单体 因而每个极仍含有两套染色体 不同的同源染色体对向两极的移动 是随机的 独立的 所以父方 母方来源的染色体此时会发生随机组合 即染色体组的重 组 这种重组有利于减数分裂产物的基因组变异 如人有 ２３ 对染色体 从理论上讲父母双 方有２２３的组合方式 同时伴有异源染色体 ｍ ｍ 的自由组合 因而除 了同卵双生之外 几乎不可能得到遗传上相同的后代 同源染色体分离的过程可能与交叉的 作用关系密切 已观察到 若某些联会的同源染色体之间缺乏交叉的形成 则不能正常分 离 最终可导致子细胞中染色体数目异常的增多或减少 在人类 唐氏综合征等染色体疾病 的发生即与上述变化有关 ４ 末期Ⅰ 末期Ⅰ是从染色体到达两极后开始 染色体逐渐解螺旋化 恢复成细丝状 核膜和核仁重新出现 同时进行胞质分裂 形成２个子细胞 子细胞内含 条染色体 每一 条染色体含有２条染色单体和１个着丝粒 在某些生物中 子细胞形成时 染色体可以仍然 保持凝集状态

116 第十一章 细胞生长 分裂和细胞周期 ２７５ 二 减数分裂间期 两次减数分裂之间的时期称为分裂间期 ｋ 是一个极短的时期 没有新的 ＤＮＡ 的合成 因而也不进行染色体复制 细胞中染色体数目已经减半 在某些生物 甚至 没有这个间期 而由末期Ｉ直接转为前期Ⅱ 三 第二次减数分裂 与有丝分裂类似 可分为前期Ⅱ 中期Ⅱ 后期Ⅱ 末期Ⅱ 前期Ⅱ时间较短 若染色 体已去凝集 则此时将发生再凝集 呈螺旋化棒状或杆状 每一染色体由两条单体组成 纺 锤体形成后 每一染色体上的两个动粒分别与不同极的动粒微管相连 并逐渐向细胞中央移 动 核仁 核膜再次消失 中期Ⅱ染色体排列于赤道面上形成赤道板 之后在纺锤体微管的 牵引下 两染色单体彼此分裂 分别向纺锤体的两极移动即进入了后期Ⅱ 末期Ⅱ时 两极 各有 条染色体 并且每条染色体只由１条染色单体构成 染色体再解螺旋化 核膜重新形 成 出现核仁 又一次经过胞质分裂 形成新的子细胞 这样就完成了减数分裂的全过程 经过完整的减数分裂过程 一个母细胞分裂成４个子细胞 子细胞的染色体数目只有母 细胞的１ ２ 成为单倍体的生殖细胞 当精子和卵子结合后 受精卵又重新组合成二倍体细 胞 由上可知 减数分裂与有丝分裂的共同点都是通过纺锤体同染色体的相互作用进行细胞 的分裂 但二者之间又有许多差异 ① 有丝分裂是体细胞的分裂方式 减数分裂是生殖细 胞产生配子的过程 生殖细胞也有有丝分裂 ② 有丝分裂是一次细胞周期 ＤＮＡ 复制一 次 分裂一次 染色体数目不变 减数分裂是两次细胞周期 ＤＮＡ 复制一次 细胞分裂两 次 染色体数目减半 ③ 有丝分裂中 每个染色体是独立活动 在减数分裂中 染色体要 配对 联会 交换和交叉 ④ 有丝分裂之前 经 ＤＮＡ 合成完成进入 Ｇ２ 期后才进行有丝分 裂 减数分裂之前 ＤＮＡ 合成时间很长 ９９ ７ 合成 ０ ３ 未合成 一旦合成 即进入 减数分裂期 Ｇ２ 期短或没有 ⑤ 有丝分裂时间短 １ ２小时 减数分裂时间长 几十小时 至几年 第二节 细 胞 周 期 当一个细胞生长到一定时期时 或者分裂繁殖 或者衰老死亡 几乎没有例外 如果是 细胞分裂 其产生的子细胞可以继续生长增大 随后又分裂产生下一代子细胞 这种生长与 分裂的周期称为细胞周期 具体是指细胞从上一次分裂结束开始生长到下一次 分裂终了所经历的过程 整个过程所需的时间则称为细胞周期时间 根据光学显微镜所观察 到的细胞分裂时的活动 可以将细胞周期分为两个主要的时期 分裂期 ｍ 和 分裂间期 分裂期简称为 Ｍ 期 Ｍ 包括细胞的胞核分裂和胞质分裂 两个过程 Ｍ 期所持续的时间较短 一般为 ３０ ６０ｍ 分裂间期实际上是新细胞的生长

117 ２７６ 细胞生物学 期 根据新细胞从开始生长起到分裂前止的分裂间隔期中的生理和生化变化 可分为 Ｇ１ 期 Ｓ期 图１１ Ｇ２ 期 ７ Ｓ期为 ＤＮＡ 合成期 Ｇ１ １ ２ 期为合成前期 该期细胞中进行的生化活动主要为 Ｓ期的进行做准备 Ｇ２ 期则为 ＤＮＡ 合成 后期 为细胞由分裂间期向分裂期转变的准备时期 由于 Ｇ１ 期在各种细胞中所持续的时间 不同 因此分裂间期持续时间为数小时至数年不等 细胞周期普遍存在于高等生物中 在典型的细胞周期中 存在着一种控制系统 该控制 系统是通过细胞周期的关卡来进行调节的 控制系统至少有３个关卡 即 Ｇ１ 关卡 靠近 Ｇ１ 末期 Ｇ２ 关卡 在 Ｇ２ 期结束点 中期关卡 在中期末 而每一个关卡 由细胞所处的 状态和环境决定细胞能否通过此关卡 以调节细胞是否能进入细胞周期的下一阶段 图１１ ７ 细胞周期可划分为四个阶段 １ Ｇ１ 关卡 启动点或限制点 如果将细胞离体培养后 减少其培养所需营养物质的 供应 或去除细胞必要的蛋白质生长因子 或应用蛋白质合成抑制剂 或使细胞分布过于密 集等 均可使细胞周期均停顿在 Ｇ１ 期 实验证明 有一个不可逆转的点处于 Ｇ１ 期的晚期 此点在哺乳动物中称为限制点 Ｒ 而在酵母中称 ＳＴＡＲＴ 即是 Ｇ１ 关 卡 Ｇ１ 关卡的作用主要是监测细胞的大小和环境的状态 如果细胞生长到足够大 细胞内 部环境合适 就会激发 ＤＮＡ 复制 细胞进入 Ｓ期 因此说 Ｇ１ 关卡可以决定细胞能否分裂 在某些真核生物 包括哺乳动物和芽殖酵母 中 其成为细胞周期的主要控制点 如果细胞 被阻止在 Ｇ１ 期 可能会产生两种结果 一种是暂时停止生长 使 Ｇ１ 期延长 直到条件合

118 第十一章 细胞生长 分裂和细胞周期 ２７７ 适时再通过 另一种是使细胞进入 Ｇ０ 期 处于暂时静息状态 某些调控蛋白要暂时降解 使细胞不分裂 当某些分裂原 外部的或内部合成的 合成出现时 静息的 Ｇ０ 细胞受到刺 激 细胞内合成某些必要的调控蛋白 细胞便可进入 Ｇ１ 期 但是有些静息的细胞不能再进 入 Ｇ１ 期 另外还有一个关卡就是 ＤＮＡ 预复制的阻断 为了保证每一条 ＤＮＡ 在细胞周期中 只复制一次 一旦 ＤＮＡ 进行了复制 细胞就会通过对预复制复合物的装配控制 ＤＮＡ 的再 复制 直到细胞分裂结束 ２ Ｇ２ 关卡 Ｇ２ 关卡是裂殖酵母的主要关卡 主要作用是检测细胞的大小 细胞所处的 状态以及细胞内 ＤＮＡ 是否复制完毕 如果 ＤＮＡ 正确复制 且复制完全 细胞生长的足够 大 细胞就会进入有丝分裂 即进入细胞分裂期 ３ 中期关卡 主要作用是监测所有的染色体是否都与纺锤体相连 并排列赤道板上 检测 ＭＰＦ 是否失活了 否则不能进行有丝分裂和胞质分裂 即当染色体完全分离后 细胞 进入下一阶段 在高等生物中 根据分裂的连续情况 可将细胞分为三种 ① 在细胞周期中连续分裂 的细胞称为周期性细胞 如卵母细胞和精原细胞需要不断地产生配子 造血干细胞需要不断 地产生血细胞 上皮基底层细胞需要不断地分裂补充表面老化死亡的细胞 这类细胞的分裂 对于组织的更新有着重要的意义 ② 在一般情况下不分裂 但受到一定的刺激后 即可进 入细胞周期 开始分裂 此类细胞称为 Ｇ０ 细胞 又称为暂不增殖细胞 休眠细胞 如肝细 胞在外科手术切除部分肝组织后可以诱导肝细胞进行细胞分裂 淋巴细胞可通过与抗原的相 互作用诱导增殖 这类细胞与组织的再生 创伤的愈合 免疫反应均有关 ③一类结构 功 能都高度特化的终端分化细胞 它们已完全丧失了分裂能力 直至其死亡 如神经细胞 肌 细胞 哺乳动物的红细胞 一 细胞周期各时相的动态变化 一 Ｇ１ 期 合成前期 细胞质量和体积逐渐增大 ｍｒｎａ ＲＮＡ 和ＲＮＡ 大量合成 这三种 ＲＮＡ 与多种蛋 白质因子共同参与蛋白质的合成 所以此期细胞中会产生大量的蛋白质 为 Ｓ期 ＤＮＡ 的复 制做准备 这些蛋白质包括与 Ｓ期的 ＤＮＡ 复制相关的酶系如 ＤＮＡ 聚合酶 胸腺嘧啶激酶 胸腺嘧啶核苷酸激酶 脱氧胸腺嘧啶核苷酸合成酶等 及与 Ｇ１ 期向 Ｓ期转变相关的蛋白质 如触发蛋白 钙调蛋白 细胞周期蛋白等 与 Ｓ 期的 ＤＮＡ 复制相关的酶在 Ｇ１ 期晚期时活 性增高 特别是 ＤＮＡ 聚合酶 这些酶活性增高 为 Ｓ 期的 ＤＮＡ 合成不可缺少的条件 触 发蛋白是一种不稳定蛋白 简称为 Ｕ 蛋白 它的积累有助于细胞通过 Ｇ１ 期的 Ｒ 点进入 Ｓ期 处于 Ｇ０ 期的细胞中缺乏 Ｕ 蛋白和其他一些因子 所以暂时不能通过 Ｒ 点 钙调蛋白是真核细胞内重要的 ２受体 它调节细胞内 Ｓ２ 的水平 钙调蛋白的含量 在 Ｇ１ 晚期可达到峰值 如用抗钙调蛋白药物处理细胞 可延缓细胞从 Ｇ１ 期向 Ｓ 期转变的进 程 蛋白质的磷酸化作用在 Ｇ１ 期也比较突出 组蛋白的磷酸化在 Ｇ１ 期开始增加 这将有

119 ２７８ 细胞生物学 利于 Ｇ１ 晚期染色体结构成分的重排 非组蛋白 一些蛋白激酶在 Ｇ１ 期也可发生磷酸化 已知大多数蛋白激酶磷酸化发生于其丝氨酸 苏氨酸或酪氨酸部位 Ｇ１ 期之末 是推进细胞周期的一个关键时刻 也是药物等因素作用于细胞周期的一个 敏感点 Ｇ１ 期持续时间在各种细胞中变异很大 多数类型细胞的 Ｇ１ 期较长 这可能与细胞 在 Ｇ１ 期需要增加质量有关 但是在某些单细胞生物 如大变形虫 四膜虫等 和多细胞生 物的某些细胞 如海胆胚胎 小鼠胚胎 它们则缺乏 Ｇ１ 期 有人认为 Ｇ１ 期缺乏意味着 ＤＮＡ 合成不一定在有丝分裂之后 可能是在 Ｇ２ 期完成的 另外 Ｇ１ 期合成的 ｍｒｎａ 还可 能与 Ｓ期 ＤＮＡ 加倍后的遗传信息转录和新的蛋白质合成有关 二 Ｓ期 合成期 Ｓ期是细胞周期中最重要的一个时期 细胞中进行着大量的 ＤＮＡ 的复制 并且组蛋白 及非组蛋白也在大量的合成 ＤＮＡ 的复制需要多种酶的参与 如解旋解链酶类 引物酶 ＤＮＡ 聚合酶 ＤＮＡ 连接 酶等 在 ＤＮＡ 复制过程中 有严格的时间顺序性 通常 Ｇ Ｃ 含量较高的 ＤＮＡ 序列在早 Ｓ 期复制 Ａ Ｔ 含量较高的 ＤＮＡ 序列则在晚 Ｓ 期复制 而就染色体来说 常染色质的复制 要较异染色质复制早 一个典型的例子就是人女性的细胞中 当其他染色体都被复制完以 后 才开始进行钝化的 Ｘ 染色体复制 还有一条规则即是能转录的 ＤＮＡ 复制在先 不能转 录的 ＤＮＡ 复制在后 而且 ＤＮＡ 复制的顺序总是一定的 Ｘ 染色体的长臂总是在 Ｓ 期之末 才复制 编码ＲＮＡ 的基因总是在 Ｓ期的前半期复制 一般 ＤＮＡ 复制仅在短短的几小时即 可完成 这主要是因 ＤＮＡ 链可以分成若干复制单位 此起彼伏 每秒钟大约有 ２５ 万个 Ａ Ｔ ＧＣ 碱基配对 在不同的发育时期 复制单位开放的多少有所不同 这就影响了 Ｓ 期的 长短 细胞中在某种特殊情况下 也可以有 Ｓ 期以外的 ＤＮＡ 合成 称为 Ｓ 期外的 ＤＮＡ 合 成 ＤＮＡ Ｓ期是组蛋白合成的主要时期 组蛋白的合成与 ＤＮＡ 的合成在时间上是同步的 在密 度上是相应的 此期胞质中有大量的组蛋白 ｍｒｎａ 产生 它们参与合成新的组蛋白 组蛋 白进入胞核后 与复制后的 ＤＮＡ 迅速结合 组装成核小体 进而形成具有两条单体的染色 体 另外 推测组蛋白起到 ＤＮＡ 复制延长因子的作用 没有组蛋白 ＤＮＡ 的复制就会停 止 除了组蛋白合成以外 在Ｓ期细胞中还进行着组蛋白持续的磷酸化 另外中心粒的复制 也在Ｓ期完成 原来的一对中心粒发生分离 分别在其垂直方向形成一个子中心粒 由此形 成两对中心粒 在以后的细胞周期进程中 这两对中心粒将发挥微管组织中心的作用 与纺 锤体微管 星体微管的形成相关 三 Ｇ２ 期 合成后期 Ｇ２ 期是 ＤＮＡ 合成的后期 在这一时期 主要是大量合成 ＡＴＰ ＲＮＡ 和与 Ｍ 期结构 功能相关的蛋白质 包括 ① 为 Ｍ 期纺锤体微管形成提供丰富来源的微管蛋白 其合成在 此期达到高峰 ② 与核膜破裂 染色体凝集密切相关的促成熟因子 ｍ ｍ ＭＰＦ 等 为细胞分裂做准备 并且在此期已复制的中心粒逐渐长大 开始向细胞

120 第十一章 细胞生长 分裂和细胞周期 ２７９ 两极分离 四 Ｍ 期 即是细胞有丝分裂期 细胞中 染色质凝集 核仁解体 核膜破裂 纺锤体形成 染色 体向赤道面运动 随后染色体在赤道面上开始分离 染色单体向两极移动 核膜 核仁重新 出现 染色体解螺旋 两个子核形成 同时胞质也一分为二 由此完成细胞分裂 Ｍ 期除非组蛋白外 细胞中蛋白质合成显著降低 可能是因染色质凝集成染色体后 模板活性降低 ＲＮＡ 的合成在此期也完全被抑制 细胞膜也发生显著变化 细胞变圆 根 据这一特点 可应用有丝分裂选择法进行细胞同步化筛选 二 细胞周期的调控 细胞周期的调控是一个极其复杂的过程 涉及到多因子在多层次上的作用 这些因子通 常在细胞周期某一特定的时期 即调控点 ｋ 处起作用 它们大多数为蛋白质或 多肽 美国科学家 Ｈ ｗ 英国科学家 Ｈ 和 Ｎ 均曾因发现了细胞周期关键分子的 调节作用获得了２００１年医学 生理学诺贝尔奖 Ｈ ｗ 的主要贡献是发现了控制细胞周期 的 ＳＴＡＲＴ 基因 Ｈ 的主要贡献是发现了细胞周期的关键调节物质 ＣＤＫ 细胞周期蛋 白依赖性激酶 Ｎ 的主要贡献则是发现了调节 ＣＤＫ 功能的 Ｃ 细胞周期蛋白 下 面将介绍几种重要的调控因子 一 细胞周期蛋白 细胞周期蛋白是一类随细胞周期的变化 呈周期性的出现与消失的蛋白质 图 １１ ８ １９８３年 Ｔ Ｅ 等在海胆受精卵中首次发 现 实验中将同步化的受精的海胆卵细胞培 养在有放射性氨基酸的培养液中 每 １０ｍ 取样一次分离纯化蛋白质 然后通过凝胶电 泳 放射自显影进行蛋白质分析 结果发现 经过几轮细胞周期之后 放射性标记的蛋白 质的量稳定增加 其中有一种蛋白质在有丝 分裂的早期含量特别高 但是到了有丝分裂 后期就急剧下降 然后在下一个细胞周期又 图１１ ８ Ｃ 的周期性变化 慢慢积累直到有丝分裂前达到高峰 因这种 蛋白质在受精卵早期卵裂与细胞分裂中呈现周期性的合成与降解 所以后来被命名为细胞周 期蛋白 Ｂ Ｂ 如果应用秋水仙碱抑制细胞分裂 则细胞周期蛋白的降解不会发生或 被延缓 在真核生物中 细胞周期蛋白共可分为 Ａ Ｂ Ｃ Ｄ Ｅ 等几大类 它们在细胞周 期的不同阶段 相继表达 与细胞中其他一些蛋白结合后 参与细胞周期相关活动的调节 表１１ ２

121 ２８０ 细胞生物学 表１１ ２ 不同类型的周期蛋白 脊椎动物 激酶复合体 芽殖酵母 Ｃ ＣＤＫ Ｃ ＣＤＫ Ｇ１ＣＤＫ Ｃ Ｄ ＣＤＫ４ ６ Ｃ ３ ＣＤＫ１ ＣＤＣ２８ Ｇ１ Ｓ ＣＤＫ Ｃ Ｅ ＣＤＫ２ Ｃ １ ２ ＣＤＫ１ ＣＤＣ２８ Ｓ ＣＤＫ Ｃ Ａ ＣＤＫ２ Ｃ ５ ６ ＣＤＫ１ ＣＤＣ２８ ＭＣＤＫ Ｃ Ｂ ＣＤＫ１ ＣＤＣ２ Ｃ １ ４ ＣＤＫ１ ＣＤＣ２８ 注 包括 Ｄ１ ３ 各亚型 Ｄ 在不同细胞中的表达量不同 但具有相同的功效 Ｃ Ｃ Ｄ Ｅ 的表达发生于 Ｇ１ 期 进入 Ｓ期即开始降解 Ｃ Ｄ 是通过与细胞中的 细胞周期蛋白依赖激酶 ｋ Ｃｋ 家族的成员 Ｃｋ４ ５ ６结合 来调 控细胞从 Ｇ１ 期越过 Ｇ１ 期晚期的限制点 Ｒ 点 向 Ｓ期转变 有研究表明 Ｃ Ｄ 在一些向 Ｓ期转变的 Ｇ０ 期细胞中也发挥着同样的作用 在这些 Ｇ０ 期细胞中 可发现 Ｃ Ｄ 的转录 及表达 相反 如果加入 Ｃ Ｄ 抗体则会阻止 Ｇ０ 期细胞向 Ｓ期转变 Ｃ Ｅ 的作用可能 在 Ｇ１ 期的晚期 与 Ｓ期的启动相关 因为在 Ｇ１ Ｓ 期测得 Ｃ Ｅ 与 Ｃｋ２ 形成的复合物活 性达到最高 Ｃ Ａ 的表达发生于 Ｇ１ 期向Ｓ期转变的过程中 其形成后与 Ｃｋ２结合 在Ｓ期 ＤＮＡ 合成的启始过程中发挥作用 当 Ｃ Ｅ 在 Ｓ期发生降解后 Ｃ Ａ 的作用将延续至整个 Ｓ 期 与 Ｓ期的进程相关 也可能在 Ｇ２ Ｍ 转换中发挥作用 Ｃ Ｂ的合成在 Ｇ２ 期时达到高峰 随着 Ｍ 期的结束而发生降解 它的降解是通过对 促后期复合物 ｍ ｍ ｘ ＡＰＣ 活性的控制来进行调节的 图 １１ ９ 实验从非洲爪蟾被阻断在中期的卵细胞中分离出 ＡＰＣ 发现其对于激发细胞周期蛋白 Ｂ 的 多遍在蛋白化的活性很低 然而从具有正常细胞周期的非洲爪蟾的卵细胞中分离出的 ＡＰＣ 却具有较高的激发多遍在蛋白化的活性 这就表明具有较高活性的 ＡＰＣ 复合物中有几个亚 基是被磷酸化的 用磷酸酶除去 ＡＰＣ 中磷酸化位点的磷酸基团 会降低 ＡＰＣ 的活性 为了 解释 ＡＰＣ 的活性和作用 学者们提出了一个模型 当 ＭＰＦ 的活性在有丝分裂中期达到最高 峰时 它将 ＡＰＣ 磷酸化并将其激活 接着发生细胞周期蛋白 Ｂ 多遍在蛋白化作用 引起细 胞周期蛋白 Ｂ 的降解 由于细胞周期蛋白 Ｂ 是 ＭＰＦ 的一个必需亚基 它的降解势必导致 ＭＰＦ的失活 到 Ｇ２ 期的后期 ＡＰＣ 失活 使得细胞周期蛋白 Ｂ 的浓度升高 同时提高 ＭＰＦ的活性 以便进入下一个有丝分裂期 由于细胞周期蛋白 Ｂ 在整个细胞周期中是连续 合成的 这就合理解释了为什么在细胞周期中细胞周期蛋白 Ｂ 的浓度在分裂间期不断升高 而在有丝分裂期又突然下降

122 第十一章 细胞生长 分裂和细胞周期 ２８１ 图１１ ９ Ｃ Ｂ 的降解途径 二 成熟促进因子 成熟促进因子 ｍ ｍ ＭＰＦ 是一种在 Ｇ２ 期形成的 能促进 Ｍ 期启动的调控因子 在１９７１年 Ｍ 和 Ｍ ｋ 发现于经孕酮处理的成熟的非洲爪蟾卵母 细胞中 未成熟的爪蟾卵母细胞在显微注射了来自 Ｍ 期卵细胞中的提取物后 可使卵母细 胞进入 Ｍ 期 而用来自细胞周期其他阶段的提取物注射卵母细胞则不能诱导进入 Ｍ 期 ＭＰＦ广泛存在于从酵母到哺乳动物的细胞中 人类 ＭＰＦ是由３ ２ ０ ０ ０ ６ ２ ０ ０ ０两种蛋白质组成 ２ 的 前者为一种细胞周期蛋白依赖激酶 ３ ４ Ｃ ｋ或 Ｃ ２ 后者则为 Ｃ Ｂ 图１ １ １ ０ ＭＰＦ 实质为一种蛋白激酶 主要在细胞从 Ｇ２ 期进入 Ｍ 期时起作用 近年来根据研究 发现 ＭＰＦ 能使某些蛋白质发生磷酸化 组蛋白 Ｈ１ 在细胞分裂的早 中期发生磷酸化 其 上有与有丝分裂相关的特殊位点 可能参与有丝分裂的启动及染色质的凝集 核纤层蛋白在 有丝分裂期发生高度磷酸化 引起核纤层去聚合 磷酸化的核纤层蛋白 Ａ 和 Ｃ 释放入溶液 中 引起核纤层结构解体 核膜破裂 到有丝分裂结束核纤层蛋白又发生磷酸化 这也与 ＭＰＦ 的特异性的催化作用相关 某些 ＤＮＡ 结合蛋白的磷酸化 能够降低其本身在 Ｍ 期与 ＤＮＡ 结合的能力 以促进染色体的凝集 在 ＭＰＦ 中 ３４２是 ＭＰＦ 的活性单位 在整个细胞周期的表达量较为恒定 具有 Ｓ Ｔ 丝氨酸 苏氨酸 激酶活性 能催化蛋白质的 Ｓ 与 Ｔ 残基的磷酸化 当其发生去磷 酸化时 可以表现出其蛋白激酶的活性 Ｃ Ｂ 是 ＭＰＦ 的调节单位 其表达随细胞周期而 变化 ３４２的活性也依赖于与其结合 具有激活 ３４２激酶和选择激酶底物的功能 在间

123 ２８２ 细胞生物学 期时 ＭＰＦ 并 无 活 性 称 为 Ｐ ＭＰＦ Ｃ Ｂ 与 ３４２则 开 始 结 合 ３４２的 Ｔ １４ Ｔ １５和 Ｔ １６１中有八分隔符 Ｔ １６１三个位点在 Ｗ 蛋白激酶 Ｃｋ 激活酶 ＣＡＫ 的 作用下 同时发生着磷酸化 到 Ｇ２ Ｍ 时 ＭＰＦ 的活性达到最高 因为此时 Ｃ Ｂ 的表达 达到高峰 ３４２的磷酸化位点 Ｔ １５和 Ｔ １４在 Ｃ ２蛋白的作用下发生了去磷酸化 而 Ｔ １６１位点则保持其磷酸化 图１１ １１ 当 Ｃ Ｂ 与 ３４２分离解体时 ３４２ Ｔ １５ 和 Ｔ １４位点的氨基酸残基又发生磷酸化 ＭＰＦ 激酶失活 这可以促进细胞从 Ｍ 期向 Ｇ１ 期转化 图１１ １０ ＭＰＦ Ｃ ２ Ｃ Ｂ 图１１ １１ ＣＤＫ１的激活需要 Ｔ １４和 Ｔ １５去磷酸化和 Ｔ １６１的磷酸化 三 生长因子 生长因子是由细胞的自分泌或旁分泌产生的一类可以与细胞膜上特异受体结合 起调节

124 第十一章 细胞生长 分裂和细胞周期 ２８３ 细胞周期作用的多肽类物质 当生长因子与其受体结合后 经过一个信号的转换及传递 激 活细胞内多种蛋白激酶 引起与细胞周期进程相关的蛋白质发挥作用 细胞周期由此受到调 节 图１１ １２ 图１１ １２ 生长因子的作用机理 生长因子种类较多 以血小板衍生生长因子 ｗ ＰＤＧＦ 表皮生长因子 ｍ ｗ ＥＧＦ 白细胞介素 ｋ ＩＬ 转化生长 因子 ｍ ｗ ＴＧＦ 等的作用较为广泛 这些生长因子对细胞周期的 调控主要表现在可刺激或抑制静止期的细胞进入Ｓ期 但在不同的细胞 其作用于细胞周期 的具体阶段有所不同 如 ＰＤＧＦ 分子量 ３０ｋＤ 左右 可刺激 Ｇ０ 期细胞的启动 它与质膜 １８０ｋＤ 特异性受体结合后 激活受体酪氨酸激酶 经过一系列的信号传递作用 将信号传递 入核内 ＥＧＦ 分子量 ６ｋＤ 左右 是一种多 功 能 生 长 因 子 与 ＰＤＧＦ 有 协 同 的 刺 激 作 用 ＥＧＦ 受体分子量为１７０ｋＤ 为跨膜蛋白配体与受体结合引起受体变构 使受体 Ｃ 末端的三 个酪氨酸残基迅速产生自身磷酸化 而激活其酪氨酸激酶 通过信息传递 诱导多种细胞增 殖 ＩＬ ＴＧＦ β分别也在 Ｇ１ Ｓ 期表达并发挥作用 而 ＴＧＦ Ｅ 表达降 β因其能使 Ｃ 低 抑制 Ｃ Ｅ Ｃｋ２复合物的形成 使细胞阻滞在 Ｇ１ Ｓ期 所以对细胞周期起着负调节 的作用 生长因子对不同类型的细胞 可产生完全不同的效应 如 ＴＧＦ β 虽可抑制大多数细胞 的分裂 但在来自间质的成骨细胞等少数细胞中 却对细胞分裂有促进作用 四 抑素 抑素 是一种由细胞自身产生并分泌的 对细胞周期进程有抑制作用的糖蛋 白 其调节细胞周期的方式与生长因子相似 也需要先与膜上受体结合 引起信号转换及在 胞内传递 继之影响细胞周期相关的蛋白的表达 抑素作用于 Ｇ１ 期末及 Ｇ２ 期 其中作用于 Ｇ１ 期的抑素被称为 Ｓ因子 可阻止细胞进入

125 ２８４ 细胞生物学 Ｓ期 作用于 Ｓ期的抑素则被称为 Ｍ 因子 能抑制 Ｓ期细胞向 Ｍ 期的转变 抑素对细胞周 期的作用是无毒及可逆的 同时还具有很强的细胞系特异性 可随细胞类型的不同而有所变 化 如红细胞 淋巴细胞 肝细胞 表皮细胞等均已发现其相应的抑素 五 ＲＮＡ 剪接因子 ＳＲ 蛋白及 ＳＲ 蛋白特异的激酶 在真核细胞中 控制蛋白质的基因 在其翻译前 需经历一个 ＲＮＡ 剪接的过程 在 ＲＮＡ 剪接中 有两种蛋白与细胞周期的调控相关 即剪接因子 ＳＲ 蛋白与 ＳＲ 特异的激酶 ＳＲ 蛋白是一组含有大量ＳＲ Ｓ 丝氨酸 Ｒ 精氨酸 二肽重复序列的蛋白质 其 Ｎ 端具 有 ＲＮＡ 结合域 在 ＲＮＡ 剪接过程中 ＳＲ 蛋白在剪接的起始及剪接位点的选择及识别等方 面起着重要的作用 其通过磷酸化与去磷酸化来调节在剪接中的作用 在剪接初始时 ＳＲ 发 生磷酸化 ＳＲ 蛋白与前体 ＲＮＡ 结合 之后 ＳＲ 则始终处于去磷酸化状态 在细胞周期中 细胞核内可观察到许多核斑 这些核斑就是由 ＳＲ 蛋白聚集而成的 ＳＲ 发生磷酸化的程度 影响着核斑的组装与去组装 从间期到分裂中期 随着 ＳＲ 磷酸化程度明显增高 核斑将发 生去组装 因此可观察到间期时细胞核内有许多核斑 随着细胞进入 Ｍ 期 核斑逐渐分散 到中期时 则完全消失 ＳＲＰＫ１ ＳＲ ｋ ＳＲＰＫ１ 是一种专一地作用于 ＳＲ 蛋白的激酶 在 细胞周期的不同阶段 呈现出不同的活性 用离子交换柱纯化 Ｇ０ Ｇ１ Ｓ Ｇ２ Ｍ 期细胞 提取液中的 ＳＲＰＫ１ 以 ＳＲ 蛋白作为底物 测得其活性在分裂中期最高 为间期细胞的 ３ ５倍 这与细胞周期中 ＳＲ 蛋白磷酸化变化情况相一致 现已证实 分裂中期细胞中 ＳＲ 蛋 白的高度磷酸化是由高活性的 ＳＲＰＫ１直接作用引起的 而 ＳＲＰＫ１则可能通过其对 ＳＲ 的特 异性作用 参与了细胞周期的调控 在发现 ＭＰＦ后的一二十年中 细胞周期调控一直集中在对 ＭＰＦ样 ＭＰＦ ｋ 酶的研究 上 即依赖于细胞周期蛋白的蛋白激酶 研究的生物也从蛙卵母细胞和胚胎转向酵母和培养的 哺乳动物细胞 现已取得了很大的进展 学者们提出了真核生物细胞周期调控的一般模型 该 模型总结了控制细胞周期三类主要的 ＣＤＫ 复合物的作用 这三种复合物分别是 Ｇ１ 期 Ｓ期 和有丝分裂 ＣＤＫ 复合物 当细胞被激活进入细胞周期时 首先是 Ｇ１ 期 ＣＤＫ 复合物进行表达 准备进入 Ｓ期的细胞通过激活转录因子 引起 ＤＮＡ 复制所需酶类以及编码 Ｓ期 ＣＤＫ 复合物的 基因表达 Ｓ期 ＣＤＫ 的活性开始被一种特异抑制物所抑制 而在 Ｇ１ 期的后期 Ｇ１ 期 ＣＤＫ 复 合物诱导 Ｓ期 ＣＤＫ 抑制物的降解 释放出有活性的 Ｓ期 ＣＤＫ 复合物 活性 Ｓ期 ＣＤＫ 复合物 通过将 ＤＮＡ 预复制复合物中蛋白质的调节位点磷酸化 将 ＤＮＡ 预复制复合物激活 预复制复 合物是 Ｇ１ 期在 ＤＮＡ 复制起点上装配的复合物 这些被 Ｓ期 ＣＤＫ 复合物磷酸化的蛋白质不仅 能够激活 ＤＮＡ 复制起始 还能够阻止新的预复制复合物的装配 从而保证了每条染色体在细 胞周期中只复制一次 进而保证了每个子细胞中的染色体数的稳定 有丝分裂 ＣＤＫ 复合物是在 Ｓ 期和 Ｇ２ 期合成的 但是它们的活性一直受到抑制直到 ＤＮＡ 合成完毕 一旦被激活 有丝分裂 ＣＤＫ 复合物就会诱导染色体凝聚 核膜解体 有丝 分裂器的装配以及凝聚的染色体在中期赤道板上排列 在所有凝聚的染色体都与适当的纺锤 体微管结合之后 有丝分裂 ＣＤＫ 复合物激活后期启动复合物 这种多蛋白的复合物指导后

126 第十一章 细胞生长 分裂和细胞周期 ２８５ 期抑制物通过遍在蛋白介导的蛋白酶解作用进行降解 导致在中期将姐妹染色单体结合在一 起的蛋白复合物失活 因此这些抑制物的降解作用允许有丝分裂进入到后期 在此期间 姐 妹染色单体分开分别进入有丝分裂的两极 在后期末 ＡＰＣ 也可诱导有丝分裂细胞周期蛋 白的蛋白酶体的降解 有丝分裂 ＣＤＫ 活性的降低 使得分离的姐妹染色单体去凝聚 核膜 重新形成 胞质分裂 最后形成子细胞 在下一个细胞周期的 Ｇ１ 期早期 磷酸酶将那些预复制复合物的蛋白质去磷酸化 这样 这些蛋白质就可以在 ＤＮＡ 复制区装配成复制复合物 准备进入 Ｓ期 Ｇ１ 期 ＣＤＫ 复合物在 Ｇ１ 后期将 ＡＰＣ磷酸化并使之失活 这样使得有丝分裂周期蛋白在 Ｓ期和 Ｇ２ 期得以逐步积累 细胞周期中三个关键的过渡 即 Ｇ１ 期 Ｓ期 中期 后期 后期 末期及胞质分裂期 这些过渡都是通过触发蛋白质的降解进行的 所以是不可逆转的 这样迫使细胞周期只能沿 一个方向行进 在高等生物中 细胞周期的调控主要是调节 Ｇ１ 期 ＣＤＫ 复合物的合成和活 性 Ｇ１ 期 ＣＤＫ 复合物的活性受催化亚基特异位点的磷酸化状态调节的 细胞生长因子是促 分裂原 能够诱导 Ｇ１ 期 ＣＤＫ 复合物的合成和激活 一旦促分裂原作用了一定的时间 使 细胞过了晚 Ｇ１ 期的限制点 即使将促分裂原除去 细胞也会继续完成有丝分裂 三 细胞周期调控的遗传基础 从上面的学习中 可以了解到细胞周期中有许多调控因子在影响着细胞周期的进程 这 些调控因子的表达及发挥作用与基因有规律的 特异性的表达有着直接或间接的关系 与周 期调控相关的基因可分为两类 一类基因被称为细胞分裂周期基因 其表达具细胞周期依赖性或其产物直接参与了细胞周期调控 如编码依赖于周期 蛋白的激酶 ２ ８ ３１ 的基因 另一大类是癌基因 及抑癌基因 它们不仅对正常的细胞周期进程有着重要的意义 同时也可在细胞异常 的增殖及癌变中起关键的作用 一 基因与细胞周期的调节 基因的发现最早来自于对酵母细胞周期的研究中 裂殖酵母 Ｓ ｚ ｍ ｍ 是一种低等真核生物 其有完整的细胞周期 是研究细胞周期的极好材料 在酵母中 与细胞周期相关基因的突变很容易被识别 因此通过对裂殖酵母的研究 可以更深地了解细 胞周期的调控 如细胞的温度敏感突变 如果是非允许范围内的温度敏感突变 就会影响细 胞的长度 现已分离了很多与细胞周期相关的温度敏感突变型 可分成两类 一类是 突 变 这类突变在非允许的温度下培养 会滞留在细胞周期的某个阶段 结果会形成特别长的 细胞 因为这类突变不能进入有丝分裂期 滞留在间期 所以能够继续生长 另一类称为 突变 这类突变体长得特别小 通过对这些突变体以及其他一些突变体的研究揭示了更多 关于细胞周期调控的细节 从 １９７９ 年在裂殖酵母中发现了其第一个 基因起 迄今已知 的酵母 基因已达４０多个 其中有些已被克隆 并确定了其生化功能 在芽 殖 酵 母 中 已 发 现 有 ２８ ３６ ３７ ３９ 等 基 因 参 与 对 细 胞 周 期 开 始 的 控 制 ２８ 基因 编码的蛋白质为 Ｃ ２８ 因为 ２８ 基因突变成温度敏感型就不会出芽 所以

127 ２８６ 细胞生物学 这表明 Ｃ ２８蛋白对于芽殖酵母进入 Ｓ期具有关键作用 根据对分离的野生型 ２８ 基因的 序列分析推测 Ｃ ２８蛋白与已知的蛋白激酶同源 当将 ２８ 基因转入正 然后从正 中分离出 Ｃ ２８蛋白 发现其具有蛋白激酶的活性 实际上 芽殖酵母中的 Ｃ ２８ 蛋白 是第一个被分离的具有蛋白激酶活性的细胞周期蛋白 其产物分子量为 ３４０００ 为一种丝氨 酸 苏氨酸蛋白激酶 另有实验研究表明 ８ ９ 基因与芽殖酵母 ＤＮＡ 合成相关 而 ２４基因 ３１基因的突变 可能与中心粒复制及胞质分裂过程的调节相关 在裂殖酵母中发现了 ２ 基因 其与芽殖酵母 ２８ 基因的序列有 ６９ 相同 功能上 也有相同的作用 ２基因的产物 ３４２也为分子量 ３４０００ 的丝氨酸 苏氨酸蛋白激酶 其 是组成成熟促进因子 ＭＰＦ 的一个亚单位 因此认为 ２ 基因与芽殖酵母 ２８ 基因是 同源基因 在裂殖酵母中 Ｍ 期的启动可能与 ２ １３ 等 ４ ５ 个基因的产物所组成的 调控 系 统 有 关 人 的 ２基因与芽殖酵母的 ２８ 基 因 也 是 同 源 基 因 两 者 的 序 列 有 ６４ ５ 的相同 其产物 ２ 基因这 ３４２也为一种蛋白激酶 且与 Ｍ 期的启动密切相关 种进化上的保守性 表明从酵母到人类的所有真核细胞中 存在着一个共同的 Ｍ 期启动的 调节机制 二 癌基因与细胞周期的调节 癌基因最早是人们在逆转录病毒的基因组中发现的 在逆转录病毒的基因组中除病毒本 身复制所必需的编码病毒核心蛋白 外壳糖蛋白及逆转录酶等的基因外 还包括一个能引起 动物宿主细胞恶性转化的基因 这种基因就是癌基因 Ｖ Ｖ 也称为病毒癌 基因 后来发现 在许多动物的正常细胞中 也都存在着与 Ｖ 相似的同源 ＤＮＡ 序列 其突变后 可使细胞增殖发生异常 故癌基因又被称为细胞癌基因 Ｃ 或原癌基因 其特性如下 ① 细胞癌基因与病毒癌基因基本上是同 源的 但在二者之间可以有一个或几个碱基对的区别 ② 细胞癌基因在长期进化过程中极 为保守 在无脊椎动物 如果蝇 的基因组中可以找到与哺乳动物细胞癌基因基本上同源的 ＤＮＡ 序列 所以实际上在正常情况下 细胞癌基因不仅对动物机体无害 而且可能在发育 过程中起着重大的作用 ③ 细胞癌基因在正常细胞中可以有低水平的表达 而在癌组织中 与其相对应的活化癌基因的表达水平却比它高得多 根据癌基因的结构 产物及功能的特 点 可将其分为 ｍ ｍ 等基因家族 表 １１ ３ 虽然在正常情况下 癌基因及 原癌基因表达的量较少 但它却是细胞生长 增殖所必需的 不同的癌基因家族成员 其产 物可通过不同的途径来参与细胞周期调节 癌基因的表达产物大致可分为生长因子 生长因 子受体 信号转导器及转录因子 基因的产物多为生长因子类蛋白 它与生长因子的受 体结合后 以自分泌的方式促进细胞的分裂 生长 如 Ｖ 基因编码的 ２８ 即可与细胞 膜上的 ＰＤＧＦ 的受体结合 进而刺激细胞的分裂 另有一些癌基因及原癌基因可编码某些 生长因子的受体 通过与生长因子的结合 参与生长因子对细胞周期的调节 如ｍ基因的 产物为神经生长因子的受体 Ｖ Ｂ 的产物为类似于 ＥＧＦ 的受体 还有许多癌基因及原癌 基因的产物 可在生长因子相关的细胞内信号转导过程中起作用 如 基因的产物 ２１类 似于 Ｇ 蛋白 能与鸟嘌呤核苷酸结合 具 ＧＴＰ 酶活性 ｍ 等基因编码的蛋白质 具

128 第十一章 细胞生长 分裂和细胞周期 ２８７ 有丝氨酸 苏氨酸激酶活性 通过丝氨酸 苏氨酸激酶级联反应 参与信号的转导 表１１ ３ 一些原癌基因的功能 原癌基因 Ｂ ｍ 功 能 生长因子 受体酪氨酸激酶 ＥＧＦ 受体 受体酪氨酸激酶 ＣＳＦ １ 受体 相关肿瘤 Ｅ ｗ 网瘤 星形细胞瘤 乳腺癌 卵巢癌 肺癌 胃癌 唾腺癌 髓性白血病 肺癌 结肠癌 膀胱癌 直肠癌 Ｇ 蛋白 非受体酪氨酸激酶 Ａ １ 非受体酪氨酸激酶 慢性髓性白血 ＭＡＰＫＫＫ 丝氨酸 苏氨酸激酶 信号转导连接蛋白 白血病 鲁斯氏肉瘤 腮腺肿瘤 ｍ ｍ 转录因子 转录因子 Ｂ ｋ 淋巴瘤 肺癌 早幼粒白血病 结肠癌 转录因子 骨肉瘤 ｊ Ａ 转录因子 转录因子 急性非淋巴细胞白血病 １ Ｄ１ Ｂ 细胞淋巴瘤 三 抑癌基因与细胞周期的调节 抑癌基因是存在于正常细胞中的一类能抑制细胞恶性增殖的基因 近年来已发现有十几 个 但有的还难确定 Ｒ及 ４ ５３为较常见的两种抑癌基因 表１１ 抑癌基因通过编码一些具有转录因子作用的蛋白质 从多个调控点参与对细胞周期的调 节 如果其缺失或失活 将会导致细胞的癌变 第一个被发现的抑癌基因是遗传性视网膜母 细胞瘤 ｍ 基因 即 Ｒ基因 其产物是分子量为１０５０００的蛋白质 分布于胞 核内 当 Ｒ基因产物发生去磷酸化时 其与转录因子结合 使转录因子的活性被抑制 而 当 Ｒ基因产物发生磷酸化时 与之结合的转录因子被释放 转录因子被活化 转录因子活 性的抑制或活化会影响到细胞周期的进程 如在人的 Ｇ１ 期细胞中 去磷酸化的 Ｒ基因产 物与转录因子 Ｅ２Ｆ 结合 图１１ １３ 使 Ｓ期所需的基因转录被阻断 而在 Ｇ１ Ｓ 期 Ｒ基因 产物被磷酸化 释放出 Ｅ２Ｆ Ｓ期所需的基因转录的阻断被解除 细胞进入 Ｓ 期 ５３ 基因 产物 ５３蛋白也分布于胞核内 分子量为５３０００ 半衰期较短 不稳定 其可作为转录因子 或与其他转录因子结合 参与基因的转录的调节 将细胞阻滞于 Ｇ１ 期 图１１ １３ Ｃ Ｄ 与 ＣＤＫ 结合使 Ｒ释放结合的转录因子 Ｅ２Ｆ

129 ２８８ 细胞生物学 表１１ １４ 一些抑癌基因的功能 抑癌基因 功 能 相关肿瘤 ＲＢ 转录调节因子 ＲＢ 成骨肉瘤 胃癌 ＳＣＬＣ 乳癌 结肠癌 ５３ 转录调节因子 星状细胞瘤 胶质母细胞瘤 结肠癌 乳癌 成骨肉 瘤 ＳＣＬＣ 胃癌 鳞状细胞肺癌 ＷＴ 负调控转录因子 ＤＣＣ ＧＡＰ ＧＴＰ酶激活因子 细胞粘附分子 ２１ １５ ＣＤＫ 抑制因子 ＣＤＫ４ ＣＤＫ６抑制因子 ＮＦ １ ＷＴ 横纹肌肉瘤 肺癌 膀胱癌 乳癌 肝母细胞瘤 神经纤维瘤 嗜铬细胞瘤 雪旺氏细胞瘤 神经纤维瘤 直肠癌 前列腺癌 成胶质细胞瘤 乳腺癌 卵巢癌 ＢＲＣＡ２ ＤＮＡ 修复因子 与 ＲＡＤ５１作用 ＤＮＡ 修复因子 与 ＲＡＤ５１作用 ＰＴＥＮ 磷酯酶 成胶质细胞瘤 ＢＲＣＡ１ 乳腺癌 胰腺癌 四 细胞周期常用的研究方法 一 细胞同步化法 细胞在体外培养时 可观察到在一个培养的群体中同时存在处于细胞周期各个不同阶段 的细胞 且由于 Ｍ 期较短 无论何时检查 只能看到极少数细胞处于分裂状态 为了研究 细胞周期的不同阶段的生化特性 必须获得细胞周期一致性的细胞 这就是细胞的同步化 ｚ 细胞同步化分为自然同步化和人工同步化 自然同步化是在动 植物细胞都能发现的自 然界存在的现象 不受人为条件的干扰 因而有可能在接近自然的条件下进行观察 但自然 同步化的细胞群体受到许多条件的限制 对结果有很大的影响 人工同步化则是利用细胞培 养的方法 用各种理化因素处理获得的同步化生长的细胞 人工同步化的方法较多 以化学 同步化法 选择同步化法较为常用 １ 化学同步化法 也称为诱导同步法 是一种通过化学药物来诱导细胞同步化的方法 可根据选择的诱导物不同 来得到各种类型的 大量的同步化细胞 但诱导物对细胞有毒副 作用 可能干扰细胞周期正常的进程及调节 ① ＤＮＡ 合成阻断法 是利用甲氨蝶呤 胸苷 等 ＤＮＡ 合成抑制剂 阻断 Ｓ期 ＤＮＡ 合成 以获得同步于 Ｓ 期的细胞的一种方法 甲氨蝶 呤是通过封闭二氢叶酸还原酶 使胸苷形成受到抑制 ＤＮＡ 合成所需的原料缺乏而致使 ＤＮＡ 合成停止 细胞因此不能向 Ｇ２ 期转变 胸苷的大量应用 会使三磷酸腺苷合成过量 反馈性地抑制其他核苷酸的磷酸化 这也使 ＤＮＡ 合成的原料缺乏 阻止 ＤＮＡ 的合成 ② 中期阻断法 是利用秋水仙碱 长春花碱等中期阻断剂 抑制纺锤体微管的聚合 以获得同 步于有丝分裂中期的细胞的一种方法 这种方法的可逆性较差 应用的时间宜短 否则会使 细胞不能进行正常的分裂 秋水仙碱相对作用较强 对细胞的毒性较小 所以较为常用 ２ 选择同步化法 是用物理方法将处于细胞周期中同一阶段的细胞从

130 第十一章 细胞生长 分裂和细胞周期 ２８９ 非同步的群体中分离出来 此种方法可以克服化学同步化法过程中对细胞的毒性影响 ① 有丝分裂选择法 是可以获得 Ｍ 期同步化细胞的一种方法 在单层培养于细胞培养 瓶内的非同步化的细胞群体中 处于对数期增殖的细胞分裂活跃 分裂指数高 分裂细胞变 圆 隆起 与培养器的粘着性降低 此时轻轻摇动 Ｍ 期的细胞就脱离器皿壁而悬浮于培 养液中 其他阶段的细胞则不会脱落 将倾出培养液储存于 ４ 保存 再向培养瓶中加入 ３７ 新鲜培养液继续培养 经１ ２ 再如同上法收集 Ｍ 期的细胞 每 １ ２ 摇动并收集 细胞 最后集中所收集的培养液 离心后 可获得一定数量的 Ｍ 期的同步化细胞 此法的 优点是不受药物的影响 同步化程度高 不足之处是分离的细胞少 手续繁琐 ② 细胞沉 降分离法 可以从悬浮培养的细胞中获得各个时期的同步化细胞 因为在细胞周期的不同阶 段细胞体积也不同 随着细胞周期的进程 细胞体积逐渐增大 所以根据细胞在某一离心力 场中的沉降速度与其半径平方成正比的理论 可以应用沉降法分离所处周期时相不同而大小 不同的细胞 此法也可用于贴壁生长的细胞 但因同一时相的细胞大小并非都是一致的 故 用此法获得的细胞的同步化程度有限 二 细胞周期调控研究方法 １ 免疫组化法 是在保存组织形态及蛋白质抗原结构的基础上 根据抗原抗体结合的 特点 用特异性抗体去检测与细胞周期调控相关蛋白的表达 这种方法的取材可直接来源于 活体组织 但取材要尽量迅速 时间控制在组织离体后数分钟内 因为在参与细胞周期调控 的蛋白中有许多不稳定蛋白 免疫组化法可在单细胞水平对检测到的抗原进行亚细胞定位及 半定量分析 现在已被广泛应用于正常及病理状态下细胞周期相关蛋白的研究中 尤其有助 于对肿瘤的快速鉴定 此外 因有些与细胞周期调控相关的蛋白在结构上的相似 相同的抗 原位点较多 所以在必要时要选择单克隆抗体 ２ 显微注射法 是在显微镜下通过毛细管将抗体 人工合成的多肽 反义核苷酸片段 等大分子物质直接注入处于细胞周期特定阶段的细胞中 以了解这些物质在周期调控中所起 的作用 因标本被注射入细胞内会被稀释 所以标本的浓度要高于体外实验的工作浓度 在 对显微注射的结果进行评价时 要用荧光物质标记的抗体去识别注射入细胞中的蛋白质 再 用荧光显微镜结合图像分析 近几年 计算机自动技术被引入显微注射 增加了注射的速 度 提高了注射的效率 ３ 细胞融合法 是应用灭活的仙台病毒或聚乙二醇使处于细胞周期不同时相的细胞彼 此发生融合 以观察核质互相作用的情况 了解与细胞周期某一特定活动相关的调节因素 在时间及亚细胞水平上的定位 例如 将同步培养的 Ｇ１ 期的 ＨＬ细胞同 Ｓ期的 ＨＬ细胞 进行融合 可发现 Ｇ１ 期的细胞质受到了 Ｓ 期细胞质的激活 开始了 ＤＮＡ 复制 这表明正 在进行复制的细胞的细胞质中含有促进 Ｇ１ 期细胞进行 ＤＮＡ 复制的起始因子 相反 将 Ｓ 期的细胞与 Ｇ２ 期的细胞进行融合 发现 Ｇ２ 期的细胞核不能再启动 ＤＮＡ 的复制 这表明 Ｓ 期的细胞质中的 ＤＮＡ 复制起始因子对于已进行了 ＤＮＡ 复制的 Ｇ２ 期的细胞核没有作用 又 如将处于分裂期的细胞与处于细胞周期其他阶段的细胞融合 分裂期的细胞质总是能够诱导 非有丝分裂的细胞中的染色质凝聚

131 ２９０ 细胞生物学 三 ３ＨＴＲ 掺入法 是应用放射性同位素氚 ３Ｈ 标记 ＤＮＡ 合成前体胸苷 ＴＲ 让细胞在含有３ＨＴＲ 的培养基中培养６ ８小时 经放射自显影后 根据细胞中银粒量的多少及分布位置 了解 细胞周期不同时相细胞的数量与比例 由此研究细胞周期动态的一种方法 如将３ＨＴＲ 掺 到已同步化了的 Ｓ期细胞中 在不同的时相点 取细胞作放射自显影 则可以对 Ｓ 期 ＤＮＡ 合成的动态过程加以研究 五 细胞周期的时间测定 标记有丝分裂比率法 ＰＬＭ 法 用添加氚标记的胸苷 ３ＨＴＲ 标记培养的细胞 在不同的时间进行放射自显影 确 定有丝分裂细胞中已被标记的细胞比率 根据该比率的变化发生的时间 可推断出细胞周期 各个时相经历的时间 因３ＨＴＲ 只掺入到 Ｓ 期细胞中 所以从３ＨＴＲ 掺入时起 到标记的有丝分裂细胞首 次出现为止 这段时间间隔是细胞由 Ｓ期末到 Ｍ 期始即 Ｇ２ 期的时间 Ｇ２ 从标记有丝分裂细胞开始出现 到标记有丝分裂比率达到峰值 这段时间间隔是原处于 Ｓ期最早阶段的细胞进入了 Ｍ 期 同时 原已进入 Ｍ 期最早阶段的细胞进入 Ｍ 期晚期 即 Ｍ 期的时间 Ｍ 当标记有丝分裂细胞比率开始下降 表示原处于 Ｇ１ Ｓ 交界期的细胞已进入 Ｍ 期 所 以从开始出现标记有丝分裂细胞 到标记有丝分裂比率开始下降之间的时间间隔即为Ｓ期的 时间 Ｓ 从标记有丝分裂细胞比率下降至０ 到再次出现标记细胞 表示原处于 Ｓ期末的细胞已 进入了第二次分裂 两次开始出现标记有丝分裂细胞的时间间隔 即为整个细胞周期的时间 Ｃ 根据Ｃ Ｇ１ Ｓ Ｇ２ Ｍ 即可求出 Ｇ１ 期的时间 Ｇ１ 图１１ １４ 图１１ １４ 细胞周期各阶段的时间与 ＰＬＭ 的关系

132 第十一章 细胞生长 分裂和细胞周期 ２９１ 六 细胞周期与医学的关系 有关细胞增殖的理论 对于解决临床医学面临的一些问题 有极其重要的意义 现就以 下几个方面作一简要介绍 一 细胞周期与组织的再生 人体的一些组织细胞 如皮肤的表皮细胞 胃肠的上皮细胞等 需要不断地再生 才能 补充衰老和死亡的细胞 这一过程称为组织的生理性再生 实验研究表明这种现象与干细胞 的分裂增生有关 干细胞是一类存在于自我更新组织特定位置的 分裂缓慢的细胞 其子细 胞一部分保留了原细胞继续分裂的能力 另一部分则可向多个方向发生分化 例如从放射自 显影研究中 发现上皮组织里存在有少量未分化的干细胞 在正常生理状态下 它可以反复 分裂增生 产生新细胞 人体中还有一些高度分化的组织 如肝 肾等 其再生可在组织受 到外界损伤后发生 称为补偿性再生 在这一过程中 Ｇ０ 期细胞重新进入细胞周期 并且 细胞周期进程加快 短时期内产生大量的新生细胞 以修复损伤的组织 在治疗受创伤的组 织时 根据这些知识应用一些细胞周期调控相关因子的生物制剂 如表皮生长因子等 会取 得更好的疗效 二 细胞周期与肿瘤 细胞周期进程中 Ｒ 点消失 自分泌大量的生长因子等异常情况发生时 细胞的生长 分裂失去控制 由此形成的赘生物 即为肿瘤 了解细胞周期的理论 可以促进对肿瘤病 因 病理的认识 并指导临床上肿瘤的诊断及治疗 １ 细胞周期与肿瘤的生长 肿瘤细胞增长速度的快慢与细胞增殖比率 即增殖型细胞 占总细胞数量的比例的大小 细胞周期的长短 以及细胞丢失 死亡的速率有关 绝大多 数肿瘤细胞的增殖周期和它相应的正常细胞是相同的 甚至还较长 如正常骨髓细胞的增殖 周期为１ ２天 而急性白血病的细胞却需要 ２ ４ 天 一个原因是由于肿瘤细胞中处于 Ｇ０ 期的细胞很少 它比正常组织有较多的细胞参加增殖周期 另一个原因是由于肿瘤细胞增殖 无极限 肿瘤所含的细胞群体 根据其细胞周期的特点 可分为三类 ① 增殖型细胞 为 肿瘤中能连续进入细胞周期 不断进行分裂的细胞群体 与肿瘤的增大直接相关 其数量的 多少决定着肿瘤恶性的程度 这类肿瘤细胞对药物敏感 使化疗容易控制 ② 暂不增殖型 细胞 主要为一些 Ｇ０ 期细胞 对肿瘤的生长无大的影响 但因其具有潜在的分裂能力 在 某些外界环境因素的刺激下 可重新进入细胞周期 发生分裂 因而是肿瘤复发的根源 这 类肿瘤细胞对药物不敏感 致使化疗不易取得疗效 如能设法使 Ｇ０ 细胞进入增殖期 则可 提高其对化疗药物的敏感 便于发挥药物的作用 ③ 不增殖型细胞 为一些已经脱离了细 胞周期 丧失了分裂能力的分化细胞 其数量的增多 可使肿瘤的恶性程度降低 从化疗角 度来看 关系不大 肿瘤的增殖比率即为增殖型细胞占总细胞数量的比例 由此可见 肿瘤的增长与停止是 随三种细胞群的比例不同而有差别

133 ２９２ 细胞生物学 处于Ｓ期的肿瘤细胞 对致癌物作用较敏感 此期因需合成嘌呤和嘧啶等碱基 出现了 许多碱基磷酸化和聚合作用有关的酶 同时在拆开 ＤＮＡ 双链后 沿 ＤＮＡ 单链暴露出许多 活性部位 这些都为化疗药物提供了作用点 目前 在肿瘤化疗中应用的有些抗代谢药物 均能抑制 ＤＮＡ 的合成 因此也能中断细胞的 Ｓ 期进入分裂期 以达到杀灭癌细胞的作用 Ｈ １９７１ 曾 报 告 处 于 Ｓ 期 的 肿 瘤 细 胞 的 放 射 敏 感 性 较 小 比 Ｇ１ 期 细 胞 相 差 约 倍 ２ ５ 处于 Ｇ２ 期的肿瘤细胞 对放射线较敏感 因此 可通过人工诱导 使 Ｇ２ 期的肿瘤细 胞发生同步分裂 ｚ 然后用放射线照射 这样就可提高放疗的效果 ２ 细胞周期与肿瘤的治疗 肿瘤常规的治疗方法包括理疗 化疗及手术三大类 在肿 瘤的治疗中 应根据肿瘤细胞分裂 增殖的情况 来选用治疗的方法 近年来 对抗癌药物作用机理的研究 已在分子层次上展开 实验中应用组织培养的手 段 观察抗癌药物在细胞周期中的作用点 如研究表明阿糖胞嘧啶属于Ｓ期特异性药物 秋 水仙碱则属于 Ｍ 期特异性药物 实验中应用组织培养的手段 观察抗癌药物在细胞周期中 的作用点 如放线菌素 Ｄ 作用于细胞周期 Ｇ１ 期 抑制 ＤＮＡ 聚合酶的合成 或者作用在 Ｓ 期后阶段与 Ｇ２ 期前阶段 抑制ＲＮＡ 另外 放线菌素 Ｄ 能改变细胞的腺苷酸环化酶的活 力与合成 从而影响细胞内ＡＭＰ 的水平 动物实验证明 放线菌素 Ｄ 能破坏小肠肠腺的 更新区 但不损伤非分裂的细胞 以上资料说明放线菌素 Ｄ 是一种细胞周期特异性药物 又如阿糖胞嘧啶 它选择性地抑制核苷三磷酸还原酶 阻断核苷酸变成脱氧核苷酸 从而抑 制 ＤＮＡ 合成 作为 ＤＮＡ 合成特异性的抑制剂 属于 Ｓ 期特异性药物 秋水仙碱有与微管 蛋白强烈结合的作用 微管蛋白是微管的组成成分 在细胞分裂时 微管作为染色体移动的 有关装置 当它与秋水仙碱结合 引起微管解体 纺锤体破坏 结果染色体的移位被阻断 细胞分裂停留在中期 此外 还认为秋水仙碱可与细胞质和细胞核的膜结合 改变核苷的运 输 而影响细胞增殖 它是作用于 Ｍ 期的特异性药物

134 第十二章 细 胞 分 化 ２９３ 第十二章 细胞分化 多细胞生物有机体由多种多样类型的细胞构成 如人的细胞多达２００余种 虽然这些细 胞形态和功能各异 但它们都是由同一细胞受精卵分裂发育而成 细胞分化不仅发生在个 体发育中 在人体中由多能造血干细胞分化为不同血细胞的细胞分化过程 在每个人的一生 中都在进行着 细胞分化 是发育生物学的核心问题 图１２ １ 图１２ １ 人体不同组织分化的细胞形态 引自 Ｋ １９９６ 第一节 细胞分化的基本概念 细胞分化是胚胎细胞分裂后未定型的细胞 在形态和生化组成上向专一性或特异性方向分化 或由原来较简单具有可塑性的状态向异样化稳定状态进行分化的过程 所有高等生物体都是由同一 来源的受精卵发育而成 在发育过程中 通过细胞增殖使细胞数目增加 为适应其特定的功能 而 合成特异性蛋白质 通过细胞分化形成不同类型的细胞 所以 细胞分化也就是一种类型的细胞在 形态结构 生理功能和生物化学特性诸方面稳定地转变成为多种不同类型细胞的过程 细胞分化过程中细胞形态结构发生变化的同时 生化特性和生理机能也发生相应变化 因 此细胞的形态结构 生化特性和生理机能可作为识别细胞分化的三项指标 例如成熟的红细胞

135 ２９４ 细胞生物学 中间凹陷 呈圆盘状 无核 产生血红蛋白 具有携带 Ｏ２ 和 ＣＯ２ 的功能 神经细胞伸出突起 产生神经递质 具有传导神经冲动和传递信息的功能 这些都是典型分化细胞的标志 脊椎动物的发育是从受精开始的 雌性个体 产生成熟的体积较大的卵细胞 其中含有绝大部 分供以后形成胚胎所需的物质和营养成分 受精 触发后 事实上精子仅仅提供小而致密的核 称 为雄性原核或雄性前核 雄性原核很快地在卵细 胞内膨大 并与雌性原核融合 完整的受精卵要 经历无数次历时很短的包括 ＤＮＡ 合成与细胞分裂 的周期 受精卵的早期分裂称为卵裂 受精后 ３ ０ 小时 受精卵在向子宫方向的移动过程中 迅速 进行卵裂 约在第 ３ 天 卵裂球先形成由 １ ２ １ ６ 个细胞时 外型似桑椹 称为桑椹胚 当胚胎由 图１２ ２ 哺乳动物早期发育期间细胞 分化的主要阶段 引自 谭曾鲁 １９９２ ３ ２ ６ ４个细胞组成时 在桑椹胚内逐渐出现空隙 成为中空的球形结构 称为胚泡 在胚泡 阶段第一次可以区分出明显不同的两种类型的细胞 即胚极滋养层和内细胞团 胚泡进入子宫 内膜的过程 称为植入 植入中的胚泡 逐渐形成三个胚层 其中外胚层发育成为表皮和神经 组织等 中胚层发育成为真皮 骨骼 肌肉 心脏 血管 血细胞和结缔组织等 内胚层发育 成为肺 肝 胰 消化道上皮及其附属器等内脏器官 图１ ２ ２ 细胞分化是基因选择性表达的结果 从分子水平上看 细胞分化意味着机体内不同细胞 中有不完全一致的基因活性 而表现为某些特异性蛋白质的合成 因而形成形态 结构和功 能各异的细胞 如红细胞的血红蛋白 胰岛素细胞合成胰岛素 浆细胞的抗体和输卵管细胞 的卵清蛋白等 这是由于在特定的细胞中某些基因在一定时间内选择性激活 因此基因表 达的调控是研究细胞分化的核心问题 然而 机体某些基因在所有各种类型细胞中都是有活 性的 如对所有细胞都属必需的那些成分 其中包括构建细胞膜 核糖体 线粒体和细胞骨 架等的基因 因此 只有对高等生物细胞中基因调控的复杂机制了解清楚后 才能在分子水 平上阐明细胞分化的本质和更精细的系列程序变化 第二节 胚胎细胞的分化 细胞分化可以出现在生物体个体的整个生命过程中 但分化最重要的时期是胚胎期 此 时 细胞分化的表现最典型 最迅速 并且受许多因素的影响 一 胚胎细胞分化的潜能与决定 在生物体个体发育的早期阶段 所有细胞都有发育成不同组织或细胞类型的潜能 这种 潜能称为全能性 ｍ 是 细胞做出的发育选择称为细胞决定 细胞潜能逐渐受限的过程 也是有关分化的基因选择性表达前的过渡阶段 具有高度的遗传 稳定性 但并非胚胎早期细胞能随意分化成某一细胞类型或组织 细胞只能按照已做出的发

136 第十二章 细 胞 分 化 ２９５ 育选择 向决定的方向分化 在胚胎三胚层形成后 随着细胞空间关系和微环境的差异 各 胚层细胞的发育去向已决定下来 这些细胞的分化潜能被局限化 只能发育成为本胚层的组 织和器官 在发育过程中 各器官的预定区逐渐出现 细胞分化的潜能进一步局限化 此时 的细胞具有演变成多种表型的能力 称为多能细胞 再进一步就是向专能 稳定型的分化 因此细胞决定是发育潜能逐渐局限化的过程 即选择基因表达的过渡阶段 此时细胞虽然还没有可分辨的分化特征 但已具备向某一特定方向分化的能力 果蝇幼虫期的成虫盘 ｍ 是一个典型的例子 成虫盘是幼虫体内未分化的 细胞团 不同成虫盘分别发育成腿 翅 触角和躯体其他结构 成虫盘虽然是未分化的细胞 团 但其向某种特定类型分化的方向已经决定 如将成虫盘移植到成体果蝇腹腔中 可一直 保持未分化状态而不断进行增殖 任何时候将此成虫盘取出植入幼虫体内 幼虫变态后 移 植来的成虫盘细胞便发育成相应的成体结构 图 １２ ３ 这种决定的特性可在国蝇遗传实验 中稳定遗传多达１８００代 图１２ ３ 成虫盘细胞决定状态的移植实验 具有全能的受精卵何时获得有限的发育潜能与细胞决定是否可逆 是我们研究细胞决定 时需要引起注意的问题 动物胚胎发育的决定时间可用胚胎移植方法来确定 以两栖类为 例 如将原肠胚早期预定将发育成表皮的细胞 移植到另一宿主胚胎预定发育为脑组织的区 域 被移植的细胞在宿主胚胎中仍然发育为脑组织 而到原肠胚晚期阶段移植则发育为表 皮 说明两栖类早期胚胎发育的细胞决定开始于在早原肠胚和晚原肠胚之间的某个时期 二 细胞质的作用 受精卵每次卵裂 细胞核内的物质包括基因组 ｍ 都会均匀地分配到子细胞内

137 ２９６ 细胞生物学 所以子细胞中的遗传物质是相同的 但受精卵细胞质各区的组分并不相同 卵裂使不同的胞 质组分分割进入各卵裂细胞 从卵母细胞开始 细胞质或表面区域就是不均质的 这种不均 质性 对胚胎的早期发育有很大影响 在一定程度上决定细胞的早期分化 这些特殊物质被 称为决定子 ｍ 决定子支配着细胞分化途径 决定子在卵母细胞中已经形成 受精卵在数次卵裂过程中 决定子一次次地重新改组 分配 卵裂后决定子的位置固定下 来 并分配到不同的细胞中 从而使子细胞产生差别 海鞘类是研究细胞质决定子最方便的生物 有些海鞘的卵含有不同色素的区域 在受精 后这些区域分别分布到某些细胞中 这些细胞将来便发育成特定的组织 如海鞘的富含线粒 体的黄色细胞质区域 将来分化成中胚层和肌肉 透明区分化成外胚层 灰色胞质区分化成 为内胚层 如果受精卵被挤压致使黄色胞质分配到更多的细胞中 获得这部分黄色胞质的细 胞就发育成为肌肉 这一结果提示这种黄色胞质含有肌肉组织的决定子 当蝗虫的神经母细胞分化期间正处于分裂状态时 用微针将有丝分裂中的纺锤体和染色 体旋转１８０度 使本来要迁移到神经节那一极的染色体移向另一极 另一套染色体移向神经 节细胞那一极 结果并不影响细胞分化的方向 原来处于神经节细胞那一极的细胞质中不管 含有哪套染色体 都会产生一个神经节细胞 以上两个例子说明某些特殊发育途径的决定 往往首先由细胞质所控制 而不是由细胞核控制 三 核质的相互作用 细胞核和细胞质彼此互相依赖和互为存在的条件 细胞质通过氧化磷酸化和无氧酵解为细胞 提供了大部分能量 其中核糖体还含有几乎全部蛋白质合成所需要的组装 细胞核基因提供 ｍｒ ＲＮＡ和 ＲＮＡ 的转录模板 因此 核和质的作用是相互依存不可分割的 一 ＮＡ和其他 ＲＮＡ 方面细胞核中的基因对胞质的代谢起调节作用 另一方面细胞质对核内基因的活性有控制作用 一 细胞质对细胞核的作用 细胞分化过程中 细胞核的遗传潜力 即核基因的活性 受核所在的胞质环境的控制 利用细胞融合技术可以诱导不同种类细胞的融合 这样就使细胞核放置于不同的细胞质环境 成为可能 便于研究细胞质对细胞核的作用 １９６５ 年 Ｈ 发现鸡的红细胞与未分化的人 类宫颈癌细胞ＨＬ细胞融合后 鸡的红细胞核被重新激活 鸡的红细胞是终末分化细胞 具有一高度凝聚的核 ＤＮＡ 和 ＲＮＡ 的合成能力很低 而 ＨＬ细胞的 ＤＮＡ 和 ＲＮＡ 合成能 力很高 在二者融合 杂交形成的异核体 指一个细胞中含有两种类型的核 中 红细胞核 的体积扩大２０倍 染色质分散 ＤＮＡ 和 ＲＮＡ 合成能力增高 出现核仁与基因表达也被激 活 利用免疫荧光法可检测出 ＨＬ细胞中的蛋白质掺入到鸡红细胞核中 说明基因表达的 激活是由于 ＨＬ细胞质物质调节的结果 二 细胞核对细胞质的作用 在细胞分化过程中 细胞核起着重要的作用 因为遗传物质存在于细胞核中 生物的任 何性状的出现均是由遗传物质决定的 分化细胞之所以能合成特异的蛋白质 就是由于细胞

138 第十二章 细 胞 分 化 ２９７ 核内基因组的选择性表达 这是细胞分化的基础 真核细胞的基因是与蛋白质结合的 以染色质的形式存在于细胞核内 其中组蛋白对基 因的表达具有抑制作用 而没有组织特异性 非组蛋白则具有组织特异性 可以使基因解除 抑制 表达转译出相应的蛋白质 由于细胞核的内环境不同 在非组蛋白的作用下 一些基 因开放 另一些基因则被组蛋白抑制 不同的分化细胞其细胞核中基因开放的类型不同 经 转录和转译后在细胞质中形成不同类型的蛋白质 造成细胞质的异质性 细胞质的变化反过 来又作用于细胞核 二者的相互作用最终引导细胞分化的进行 四 细胞分化的遗传基础 １９１０年 Ｂ 用马蛔虫卵为材料做过一个典型的实验 证明生殖细胞和体细胞的决定 受染色体物质多少的控制 而染色体物质的正常与否又受细胞质的控制 马蛔虫的合子核中 含有两个大的复合染色体 当第一次卵裂后 正常卵会分为两个部分 第二次分裂时 上半 部分含动物极的染色体断裂 一部分断裂的染色体被放出核外 相反 下半部分含有植物 极 可以正常地进行核分裂成为两个细胞 但其中的一个细胞在下次进行分裂时 会放出一 部分染色体 而另一个细胞却能正常地分裂 如此反复分裂 最后保持正常染色体的细胞将 来成为生殖细胞 而染色体部分丢失的细胞将来分化成体细胞 但是 如果将马蛔虫的受精 卵３８００ ｍ 离心数小时 使卵成为扁平形 第一次卵裂是垂直进行 那么植物极的物质会 分配到两个细胞中 下次再分裂时 就不会出现染色体部分丢失的现象 这说明生物体的性 状 包括细胞内的物质代谢变化 都是由遗传物质决定的 第三节 细胞分化的外在影响因素 细胞分化不仅决定于细胞本身核 质的关系 还与细胞间的相互作用密切相关 如细胞 间的分化诱导作用 位置信息以及激素等 对细胞的分化与形态发生均起重要的作用 一 胚胎诱导对细胞分化的作用 在动物胚胎发育过程中 一个细胞与邻近细胞的相互作用 在细胞分化中起着重要作用 各 胚层之间能相互促进细胞分化和组织器官发生的正向作用称为胚胎诱导 ｍ 对 其他细胞起诱导作用的细胞称为诱导者 或组织者 胚胎诱导一般发生在内胚层和中胚 层或外胚层和中胚层之间 中胚层独立分化的能力最强 其诱导分化的作用也就最强 中胚层可 作用于相应部位的外胚层或内胚层细胞 而导致不同胚层细胞合成组织特异性蛋白质 出现组织 分化 从诱导的层次上看 胚胎诱导可分成三级 即初级诱导 次级诱导和三级诱导 例如脊索 中胚层诱导其表面覆盖的外胚层发育成神经板 是初级诱导 神经板卷成神经管后 前端膨大成 原脑 其两侧突出的视杯再诱导视杯上方的外胚层形成眼晶状体 为次级诱导 晶状体再诱导其 表面的外胚层形成角膜 为三级诱导 图１ ２ ４ 皮肤由表皮及真皮组成 表皮来源于外胚层 真皮来源于中胚层 皮肤一些区域一般可 鉴别的特征如羽毛 鳞片 毛发等衍生物或外表的角质层是表皮细胞分裂及合成特异性蛋白

139 ２９８ 细胞生物学 质的结果 表皮不同衍生物的形成是由真皮控制的 如鸡的皮肤在背部和翅上长有羽毛 而 爪部者则有鳞片 如果将胚胎爪部的表皮取下与位于羽毛下面的胚胎背部的真皮结合在一 起 结果从爪部发育出来的是羽毛而不是鳞片 表明表皮形成什么样的表皮衍生物 决定于 位于下面的真皮 图１２ ４ 眼球发育过程的多次诱导作用 胚胎诱导的机制至今尚不清楚 但一些实验已证明诱导作用是通过某些化学诱导物实现 的 诱导物质的性质 在不同发育体系中是不同的 它们可能是大分子的蛋白质或核酸类 也可能是一些小分子 其确切性质还有待进一步研究 诱导物从诱导组织进入反应组织引发 诱导 而不需要诱导者与反应组织间的细胞接触 二 位置信息在细胞分化中的意义 在组织 器官的建成中 细胞受到某种指令的控制 从而使动物躯体的组织 器官的大 小 形态受到控制 如肢体的形成不仅需要肌肉 神经 骨骼和皮肤在数量上的增加 而且 还需要它们在空间上的分布 在特化区域中 细胞生长在空间上的局限性对形态发生具有重 要作用 可使特化的组织器官保持一定大小的形态和空间位置 因此 位置信息就是使细胞 能正确地按发育指令进行形态构建 例如 从鸡胚肢体形态的研究可说明位置信息的存在及其重要性 鸡卵受精３ ４天后 在胚胎长轴两侧形成凸起叫肢芽 肢芽进一步发育成腿或翅 所有肢芽中的细胞类型都是一 致的 即外层为外胚层细胞 包围着里面的间充质细胞 间充质细胞以后分化为腿和翅的肌 肉 软骨及骨骼等不同组织 三 激素对细胞分化的调节作用 在胚胎细胞发育早期 邻近细胞间的相互作用可诱导细胞分化 发育晚期 细胞分化还 受到激素的调节 由于激素是在发育后期产生作用的 因此 激素所引起的反应是按预先决 定的分化程序进行的 激素由血液循环输送到不同部位影响细胞分化 所以远距离的作用主 要依靠激素 它的作用主要是引发靶细胞进行分化 例如 激素对哺乳动物性别分化的调节 在发育早期阶段 雄性和雌性表型从外形上还 无法区别 最初形成一系列共同的前体结构 原基 首先是性腺 即胚胎后壁中的尿生殖

140 第十二章 细 胞 分 化 ２９９ 嵴 它是 由 上 皮 细 胞 和 疏 松 的 间 充 质 细 胞 组 成 的 第 二 个 重 要 结 构 是 中 肾 管 Ｗ 最后 排泄系统的早期组分 第三个是位于中肾管外侧的副中肾管 Ｍ 的结构是外生殖器 胚胎 ３ ５ 周时 在 Ｙ 染色体短臂上编码的一种或多种基因产物影响 下 尿生殖嵴深层的间充质结构开始发育形成雄性的睾丸 如果缺少 Ｙ 染色体信号 这些 结构蜕变 而皮质上皮发育成卵巢 在这一阶段性腺的性别开始建立 性分化最早可见的现 象发生在胚胎第９周 睾丸合成并释放一种副中肾管抑制物 ＭＩ Ｓ 的糖蛋白因子 抑制副 中肾管的继续生长发育 在雌性动物不产生这种抑制因子 副中肾管继续发育 直至分化为 输卵管 子宫和阴道上部 胚胎 １０ １１周时 睾丸开始产生睾丸酮 它是中肾管生存和继 续分化为输精管所需要的激素 雌性者则由于缺少睾丸酮 中肾管退化 在胚胎 １０ １５ 周 之间 睾丸开始合成双氢睾丸酮 形成雄性生殖器 图１２ ５ 图１２ ５ 胚胎雄 雌性性别分化调节的步骤和顺序 ＤＨＴ 双氢睾丸酮 ＭＩ Ｓ 副中肾管抑制物 Ｔ 睾丸酮

141 ３００ 细胞生物学 四 胚干细胞及其他干细胞 详见第十四章 干细胞 第四节 细胞分化的分子基础 细胞分化使同一来源的细胞产生形态结构 生化特性 生理功能上的差异 从分子水平 来看这是由于特定基因活化的结果 特定基因表达后合成某些特异性蛋白质 执行特殊功 能 因此 细胞分化的问题在本质上就是基因表达调控的问题 实际上并非细胞中所有基因 都参与细胞分化过程 细胞内与分化有关的基因按功能可以分为两类 一类是管家基因 或 称持家基因 ｋ 它是为维持各种细胞基本活动所不可缺少的基因 这种 基因是各种类型细胞中所共有的 如与细胞分裂和能量代谢有关的各种蛋白质编码的基因 管家基因还有一些产物不是蛋白质 而是参与蛋白质合成的ＲＮＡ 和ＲＮＡ 等 这类基因的 表达称为基本的 表达 另一类为组织特异性基因 或称奢侈基因 ｘ 这类基因为细胞 特异性蛋白质编码 它对细胞的生存并无直接影响 但对细胞分化起重要作用 这些选择性基因 表达的产物在不同的细胞中有质和量上的差别 如红细胞表达血红蛋白基因 淋巴细胞表达免疫 球蛋白基因 结缔组织细胞表达胶原基因等 这些基因的选择性表达导致细胞的分化 一 专一蛋白质合成的细胞表型特化 细胞分化一般是指细胞表型的特化 常以细胞水平明显可查的指标判断细胞是否分化和 分化程度 如表皮细胞的角蛋白 红细胞的血红蛋白 腺细胞的分泌蛋白等特异蛋白的出 现 含量以及成熟程度等 这类蛋白对细胞自身生存并无直接影响 却是细胞向特殊类型分 化的物质基础 故称为奢侈蛋白 ｘ 将那些维持细胞生命活动所必需的 各 类细胞普遍共有的蛋白质管家蛋白 ｋ 如膜蛋白 核糖体蛋白 线粒 体蛋白 糖酵解酶和核酸聚合酶等等 二 细胞分化基因表达的调控 细胞分化的调控可以发生在不同的水平 转录水平或翻译水平 其中转录水平的调控是 最重要的 一 转录水平调控 转录调控 是细胞分化基因表达的重要调控方式 通过转录调 控 控制着基因在不同组织中进行差异表达 转录水平上进行的基因表达 在不同类型的细 胞中 ｍｒｎａ 的种类和性质应是不同的 在 ｍｒｎａ 与 ＤＮＡ 杂交实验中可以看到 从鼠胚中 提取 ＤＮＡ 使之变性后结合到一固体基质上 然后与从一种鼠组织 如脑 分离出的经放射 性核 素 标 记 的 ｍｒｎａ孵 育 再 加 入 来 自 另 一 种 鼠 组 织 如 肝 或 肾 的 ｍｒｎａ 标 记 的 ｍｒ

142 第十二章 细 胞 分 化 ３０１ ＮＡ 与 ＤＮＡ 以互补链结合 未标记的同种 ｍｒｎａ 可以与标记分子竞争这个结合点 结果表明一种 组织的 ｍｒｎａ 与 ＤＮＡ 的杂交可以被其他组织的 ｍｒｎａ 部分抑制 因此表明不同类型的细胞有一 定数量共同的 ｍｒｎａ 即编码基本蛋白质的 ｍｒ ＮＡ 另外还提示在不同的细胞中存在着 独 特 的 ｍｒｎａ 例如从鼠组织中提取总 ＲＮＡ 与放射性核 素标记的 ＤＮＡ 探针杂交 通过 Ｎ 进行 图１２ ６ 小鼠发育期间不同组织的 基因表达 Ｎ 印迹法 分析 可以显示来自不同组织的 ｍｒｎａ 用人类 肌动蛋白基因的克隆片段作为探针时发现组织特异性信息在心脏和睾丸 而用鼠血清清蛋白 基因片段为探针 清蛋白的 ｍｒｎａ 只在肝脏中出现 图 １２ ８ 这些 ｍｒｎａ 种类的差异是 由于转录水平的调控所引起的 二 翻译水平调控 翻译调控 是指基因转录的 ｍｒｎａ 有选择性地翻译成蛋白质 在 不同细胞中含有同样的 ｍｒｎａ 但各种 ｍｒｎａ 不能都翻译成蛋白质 而只有不同的 ｍｒｎａ 得到翻译 产生不同的蛋白质 如果调控是在翻译水平上完成的 细胞中就应存在一种机制 来区别不同的 ｍｒｎａ 从中选择特定的对象进行翻译 检验这种机制是否存在的有效手段是 ｍｒｎａ 显微注射的研究 结果发现将动物或植物 的许多种 ｍｒｎａ 例如编码血红蛋白 免疫球蛋白 甲状腺球蛋白和胶原等的 ｍｒｎａ 注 射到爪蟾的卵母细胞中 这些 ｍｒｎａ 都能充分地翻译成相应的蛋白质分子 卵母细胞没有 对不同的 ｍｒｎａ 进行选择性翻译 因此可以说明细胞分化时基因表达的调控主要是在转录 水平上进行的 而不在翻译水平上 第五节 细胞分化与癌变 生物体内由正常细胞转变成的不受控制地恶性增殖细胞的过程称为癌变 正常细胞一旦 发生癌变 其生物学属性便发生了本质变化 细胞的癌变不属于正常的细胞分化过程 但可 以看作是分化过程中的异常变化 正常细胞中癌基因实际上是一些参与细胞生长 分裂和分 化的基因 生物体内每个细胞内有许多基因 一般为 ３００ ４００ 个 控制正常的细胞功能 这些基因在正常细胞中以非激活的形式存在 故称原癌基因 当原癌基因受到多种因素的作 用使其结构发生改变时 激活成为癌基因 现已知道 大约有６０种癌基因与癌的发生有关 由于癌基因是作为引起恶性肿瘤的逆转录病毒的部分而被发现和命名的 不久 又发现了存 在于细胞内的另一类基因即抑癌基因 抑癌基因在癌的发生上与癌基因同等重要 如果说癌 基因是细胞生长加速器 那么抑癌基因就是抑制细胞生长的制动器 原癌基因的激活与抑癌 基因的失活是导致正常细胞的发生癌变关键

143 ３０２ 细胞生物学 一 原癌基因 原癌基因的激活与抑癌基因的失活可以引起正常细胞的癌变 胚胎发生过程中的显著特 征是细胞始终处于细胞周期循环之中 直至决定最后命运的时空性开关 ｍ ｗ 打开后 才进入分化阶段 此时会发现原癌基因相关基因 的大量表 达 这表明原癌基因对于细胞周期与细胞分化有着极为重要的关系 原癌基因主要包括 ① 生长因子 如 ② 生长因子受体 如ｍ Ｂ ③ 蛋白激 酶及其他信号转导组分 如 ④ 细胞周期蛋白 如 １ ⑤ 细胞凋亡调控因 子 如 ２ ⑥转录因子 如 ｍ ｊ ｍ 和 这里主要介绍 １ ｍ 与分化调节 ｍ 高水平的表达可以阻遏细胞分化 例如有数种白血病细胞 系均有 ｍ 的过分表达 若以能诱导分化的试剂处理这些细胞系 则 ｍ 基因的表达迅 速下降 有研究发现以表达反意 ｍ 之 ｍｒｎａ 的质粒转染 可诱导 Ｆ９ 畸胎癌 细胞分化 总之 只要 ｍ 过分表达 细胞便不能进入终末分化 此外 如果细胞中没有 ｍ 表达 则有其他原癌基因 如 ｍ 的表达 其功能与 ｍ 相似 即防止细胞趋向老 化 ｍ 基因表达的下行调节分化过程的控制 是在一级基因转录水平上延伸进行的 如 当以那些可以诱导 ＨＬ６０细胞系发生粒细胞分化的因子处理细胞时 则在非翻译的外显子获 得拷贝之后可以阻断 ｍ 的转录 这一现象称之为衰减 这就提出一种可能 性 即弱化作用 信使稳定性 以及其他的转录后机制 对于分化过程是极端重要的 ２ 与分化调节 的表达可以使细胞被刺激而进入细胞周期 因此 当迅速增 殖的细胞进行单核细胞分化时 的激活也就表明它的功能与进入和走出可逆性的静止 态相连系的 １９８６年 Ｇ 等证明 单核细胞的分化还伴有 蛋白水平的升高以及 ｋ 和 ｍ基因的上行调节 在单核细胞分化过程中 的上行调节发生于 ｍ表达 开启之前 由于 ｍ产物提供了单核细胞 巨噬细胞的生长因子受体 ＣＳＦ １ 因此可能是一 个调节者功能性产物序列 加速单核细胞分化的条件也使得与 ｍｍｒｎａ 更加稳定 因 此 ｍ的表达是细胞趋向于静止态或 Ｇ０ 期的一种标志 二 抑癌基因 抑癌基因 ｍ 又称肿瘤抑制基因 是正常细胞增值过程中的负调 控因子 能够阻止细胞周期的进程 进而限制细胞的增殖 其基因的失活有利于癌变的发 生 故被称为 抑癌基因 由于基因突变在大多数情况下是使基因的功能减弱或消失 而 不是基因功能的增强 有认为抑癌基因异常在癌变中的作用较之癌基因活化更为重要 这些 基因在细胞增殖 分化调控中的作用受到越来越大的重视 是２０世纪９０年代癌肿分子生物 学研究的热点 迄今克隆到的抑癌基因的数目较少 这并不意味着客观存在的抑癌基因就一 定比癌基因少 只是由于技术上的原因 要想分离 鉴定和确认一个抑癌基因比较困难 人 类大约有５０个遗传性癌综合征 理论上讲至少有５０个有关的抑癌基因 抑癌基因主要包括 ① 转录调节因子 如 Ｒ ５３ ② 负调控转录因子 如 ＷＴ ③ 周期蛋白依赖性激酶抑制因子 ＣＫＩ 如 １５ １６ ２１ ④ 信号通路的抑制因子 如

144 第十二章 细 胞 分 化 ３０３ ＧＴＰ酶活化蛋白 ＮＦ １ 磷脂酶 ＰＴＥＮ ⑤ ＤＮＡ 修复因子 如 ＢＲＣＡ１ ＢＲＣＡ２ 等 这里主要介绍 Ｒ ＷＴ 和 ５３ １ Ｒ基因 是第一个被人类克隆和完成全序列测定的肿瘤抑制基因 是在儿童视网膜 母细胞肿瘤 ｍ Ｒ 中发现基因 Ｒ 家族的儿童对 Ｒ 基因高度敏感 因为 所有体细胞中只有一个 Ｒ基因 在发育过程中 只需极少数视网膜细胞再发生一次细胞突 变 就可使正常的 Ｒ基因消失 从而触发 Ｒ 散发性 Ｒ发生较晚 一般只危及一眼 遗 传性 Ｒ往往危及双眼 ３岁左右发病形成多个肿瘤 在 Ｇ１ 期 Ｒ与 Ｅ２Ｆ 结合 抑制 Ｅ２Ｆ 的 活性 在 Ｇ１ Ｓ期 Ｒ被 ＣＤＫ２磷酸化失活而释放出转录因子 Ｅ２Ｆ 促进蛋白质的合成 Ｒ 基因于１９８７年被克隆 长１９０Ｋ 在正常视网膜母细胞表达 有人研究了１８个 Ｒ细胞系 Ｒ基因无一表达 对基因缺陷的分子水平研究证实 约不到１ ３的病例有大的重组或缺失 而更常见的是微小改变 如点突变 对 Ｒ患者的细胞进行遗传分析 发现少数 Ｒ细胞有 显微镜下可见的１３号染色体有一小段异常 另外 Ｒ基因失活也可见于其他肿瘤 如骨肉 瘤和软组织肉瘤 但即使在无 Ｒ 病史的肉瘤患者 Ｒ 基因亦有灭活 故该基因灭活可能 与大部分肉瘤的发生有关 此外 在小细胞性肺癌 膀胱癌和少数乳腺癌亦发现 Ｒ基因失活 有人将正常 Ｒ基 因引入 Ｒ和骨肉瘤细胞 结果发现肿瘤细胞的恶性表型受到抑制 而 Ｒ基因的导入又可 使某些肿瘤得以逆转 这均证明 Ｒ基因失活确实在肿瘤发生中具有关键作用 ２ ＷＴ１基因 与 Ｒ具有极相似发病机理的另一个肿瘤 是胚胎肾母细胞瘤 Ｗ ｍ Ｔｍ 以下简称 ＷＴ 该肿瘤亦有家族性和散发性两类 ＷＴ 中一部分 约 ２０ 同时 伴有虹膜 泌尿系统异常和脑发育延迟等先天异常 称为 ＷＡＧＲ 综合征 此综合征患者正 常组织中有一条染色体的先天性缺失 在肿瘤中则有双侧缺失 肿瘤常见于双侧肾脏围以增 生异常的肾组织 可能为癌前改变 研究发现 １１ １３ 区域某个基因的缺失是 ＷＴ 发病的关 键 用定位克隆的方法 体细胞杂交 分子克隆 脉冲场电泳 染色体跳跃 克隆到散发性 ＷＴ 缺陷区的一个基因 长５０ｋ ｍｒｎａ 约ｋ 根据核酸序列推导的氨基酸序列 该基因 产物是一 个 锌指 蛋 白 可 能 是 一 个 转 录 因 子 与 最 近 发 现 的 ２ 种 人 早 期 生 长 反 应 基 因 ＥＧＲ１ ＥＧＲ２ 的锌指状蛋白区域有较高的同源性 由于这一基因在人肾脏细胞中有高度 表达 被认为是非常可能的 ＷＴ１基因 ３ ５３基因 ５３基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基因 该基因编码定位于人 类１７号染色体短臂 是一种分子量为 ５３ｋＤ的磷酸化蛋白 命名 ５３ 最初发现 ５３ 是野 生型的 后来研究发现它是突变型的 实验证实 野生型 ５３ 具有抑制活化的 ＲＡＳ 基因的 灭活 ５３可以互相结合形成寡聚体 因此突变 ５３可以通过与野生型 ５３ 阻遏后者的活性 而呈现显著性抑制作用 ５３磷蛋白的正常功能是调控细胞增殖 在白血病 骨肉瘤 肺癌和结 直肠癌中有 蛋白的突变和缺失 现已证明 ５３ ５３蛋白是人体内最有效的对抗肿瘤的自然防御物 关 于 ５３的研究已付诸实施 我国已经批准了用于人类癌症的首个基因治疗 新近研究发现 一些小分子药物可以通过阻止 ５３负调节子 Ｍｍ２与 ５３的结合来激活 ５３ 这一研究为新 的肿瘤治疗方法通过蛋白质相互作用找到新的和有效的药物靶点开辟了光明的前景

145 ３０４ 细胞生物学 第十三章 细胞的衰老与死亡 细胞衰老 和死亡 是细胞生命活动的必然规律 构成机体的绝 大部分细胞都须经过分裂 分化 衰老 死亡的历程 因此 细胞衰老和死亡如同细胞的生 长 增殖 分化一样是细胞重要的生命现象之一 生物个体的衰老主要是机体内部结构的衰 变 其实质是构成机体的基本单位 细胞的生理功能衰退或丧失 细胞发育到一定阶段就 会发生死亡 其原因不外乎内因和外因两类 内因主要是由于发育过程或衰老所致的自然死 亡 而外因则指受到外界物理 化学 生物等各种因素的作用 使细胞超过了所能承受的限 度或阈值而引起的细胞死亡 根据细胞死亡的不同模式 可分为坏死 和凋亡 两种类型 第一节 细胞的衰老 一 细胞衰老的概念与特征 一 细胞衰老的概念 细胞衰老是指细胞内部结构发生衰变 从而导致细胞生理功能衰退或丧失 细胞衰老和 细胞的寿命密切相关 同一机体内的所有细胞都来自受精卵 这些不同组织器官的细胞以不 同速率 不同时间 不同方式发生衰老和死亡 同时又有新的细胞不断产生 二者处于一种 动态平衡 机体内绝大多数细胞的寿命与机体的寿命不相等 而且机体不同组织 器官的各 种细胞寿命差异很大 一般而言 能保持继续分裂能力的细胞不容易衰老 而分化程度高 又不分裂的细胞寿命相对有限 衰老现象容易在短寿细胞中见到 而长寿细胞在个体发育的 晚期方可见到衰老现象 研究发现 离体培养的细胞与体细胞一样 也有一定的寿命 １９６１年 Ｈ ｋ和 Ｍ 报道 体外培养的人二倍体细胞随着传代表现出明显的衰老 退化和死亡现象 并因 此提出了 Ｈ ｋ界限 即离体培养的细胞有一定的寿命 其增殖能力也具有一定限度 体 外培养实验证明 胚胎成纤维细胞在体外培养的代数与该动物寿命有关 传代次数越多 说 明该动物寿命越长 衰老速度亦慢 培养细胞寿命长短不取决于培养的天数 而是取决于培 养细胞的平均代数即群体倍增次数 即细胞寿命 群体细胞传代次数

146 第十三章 细胞的衰老与死亡 ３０５ 二 细胞衰老的特征 细胞衰老过程是细胞生理 生化发生复杂变化的过程 如细胞呼吸率减慢 酶活性降 低 最终反映出形态结构的改变 表现出对环境变化的适应能力降低和维持细胞内环境能力 的减弱 以致出现细胞功能紊乱等多种变化 细胞衰老的主要表现是对环境变化适应能力和维持细胞内环境恒定能力的降低 这些表 现是以细胞形态结构与生化改变作为基础的 细胞衰老最明显的结构变化是细胞内原生质与 水分的减少 尤其是水分的减少 使得原生质硬度增加 造成细胞收缩而失去正常形态 在 原生质改变的同时 细胞核发生固缩 核结构不清 核染色加深 细胞核与细胞质的比率减 小 有些细胞的核几乎不见 如脂肪细胞 或完全消失 如哺乳类的红细胞 还有人观察 到衰老细胞中核外染色物质的含量也减少 例如神经细胞中的核外染色物质尼氏小体 随着 细胞的衰老而减少 衰老的细胞还有一个显著特征是细胞内有色素或蜡样物质沉积 如神经细胞 心肌细胞 与肝细胞内脂褐素的沉积 皮肤细胞中这些物质的沉积便形成为 老年斑 有人对脂褐素 在脑细胞中的沉积进行过详细分析 发现初生小鼠脑细胞中无脂褐素存在 ３ ５ 月者有散 在的脂褐素颗粒 老年者脂褐素成簇分布于核的周围和轴突 树突处 新生小鼠的神经细胞 １００ 无脂褐素 ２４月龄者２０ 的神经细胞中有脂褐素 脂褐素多存在于细胞的溶酶体内 一般认为由于溶酶体消化功能的降低 不能将摄入细胞内的大分子物质分解成可溶性分子而 及时排出 因此蓄积在胞质内成为残余体 除了结构与形态改变之外 随着细胞的衰老还发生一系列化学组成与生化反应的改变 首先是氨基酸与蛋白质合成速率下降 如有人证明衰老细胞蛋白质摄取３５Ｓ 蛋氨酸的能力下 降 而摄取半胱氨酸的能力增加 此外 由于原生质是一种以蛋白质为主要成分的复杂亲水 胶体系统 当细胞水分逐渐减少时胶体的理化性质发生改变 更由于其中不溶性蛋白质的增 多 使得细胞的硬度增加 衰老细胞内酶的活性与含量也改变 如肝脏中的异柠檬酸脱氢酶 ＩＣＤＨ 其中一种是 依赖于辅酶Ｉ ＮＡＤ 的ＩＣＤＨ 另一种是依赖于辅酶 Ｋ ＮＡＤＰ 的ＩＣＤＨ ５ ３３周龄 大鼠 ＮＡＤ ＩＣＤＨ 的比活性较高 ８５ 周龄者降低 ＮＡＤＰ ＩＣＤＨ 的比活性 ５ １３ 周龄时增 高 ３３ ８５周龄者下降 实验证实 去卵巢大鼠 ＮＡＤ ＩＣＤＨ 的比活性下降 但可以用雌二 醇诱导 而随着年龄的增加诱导作用减弱 至 ８５ 周龄时不再能诱导出 ＮＡＤＰ 和ＩＣＤＨ 酶的 活性 同样 老年神经细胞硫胺素焦磷酸酶 ｍ 的活性减弱 使高 尔基复合体的分泌功能与囊泡的运输功能下降 有人认为头发变白可能与头发基部黑色素细 胞中酪氨酸酶活性的下降有关 衰老细胞内线粒体的数量也发生改变 线粒体的数量随年龄的增长而减少 有人认为线 粒体是决定衰老的生物钟 在果蝇中发现线粒体 ＤＮＡ 转录产物在衰老过程中逐渐减少 特 别是１６ＳＲＮＡ 减少 影响线粒体蛋白质和酶的合成 使细胞代谢功能受影响 细胞的衰老也必然伴有与细胞增殖有关参数的特有改变 最明显的是细胞集落形成率在 衰老过程中逐渐下降 每单位时间进入细胞有丝分裂Ｓ期的细胞数目减少 如在人成纤维细

147 ３０６ 细胞生物学 胞培养基里加入３ＨＴＲ ２４ 小时后标记指数从第 ２５ 代 生长期 的 ８３ 下降到第 ５０ 代 衰老期 的３７ 如从上述两代的培养里选出分裂期的细胞进行传代 则生长期细胞与衰 老期细胞的周期时间 到达下一次分裂的平均时间 相似 这一结果提示 衰老细胞增殖速 度的下降可能不是由于培养中所有细胞分裂周期时间的普遍延长 而是由于十分缓慢地通过 Ｇ１ 期的细胞 或是完全停止细胞周期循环的细胞增多之故 而其余的细胞则仍以正常的速 度周转 总之 有人统计 细胞衰老有１５０余种功能与结构的改变 二 细胞衰老学说 由于机体的寿命有限 衰老也在所难免 为什么每一个个体都逃脱不了有序的衰老与死 亡 引起细胞与机体衰老的机理是什么 这一直是人们在探索的重大课题 近几十年 医 学 遗传学 生理学 细胞生物学和分子生物学等领域的学者从不同角度尝试对这一重要问 题进行研究 并从大量实验结果中提出若干学说 现将有关内容简要介绍如下 一 自由基理论 自由基是指在外层轨道上不成对电子的分子或原子的总称 体内常见的自由基如超氧离 子自由基 氢自由基 羟自由基 脂质自由基和过氧化脂质自由基等等 它们可来自分子氧 与多种不饱和脂类 如膜磷脂中的不饱和脂肪酸 的直接作用 也可来自分子氧与游离电子 包括体内形成与体外电离辐射产生 的相互作用 自由基性质活泼 易与其他物质反应生 成新的自由基 而后者又可进一步与基质发生反应 从而引起基质大量消耗及多种产物形 成 因此 一般认为 自由基在体内除有解毒功能外 它对细胞更多的是有害作用 其主要 表现为 它使生物膜的不饱和脂肪酸发生过氧化 形成过氧化脂质 从而使生物膜流动性降 低 脆性增加 以至脂质双层断裂 各种膜性细胞器受损 过氧化脂质又可与蛋白质结合成 脂褐素 沉积在神经细胞和心肌细胞等处 影响细胞正常功能 自由基还会使细胞 ＤＮＡ 发 生氧化破坏或交联 导致核酸变性 扰乱 ＤＮＡ 的正常复制与转录 自由基也使蛋白质发生 交联变性 形成无定性沉淀物 降低各种酶的活性 并导致因某些异性蛋白出现而影响机体 自身免疫现象等等 自由基理论的依据是人体血清中自由基含量随年龄而增加 细胞内脂褐 素也随年龄而增加 以上这些都加速了细胞衰老 二 神经免疫网络论 该理论认为衰老与神经系统及免疫系统的衰退有关 下丘脑的衰老是导致神经内分泌器 官衰老的中心环节 由于下丘脑 垂体的内分泌腺轴系的功能衰退 使机体内分泌功能下 降 从而导致免疫功能的减退 而机体免疫功能的减退是衰老的重要原因之一 又如发现机 体免疫组织中淋巴细胞数目 Ｂ 淋巴细胞制造抗体的能力 以及胸腺激素的分泌能力都随年 龄的增加而下降 以致机体对异物 病原体 癌细胞等的识别能力下降 免疫监视系统功能 紊乱 不能有效抵抗有害物质对机体的侵害 同时 免疫系统功能的紊乱还表现在自身免疫 现象增多 误把自身组织细胞当作异己攻击 最后导致机体衰老 尤其是胸腺随着年龄增长 而体积缩小 重量减轻 例如新生儿的胸腺重约１５ ２０ １３ 岁时 ３０ ４０ 青春期后胸腺

148 第十三章 细胞的衰老与死亡 ３０７ 开始萎缩 ２５岁后明显缩小 到４０岁胸腺实体组织逐渐由脂肪所代替 至老年时 实体组 织完全被脂肪组织所取代 基本上无功能 因此 老年人免疫功能降低 易患多种疾病 其 中包括肿瘤 三 遗传程序论 该理论认为 机体从生命一开始 其生长 发育 衰老与死亡都按遗传密码中规定的程 序在进行着 在生命过程中随着时间的推延 有关基因启动与关闭的命令按时发生 细胞 自我摧毁 的计划按期执行 支持这种理论的实验如 有人在细胞体外培养中发现 人成 纤维细胞在体外分裂的次数与细胞供体的年龄有关 胎儿成纤维细胞体外分裂的次数是 ５０ 次左右 成人的成纤维细胞体外分分裂的次数是２０次左右 而一种叫 Ｈ Ｇ 综 合征的早老病患者 １０ 岁时具有正常老人特征 早亡 的细胞 在体外仅分裂 ２ １０ 次 有人用不同细胞进行核质融合实验发现 年轻者培养细胞的细胞质与同种老年者培养细胞的 细胞核融合 融合后的细胞有丝分裂只维持几次 似老年细胞那样 而当年轻者培养的细胞 核与同种老年者细胞的细胞质融合时 融合后的细胞具有年轻细胞那样的有丝分裂能力 说 明融合细胞的分裂能力是由细胞核中的遗传物质决定的 在遗传程序论中 由于对遗传结构在衰老过程中作用的看法不同 又可分为几种假说 １ 重复基因利用枯竭学说 此学说由 Ｃ 等人在１９７２年提出 他们认为 在细胞的 一生中只有少数基因在表达 大部分基因处于关闭状态 而在表达的基因中有一些是重复序 列 如果某基因由于受损而不能表达 重复基因的作用可以弥补 但当重复基因也因损伤而 不能表达时 一些生命大分子合成受阻 衰老随之出现 有人曾观察到ＲＮＡ 基因的含量随 着年龄的增长而减少 ２ ＤＮＡ 修复能力下降学说 此学说认为 细胞中的 ＤＮＡ 在自然界会受到各种致突变 因素的损伤 同时细胞都有一定的 ＤＮＡ 损伤修复能力 如果修复能力下降 基因因受损而 表达异常 细胞功能失常 衰老逐渐形成 细胞的这种修复能力是生物体长期进化的结果 是由遗传因素决定的 ＤＮＡ 修复能力可因机体所属的物种平均寿命 个体的年龄不同而异 Ｈ 等人１９７４年观察７种不同物种成纤维细胞的 ＤＮＡ 非程序合成水平 结果表明 １０ Ｊ ｍ２ 剂量紫外线 ＵＶ 照射不同培养时间的细胞后 细胞核中所出现的银染颗粒数显著不同 提示不同物种的 ＤＮＡ 修复能力与物种各自的平均寿命呈正相关 Ｓ ｍ 等人 １９７９ 用 ＵＶ 诱发的人外周血淋巴细胞的 ＤＮＡ 修复 发现年轻人供体细胞的 ＤＮＡ 修复能力高于中 老年人供体细胞 说明在同一物种内 个体的 ＤＮＡ 修复能力与其年龄呈负相关 即高龄个 体的 ＤＮＡ 修复能力小于低龄个体 ３ 衰老基因学说 Ｓｍ 等认为 细胞中存在着衰老基因 其表达产物是一种可抑制 ＤＮＡ 和蛋白质正常合成 促进衰老的抑制素 同时 细胞还存在一种阻遏基因 其产物可 阻碍衰老基因的表达 阻遏基因有许多拷贝 但拷贝数会随着细胞分裂次数的增多而逐渐丢 失 因此 年轻细胞中有足够阻遏基因的拷贝 可形成足够浓度的阻遏物质 抑制衰老基因 的表达 随着细胞增殖次数增加 细胞中阻遏基因拷贝数减少 阻遏物浓度逐渐下降 以致 不足以阻遏衰老基因的表达 于是细胞的 ＤＮＡ 和蛋白质合成受阻 从而导致细胞衰老

149 ３０８ 细胞生物学 ４ 密码子限制学说 Ｓ 提出的密码子限制学说 认 为 细胞合成蛋白质的过程是由遗传密码所决定的 而遗传密码按时间顺序 相继被激活或 抑制 合成发育的某一阶段所需的蛋白质成分 当细胞发育分化至某一阶段时 这种合成维 持细胞生命所必需的蛋白质的遗传密码可因使用限制或数量限制而导致衰老 对各种组织中 ＲＮＡ ＲＮＡ 合成酶类型的研究表明 这些分子的某些成分在不同生理过程是不相同的 如９个月和３个月大鼠胚胎组织的蛋白质分子不完全相同 不同年龄细胞内酶的类型变化似 乎与密码限制学说相吻合 但缺乏直接的实验证据 ５ 端粒缩短假说 Ｏ ｍ ｋ 认为 细胞老化是由于细胞中的染色体端粒的长度随着年龄 增加而逐渐缩短所致 分裂旺盛的细胞 其染色体端粒较长 分化后分裂能力较差的细胞 其 染色体端粒缩短 Ｈ ９ ９ １年 发现 培养的成纤维细胞老化时 其染色体端粒长度由 等 １ ４ｋ 缩短到２ｋ ＥＳＴ １酵母突变株 其染色体端粒缩短 显示出早老特征 ６ 终末分化学说 该学说认为在受精卵的基因组中 某些特定基因在细胞经历了若干 次分裂后被激活 它们可能编码某种抑制细胞进入 Ｓ 期的特殊蛋白质 使细胞不能进入 Ｓ 期 失去增殖能力 从而导致细胞衰老 ７ 基因程控学说 这一学说最初由 Ｈ ｋ １９６６ 年 提出 得到不少学者的支持 大量实验结果也表明细胞衰老是主动过程 是基因自身调控的结果 染色体 上的基因按既定时空程序进行活动 一个基因 或基因群 活动后便处于沉默 另一个基因 或基因群 又被激活 当整个基因组活性降低时 就导致细胞衰老 四 其他学说 １ 差错灾难学说 该学说认为机体在生命过程中会产生有缺陷的分子 并随年龄增长 而积累 当有缺陷的分子影响到细胞中核酸与蛋白质的合成系统时 将造成更多生物大分子 的差错 严重影响细胞功能 最终导致细胞衰老与死亡 如蛋白质合成中氨基酸顺序时有差 错发生 当连接的差错氨基酸正好是蛋白质的生物活性关键区 如酶的活化中心 时 则该 酶的活性改变或完全消失 继而导致生化代谢异常 最终可能引起一场灾难性结果 有人在 体外成纤维细胞培养中发现 从年轻细胞中提取的 ６ 磷酸葡萄糖脱氢酶 Ｇ ６ ＰＤ 在 ５９ 条件下最初几分钟酶活性不变 而从老年细胞中提取的这种酶 在同样条件下酶活性急剧下 降 说明老年细胞中的这种酶含有异常蛋白 ２ 大分子交联学说 该学说认为 细胞内外一些大分子在多种因素作用下发生交联反 应 此反应可发生在多核苷酸之间 也可发生在蛋白质原纤维之间 甚至在多核苷酸与蛋白 质原纤维之间 这些大分子物质通过共价键连接成难以分解的聚合物 从而引起核酸与蛋白 质功能严重下降 如交联的 ＤＮＡ 无法进行正常复制与转录 交联的蛋白质失去了原有的通 透性与溶解度等 最终导致细胞衰老 由于大分子的交联现象随增龄而上升 因此细胞衰老 也随增龄而加剧 ３ 体细胞突变学说 由于物理 化学等因素使体细胞发生突变 细胞内功能基因减少 和改变 使功能蛋白减少和变异 一些正常生理活动受到破坏 进而威胁寿命 ４ 代谢学说 限制饮食热量可以延长动物最高寿命 延缓老化 营养过剩可缩短寿命

150 第十三章 细胞的衰老与死亡 ３０９ 钙吸收过多可使动物早老 居住在寒带的人平均寿命长 热带人寿命短 这些现象均与代 谢有关 这些例子说明 代谢的盛衰 同寿命的长短有密切的关系 ５ 线粒体 ＤＮＡ 突变的衰老假说 粒体能量代谢障碍导致衰老 由于内部或外部的原因 线粒体 ＤＮＡ 发生突变和线 还有其他一些关于细胞衰老机理的假说 如生物膜假说 内分泌假说等等 值得提出的 是 目前对细胞衰老的假说远未达到可以下结论的时候 随着科学技术的发展 出现了许多 支持某一假说的实验研究 同时也出现了一些与某些假说不尽一致甚至结果相反的实验研 究 所以 尚难以下定论 其次 对已经观察到的一些现象 究竟它们是引起细胞衰老的动 因 还是由于衰老而造成的结果 这些都需要人们作更加深入 艰苦的探索 不少学者认 为 造成细胞衰老的因素可能是多方面的 在现有的一些衰老机制假说中 相互之间也并非 对立 有一些还可能互为补充 或同时作用 可以预见 随着科学技术的发展 必将会有一 个比较全面 更接近于衰老机制本质的衰老理论出现 第二节 细胞的死亡 一 细胞死亡的标志 衰老的细胞最后终将死亡 死亡即为细胞生命现象发生不可逆转的停止 死亡细胞的鉴 定 通常采用活体染色的方法来进行 即用中性红 台盼蓝 次甲基蓝等活性染料对细胞进 行染色 在活细胞中这些染料只积聚于细胞质的一定区域 如溶酶体等液泡系染成红色 而 细胞内其他部分都不着色 但在死亡细胞中 细胞质与细胞核都被染色 且着色均匀 用中 性红对体外培养细胞进行染色 可观察到死亡的细胞伪足收缩 细胞变圆 细胞核凝集皱 缩 线粒体解体 细胞质与细胞核呈扩散性染色 细胞死亡后 如不被吞噬细胞吞噬 消化 不被排出体外 则可发生由于细胞内某些酶 的活动而造成自我解体性的死亡现象 这些现象包括 由于酶的作用 大分子被破坏 小分 子和离子积累 细胞渗透压增加 细胞体积膨胀 由于原生质不可逆的凝集 细胞质内出现 颗粒状蛋白质 细胞呈现混浊的尘状外貌 即雾状膨胀 由于缺氧后无氧酵解依然在进行 从而使细胞酸度偏高 Ｈ 值下降 细胞核在细胞死亡后一段时间内继续维持其结构的染色 性 甚至在有的细胞中出现染色增强现象 但随着核内蛋白质减少 ＤＮＡ 的不断消失 最 后核溶解 失去染色质 由于细胞的死后现象完全改变了活细胞的面貌 因此 研究活细胞结构 必须采取合适 的固定剂 把细胞很快杀死 使细胞各部结构维持在生前状态 而不发生死后现象 二 细胞死亡的机制 一 细胞凋亡与细胞坏死 细胞凋亡与细胞坏死是细胞死亡的两种不同形式 细胞凋亡是一种主动性的 基因所控制

151 ３１０ 细胞生物学 的按细胞固有程序进行的一种生理性死亡现象 它受一系列生理性和病理性的因素所激活或抑 制 胚胎形成 衰老和损伤细胞的清除以及肿瘤的发生发展和转归等病理生理过程 都与细胞 凋亡有密切的关系 尽管许多文献中将细胞凋亡和编程性细胞死亡 ｍｍ ＰＣＤ 作为相同的概念来使用 但严格来说二者强调的侧重点并不是完全相同的 ＰＣＤ 强调的 是死亡发生的时间 何时发生死亡 指在胚胎发育过程中 到一定阶段 某一群细胞必然死 亡 通过 ＰＣＤ 实现胚胎形态改造 凋亡强调的是死亡的方式 死亡是怎样进行的 二者的 形态特征也有所不同 尽管大多数 ＰＣＤ 表现为典型细胞凋亡形态特征 但也有些 ＰＣＤ 缺乏典 型的凋亡形态特征 两者均涉及到程序性 但程序性的内涵不同 凋亡的程序性是指凋亡细胞 完成死亡的途径具有程序性 一旦凋亡途径被激活 一般不能逆转 ＰＣＤ 的程序性是指在胚胎 发育过程中 发生死亡的细胞在时间和空间上受到严格控制 细胞坏死 则是指病理及损伤刺激引起的退行性变化所导致的细胞死亡 从 抽象概念来讲细胞凋亡属于生理性过程 是自然死亡 坏死是意外死亡 凋亡和坏死是细胞 死亡的两个不同途径 细胞凋亡在一定情况下可转化为坏死 但是 坏死是不可逆的被动过 程 细胞凋亡从形态学 生化和分子事件上讲与细胞坏死有明显的区别 二 细胞凋亡与细胞坏死的比较 细胞凋亡和细胞坏死是多细胞生物的两种完全不同的死亡形式 它们在形态 代谢 分子 机制 结局和意义等方面都有着本质的区别 细胞凋亡是由基因控制的自主有序的过程 其形 态特征是细胞体积缩小 胞浆浓缩 内质网肿胀呈泡状并与细胞膜发生融合 线粒体肿胀 通 透性增加 细胞色素 Ｃ释放 核染色质浓缩呈新月形 染色质凝聚靠近核膜周缘 核仁裂解 进而细胞膜内陷将细胞分割成多个具有完整膜性结构且内含各种细胞成分的凋亡小体 细胞凋 亡的过程不导致溶酶体破裂 没有细胞内含物外泄 故不引起炎性反应 细胞凋亡是单个细胞 的丢失 其结局是被吞噬细胞或邻近细胞所识别 吞噬 其生化反应主要是细胞核 ＤＮＡ 被核 酸内切酶在核小体单位之间降解 产生１ ８ ０ ２ ０ ０ 倍数的片段 在琼脂糖电泳上呈现 ＤＮＡ 梯 带 凋亡往往需要新的基因转录和蛋白质合成 因而需要能量 但是 有些细胞发生凋亡时 染色质 ＤＮＡ 并不降解 而细胞坏死首先是膜通透性增加 细胞外形发生不规则变化 内质网 扩张 染色质不规则位移 进而线粒体及核发生肿胀 溶酶体破坏 细胞膜破裂 胞浆外溢 引起严重的炎性反应 坏死常是成群细胞丢失 表１ ３ １ 图１ ３ １ 表１３ １ 细胞凋亡与坏死的主要特征比较 细胞凋亡 细胞坏死 概念 基因所控制的按细胞固有的程序进行的一种主动 性生理性死亡现象 病理及损伤刺激引起的退行性变化 所导致的非自主性细胞死亡过程 刺激 生理或病理刺激 病理 及 损 伤 刺 激 例 如 毒 素 作 用 严重缺氧 缺血和缺乏 ＡＴＰ 细胞发生皱缩 与邻近细胞连接丧失 细胞出现肿胀 形态不规则 细胞形态

152 第十三章 细胞的衰老与死亡 ３１１ 续表 细胞凋亡 细胞坏死 细胞膜 完整 鼓泡 形成凋亡小体 丧失完整性 溶解或通透性增加 细胞器 完整 受损 细胞质内容物外泄 细胞核 固缩 片段化 核内染色质浓缩 核质边缘化 分解 染色质不规则转移 线粒体 肿胀 通透性增加 细胞色素释放 肿胀 破裂 ＡＴＰ耗竭 溶酶体 完整 破裂 生化特征 核小体 ＤＮＡ 断裂成１８０ ２００ 片段 随机断裂成大小不等片段 能量需求 依赖于 ＡＴＰ 不依赖于 ＡＴＰ 组织分布 单个或成群细胞 成片细胞 组织反应 非炎症反应 炎症反应 吞噬细胞吞噬部分膜性结构 细胞内容物溶解释放 结局 图１３ １ 细胞凋亡与细胞坏死的超微形态比较 参照 Ｃ 等 １９９９ １ 正常细胞 ２ ４显示细胞凋亡过程 ２ 细胞皱缩 核染色质凝聚 边集 解离 胞浆致密 ３ 胞浆分叶状突起并分离成为多个凋亡小体 ４ 凋亡小体迅速被其周围巨噬细胞等吞噬 消化 ５ ６ 显示细胞坏死过程 ５ 细胞肿胀 核染色质凝聚 边集 裂解成许多小团块 细胞器肿 胀 线粒体基质絮状凝集 ６ 细胞膜 细胞器膜 核膜崩解 进而自溶

153 ３１２ 细胞生物学 三 凋亡细胞的特征 目前已证明 既往所提及的细胞坏死中也可观察到有大量细胞的凋亡现象 因此可以说 凋亡现象广泛存在于生物机体中 是对机体的发育生长极为有利的生物现象 凋亡细胞的特 征从形态学方面概述如下 凋亡细胞的形态学特征表现为核固缩 胞质浓缩 细胞器出现不同程度的改变 细胞体 急剧变小 细胞骨架解体等 １ 核的变化 １ 染色质凝聚 核 ＤＮＡ 在核小体连接处断裂成核小体片段 并在核膜下或中央部异 染色质区聚集形成浓缩的染色质块 在电镜下呈高电子密度 凋亡细胞中染色质块聚集于核 膜下 称边聚 或聚集于核中央部 称中聚 边聚的染色质块使胞核呈新月状 八 字形 花瓣状或环状等 而染色质块中聚则使胞核呈眼球状 异染色质丰富 常染色质少的细胞 核 在凋亡早期染色质呈现为高度浓缩的致密核 黑洞样核 染色质聚集部以外的低电子 密度区为透明区 这是由于核孔变大从而导致其通透性增大 细胞质中水分不断渗入而造成 图１３ ２ 图１３ ３ 图１３ ４ 图１３ ２ 凋亡细胞核形态模式 引自姜泊 １９９９ ２ 核碎片 核残块 由于核内透明区不断扩大 染色质进一步聚集 核纤维层的断 裂消失 核膜在核膜孔处断裂 两断端向内包裹将聚集的染色质块分割 形成若干个核碎 片 其中含有少量的透明区 而个别的黑洞样核变得更致密 仍保持原状 不被分隔 图 １３ ３ ２ 胞质的变化 １ 胞质浓缩 由于脱水 细胞质明显浓缩 约为原细胞大小的７０ 是凋亡细胞形态 学变化的第二大特征 除线粒体及内质网外的多数细胞器无明显改变 ２ 细胞器 在凋亡过程中 细胞器也出现不同程度的改变 线粒体 较为敏感 凋亡早期个别细胞内线粒体变大 嵴增多 表现为线粒体增殖 接 着 增殖线粒体空泡化 生物化学研究证明线粒体内细胞色素 Ｃ 向胞质逸出是细胞凋亡早 期常发生的一种现象 并认为线粒体内细胞色素 Ｃ 的逸出与细胞凋亡有密切关系 共聚焦 显微镜观察证实 凋亡细胞线粒体膜电位下降

154 第十三章 细胞的衰老与死亡 ３１３ 图１３ ３ 普通光镜下的凋亡细胞形态 一 图１３ ４ 普通光镜下的凋亡细胞形态 二 内质网 多数情况下凋亡细胞内的内质网腔扩大 增殖的内质网在凋亡细胞内形成自噬 体过程中提供包裹膜 与细胞的自噬性凋亡有密切关系 细胞骨架 凋亡细胞的细胞骨架也发生显著的改变 并与膜形态的改变有关 原来疏 松 有序的结构变得致密和紊乱 其主要组成成分肌球蛋白和肌凝蛋白的表达受到显著的抑 制 含量明显减少 细胞骨架的改变不仅仅是细胞凋亡的后果 它还影响到凋亡的过程 这 一点可以从两个实验得到证实 一方面一些能与细胞骨架组成成分结合 干扰其功能的药 物 如长春新碱或秋水仙碱等 可以诱使细胞出现细胞凋亡的典型改变 另一方面用佛波酯 等促进细胞骨架有序化的药物 可以有效的抑制这些药物诱导的细胞凋亡 ３ 细胞膜的变化 凋亡的细胞失去原有的特定形状 如微绒毛 细胞突起及细胞表面 皱褶的消失 细胞膜表面张力使其变成表面平滑的球形 不易被损伤 而且对表面活性剂有 很强的抵抗能力 细胞膜活性渗透性改变不明显 内容物难以逸出 共聚焦显微镜证明细胞 膜电位 下 降 膜 流 动 性 降 低 另 外 细 胞 膜 上 新 出 现 了 一 些 生 物 大 分 子 如 磷 脂 酰 丝 胺 酸 和 ｍ 等 这些分子的出现与凋亡细胞的清除有关 有一 些生物大分子则从凋亡细胞的膜上消失 如某些与细胞间连接有关的蛋白质 有些糖蛋白的 侧链被降解 暴露出的成分可能介导了吞噬细胞和凋亡细胞的结合 从而有利于凋亡细胞的

155 ３１４ 细胞生物学 清除 彩图 １ 彩图 ２ ４ 凋亡小体的形成 凋亡小体的形成通过以下两种方式 １ 通过发芽脱落机制 凋亡细胞内聚集的染色质块 经核碎裂形成大小不等的染色质 块 核碎片 然后整个细胞通过发芽 起泡 ｚ 等方式形成一个个球形 的突起 并在其根部发生窄缩而脱落形成一些大小不等 内含胞质 细胞器及核碎片的膜包 小体 即凋亡小体 或通过在凋亡细胞内由内质网分隔成大小不等的分隔 区 靠近细胞膜端的分隔膜与细胞膜融合并脱落形成凋亡小体 图１３ ５ １３ ６ 图１３ ５ 扫描电子显微镜下凋亡细胞的形态 一 图１３ ６ 扫描电子显微镜下凋亡细胞的形态 二 ２ 通过自噬体形成机制 凋亡细胞内线粒体 内质网等细胞器和其他胞质成分一起被 内质网膜包裹形成自噬体 并与凋亡细胞膜融合后 自噬体排出细胞外成为凋亡小体 有些细胞在凋亡过程中并不通过上述方式形成若干个凋亡小体 而仅仅发生核固缩和胞 质浓缩 成为单个致密结构 也被称为凋亡小体 图１３ ７ １３ ８

156 第十三章 细胞的衰老与死亡 ３１５ 图１３ ７ 透射电子显微镜下凋亡细胞核的形态 图１３ ８ 细胞凋亡时 ＤＮＡ 变化模式图 ５ 生物化学改变 细胞凋亡时在生物化学方面也发生着复杂多样的变化 至今尚不能 确定哪一种变化是细胞凋亡过程所特有的 １ 梯状条带 １９８０年 Ｗ 报道 胸腺细胞发生凋亡时 其 ＤＮＡ 琼脂糖凝胶电 泳呈特征性 梯状条带 研究表明 梯状条带是凋亡细胞 ＤＮＡ 片段化 ｍ 的结果 内源性核酸内切酶 将核小体间的连接 ＤＮＡ 降解 形成长 度为１８０ ２００整数倍的寡聚核苷酸片段 组蛋白和其他核内蛋白质不降解 核基质也不 改变 由于大部分细胞凋亡出现 ＤＮＡ 梯状条带 而细胞坏死时 ＤＮＡ 随意断裂为长度不一 的片段 琼脂糖凝胶电泳呈 弥散状 ｍ 因此 尽管后来发现并不是所有的凋亡细 胞都出现 ＤＮＡ 梯状条带 但仍把这一现象看作是细胞凋亡的典型生化特征 典型的凋亡细 胞 ＤＮＡ 琼脂糖凝胶电泳图 图１３ ９ ２ 核酸内切酶 如前所述 阶梯形 模式的 ＤＮＡ 降解是由于核酸内切酶的活化所 致 因此 对于内切酶的鉴定是细胞凋亡研究的一个重要的方面 近来的研究指出 在凋亡 时出现在绝大多数细胞的一种与 ＤＮＡ 降解有关的内切酶是与 ＤＮＡ 酶Ｉ不可区别的一种酶

157 ３１６ 细胞生物学 为 Ｃ２ 和 Ｍ２ 所依赖 而受 Ｚ２ 抑制 在最易见到凋亡的胸腺细胞中这种内切酶是作为 细胞固有成分存在的 只要胞浆内的 Ｃ２ 升高 就可激活内切酶 ３ 组织谷氨酰胺转移酶 进入凋亡的细胞胞浆的致密化和细胞皱缩的原因之一是生 物化学改变 包括 ｍｒｎａ 和蛋白质的合成减少 在 Ｔ 细胞的凋亡中 磷酸肌醇的形成和细 胞内游离的 Ｃ２ 浓度的升高着起重要作用 在此过程中 编码组织谷氨酰胺酶的基因被诱 导表达 其编码的酶是 Ｃ２ 依赖酶家族中的一员 它催化形成高稳定的广泛的胞浆蛋白交 联 形成与角化鳞状上皮细胞相似的胞膜下的壳状结构 使凋亡小体稳定 防止有生物活性 的物质释放到细胞外环境中而引起炎症反应 图１３ ９ 细胞色素诱导的凋亡细胞 ＤＮＡ 电泳图 引自 翟中和 ２００３ 细胞色素诱导 １ ０ ２ １ ３ ２ ４ ３ ５ ４ ６ 阴性对照 ７ Ｍ ｋ 三 细胞凋亡的分子机制 一 诱导细胞凋亡的因素 诱导细胞的主要因素有物理因素 如射线 紫外线 λ 射线等 温度等 化学因素 如各种自由基 钙离子载体 ＶＫ３ 视黄酸 ＤＮＡ 和蛋白质合成抑制剂 如环己亚胺 及 一些药物等 生物因素 如细胞毒素 激素 细胞生长因子 肿瘤坏死因子 ＴＮＦα 抗 Ｆ Ａ １ ＣＤ９５抗体等 二 与细胞凋亡相关的基因 细胞凋亡是在凋亡因子的诱导之下 通过信号转导途径激活了细胞内与凋亡有关的基

158 第十三章 细胞的衰老与死亡 ３１７ 因 从而使细胞凋亡 细胞内与凋亡有关的基因有以下几种 １ 基因 线虫 Ｃ 凋亡基因 在线虫中已发现１４个与细胞凋亡有关的基因 被分别命名为 １ １４ 其中有 ３ 个在凋亡中起关键作用 ３ ４ 和 ９ 研究结 果表明 在所有的凋亡细胞中都有 ３和 ４ 两个基因的表达 ３ ４ 可促进细胞凋 亡 属于凋亡基因 而 ９基因为细胞控制基因 其作用与 ３和 ４相反 可抑制线虫 体细胞凋亡的发生 故 ９被称为 抗凋亡基因 正常情况下 ４ 与 ３和 ９结合形成复合物 保持 ３ 无活性状态 当细胞接受凋亡信号 导致 ９ 脱离复合物 使 活化而致细胞凋亡 ３ ２ Ｂ ２基因 ２ 是 Ｂ 细 胞 淋 巴 瘤 白 血 病 ２ Ｂ ｋ ｍ ２ ２ ｍｍ 的缩写 是研究最早的与细胞凋亡有关的基因 人 ２ 基因是从与滤泡性淋巴瘤相关的 １４ １８ 染色体易位的断裂点克隆到的基因 其编码的氨基酸序列与 ９ 基因编码的氨基 酸序列有２３ 同源性 ２发现之初被认为是一种癌基因 一般认为 ２通过抑制诱导凋 亡的信号而在肿瘤中发挥作用 后来发现它并无促进细胞增殖的能力 而它的过度表达则可 防止细胞凋亡 由于其可抑制多种原因诱导的细胞凋亡 故属抗凋亡基因 其 Ｂ ２基因定位于１８号染色体 为一个不断扩增的多基因家族的原型 家族成员中还有 Ｂ １ Ｂ κ Ｂ Ａ１ Ｂ κ １ 等 其中 Ｂ ２ Ｂ １等 ξ Ｍ ξ Ｂ ξ Ｍ 抑制细胞凋亡 而 Ｂ κ Ｂ Ｂ 及 Ｂ κ等刺激细胞凋亡 ξ ３ 基因家族 白细胞介素 １β转化酶 ｋ １ ｚ ｍ ＩＣＥ 基 β 因在细胞凋亡中起重要作用 迄今已发现 ５ 个成员 Ｉ ２ ＩＣＥ Ⅱ ＣＰＰ３２ Ｎ ２ Ｉ １ Ｉ ２ ＩＣＥ Ⅱ和Ｉ ２ ＩＣＥ Ⅲ 它们的高表达皆可导致细胞凋亡 后来又陆续发现了 一些与ＩＣＥ 同源的基因 １９９６年 人们根据这些基因的产物均为底物特异性的半胱氨酸蛋 白酶 将它们统一命名为 目前已确定至少存在 １４ 种 其中 ２ ８ ９ 和１０参与细胞凋亡起始 ３ ６和７则参与执行细胞凋亡 ４ Ａ １９９７年 人们从细胞提取物中分离出 ３ 种凋亡蛋白酶活化因子 在 存在时它们可使 活化 参与执行细胞凋 Ａ ＡＴＰ ３ 亡 ５ ｍ 基因 ｍ 是与细胞生长调节有关的原癌基因 其主要编码转录激活蛋白来 调节 ｍｒｎａ 的转录 在缺乏生长因子的条件下 ｍ 的转录水平低 其靶细胞处于 Ｇ１ 停 滞阶段 在加入生长因子后 ｍ 的转录迅速增加 诱导细胞进入 Ｓ 期 ｍ 蛋白在有 其他延长存活的因子如 Ｂ ２存在时 促进细胞生长 而在无其他生长因子时 可刺激细胞 凋亡 ６ ５３基因 人 ５３基因位于１７号染色体短臂 １７ １３ １７ 上 其编码的 ５３ 蛋白是 一种位于细胞核内的５３ｋＤ磷酸化蛋白 现已确认 ５３ 基因是多种中突变频率最高的抑癌 基因 在某些情况下 ５３依赖性细胞周期检查点的激活 无论有无生长阻滞 均可使细胞发 生凋亡 ５３为 Ｂ ｘ的转录活化因子 如果 ＤＮＡ 损伤不能被修复 则 ５３ 持续增高 特异 性抑制 ２基因的表达 进而促进 Ｂ ｘ的表达 引起细胞凋亡 人类 ５３ 蛋白存在两种形 式 野生型 ｗ ５３ 和突变型 ｍ ５３ 野生型 ５３ 蛋白在细胞 ＤＮＡ 受到损害时 可诱

159 ３１８ 细胞生物学 导细胞停止于 Ｇ１ 期 防止有突变 ＤＮＡ 的细胞进入增殖 直到 ＤＮＡ 损伤得到修复 突变型 的 ５３蛋白对于细胞凋亡有抑制作用 当 ５３发生突变 突变的 ５３不能诱导细胞凋亡以阻 止突变细胞增殖 从而导致肿瘤 三 细胞凋亡的分子机制 多年来的分子生物学研究已鉴定了数百种与细胞凋亡有关的调控因子 这些因子组成了 多条凋亡信号转导通路 其中某些通路相对具有一定的特异性 而有些通路为非特异性通 路 表明在细胞凋亡信号的转导机制中 不同通路的作用形式不同 而且通路间存在错综复 杂的关系 以下简要介绍细胞内外信号诱导的凋亡机制及 活性的调节在细胞凋亡中 的作用 从而使我们对细胞凋亡分子机制有一个简要的了解 １ 细胞内信号诱导的细胞凋亡 细胞色素 Ｃ ｍｃ Ｃ Ｃ 是一种可溶性蛋 白 正常时位于线粒体膜内并松散地附着于线粒体膜的内表面 在将要凋亡的细胞中观察到 Ｃ Ｃ 是从线粒体中释放到细胞质 一旦在胞质中出现 Ｃ Ｃ 其可与细胞浆中的其他成分 相互作用 激活 诱导细胞凋亡的发生如染色质浓缩和核碎裂 释放的 Ｃ Ｃ 和 Ａ １ 及 ９酶原结合形成一个复合物称为 ｍ 因 Ａ １ 分子中存在 ４ 同源 区 而在其两侧 即 Ｎ 端存在 募集结构域 ｍ ｍ ＣＡＲＤ 可 直接与 ９酶原结合 而 Ｃ 端有与 Ｃ Ｃ 相互作用的结构域 形成的复合物使 ９ 从酶原而激活成为具有活性的酶 激活的 ９ 又导致 家族其他成员被激活 以 使胞质中的结构蛋白和细胞核中的染色质降解 引发核纤层解体 从而导致细胞凋亡 ２ 细胞外信号诱导的细胞凋亡 Ｆ 是 肿 瘤 坏 死 因 子 ＴＮＦ 受 体 和 神 经 生 长 因 子 ＴＮＦ 受体家族的细胞表面分子 Ｆ 配体 简称 Ｆ Ｌ 是 ＴＮＦ 家族的细胞表 面分子 Ｆ Ｌ 与其受体 Ｆ 结合导致携带 Ｆ 的细胞凋亡 Ｆ Ｌ 或 ＴＮＦ 作为细 胞外凋亡激活因子如分别与其相应受体 Ｆ 或 ＴＮＦ 结合而启动 进而形成 Ｆ 或 ＴＮＦ 受体 连接器蛋白 ＦＡＤＤ 和 ２ ８和１０酶原组成的死亡诱导信号复合物 ｍ ｘ ＤＩ ＳＣ 当 ２ ８和１０酶原聚集在细胞膜内表面达到一定浓度时 它 们就进行同性活化 在其亚基间连接区的天冬氨酸位点进行切割 从而使 从酶原而 激活成为具有活性的酶 ２ ８ 和 １０ 被激活后 通过异性活化 使 ３ ６和７激活而引发核纤层解体 从而导致细胞凋亡 ３ 活性的调节 体内 能被激活而成为有活性的酶 同时也能在其他因素 的作用下被抑制从而达到对细胞凋亡的调节作用 哺乳类细胞中 抑制剂是凋亡抑制 因子 ＩＡＰ 家族 如人细胞中的 ＸＩＡＰ ＩＡＰ１ 和 ＩＡＰ２ 它们能特 异性地抑制 ３和７的激活 ＩＡＰ 能抑制 ９的活化 定位于线粒体外膜上的 Ｂ ２则具有双重功能 一方面阻止细胞色素 Ｃ 从线粒体释放 抑制 的激活 另一方面 与 Ａ 结合 调节细胞凋亡 有些病毒蛋白如痘病毒蛋白 和杆病毒蛋白 １ ＣｍＡ ３５ 也能抑 制 通过 的活化和抑制 调节细胞凋亡

160 第十三章 细胞的衰老与死亡 ３１９ 四 细胞凋亡与医学的关系 细胞凋亡是个体发育过程中维持机体自稳的一种机制 是生长 发育 维持机体细胞数 量恒定的必要方式 细胞凋亡与细胞周期 细胞癌变及细胞病理改变之间存在着密切的关 系 细胞凋亡的研究 对理解胚胎发育 免疫耐受 细胞群体稳定等重要生命现象具有重要 的意义 通过促进有害细胞的凋亡 可开发出治疗艾滋病 癌症等严重威胁人类生存的疾病 以及其他疾病的新方案 同时采用人为干预凋亡 把维持身体正常功能的细胞从细胞凋亡中 拯救过来 如通过抑制神经系统某些细胞的程序性死亡 治疗神经系统的变性或退行性疾 病 如阿尔茨海默病等 一 细胞凋亡与机体发育 从低等动物到高等动物的发育 都存在着细胞凋亡的现象 现已认识到 在哺乳动物的 胚胎发生 发育和成熟过程中 构成组织的细胞发生生死交替及细胞凋亡是保证个体发育成 熟所必需的 例如 某些昆虫从虫卵到成虫 中间要经过几个蜕变期 每个时期组织结构以 及外形都要发生改变 在这些过程中 均有赖于新旧细胞的生死交替 细胞的死亡是在完成 了它的使命后而被淘汰消失的 井然有序 蝌蚪发育为蛙时 尾部自然消失 这是细胞有序 凋亡的过程 人的胚胎肢芽 ｍ 的发育过程中 指 趾 间的部位则在胚胎发育过 程中 以细胞凋亡的机制逐渐消退 从而成指 趾 间的裂隙 从生物学意义来讲 在胚胎 发育过程中 通过细胞凋亡可清除对机体没有用的细胞 亦可清除多余的 发育不正常的结 构细胞 在成年机体中 通过细胞凋亡清除衰老的细胞并代之新生的细胞 从而维持器官中 细胞数量的稳定 细胞凋亡可参与和影响几乎所有胚胎新生儿的发育 一旦细胞凋亡规律失 常 个体即不能正常发育 或发生畸形 或不能存活 人类免疫系统的发育是细胞凋亡最有 代表性的例子 在淋巴细胞发育分化成熟过程中 始终伴随着细胞凋亡 Ｔ 淋巴细胞和 Ｂ 淋 巴细胞在分化成熟中 由于免疫系统的选择作用 ９５ 的前 Ｔ 淋巴细胞和前 Ｂ 淋巴细胞均 要发生凋亡 否则就会发生自身免疫性疾病 而成熟的白细胞的寿命也只有一天 死一批 再生一批 相互交替 且严格有序 如果淋巴细胞不能发生凋亡 则白细胞数量增加 将导 致白血病的发生 二 细胞凋亡与疾病 细胞凋亡是维持人体正常功能所必需的 细胞凋亡的研究对医学最大的推动 是扩大了 思维空间 明白了细胞的生与死都是其生理特征 都对机体正常的生理功能和内环境的稳定 性有着相同的重要性 对细胞凋亡的研究 有助于理解胚胎发育 免疫耐受 细胞群体稳定 等重要生命现象 近年来的研究显示病毒感染 自身免疫性疾病 神经变性性疾病及肿瘤的 发生等都与细胞凋亡有关 医学研究工作者已经开始在着力于细胞凋亡机制探讨的同时 设 计几种能够促进或抑制细胞凋亡的方案 并已取得一些突破性进展 相信在不久的将来可应 用人为干预细胞凋亡的技术 把维持身体正常功能的细胞从凋亡中拯救过来 以达到治病救 人 延年益寿的目的 也可通过促进有害细胞的凋亡 可开发出治疗艾滋病 癌症等严重威

161 ３２０ 细胞生物学 胁人类生存的疾病以及其他疾病的新方案 凋亡不仅与肿瘤的发生有密切的关系 近年来的研究还显示凋亡和病毒感染 自身免疫 性疾病以及神经变性性疾病等也有关 新近有报告指出 轻度氧化的 ＬＤＬ 可通过 Ｃ２ 升高 导致血管内皮细胞和平滑肌细胞凋亡 引起动脉粥样硬化 以下主要对凋亡与自身免疫性疾 病 ＡＩＤＳ以及神经变性性疾病的关系作一些介绍 １ 自身免疫性疾病 ＴＮＦ 家族成员 Ｆ 是 １９８９ 年发现的 为细胞毒性抗体识别的膜 蛋白 人 Ｆ 是３２５个氨基酸组成的糖蛋白 主要存在于活化的 Ｔ 细胞膜上 其配体 存在于将发生凋亡的细胞膜上 与 结合引起细胞凋亡 在编码的 Ｌ Ｆ Ｆ Ｌ Ｆ Ｆ 蛋白的１ 基因发生突变的大鼠 可发生淋巴增生和类似于人类系统性红斑狼疮的自身免疫 性疾疾病 编码 Ｆ 配体的 基因缺失的大鼠也可发生淋巴增殖和狼疮 对此的解释是在 免疫系统的发育过程中 机体为了识别和破坏在生命过程中可能遇到的外源性抗原 Ｔ 细胞 和 Ｂ 细胞产生抗原受体基因 如 Ｔ 细胞受体和Ｉ 基因 重排 随机地产生出数目在百万以 上的携带不同抗原受体分子的克隆 其中一部分是针对机体的自身组织细胞的 正常情况 下 这些携带针对自身抗原的受体分子的克隆在其发育的早期通过凋亡被清除 而在 Ｆ 及 其配体基因发生突变或缺失时 自身反应性的 Ｔ 细胞未能通过凋亡除去 造成自身免疫性 疾病 ２ ＡＩＤＳ ＡＩＤＳ的主要免疫学改变是患者血液中的 ＣＤ４ 阳性 Ｔ 细胞减少 对 ＨＩＶ 和 ＡＩＤＳ的研究的新证据表明 ＨＩＶ 感染所致的淋巴细胞减少和免疫缺陷与 ＣＤ４ 阳性辅助 Ｔ 细 胞对凋亡的敏感性增高有关 无症状的 ＨＩＶ 阳性病人的成熟 Ｔ 细胞在用 ＣＡ 或抗 Ｔ 细胞 受体抗体激活后 诱导一部分 ＣＤ４ 和 ＣＤ９ 阳性 Ｔ 细胞的凋亡 ＣＤ４ 阳性细胞容易凋亡的机 制尚不完全清楚 已发现 ＨＩＶ 病毒的包膜糖蛋白 １２０ 与此有关 １２０ 可与 ＣＤ４ 受体结 合 加上抗 １２０抗体的作用使 ＣＤ４ 分子相互连接 为 Ｔ 细胞受体分子受到刺激后引起的 凋亡做准备 在 ＨＩＶ 感染细胞表面的 １２０ 蛋白分子可通过 ＣＤ４ 分子与未受到感染的 ＣＤ４ 阳性细胞交连 一旦受到抗原刺激 将引起 ＣＤ４ 阳性细胞的凋亡 除了 １２０ 外 在 ＣＤ４ 阳性细胞凋亡的诱导中起作用的还有细胞生长因子 如 ＴＮＦα 因此对凋亡抑制的研究 可 能是 ＡＩＤＳ治疗的突破口之一 ３ 细胞凋亡与神经变性性疾病 神经细胞的死亡方式主要是凋亡 Ａ ｚ ｍ 病的缺血 性细胞死亡和神经细胞死亡已证实是凋亡所致 在体外培养的神经细胞受到多种刺激即将发 生死亡时 Ｂ ２基因的表达可保护其免于凋亡 已有报告指出 帕金森病和肌营养不良性 侧索硬化等神经变性性疾病的发病均与凋亡有关

162 第十四章 干 细 胞 ３２１ 第十四章 干 细 胞 人等各种脊椎动物的发育过程十分相似 都要经历卵裂 胚层出现 组织器官形成及胚 后 发 育 这 样 一 个 连 续 的 过 程 个 体 发 育 中 组 织 器 官 形 成 的 基 础 是 细 胞 分 化 即同一来源的细胞 通过细胞分裂在细胞间产生形态结构 生化特征和生 理功能有稳定性差异的过程 在细胞的分化过程中 细胞往往由于高度分化而完全失去了再 分裂的能力 最终走上衰老死亡 机体在发展适应过程中为了弥补这一不足 保留了一部分 未分化的原始细胞 一旦生理需要 这些细胞可按照发育途径通过分裂而产生分化细胞 我 们将那些具有无限的或永生的自我更新能力 并在一定条件下分化产生一种以上 专业 细 胞的原始细胞称为干细胞 然而 在发育过程中 可存在处于不同 分化等级 ｍ 的干细胞 如存在于囊胚内细胞团 ｍ ＩＣＭ 中的细胞具有分化为机体任何一 种组织器官的潜能 称为胚胎干细胞 ｍ ｍ ＥＳＣ 因其分化潜能很 宽 故认为它们是个体发育中 等级 较高的干细胞 而存在于成熟个体各种组织器官中的干细 胞 通常 只 能 分 化 为 相 应 或 相 邻 组 织 器 官 组 成 的 专 业 细 胞 称 为 成 体 干 细 胞 其分化潜能较 窄 所以它们在个体发育中 等级 较低 胚胎干细 ｍ ｍ 胞分化为成体干细胞是一个连续的过程 此过程中的各种细胞都是处于不同分化等级的干细 胞 这些干细胞随着其分化的进行 其分化方向趋于增多 分化潜能也趋于变 窄 正是 由于它们的存在 构成了个体发育在空间上的正确性和时间上的有序性 如今干细胞的研究与应用是现代生命科学中最令人瞩目的领域之一 被 １９９９ 年美国 科学 推举为二十一世纪最重要的十项科学领域之首 使浩大的 人类基因组计划 测序 图位居其后 ２０００年干细胞研究成果再度入选 科学 评选的当年十大科技成就 目前干 细胞生物学几乎涉及所有生命科学和生物医药领域 在细胞治疗 组织器官移植 基因治疗 及发育生物学等方面均产生深远影响 其发展前景是不可估量的 第一节 干细胞生物学 个体发育从受精卵开始 受精卵通过不同的增殖分化途径 形成由不同特征细胞组成的 功能各 异 的 组 织 和 器 官 即 使 在 动 物 个 体 成 熟 之 后 机 体 的 组 织 仍 然 保 持 自 体 稳 定 性 ｍ 即特定组织中细胞的死亡和细胞的增生保持动态的平衡 另外各种组织还保 持着程度不同的损伤后再生的能力 如一些两栖类动物的肢体在损伤后可完美的再生 哺乳 动物的造血系统 小肠 毛发和皮肤也保持了一定的再生能力 肝在损伤不太严重时也可部

163 ３２２ 细胞生物学 分再生 而生物个体发育和组织再生的基础则是由于干细胞的存在 干细胞群的功能即为控 制和维持细胞的再生 一般来说 在干细胞和其终末分化的子代细胞之间存在着被称为 定 向祖细胞 的中间祖细胞群 它们具有有限的扩增能力和限制性分化潜能 其与干细胞的根 本区别是其没有自我更新能力 干细胞则具有在一定条件下无限制自我更新与增殖分化能 力 能够产生表现型与基因型和自己完全相同的子细胞 也能产生组成机体组织 器官的已 特化的细胞 同时还能分化为祖细胞 干细胞与祖细胞的区别见 图１４ １ 图１４ １ 干细胞与祖细胞的区别 引自 Ｔ Ｗ ｗ Ｌ Ｋ ｋ 上图显 示一个造血干细胞产生第二代干细胞和一个神经元 下图为一个髓样祖 细 胞 分 裂 产 生 两 个 特 化 细 胞 一 个 中 性 粒 细 胞 和 一 个 红 细 胞 一 干细胞的分类 一 根据发生学来源分类 根据发生学来源 干细胞可以分为胚胎干细胞和成体干细胞 １ 胚胎干细胞 胚胎干细胞是一种高度未分化细胞 它具有发育的全能性 能分化出 成体动物的所有组织和器官 包括生殖细胞 ２ 成体干细胞 成体干细胞是存在于成年动物的许多组织和器官 比如表皮和造血系 统中 具有修复和再生能力的细胞 成年个体组织中的成体干细胞在正常情况下大多处于休 眠状态 在病理状态或在外因诱导下可以显现出不同程度的再生和更新能力 在多数情况 下 成体干细胞分化为与其组织来源一致的细胞 但是在某些情况下成体干细胞的分化并不 遵循该规律 表 现 出 很 强 的 跨 系 或 跨 胚 层 分 化 潜 能 即 具 有 可 塑 性 或 横 向 分 化 的能力 二 根据分化潜能分类 按分化潜能的大小 干细胞还可分为三种类型

164 第十四章 干 细 胞 ３２３ １ 全能性干细胞 ｍ 它具有形成完整个体的分化潜能 如胚胎干 细胞 简称 ＥＳ细胞 具有与早期胚胎细胞相似的形态特征和很强的分化能力 可以无限 增殖并分化成为全身２００多种细胞类型 进一步形成机体的所有组织 器官 人类的全能干 细胞可以分化成人体的各种细胞 这些分化出的细胞构成人体的各种组织和器官 最终发育 成一个完整的人 人类的精子和卵子结合后形成受精卵 这个受精卵就是一个最初始的全能 干细胞 受精卵继续分化 在前几个分化过程中 可以分化出许多全能干细胞 提取出这些 细胞中的任意一个放置到妇女子宫中 就可以发育出一个完整的人体 ｍ 这种干细胞具有分化出多种细胞组织的潜 ２ 多能性干细胞 能 但却失去了发育成完整个体的能力 发育潜能受到一定的限制 骨髓多能造血干细胞是 典型的例子 它可分化出至少十二种血细胞 ３ 单能干细胞 ｍ 也称专能 偏能干细胞 这类干细胞只能向一 种类型或密切相关的两种类型的细胞分化 如上皮组织基底层的干细胞 肌肉中的成肌细胞 也称卫星细胞 二 干细胞的形态和生化特征 作为有分裂增殖能力的细胞 干细胞在形态上具有一些共性 细胞通常呈圆形或椭圆 形 体积较小 核质比相对较大 不同种类的干细胞生化特征各有差异 但都具有比较高的 端粒酶活 性 这 与 其 增 殖 能 力 是 密 切 相 关 的 如 造 血 干 细 胞 ｍ ｍ ＨＳＣ 有 类 似 癌 细 胞 的 端 粒 酶 活 性 而 由 其 分 化 产 生 的 专 能 性 先 祖 细 胞 ｍ 的端粒酶活性则显著下降 ＭＰＰ 干细胞有时可以根据其形态学特征和存在位置来辨认 如在果蝇的性腺和外周神经系 统 干细胞与其外周的分化细胞有固定的组织方式 形成增殖结构单元 但是 对许多组织 而言 干细胞的存在部位目前仍未确定 也没有与分化细胞截然不同的形态学特征 不同的 干细胞具有各异的生化标志 这对于确定干细胞位置 寻找和分离干细胞有重要意义 如角 蛋白１５是确定毛囊中表皮干细胞的标志分子 巢素蛋白 为神经干细胞 ｍ ＮＳＣ 的标志分子等等 然而 干细胞生存的微环境可以影响其形态和生化特征 有时这种影响之大足以产生欺骗性 因此不能仅根据细胞的形态和生化特征来寻找干细胞 具有增殖和自我更新能力以及在适当条件下表现出一定的分化潜能是干细胞的本质特点 三 干细胞的增殖特征 一 干细胞增殖的缓慢性 当干细胞进入分化程序前 首先要经过一个短暂的增殖期 产生过渡放大细胞 ｍ 过渡放大细胞是界于干细胞和分化细胞之间的过渡细胞 经若干次分裂后 产生分化细胞 过渡放大细胞的作用是可以通过较少的干细胞产生较多的分化细胞 细胞动 力学方面的研究表明 干细胞通常分裂较慢 组织中快速分裂的是过渡放大细胞 如小肠干 细胞较其过渡放大细胞的分裂速度大约慢一倍 目前认为缓慢增殖有利于细胞对特定的外界

165 ３２４ 细胞生物学 信号作出反应 以决定进行增殖还是进入特定的分化程序 缓慢增殖还可以减少基因发生突 变的危险 使干细胞有更多的时间发现和校正复制错误 由此 有学者认为干细胞的作用可 能不仅仅在于补充组织细胞 干细胞的存在还具有防止体细胞发生自发突变的作用 图１４ ２ 干细胞生存的微环境和干细胞分裂方式示意图 引自凌诒萍 ２００２ 二 干细胞增殖系统的自稳定性 自稳定性 ｍ 是指干细胞可以在生物个体生命区间中自我更新 并维持其自身数目恒定 这是干细胞的基本特征之一 当干细胞分裂时 如两个 ｗ 子代细胞都是干细胞或都是分化细胞 称为对称分裂 产生一个子代干 ｍｍ 细胞和一个子代分化细胞则称为不对称分裂 对无脊椎动物而言 不 ｍｍ 对称分裂是干细胞维持自身数目恒定的方式 不对称分裂受一系列基因的调控 例如 在果 蝇的外周神经系统中 Ｉ 是感觉器官前体细胞不对称分裂的调控基因之一 Ｉ 蛋白至少 有三个方面的作用 ① 不对称地分配细胞膜上的细胞定向决定因子 ｍｍ ｍ 如 Ｎｍ ②不对称地分配细胞内 ｍｒｎａ ③决定细胞分裂时纺锤体 的取向 但是对哺乳动物的细胞而言却并非如此简单 大多数哺乳动物可自我更新的组织 中 干细胞分裂产生的两个子代细胞既可能是两个干细胞 也可能是两个特定分化细胞 当 组织处于稳定状态时 平均而言 每一个干细胞产生一个子代干细胞和一个特定分化细胞 因此哺乳动物的干细胞是种群 而不是单个干细胞 意义上的不对称分裂 称种群不对称分 裂 图 １４ ２ 这使得机体对干细胞的调控更具灵活性 ｍｍ 可以更灵活地应对机体生理变化的需要 为了保持干细胞数目的恒定 机体需要对干细胞的 分裂进行十分精确的调控 据研究 每个正常肠腺大约有２５０个细胞组成 如果额外多产生 一个干细胞 则该干细胞进而会多产生６４ １２８个子代细胞 目前对哺乳动物干细胞种群不 对称分裂的调控机制和细节知之甚少 虽然已经克隆了哺乳动物中与果蝇干细胞不对称分裂 调控基因同源的基因 但是它们是否具有类似的功能目前仍不清楚 高度进化的哺乳动物对 其干细胞增殖的调控是多角度多层次的 通过转基因技术使小鼠长期造血干细胞 ｍ

166 第十四章 干 细 胞 ３２５ ｍ ｍ ＬＴ ＨＳＣ 高表达抗凋亡蛋白 Ｂ ２后 可使长期造血干细胞的数目显著 增加 说明细胞凋亡对调节干细胞数目也起着重要作用 干细胞的自稳定性是其区别于肿瘤细 胞的本质特征 对干细胞自稳定性的研究有望从不同的侧面认识肿瘤的发生机制 四 干细胞的分化特征 一 干细胞的分化潜能 干细胞具有多向分化潜能 能分化为各种不同类型的组织细胞 根据分化潜能可分为全 能性干细胞 多能性干细胞和单能干细胞 二 干细胞的转分化和去分化 一直以来 成体干细胞被认为只能向一种类型或与之密切相关的细胞分化 如神经干细 胞只能向神经系统细胞 神经元细胞 神经胶质细胞 分化而不能分化成其他类型细胞 但 是最近一些发现对这一论断提出了挑战 越来越多的证据表明自体分离的干细胞仍然具有相 当的 可塑性 ３所示 表现出多向分化潜能 如图１４ 图１４ ３ 目前动物成体干细胞 可塑性 研究的主要证据 引自 Ｔ Ｗ ｗ Ｌ Ｋ ｋ 一种组织类型的干细胞在适当条件下可以分化为另一种组织类型的细胞 称为干细胞的 转分化 １９９７年 Ｅ 等人将来自成年雄性 Ｃ５７ＢＬ ６ ｊ小鼠的造血干 细胞移植到受亚致死剂量同位素照射的雌性 ＷＢＢ６Ｆ１ Ｊ ｋ Ｗ ｋ ＷＶ小鼠体内 ３ 天后在受体

167 ３２６ 细胞生物学 雌鼠的神经胶质细胞中检测到 Ｙ 染色体的存在 首次证明成年动物的造血干细胞可分化成 为脑的星形胶质细胞 少突胶质细胞和小胶质细胞 １９９９年 Ｇ 等人分离出小鼠的肌肉 干细胞 体外培养５天后 与少量的骨髓间质细胞一起移植入接受致死量辐射的小鼠中 结 果发现肌肉干细胞会分化为各种造血细胞系 又有研究表明 神经干细胞 ｍ ＮＳＣ 在生长因子 激素和微环境因素的作用下 除了可以分化为神经元 星形胶质细胞和 少突胶质细胞外 还可以分化为骨骼肌细胞和造血细胞 可塑性 使得成体干细胞分化潜 能较弱的传统观念受到挑战 更重要的是 表明其在修复 取代受损的细胞 组织甚至是器 官方面将发挥重要作用 一种干细胞向其前体细胞的逆向转化被称为干细胞的去分化 长期 以来 对细胞是否可以逆向分化一直存在争议 关于干细胞去分化的证据较少 有实验表明 当把来自成体鼠的造血干细胞注入鼠卵泡的内细胞团后 成体鼠造血干细胞的分化状态发生 逆转 开始表达胎鼠的珠蛋白基因 并参与胚胎造血系统的发育 目前对干细胞可塑性的机制仍知之甚少 实验中观察到的转分化现象大多是将分离自成体 的干细胞移植给受亚致死剂量同位素照射的受体后表现出来的 当前仍然缺乏证据证明机体在正 常生理条件下 成体动物的干细胞有转分化和去分化发生 因此对转分化和去分化可能的生理意 义尚不知晓 但是干细胞可塑性的实验证据揭示了干细胞的生存环境对干细胞有巨大作用 五 干细胞增殖与分化的微环境 干细胞在机体组织中的居所称为干细胞巢 ｍ 在干细胞巢中所有控制干细胞增 殖与分化的外部信号构成了干细胞生存的微环境 干细胞的微环境主要包括以下三个层面 一 分泌因子 为数众多的分泌因子 对干细胞的生存 增殖和分化具有重要的调控作 用 目前对转化生长因子β ｍ ｗ 家族的分泌信号 β ＴＧＦ β 和 Ｗ 分子了解较多 它们在组织间乃至物种间的功能都相当保守 Ｗ 家族信号分子通过 β 连 环蛋白 β 参 与 的 复 杂 途 径 激 活 由 Ｔ Ｌ Ｔ Ｌｍ 的转录 促进细胞的增殖 家 转录因子家族介导的基因如 ｍ 和 Ｄ １ Ｔ Ｌ 族成员 Ｔ ４纯合缺失小鼠缺乏肠干细胞 而 Ｌ １纯合突变小鼠毛发发育不正常 表明该途 径对哺乳动物表皮和肠上皮的正常发育具有重要作用 此外在果蝇中发现与 ＢＭＰ２ ４ 同源 的转化生长因子β家族成员 Ｄ Ｄ 对维持果蝇雌性生殖干细胞的增殖必不 可少 二 受体介导的细胞间相互作用 虽然分泌因子可以形成跨细胞的效应 但是细胞与细胞之间的相互作用对干细胞命运的 调控具有重要意义 尽管已经发现了许多细胞间粘附结构的组成分子 但是细胞间粘附对干 细胞发育调节作用的分子机制目前认识不多 现已知由 Ｎ 受体及其配体 Ｄ 介导的细 胞粘附与 Ｎｍ蛋白的协同作用调控着果蝇感受器官干细胞的正确分化

168 第十四章 干 细 胞 ３２７ 三 整合素和细胞外基质 细胞对细胞外基质 ｘ ｍ ｘ ＥＣＭ 的附着可以由多种受体介导 目前认 识最多的是整合素 例如 高表达β 整合素对维持表皮干细胞 ｍ ｍ 的增殖 分化至关重要 β 整合素还通过有丝分裂激活蛋白激酶途径调节角质细胞等细胞的分化 此 外 整合素有将干细胞置于组织中正确位置的作用 否则干细胞会脱离生存环境而分化或凋 亡 胞间基质有调节干细胞微环境中局部分泌因子浓度的作用 整合素的激活和表达也要受 胞间基质蛋白的调节 在高等脊椎动物中 干细胞生存的微环境在维护干细胞自我更新 决定干细胞分化命运方面 至关重要 如将小鼠的内胚层细胞置于另一只小鼠胰芽的分散细胞中 内胚层细胞可转变为胰腺 细胞的前体细胞 但是干细胞微环境对干细胞命运的设定并不是不可逆的 当干细胞被置于新的 生存环境后 干细胞的特性会发生改变而带有新环境的烙印 从而体现出干细胞的可塑性 干细胞生物学所面对的一个主要挑战是确定干细胞生存的微环境中调控干细胞增殖与分 化的关键作用因子 在某些组织 干细胞巢中的干细胞不止一种 例如在骨髓干细胞巢中不 仅有造血干细胞 还有间充质干细胞 这就意味着不同的干细胞可以对同一个干细胞巢中的 作用因子作出不同的反应 这使对干细胞微环境中作用因子的研究十分复杂 第二节 胚胎干细胞 简单地讲 胚胎干细胞是指极早期的胚胎细胞 也就是受精卵分裂至少达１ ６ ３ ２个细胞 时期的胚胎 又名桑葚胚 及分裂球 即单个细胞 此时若将每个细胞分开 每个细胞都能 发育成一个完整的胚胎 即为全能干细胞 胚胎干细胞可以在体外无限扩增并保持未分化状 态 具有分化为胎儿或成体动物各种细胞类型的潜能 胚胎干细胞可以像普通的细胞那样 进行体外培养传代 遗传操作和冻存而不失其多能性 在适当条件下胚胎干细胞可被诱导分 化为多种细胞 如心肌细胞 神经元 色素细胞 巨噬细胞 上皮细胞和脂肪细胞等 也可 以与受体胚胎形成嵌合体 可嵌合进入包括生殖腺在内的各种组织 因此胚胎干细胞是进 行哺乳动物早期胚胎发生 细胞分化 基因功能和基因表达调控等发育生物学基础研究的理 想模型和有效工具 如小鼠的胚胎干细胞在作转基因动物模型方面发挥重要作用 在应用研 究领域 胚胎干细胞尤其是人胚胎干细胞的获得 打开了细胞治疗和组织工程的大门 必将 对医学研究带来深远的影响 自１９８１年 Ｅ 和 Ｋ ｍ 首次分得小鼠的胚胎干细胞以来 到目前为止已分离获得猪 牛 绵羊 仓鼠 鸡 斑马鱼 恒河猴及人等脊椎动物的胚胎干 细胞 本节主要以人的胚胎干细胞为例对干细胞的分离获得 增殖分化特征等加以介绍 一 人胚胎干细胞的获得与胚胎干细胞系的建立 胚胎干细胞通常是从囊胚期胚胎的内细胞团获得的 在胚胎发育早期 囊胚的内细胞团 中含有约１４０个细胞 最外层由扁平细胞构成的滋养层 可发育成胚胎的支持组织等 中心 的腔称囊胚腔 腔内一侧的细胞群 即 内细胞团 内细胞团中的胚胎干细胞可进一步分

169 ３２８ 细胞生物学 裂 分化并发育成个体 内细胞团在形成内 中 外３个胚层时开始分化 每个胚层将分别 分化形成人体的各种组织和器官 由于内细胞团中的胚胎干细胞可以发育成完整的个体 因 而这些细胞被认为具有全能性 但是内细胞团细胞并不是胚胎干细胞的唯一来源 哺乳动物 的原始生殖细胞 ｍ ｍ ＰＧＣ 经适当信号分子的作用后 也可从中获得胚 胎干细胞 ＰＧＣ 最早出现于靠近尿囊基部的卵黄囊内胚层内 以后胚胎纵向折转 卵黄囊 这一部分成为胚胎的后肠 ＰＧＣ 由此做变形运动 经背侧系膜向生殖嵴移动 从生殖嵴 性腺嵴 分离的 ＰＧＣ 同样具有全能性 由胚胎建立胚胎干细胞细胞系的原理 就是把囊胚 期的内细胞团 桑葚胚或 ＰＧＣ 在体外培养建系 并设法阻止其分化 根据来源不同 将前 者称为胚胎干细胞 ｍ ｍ ＥＳＣ 后者称为胚胎生殖细胞 ｍ ｍ ＥＧＣ 通常所说的胚胎干细胞即 ＥＳＣ １９９８年１１月 美国威斯康星大学的 Ｔｍ 和约翰霍普金斯大学的 Ｇ 分别报 道 他 们 用 不 同 的 方 法 获 得 了 具 有 无 限 增 殖 和 多 分 化 潜 能 的 人 胚 胎 干 细 胞 ｍ ｍ ｍ ＥＳＣ Ｔｍ 研究小组是从体外受精形成的囊胚内细胞团中获得人胚胎干细胞的 在征得 精子和卵子供者同意的情况下 他们从１４ 个经体外受精 以治疗不孕症为目的 并发育成 囊胚的人胚中 采用免疫切除法去除滋养层 将内细胞团置于 γ射线灭活的鼠胎儿成纤维细 胞饲养层上 用８０ ＤＭＥＭ ２０ 胎牛血清 １ｍｍ Ｌ 谷氨酰胺 ０ １ｍｍ Ｌ２ 巯基乙醇 １ 非必需氨基酸培养 克隆获得了五株人胚胎干细胞系 其中 Ｈ９ 株一直连续传代超过 ８ 个月 ３２代 仍保持未分化状态 Ｇ 领导的小组几乎同时发表了他们建立人胚胎干细胞系的报道 他们从 ５ ９ 周 龄流产胎儿的性腺嵴及肠系膜中分离获得 ５ 个多潜能干细胞系 饲养层为 γ 射线灭活的 ＳＴＯ 成纤维细胞 培养液为 ＤＭＥＭ １５ ＦＢＳ ０ １ ｍｍ Ｌ２ 巯基乙醇 ２ｍｍ Ｌ 谷胺 酰氨 １ｍｍ Ｌ 丙酮酸钠 １０００ ＩＵ ｍ人重组白血病抑制因子 ｍ ｍ ｋ ｍ ＬＩＦ １ ｍ人 重 组 碱 性 成 纤 维 细 胞 生 长 因 子 ｍ ｍ ｗ ＦＧＦ １０μｍ Ｌ ｋ 等 实验表明胚胎生殖细胞表现出与胚 胎干细胞相似的特征 可在体外培养７个月而不分化 并保持正常的核型 利用克隆 多莉 羊的体细胞核移植技术是获得胚胎干细胞的又一选择 只要供体提供 任何体细胞 如面颊细胞 将其与去核的人卵细胞融合 然后刺激杂合细胞发育成囊胚 再 从囊胚的内细胞团中分离获得胚胎干细胞 结合体细胞核移植技术获得的胚胎干细胞 具有 与供体完全一致的遗传物质 再移植到供体体内不会产生免疫排斥反应 十分有利于细胞治 疗的应用 体细胞核移植技术路线的可行性已经得到验证 二 胚胎干细胞的主要特征 一 人胚胎干细胞的形态和生化特征 各种哺乳动物的胚胎干细胞都具有相似的形态特征 即细胞体积小 核大 有一个或多 个核仁 核仁清晰 细胞中多为常染色质 胞质结构简单 散布着大量核糖体和线粒体 核

170 第十四章 干 细 胞 ３２９ 型正常 具有稳定的整倍体核型 如 Ｔｍ 等分离的 ５ 个 ＥＳＣ 系中 Ｈ１ Ｈ１３ 和 Ｈ１４ 具 有正常的 ＸＹ 核型 Ｈ７和 Ｈ９ 具有正常的 ＸＸ 核型 正常 ＥＳＣ 染色体正常 如发生异常很 难形成动物个体 ＥＳＣ 在体外分化抑制培养时 呈克隆状生长 细胞紧密地聚集在一起 圆形或卵圆形 细胞均呈单层或多层紧密堆积而形成岛状或巢状的群体细胞克隆 细胞界限不清 克隆周围 有时可见单个 ＥＳＣ 和分化的扁平状上皮细胞 ＥＳＣ 增殖迅速 每１８ ２４ 小时增殖 １ 次 已 证实人 ＥＳＣ 具有较强的端粒酶活性 在体外培养系中连续培养４ ５ 个月而不分化 具有比 一般体细胞更长的寿命和更高的增殖活性 胚胎干细胞为未分化多能性干细胞 它表达早期胚胎细胞 畸胎瘤细胞的表面抗原 但 鼠和人胚胎干细胞表达的表面抗原具有种属差异性 如小鼠内细胞团细胞 胚胎干细胞和畸 胎瘤细胞表达胚胎阶段特异性抗原 １ ｍ １ ＳＳＥＡ １ 但不表 达 ＳＳＥＡ ３或 ＳＳＥＡ ４ Ｔｍ 等人研究表明人胚胎干细胞表达非人灵长类胚胎干细胞和 人畸胎瘤细胞表面那些标志未分化状态的细胞抗原 包括 ＳＳＥＡ ３ ＳＳＥＡ ４ ＴＲＡ １ ６０ ＴＲＡ １ ８１和碱 性 磷 酸 酶 人 胚 胎 干 细 胞 一 直 呈 ＳＳＥＡ ４ 强 阳 性 而 ＳＳＥＡ ３ 为 弱 阳 性 Ｇ 等人从原始生殖细胞分 离 的 胚 胎 干 细 胞 ＳＳＥＡ １ ＳＳＥＡ ３ ＳＳＥＡ ４ ＴＲＡ １ ６０ ＴＲＡ １ ８１均表现为阳性 识别 ＳＳＥＡ ３ 抗原的抗体染色弱且不稳定 Ｔｍ 获得的人胚 胎干 细 胞 表 现 为 ＳＳＥＡ １ 阴 性 而 Ｇ 分 离 的 人 胚 胎 干 细 胞 却 表 现 ＳＳＥＡ １ 阳 性 Ｇ 等人认为 ＳＳＥＡ １阳性可能是源于原始生殖细胞的多能干细胞分化的标志 因为未 分化状态的人胚胎干细胞不表达 ＳＳＥＡ １ 而分化的人胚胎干细胞呈 ＳＳＥＡ １强阳性 二 胚胎干细胞的分化潜能 １ ＥＳＣ 的体外分化潜能 用于 ＥＳＣ 分离的胚胎或 ＰＧＣ 是具有全能性的细胞或细胞团 在体内这些细胞处于快速增殖和有序分化状态 其实质是细胞特异基因在时间和空间上差次 表达的结果 组织细胞间的差异主要取决于哪些基因被激活和在什么时间与位点被激活 因 此 ＥＳＣ 的分离培养首先需要解决的问题是阻止引起分化的基因的激活与表达 以实现分 化抑制 保证细胞的全能性 ＥＳＣ 在体外需在饲养层细胞上培养才能维持其未分化状态 一旦脱离饲养层就自发地进行分化 大鼠肝细胞等条件培养基和细胞分化抑制因子 白血病 抑制 因 子 ｋ ｍ ＤＩＡ ＬＩＦ 的 应 用 可使培养的 ＥＳＣ 处于不分化状态 除去这些分化抑制物 在单层培养时细胞自发分化成多 种细胞 悬浮培养可形成 简单类胚体 进一步培养可形成 囊状胚体 使简单类胚体重 新附着于培养皿上生长 可形成不同种类复杂的细胞分化物 ＥＳＣ在体外某些物质的诱导下可 以发生定向分化 如转化生长因子 ｍ ｗ ＧＦ ＳＣ 发育为 １ Ｔ １ 可诱导 Ｅ β β 血管样结构或骨骼肌和肌管 而二甲亚砜可诱导 ＥＳＣ 向各类肌细胞分化 维甲酸可诱导其向 神经细胞分化 ２ ＥＳＣ 的体内分化潜能 将胚胎干细胞给同源动物皮下注射会形成复杂的混合组织瘤 其细胞组成可代表３个胚层细胞 Ｔｍ 等人将从囊胚分离的５个胚胎干细胞系分别注射 给患严重结合性免疫缺陷的棕色小鼠 每个小鼠都产生胚胎组织瘤 瘤组织包括胃上皮 内

171 ３３０ 细胞生物学 胚层 骨和软骨组织 平滑肌和横纹肌 中胚层 神经表皮 神经节和复层鳞状上皮 外 胚层 证明了人胚胎干细胞系具有分化形成外 中 内三个胚层的潜能 如果直接将分离 的小鼠胚胎干细胞植入子宫内 它们不会发育成个体小鼠 因为没有着床必需的滋养层细 胞 这种条件下 胚胎干细胞被认为是多能的 而不是全能的 尽管如此 如果将胚胎干细 胞植入不能发育成个体的四倍体胚胎中 再将该胚胎植入小鼠子宫中 那么可以获得完全是 由培养的胚胎干细胞产生的正常个体小鼠 这表明了胚胎干细胞具有难以置信的全能性 三 胚胎干细胞生长和分化的内源性调控 干细胞除受微环境影响外 其自身也产生许多调控因子可对外界信号起反应 而调节其 增殖和分化 包括调节细胞不对称分裂的蛋白 控制基因表达以及干细胞和非干细胞后代染 色体修饰的核因子 除此之外 还有 时钟 因子 对干细胞在终末分化之前所进行的分裂 次数进行限定 一 细胞内蛋白的调控 在干细胞的不对称分裂过程中 细胞本身成分的不均等分配和分裂后子代细胞所处的不 同环境 可以造就具有不同发育潜能的分化细胞 细胞的结构蛋白 特别是细胞骨架成分对 细胞的发育非常重要 如在果蝇的外周神经系统中 有一系列基因调控感觉器官前体细胞的 分裂 其中之一是Ｉ Ｉ 蛋白的作用在于可以使与膜相关的决定细胞命运的物质的分布 具有不对称性 比如 Ｎｍ 有丝分裂中的纺锤体和 ｍｒｎａ 的定位等 而Ｉ 蛋白的中心 区域与锚蛋白同源 它对前两者的定位起重要作用 在果蝇卵巢中 调控干细胞不对称分裂 的是一种称为收缩体的细胞器 包含有许多膜骨架蛋白和调节蛋白 如膜收缩蛋白和细胞周 期素 Ａ 收缩体与纺锤体的结合决定了干细胞分裂的部位 从而把维持干细胞性状所必需的 成分保留在子代干细胞中 二 转录因子的调控 在脊椎动物中 转录因子对干细胞分化的调节非常重要 比如在胚胎干细胞的发生中 转录因子 Ｏ ４是必需的 Ｏ ４是一种哺乳动物早期胚胎细胞表达的转录因子 它诱导表达 的靶基因产物是 ＦＧＦ ４等生长因子 能够通过生长因子的旁分泌作用调节干细胞以及周围 滋养层的进一步分化 Ｏ ４缺失突变的胚胎只能发育到囊胚期 其内部细胞不能发育成内 层细胞团 另外白血病抑制因子 ＬＩＦ 对培养的小鼠 ＥＳ 细胞的自我更新有促进作用 而 对人的成体干细胞无作用 说明不同种属间的转录调控是不完全一致的 又如 Ｔ Ｌ 转录 因子家族对上皮干细胞非常重要 Ｔ 是 信号通路的中间介质 当与 Ｌ Ｗ 形成 β 转录复合物后 促使角质细胞转化为多能状态并分化为毛囊 三 时钟 因子 在细胞到达终末分化之前所经历的分裂次数是由 时钟 因子决定的 目前对它的研究主 要集中在细胞周期启动子和抑制子水平上 在新杆状线虫中 Ｃ １可以使细胞周期蛋白 细胞周期素 Ｇ１ 解构 另外 ＣＤＫ 抑制子 ２ ７ Ｋ １的聚集 对于限制大鼠少突胶质细胞的增殖

172 第十四章 干 细 胞 ３３１ 和促进其分化起作用 而端粒的长度是第三种时钟控制机制 它是干细胞不老的原因 四 胚胎干细胞的应用前景及面临的伦理学挑战 １９９８年 美国科学家成功地用人类胚胎干细胞在体外生长和增殖 带动了全世界的干 细胞工程研究热潮 具有多向分化潜能甚至全能性胚胎干细胞系的建立 极大地促进了生命 科学的发展 也为医学上治疗某些顽固性疾病带来了希望 一 胚胎干细胞可用于个体器官克隆 理论上 ＥＳ细胞可以无限传代和增殖而不失去其基因型和表现型 以其作为核供体进 行核移植后 在短期内可获得大量基因型和表现型完全相同的个体 ＥＳ 细胞与胚胎进行嵌 合克隆动物 可解决哺乳动物远缘杂交的困难问题 生产珍贵的动物新种 对于保护珍惜野 生动物有着重要意义 自绵羊 多莉 问世至今 已有多位学者分别报道用体细胞作核供体 进行动物克隆并取得成功 虽然 体细胞克隆动物具有取材简便的特点 但这种方法的研究 才起步 克隆出的动物个体多表现严重的生理或免疫功能上的缺陷 而且多为致命性的 因 此 体细胞克隆目前还不能代替以 ＥＳ细胞克隆动物 由于 ＥＳ细胞具有发育分化为机体中几乎所有类型细胞的潜能 任何涉及丧失正常细胞 的疾病都可以通过移植由胚胎干细胞分化而来的特异组织细胞来治疗 而使得人类 ＥＳ 细胞 的研究具有独特价值 目前 科学家们正试图用自体细胞的核去置换 ＥＳ细胞核 再经定向 诱导分化以克隆出所需要的组织 器官 从而达到替换病变组织和器官之目的 实现真正意 义上的治疗 这就是目前所谓的治疗性克隆 美国威斯康星大学的研究人员于 ２００１ 年 ９ 月 首次将人类胚胎干细胞转化为血细胞 向为医学治疗创造血液供应迈出了重要关键的一步 生 物学和工程学相结合的一项技术 组织工程 其目标是人工培育用于移植的人或动物的组织 和器官 它的主要操作过程之一是在支架上置入种子细胞 而 ＥＳ细胞是最佳的候选者 二 胚胎干细胞是功能基因组学研究的工具 基因 特 别 是 个 体 发 育 相 关 基 因 功 能 的 确 定 依 赖 于 在 整 体 水 平 上 的 基 因 敲 除 ｋ ｋ 或基因敲进 ｋ ｋ 在目前进行的基因敲除或敲进工作中 通常 是应用基因打靶 技术对 ＥＳ 细胞进行遗传学操作来完成 其主要过程是 ① 根据预选靶基因 内源基因 的 ＤＮＡ 序列 构建打靶基因 外源基因 打靶基因包含一 个可选择的标志基因 其两侧序列与内源性基因的相应部位序列同源 ②将外源性打靶基因 导入 ＥＳ细胞 并根据可选择的标志基因进行筛选 使外源性的打靶基因与内源性的靶基因 发生同源重组 获得靶基因被修饰后的 ＥＳ 细胞克隆株 这种修饰后的 ＥＳ 细胞仍保持其多 能性 并能通过生殖系传递 ③应用显微注射技术将靶基因被修饰后的 ＥＳ 细胞注射到胚泡 腔 这些外源性的 ＥＳ细胞将与胚胎的内细胞团协同形成嵌合体小鼠 通过生殖系嵌合体小 鼠的交配繁殖 或获得带有特定修饰基因的纯合型小鼠 根据所获得小鼠的表型变化 即可 确定靶基因的功能 应用以上方法还可以构建携带有目的基因动物 以及人类疾病的研究模 型

173 ３３２ 细胞生物学 三 胚胎干细胞是发育生物学研究的理想体外模型 个体发育归根到底是基因表达与调控的过程 但是 由于哺乳动物的胚胎小 且在子宫 内发育 因此很难在体内连续动态地研究其早期胚胎的形态结构变化和组织细胞分化中的基 因表达调控过程 而 ＥＳ细胞具有多向分化潜能 可在体外操作及无限扩增的特性 因此是 在细胞和分子水平上研究个体发育过程中早期事件的良好材料 四 应用胚胎干细胞指导药物的研制和应用 许多新药在用于人体之前 往往需要先在实验动物身上检测其药效及安全性 尽管这是 药物研制与开发的主要手段 但其并不能准确预测药物对人类的真正影响 毕竟人与动物在 解剖结构 生化反应和生理功能等方面有着很大的差别 因此人类细胞被用于药物的临床前 试验是实验动物的有效补充 而体外培养的普通人类细胞往往失去了其在体内的一些特性 以致难以预测药物最终的体内效应 ＥＳ细胞定向诱导分化形成的细胞能更加准确地模仿体 内细胞 组织和器官对药物的反应 可以提高药物筛查的可信性 尽管人胚胎干细胞有着巨大的医学应用潜力 但是 由于人胚胎干细胞主要来源于流产 的胎儿和体外受精制造的胚胎 围绕该研究的伦理道德问题也随之出现 这些问题主要包括 人胚胎干细胞的来源是否合乎法律与道德 其应用是否会引起伦理及法律问题 有人担心 人胚胎干细胞的研究可能导致人流的泛滥 或导致医生为提供其他病人治疗的需要而刻意收 集破坏未出生胚胎 或利用该项技术进行克隆人的研究 虽然 美国 ＮＩＨ 在国家生物伦理 指导委员会 ＮＢＡＣ 的参与下于１９９９年１２月公布了 关于胚胎干细胞研究的指导原则 许多国家对人胚胎干细胞的研究仍进行程度不同的限制 任何事物都有两面性 人胚胎干细 胞也不例外 但人类一定可以找到恰当的结合点 使人胚胎干细胞的研究造福全人类 第三节 精原干细胞 在哺乳动物的整个生命周期中 生殖细胞维持了种代间的延续性 原始生殖细胞起源于 胚胎外胚层 随着胚胎的发生 原始生殖细胞陆续从尿囊基部沿后肠迁移到双侧生殖腺嵴的 所包围 接着原始生 原始生殖细胞被支持细胞 塞尔托利前体细胞 殖细胞与塞尔托利细胞一起形成实体细胞团 生精索 在发育过程中 生精索逐渐形成腔 隙 最后形成曲精小管 原始生殖细胞包绕在生精索中逐渐分化为生精母细胞 它是精原干细胞 的前体细胞 生精母细胞增殖数天后停止在 Ｇ０ ｍ ｍ Ｇ１ 期 对小鼠而言生精母细胞在个体出生几天后恢复增殖 发育为成体精原干细胞 一 精原细胞的增殖和干细胞的再生 精原细胞紧贴曲精小管基膜 圆形或椭圆形 直径 １２μｍ 核大 除核糖体外 其他细 胞器不发达 精原细胞分 Ａ Ｂ 两型 Ａ 型精原细胞的核常染色质丰富 缺少异染色质 核

174 第十四章 干 细 胞 ３３３ 仁常靠近核膜 根据其在曲精小管基膜上的局部排列特征 Ａ 型精原细胞又可分为 Ａ Ａ Ａ Ａ 及 Ａ Ａ 三型 Ａ 型精原细胞是精子发生的干细胞 也可称为 Ａ 精原干细胞 Ａ 型精原干细胞分裂时 子细胞或者互相分离形成两个干细胞 或者胞质分 裂并不完全而成为以细胞间胞质间桥 ｍ 相连的 Ａ型精原细胞 这种胞质 间桥使来源于同一母细胞的同族细胞连成一个细胞群 产生细胞同步分化的现象 直到精子 形成后才成为独立个体 正常情况下 大约一半的 Ａ 型精原干细胞分裂形成 Ａ型精原细 胞 而另一半精原干细胞则以自我增殖的方式保持干细胞数量 Ａ型精原细胞进一步分裂 形成４个 ８个或１６个 Ａ型精原细胞 Ａ型精原细胞再分裂形成 Ａ１ 型精原细胞 Ａ１ 型精 原细胞经过连续六次分裂 分化形成 Ａ２ Ａ３ Ａ４ 及中间型精原细胞 最终分化为 Ｂ 型精原 细胞 图１４ ４ Ｂ 型精原细胞核中富含异染色质 核仁位于中央 Ｂ 型精原细胞经过数次分 裂后 体积增大 分化为初级 精 母 细 胞 如 上 所 述 Ａ型 精 原 干 细 胞 有 丝 分 裂 形 成 胞 质 间 图１４ ４ 精原干细胞的增殖 引自 凌诒萍

175 ３３４ 细胞生物学 桥相连的 Ａ型精原细胞时 精子形成过程中的第一步发生了 目前还不清楚 Ａ和 Ａ型精 原细胞中胞质间桥是否反映了这些细胞在功能上已经分化 Ａ 型精原干细胞也或多或少遵 循 Ａ和 Ａ型精原细胞的增殖方式 因此 对 Ａ 型精原干细胞 Ａ和 Ａ型精原细胞增殖的 调节很可能是近似的 它们的增殖活性能同时被激活或抑制 精子的形成是一个循环往复的 过程 在小鼠的精子发生过程中 可以观察到 １２ 个阶段 在第七 八阶段 Ａ型精原细胞 分化成 Ａ１ 型精原细胞 标志着精原细胞进入定向分化历程 Ａ１ 型细胞经６次严格控制的分 裂后转为系列分化型精原细胞 最终通过减数分裂形成精子细胞 但分化型精原细胞也可选择 另外一种发育途径 即进行凋亡 二 精原细胞的分化及其控制 Ａ型精原细胞分化成 Ａ１ 型精原细胞是精子生成过程中不可逆的调控点 机体对之有相 当严格的控制 许多因素和机制可导致精原细胞分化停止 如塞尔托利细胞中毒 维生素缺 乏症 辐射损伤 甚至睾丸温度升高等等 目前研究形成了一些动物模型 其精子的发生被 可逆抑制 这为研究精原细胞的分化过程提供了强有力的工具 其中有三个模型精子发生被 抑制 Ａ 型精原细胞不能分化但可增殖 在第一个模型中 连续５周给予大鼠塞尔托利细胞 毒性药物２ ５ 己二酮 ７周后发现 Ａ 型精原细胞已不能分化 在第二个模型中 ＬＢＮＦ１ 大 鼠经 Ｘ 线照射 曲精小管上皮退化 精子发生逐渐衰退 但直到照射约 １５ 周后 积极增殖 的 Ａ 型精原细胞仍存在 令人惊奇的是 在这两种模型中 精原细胞分化障碍都能通过用 促性腺激素释放激素 ｍ ＧＲＨ 的激动剂治疗得以缓解 促 性腺激素释放激素的激动剂的成功治疗表明尽管塞尔托利细胞在两个模型中因细胞毒药物或 照射而受到损伤 但其功能可通过控制激素水平而得以改善 另外通过 ２ ５ 己二酮给药大 鼠模型 发现 Ｋ 受体在精原细胞发育中起重要作用 在胎儿原始生殖细胞迁移中 原始生 殖细胞表达 Ｋ 受体 干细胞因子是 Ｋ 受体的配体 可通过 Ｋ 受体促进细胞增殖 实际 上 精原细胞也能表达 Ｋ 受体 而塞尔托利细胞表达并分泌其配体 干细胞因子 干细 胞因子有可溶的和膜包被的两种形式 啮齿动物出生后不久 精子发育开始即伴随着塞尔托 利细胞由产生可溶性干细胞因子转换至产生膜包被的干细胞因子 这表明膜包被的干细胞因 子对精子发生至关重要 有趣的是 在 ｘ 导致精子发生衰退的大鼠中 塞尔托利 细胞主要产生可溶形式的干细胞因子 而用促性腺激素释放激素激动剂进行治疗 促性腺激 素释放激素能重新刺激精原细胞分化 竟也伴随膜包被干细胞因子表达量的增加 这些结果 有力证实 Ｋ ＳＣＦ 系统在精原细胞分化中的作用 第三个模型是维生素 Ａ 缺乏症模型 发 现缺乏维生素 Ａ 时 大鼠的精原细胞退化 仅存 Ａ 型精原细胞 而且大多 Ａ 型精原细胞是 静息的 明显不能分化的细胞 补充维生素 Ａ 或维甲酸后 分化重新开始 紧接着精子发 生完全恢复 据推测 Ａ 型精原细胞中有维甲酸的核内受体 因此维甲酸直接对 Ａ 型精原细 胞有作用 但是这种作用依赖塞尔托利细胞的存在 三 精原细胞的凋亡 细胞程序性死亡是精子形成过程中必不可少的过程 没有调节机制确保 Ａ 精原干细胞

176 第十四章 干 细 胞 ３３５ 或不分化精原细胞在曲精小管基膜上均一分配 因此 分化型精原细胞在曲精小管不同部位 数目差别很大 但原始生殖母细胞密度变化很少 这是不同部位分化型精原细胞选择性凋亡 的结果 一般来说高密度细胞的分布是导致细胞凋亡的原因之一 一 Ｂ ２家族 Ｂ ２蛋白家族都具有与 Ｂ ２ 同源的 ＢＨ１ 和 ＢＨ２ 区段 其家族成员有的可诱导凋亡 而有的也能阻止细胞凋亡的发生 ＢＨ 区段使 Ｂ ２家族成员互相形成同二聚体或异二聚体 同二聚体或异二聚体间的平衡对决定一个细胞是否进入凋亡途径至关重要 Ｂ ２ 本身在精 原细胞中并不存在 但在 Ｂ ２ 转基因小鼠中 局部高密度精原细胞诱导的凋亡并不会发 生 这说明虽然 Ｂ ２蛋白本身并不参与 但其家族成员控制着精子发生过程 Ｂ Ｘ 编码 了相关因子 在睾丸中 至 少 有 两 种 相 关 变 异 体 表 达 Ｂ Ｘ 和 Ｂ Ｘ Ｂ Ｘ 抑 制 凋 亡 Ｂ Ｘ作用相反 在 Ｂ Ｘ 过度表达的小鼠中 能见到与 Ｂ ２ 过度表达小鼠一致的现象 而且 通过免疫组化试验 发现 Ｂ Ｘ和 Ｂ Ｘ 两者同时或者单独在人睾丸精原细胞中有 高度表达 这都说明 Ｂ Ｘ 在干细胞密度调节中的重要作用 Ｂ ２家族成员 Ｂ ｘ可能是凋亡的诱导剂 Ｂ ｘ 基因剔除小鼠无生育能力 其睾丸组化 特征与 Ｂ ２和 Ｂ Ｘ 转基因小鼠相似 都表现出精原细胞的聚集 这表明 Ｂ ｘ 也是控制 精原细胞凋亡的一个重要因素 可能是 Ｂ Ｘ 和 Ｂ ｘ间表达和作用的平衡控制着精原细胞的 细胞密度相关性凋亡 二 ５３蛋白 与野生型小鼠相比 ５３缺陷型小鼠睾丸中 Ａ１ 精原细胞多 ５０ 这表明要么 ５３ 参与 不分化精原细胞的细胞周期调节 要么在正常情况下可诱导这些细胞凋亡 有趣的是 ５３ 缺陷型小鼠中前细线期精母细胞的数量与野生型小鼠中数目相近 这说明在精原细胞分化水 平上控制细胞密度的机制在 ５３缺陷型小鼠中正常发挥作用 在正常精子形成过程中 精原细胞中检测不到 ５３蛋白 但经４Ｇ Ｘ 线照射后 这些 细胞中出现 ５３的强组化标记 并导致分化型精原细胞的广泛凋亡 这说明分化型精原细胞 中 ５３表达的增加与凋亡的程度呈正相关 经 Ｘ 线照射后 ５３缺陷型小鼠中出现数量很多 的巨精原细胞 这些巨细胞是受到致死性损伤的精原细胞 其 ＤＮＡ 能自我复制但不能再分 裂 很明显也延迟进入凋亡 在野生型小鼠中则很少见到这种巨细胞 可见损伤的精原细胞 经凋亡迅速去除需要 ５３的参与 第四节 成体干细胞 在成体组织或器官中 许多细胞仍具有自我更新及分化产生不同组织的能力 如血液细 胞和皮肤细胞 此外在损伤情况下 肝等组织也表现出明确的补充受损死亡细胞的能力 所 以一直推测在成体中也存在一些具有新旧更替作用的成体干细胞的存在 造血干细胞是最先被认识的成体干细胞 近年来由于细胞生物学和分子生物学的发展

177 ３３６ 细胞生物学 除造血干细胞之外已有多种其他成体组织的干细胞被成功地分离或鉴定 如间充质干细胞 神经干细胞 皮肤干细胞 肠干细胞 肝干细胞等 图 １４ ５ 目前普遍认为成体干细胞是 在成体组织内具有自我更新能力及能分化产生一种或一种以上子代组织细胞的未成熟细胞 本节主要从成体干细胞的形态 生化特性 增殖与分化的调控等角度来说明目前认识较为明 确的几种成体干细胞 图１４ ５ 成体干细胞及其干细胞巢 引自 Ｅ Ｆ 等 Ａ 无发囊表皮 干细胞位于基底层 Ｂ 发囊 干细胞位于膨胀部位 Ｃ 小肠 Ｄ 中枢神经 干 细胞位于室管膜或下脑室区 Ｖ 脑室区 ＳＶＣ 下脑室区 Ｅ 室管膜 ＯＢ 嗅觉球 Ｅ 造血系统 ＨＳＣ 造血干细胞 Ａ 脂肪细胞 Ｍ 巨核细胞 Ｔ Ｌ Ｔ 淋巴细胞 Ｂ Ｌ Ｂ淋巴细胞 Ｂ 嗜碱性粒细胞 Ｅ 嗜酸性粒细胞 Ｎ 中性粒细胞 Ｅ 红细胞 Ｓ 基质细胞 Ｖ 静脉 Ａ 动脉 一 造血干细胞 目前已经证实骨髓中存在三种干细胞 造血干细胞 ｍ ｍ ＨＳＣ 是体内各种血细胞的唯一来源 基质干细胞 ｍ ｍ 可分化产生骨 软骨 脂 肪 纤维结缔组织与支持血细胞的网状组织 间充质干细胞也分化构成上述组织 最近从 血循环中分离出一种祖细胞 能分化为分布于血管的内皮细胞 推测为内 皮祖细胞 并证实其来源于骨髓 图１４ ６ 造血干细胞是指存在于造血组织内的一类能分化生成各种血细胞的原始细胞 又称多能 造血干细胞 ｍ ｍ ｍ 它主要存在于骨髓 外周血及脐带血 中 １９６１年 Ｔ 和 ＭＣ 首次通过小鼠脾集落形成实验证实了造血干细胞在成体内的存 在 他们将一定量的小鼠骨髓细胞悬液静脉注射给受致死剂量 Ｘ 射线照射的小鼠 ７ １０ 天 后受体小鼠由于重新获得造血能力而免于死亡 此时可在小鼠脾脏中观察到白色的小结节状

178 第十四章 干 细 胞 ３３７ 造血灶 每个造血灶被称为一个 脾集落形成单位 ｍ ＣＦＵ Ｓ ＣＦＵ Ｓ的数量与输入有核细胞数成正比 每输入大约 １０４ 个细胞便可在脾脏形成 １ 个 ＣＦＵ Ｓ 该 ＣＦＵ Ｓ可分化发育为红细胞 粒细胞及巨核细胞 目前认为 造血干细胞在一定微环 境和某些因素的调节下 增殖分化为多能淋巴细胞 ｍ 和多 ｍ 能髓性造血干细胞 ｍ ｍ ＰＭＳＣ 前者可进一步分化 发育成功 能性淋巴细胞 后者则首先发育成粒细胞巨噬细胞系 红细胞系及巨核细胞系等造血祖细胞 ｍ 然后再进一步分化为白细胞 红细胞和血小板 图１４ ６ 造血干细胞与基质干细胞及其分化 在哺乳动物发育过程中 血细胞首先出现在卵黄囊 称为胚胎有核红细胞 ｍ 随着胚胎发育 这些中胚层衍生而来的前体细胞迁移进入造血环境 大动脉 性腺嵴和中期肾 ｍ ＡＧＭ 区 研究发现血管内皮生长因子 ＶＥＧＦ 及其酪氨酸激酶受体ＦＩＫ 信号转导途径对胚胎血细胞和内皮前体细胞迁移进入 ＡＧＭ 必不 可少 随着发育进程 造血干细胞进一步的迁移进胎肝 在胎肝滞留时 一些造血干细胞分 化产生功能定向的前体细胞 这些前体细胞可产生髓系和淋巴系细胞 在出生前 造血干细 胞又移位至骨髓并在那里保留至整个生命过程 造血干细胞是第一种被认识的组织特异性干细胞 目前对造血干细胞的形态仍无定论 一般认为类似于小淋巴细胞 目前主要通过表面标志来分离纯化造血干细胞 人造血干细胞 表面 标 志 包 括 ＣＤ３４ ＣＤ３８ Ｌ ＨＬＡＤＲ Ｔ Ｋ ＣＤ４５ＲＡ 和 ＣＤ７１ 等 其中 ＣＤ３４ 是临床上应用最多的造血干细胞标志物 人出生后造血组织中有 ０ １ ０ ５ 的 ＣＤ３４ 细胞表达 ＫＤＲ ｋ ｍ 即血管内皮生长因子受体 等 用 分 别 来 源 于 骨 髓 外 周 血 脐 带 血 的 ＣＤ３４ ＣＤ３４ ＫＤＲ 和 ＶＥＧＦＲ２ Ｚ

179 ３３８ 细胞生物学 ＣＤ３４ ＫＤＲ 细胞植入经致死剂量照射的小鼠 发现 ＣＤ３４ ＫＤＲ 细胞均能成功植入 而 ＣＤ３４ ＫＤＲ 细胞不能植入 受体鼠死亡 随后一系列的相关移植实验显示 造血干细胞 存在于 ＣＤ３４ ＫＤＲ 亚群 而造血祖细胞存在于 ＣＤ３４ ＫＤＲ 亚群 分化程度介于这两者 之间的细胞则同时存在于这两种亚群中 因而 ＫＤＲ 可将干 祖细胞区别开来 骨髓微环境中的一些蛋白分子对造血干细胞的移行 增殖和分化起了调控作用 如可溶 性和膜包被的干细胞因子 干细胞因子可与干细胞表面的 Ｋ 受体作用 参与维持干细胞数 目的恒定 虽然干细胞因子或 Ｋ 的遗传缺失不影响原始造血发生 但它们能引起严重的 在胎肝期以后 造血调控失调 另外也发现成纤维细胞生长因子 １ ｗ １ ＦＧＦ １ ＦＧＦ ２ ＳＤＦ １ α ｍｋ ｍ １ 和胞外基质都能与造 血干细胞表面的相关受体作用而影响造血干细胞的移行 数目维持和分化 在所有干细胞系 统中 对造血干细胞增殖与分化分子途径的研究最为深入 尽管有大量的问题有待阐明 但 是目前许多参与造血干细胞增殖与分化的细胞因子 转录因子已被发现 Ｇ 及其同事对 此进行了开创性的工作 研究发现使造血干细胞表达锌指蛋白转录因子 ＧＡＴＡ １ 可使其分 化为红细胞 嗜 酸 细 胞 和 巨 核 细 胞 ｍ ｋ 与 此 相 似 如使髓系细胞表达 ＧＡＴＡ １ 或 ＧＡＴＡ ２ ＧＡＴＡ ３ 也可令其转变为巨核细胞 此外 表达转录因子 ＰＵ１也可使造血干细胞向髓系细胞方向分化 另外转录因子的浓度也对造血 干细胞的分化有影响 如造血干细胞低水平表达 ＧＡＴＡ １ 时分化为嗜酸细胞 而高水平表 达 ＧＡＴＡ １则会分化为红细胞和巨核细胞 在活体小鼠中 如使其造血干细胞 ＧＡＴＡ １的 表达量下降 大约 ３ 倍 则会阻碍红细胞前体的成熟 最近的研究还发现高水平的表达 ＰＵ１有利于巨噬细胞的形成 而 ＰＵ１有利于 Ｂ 淋巴细胞形成 造血系统是体内高度活跃和高度新陈代谢系统 造血干细胞的基本特征是具有自我维持 和自我更新 即干细胞通过不对称性的有丝分裂 在不断产生大量祖细胞的同时 使自己不 增殖也不分化 而造血祖细胞进一步的增殖与分化是补充和维持人体外周血细胞的基础 由 造血干细胞到祖细胞再到外周血细胞的这种分化调节过程相当复杂 依赖于各种造血生长因 子 造血基质细胞 细胞外基质等多种因素的相互作用与平衡 并涉及细胞的增殖分化 发 育成熟 迁移定居 衰老凋亡和癌变等生命科学中的许多基本问题 这也是基础研究的主要 热点 二 间充质干细胞 传统的科学观点认为 骨髓只有一项功能 替换血液中的红细胞和白细胞 间质细胞 被认为仅仅是支持血细胞的产生 而在过去几年内 人们才明确地意识到骨髓间质细胞是成 体干细胞 研究发现 在人类 鸟类 啮齿类等生物的骨髓中 可分离出一种骨髓间充质干 细胞 Ｍ ｍ ｍ ＭＳＣ 其形成于发育中的骨髓腔 ｍ ｗ 个体出 生后 间充质干细胞附于骨髓窦的内腔面 形成一种包埋于窦状网络中的三维细胞网络 间 充质干细胞在尚未建立造血功能的骨髓中 分裂旺盛 类似前成骨细胞 在 具有造血功能的骨髓中 间充质干细胞是静止的 但是仍然高水平表达成骨细胞的特征性标 记碱性磷酸酯酶

180 第十四章 干 细 胞 ３３９ 人的间充质干细胞属于专能性干细胞 可以像未分化细胞那样进行体外扩增 也可以分 化为间充质类细胞 对骨髓抽提物采用密度梯度离心的分离方法 分出处于１ ０７３ ｍ密度 界面上的细胞 占细胞总数的０ １ ０ ０１ 进行平皿接种 细胞贴壁生长 类似成纤维 样细胞 通过换培养基的方式除去悬浮生长细胞 如造血干细胞 可获得纯度 ９５ ９８ 的间充质干细胞 通过流 式 细 胞 仪 分 析 间 充 质 干 细 胞 特 异 性 表 面 抗 原 有 ＳＨ２ ＳＨ３ ＣＤ２９ ＣＤ４４ ＣＤ７１ ＣＤ９０ ＣＤ１０６ ＣＤ１２０ ＣＤ１２４ 等 但是与造血干细胞不同 间充 质干细胞不表达 ＣＤ４５ ＣＤ３４ ＣＤ４１ ＣＤ１４等表面抗原 分离获得的间充质干细胞在体外 成单层生长 并有稳定核型 ＭＳＣ 具有干细胞的共性 即自我更新及多向分化的能力 一般认为 ＭＳＣ 只存在于骨髓 中 但最近的研究发现从人的骨骼肌中也分离出了 ＭＳＣ 也有人分别从骨外膜和骨小梁分 离出 ＭＳＣ 间充质干细胞可分化为多种间充质组织 如骨 关节 脂肪 肌腱 肌肉及骨 髓基质等 从人骨髓中获得的间充质干细胞体外可专一性的诱导分化为脂肪细胞 软骨细胞 和成骨 细 胞 在 含 有 １ 甲 基 ３ 异 丁 基 黄 嘌 呤 地 塞 米 松 吲 哚 美 辛 的 培 养 基 中 培 养 时 ９５ 的间充质干细胞会分化为胞内富含脂滴的细胞 并表达过氧化物酶体增殖激活受体 λ２ ｘ ｍ λ２ ＰＰＡＲλ２ 脂蛋白脂肪酶 ＬＰＬ 和脂肪 酸 结 合 蛋 白 等 脂 肪 细 胞 特 异 标 志 间 充 质 干 细 胞 在 含 转 化 生 长 因 子 β ３ ｍ ｗ β ３ ＴＧＦβ ３ 的无血清培养基中生长 １０ １４ 天后 用 ４ ６单 抗检测发现有Ⅱ型胶原蛋白表达 并且在 １０ ２１ 天内 表达量逐渐上升 表明已被诱导为 软骨细胞 在含地塞米松 β 磷酸甘油 Ｖ和含有 １０ ＦＢＳ 的培养基中培养时 间充质干 细胞开始聚集 碱性磷酸酯酶的活性增高４ １０倍 １周后细胞内钙的积累持续增加 表明 已被诱导为成骨细胞 由单个间充质干细胞扩增获得的克隆有与之相同的分化潜能 由于间充质干细胞具有向骨 软骨 脂肪 肌肉及肌腱等组织分化的潜能 因而利用它 进行组织工程学研究有如下优势 ① 取材方便且对机体无害 间充质干细胞可取自自体骨 髓 简单的骨髓穿刺即可获得 ②由于间充质干细胞取自自体 由它诱导而来的组织在进行 移植时不存在组织配型及免疫排斥问题 ③由间充质干细胞分化的组织类型广泛 理论上能 分化为所有的间质组织类型 将它分化为骨 软骨或肌肉 肌腱 在治疗创伤性疾病中具有 应用价值 将它分化为心肌组织 则有可能构建人工心脏 将它分化为真皮组织 则在烧伤 中有不可限量的应用前景 地塞米松是 ＭＳＣ 分化的非特异诱导剂 它可使 ＭＣＳ 分化成骨 及脂肪细胞 而两性霉素 Ｂ 则可使 ＭＳＣ 分化为肌细胞 ＭＳＣ 起源于中胚层 理论上讲 它 应可以向其他中胚层组织分化 如真皮 结缔组织及上皮等 尤其是真皮 如能诱导成功 则在烧伤的治疗中有不可低估的作用 三 神经干细胞 传统观点认为 哺乳动物和人中枢神经系统的神经元在出生后不久就丧失其再生能力 成人脑细胞一经损伤就不能再生 然而近来的一些研究证明 在成体中枢神经系统中仍然存 在一些可分裂细胞 这些细胞具有自我更新及分化形成神经元 星形胶质细胞和少突胶质细 胞等成熟细胞的能力 因而被称为神经干细胞

181 ３４０ 细胞生物学 实验表明 哺乳动物脑中侧脑室的室管膜下区包括室管膜的细胞中 存在着有增殖能力 的神经细胞 用免疫荧光标记这些细胞 在活体中可清晰地看到增殖的细胞从脑室迁移到嗅 球 的轨迹 这有力地证明了在成体哺乳动物中有可增殖的神经干细胞存 在 １９９２年 Ｒ 和 Ｗ 首先在成体小鼠的脑旁侧室膜下的神经组织中分离和培养了神 经干细胞 １９９８年 Ｓ 等用相同的方法从人的胚胎中分离出神经干细胞 神经干细胞 在表皮生长因子 ｍ ｗ ＥＧＦ 的作用下不断分裂 如果每周传代一次 可以维持一年以上 研究发现 神经干细胞表达的一种中间丝状蛋白 巢素蛋白 是干细胞的特 征性生化标记 该蛋白属于第Ⅳ类中间丝 它的表达起始于神经胚形成期 当神经细胞的迁 移基本完成后 巢素蛋白的表达量开始下降 并随神经细胞分化的完成而停止表达 免疫组 化证实所有神经干细胞巢素蛋白均呈阳性 在神经干细胞培养过程中 如果以小牛血清代替 表皮生长因子 神经干细胞可进一少分化为星形胶质细胞 少突状细胞和神经元 巢素蛋白 的表达逐渐减少 而出现神经元特征性的微管结合蛋白 ２ 及胶质细胞的特征性神经胶质原 纤维酸性蛋白 ＧＦＡＰ 表皮生长因子并不是维持神经干细胞 的唯一因子 成纤维细胞生长因子 ２ 能直接刺激神经干细胞的增殖与分化 胎鼠的海马 脊髓及嗅球组织在成纤维细胞生长因子 ２的作用下 均能够诱导产生多潜能的神经干细胞 目前关于表皮生长因子 成纤维细胞生长因子 ２ 对神经干细胞的存活 增殖与分化的作用 机制尚未明了 初步的研究结果表明单独用表皮生长因子可使干细胞表达巢素蛋白的时间延 长 而单独用成纤维细胞生长因子 ２ 可增加微管结合蛋白 ２ 阳性细胞数量 因此推断表皮 生长因子主要作用是维持神经干细胞的生存 而成纤维细胞生长因子 ２ 对神经干细胞的分 化起着重要的作用 研究人员常用表皮生长因子 成纤维细胞生长因子 ２ 受体及巢素蛋白 等细胞标志从各种中枢神经区域 如下脑室区 嗅球和海马中分离成体神经干细胞 理论上讲 任何一种中枢神经系统疾病都可归结为神经干细胞功能的紊乱 脑和脊髓由 于血脑屏障的存在使之在干细胞移植到中枢神经系统后不会产生免疫排斥反应 如给帕金森 氏综合征患者的脑内移植含有多巴胺生成细胞的神经干细胞 可治愈部分患者症状 四 表皮干细胞 在整个生命过程中 皮肤是再生能力较强的组织 表皮细胞和毛囊不断进行着更新 如 人表皮细胞每两周替换一次 另外机体体表的不断扩增也需表皮细胞和毛囊不断的分化和增 殖 研究发现 在毛囊隆突部 即皮脂腺开口与立毛肌毛囊附着处之间的毛囊外鞘中含有丰 富的表皮干细胞 ｍ ｍ 在没有毛发的部位如手掌 脚掌 表皮干细胞位于 与真皮乳头顶部相连的基底层 而其他有毛发的皮肤 表皮干细胞则位于表皮的基底层 表 皮干细胞能持续增殖分化以取代表层终末分化细胞 从而完成皮肤组织结构的更新 在表皮 基底层中有１ １０ 的基底细胞为表皮干细胞 随着年龄的增大 表皮干细胞的数量也随 之减少 这也是小儿的创伤愈合能力较成人强的原因之一 毛囊是由一外根鞘 ＯＲＳ 内根鞘 ＩＲＳ 和发干组成 产生内根鞘和发干的活跃分 裂细胞称为基质细胞 基质细胞是存在于毛囊球中的一群可分裂的上皮细胞 毛囊球中还包

182 第十四章 干 细 胞 ３４１ 括一团特化的间充质细胞称为毛乳头 在成熟毛囊中 当基质细胞耗尽其增殖潜能后 毛囊 退化 并拉动毛乳头细胞团到毛囊的膨胀部位 此膨胀部位实际上是毛囊干细胞存在的部 位 受到来自毛乳头细胞信号刺激后 在膨胀部位的干细胞增殖产生新的毛囊 这些干细胞 同样可以产生表皮 尤其在外伤或烧伤后能重建表皮及毛发 脉冲标记试验表明膨胀部位的 细胞有较长的细胞周期 体外培养膨胀部位细胞可以很好地长出毛囊角质细胞 当膨胀部位 细胞与毛乳头细胞混合培养时可形成能存活的毛囊 这些证据进一步地支持膨胀部位是干细 胞巢的观点 表皮干细胞是具有自我更新能力 能产生至少一种以上高度分化子代细胞潜能的细胞 从发生机制来看 表皮干细胞并不直接分化产生终末分化细胞 而是先分化成过渡放大细胞 ｍ 短暂扩充细胞有定向分化为某种终末分化细胞的能力 可以是定 向祖细胞 短暂扩充细胞经过几次到十几次不等的分裂后形成有丝分裂后细胞 ｍ ｍ 及终末分化细胞 角蛋白 ｋ 是表皮细胞的结构蛋白 它们构成直径为 １０μｍ 的微丝 在细胞内形 成广泛的网状结构 随着分化程度的不同 表皮细胞表达不同的角蛋白 因而角蛋白也可作 为干细胞 定向 祖 细 胞 分 化 细 胞 的 鉴 别 标 志 表 皮 干 细 胞 表 达 角 蛋 白 １９ Ｋ １９ Ｋ１９ 定向祖细胞表达角蛋白５和１４ Ｋ５ Ｋ１４ 而分化的终末细胞则表达角蛋白１和１０ Ｋ１ Ｋ１０ 表皮干细胞最显著的两个特征是慢周期性 ｗ 与自我更新能力 慢周期性在 体内表现为标记滞留细胞 即在新生动物细胞分裂活跃时掺入氚标记的 胸苷 由于干细胞分裂缓慢 因而可长期探测到放射活性 表皮干细胞的自我更新能力表现 为离体培养时细胞成克隆性生长 如连续传代培养 细胞可进行 １４０ 次分裂 能产生 １ １０４０个子代细胞 此外 表皮干细胞还有一个显著特点就是对基底膜的粘附性 其主要通过 表达整合素实现对基底膜各种成分的粘附 整合素由１个α亚基和１个β亚基组成 其中由 １亚基组成的整合素在表皮干细胞与基底膜的粘附中起重要作用 各种整合素作为受体分 β 子与基底膜中相应配体结合 如与层粘连蛋白结合的整合素有 α １β １ α ２β １ α ３β １及α ６β ４ 与纤维粘连蛋白结合的整合素有 α ３β １ 与胶原结合的整合素有 α ３β １ 干细胞对基底膜的粘 附是干细胞维持其特性的基本条件 干细胞对基底膜的脱粘附是诱导干细胞脱离干细胞群落 进入分化周期的重要调控机制之一 目前 体外分离 纯化表皮干细胞也是利用干细胞对细 胞外基质的粘附性进行的 近来的研究发现 Ｗ 及其相关信号也参与皮肤干细胞的分化调节 Ｗ 信号导致 β 连 环蛋白的积累 β 连环蛋白在正常状况下与 Ｅ 钙粘蛋白相互作用而促进细胞的粘附 当β 连 环蛋白的快速更新被 Ｗ 信号阻断时 过量的β 连环蛋白可与 Ｌ Ｔ 家族的 ＤＮＡ 结合蛋 白 Ｔ ３结合 形成的复合物可激活下游基因的转录 包括 ｍ 和细胞周期蛋白 Ｄ１ 表皮 干细胞脱离干细胞群进入已分化阶段的一个重要表现 是通过 ｍ 蛋白诱导并伴随表面整 合素水平的下降以及细胞从基底膜脱粘附而实现的 因此β 连环蛋白是弱化干细胞在巢中附 着 并激活干细胞增殖分化的关键因子 然而这一过程的精确分子机制和外源信号对这一过 程的调节是相当复杂的 还有许多机制也是未知的

183 ３４２ 细胞生物学 五 肠干细胞 肠表面由被肠腺围绕并根植于肠壁的绒毛组成 每一肠腺大约有２５０个细胞 实验证明 这些细胞中有起再生作用的干细胞存在 因为把肠腺细胞注射入小鼠体内后 在受体鼠的肠 部位可发现其中有些移植细胞能分化发育成肠绒毛细胞 进一步的实验发现这些细胞位于肠 腺基部或近基部 为保持肠腺的自体稳定性 这些增殖缓慢的肠干细胞可以很快地转变为过 渡放大细胞 移向肠腺中部并分化为肠上皮吸收细胞 杯细胞和肠内分泌细胞 这些分化细 胞最终死亡脱落入肠腔内 肠干细胞还可以向肠腺基部分化产生潘氏细胞 尽管肠干细胞的位置已很明确 但是肠干细胞的体外培养至今未获成功 目前对肠干细 胞的认 识 主 要 来 自 对 肠 道 肿 瘤 发 生 发 展 的 研 究 家 族 性 肠 息 肉 腺 癌 ｍ ｍ 连环蛋白作用并 是由于结肠腺癌性息肉病基因 ＡＰＣ 缺陷所所致 ＡＰＣ 可与β 加速其降解 而β 连环蛋白可与 Ｌ Ｔ 家族成员结合 Ｔ ４ 从而启动基因的转录 包括 ｍ 和细胞周期蛋白 Ｄ１ 促进细胞的增殖 功能研究表明 Ｔ ４ 缺失小肠腺干细胞发育有缺 陷 这与无翼脊椎动物癌基因蛋白配对物 Ｗ 信号途径对皮肤细胞的调控十分相似 进一 步证实了 Ｌ Ｔ 在促进干细胞增殖 弱化干细胞在巢中附着方面的重要功能 肠 β 腺干细胞也表达中间纤维 Ｋ８ Ｋ１８和 Ｋ１９ Ｋ８缺乏的小鼠可观察到大肠增生现象 表明角 蛋白表达水平的改变可影响肠干细胞的增殖和迁移功能 小鼠肠中 Ｅ 钙粘连蛋白的高表达 可抑制肠腺的增殖并诱导凋亡 表明细胞间粘附也涉及对肠腺自身稳定的调控 此外 整合 素及其胞间基质配体对肠腺干细胞数目地维持也十分重要 研究发现 参与肠干细胞和皮肤 干细胞调控的机制有许多相似之处 但是细胞凋亡对肠干细胞似乎有更为重要的调控作用 六 肝干细胞 自从 Ｋ 于１９３７年首次提出肝中存在可分化为肝细胞的干细胞样细胞后 肝干细 胞 的存在就一直处于广大研究者的关注和争论之中 新近由于从啮齿类 ｍ 动物肝脏研究中得到了确切的证据 以及人类肝脏疾病发病的细胞生物学机制研究的进展 才肯定了肝干细胞的存在 目前肝干细胞在肝脏内的精确定位尚不完全明确 一般认为 肝 干细胞为肝内胆管系统源性的多潜能分化细胞群 它既可向胆管细胞分化 又可向肝细胞分 化 到今尚无法从形态上来识别肝干细胞 而且缺乏特异性标志 目前根据形态命名的两种 细胞据认为与肝干细胞有着密切的关系 一种是卵圆细胞 它因形态小 胞浆 少 胞核呈卵圆形而得名 有研究表明 胆管周围细胞 小胆管细胞 过渡细胞 等 在某些特定的环境下均可分化为卵圆细胞当肝脏暴露于肝毒剂或致癌剂而受到严重的损伤时 可观察到这些细胞 有人认为这是处于休眠状态下的肝干细胞被激活的结果 目前已在人的 肝胚细胞瘤 肝细胞瘤及硬化肝中发现了卵圆细胞 另一种是从大鼠肝脏中分离到的 小肝 细胞 ｍ 这些细胞无极化和增生现象 具有高密度的核 缺乏任何分化标 志 而大量的形态学研究也有力地证明了病人的肝中存在着 小肝细胞 这些资料提示 肝内干细胞可能位于肝内胆管系统 并呈多潜能性

184 第十五章 细 胞 工 程 ３４３ 第十五章 细胞工程 细胞工程 是应用细胞生物学和分子生物学方法 在细胞水平上进行 遗传操作 改变细胞的遗传特性和生物学特性 以获得具有特定生物学特性的细胞和生物个 体的技术 动物细胞工程在细胞培养 细胞融合和细胞拆合技术基础上发展起来的 随着基 因工程技术 基因转移技术和干细胞工程技术的出现 动物细胞工程在理论和应用两方面获 得了快速发展 第一节 细 胞 融 合 细胞融合 是两种不同类型的细胞发生融合产生一个杂种细胞的现象 早 在２０世纪６０年代法国科学家 Ｂ ｋ 发现将两种不同的细胞混合培养于同一个培养皿中 出 现两种不同类型的细胞发生融合产生一个杂种细胞的现象 日本科学家冈田善雄随后发现将 灭活的仙台病毒加入艾氏腹水瘤细胞中时 出现了腹水瘤细胞的相互融合 所以在自然生长 情况下 或在其他人为添加因素存在下 同种细胞之间或不同种类细胞之间可相互融合 产 生含有两个或几个不同的细胞核的异核体细胞 异核体细胞在分裂增殖过程中 可能将来源 于不同细胞核的染色体结合到同一个核内 结果形成一个合核体的杂种细胞 随着对细胞融 合技术研究的发展 细胞融合已能产生出动植物种内 种间 属间 科间甚至动植物之间的 杂种细胞 为生物学遗传 变异 进化 发育等基础研究和在医学 农业应用开辟了一条细 胞工程技术的新途径 一 细胞融合技术 细胞在生长过程中 可能发生自发的融合 但几率很低 细胞融合技术在文献中记载的 方法有许多种 应用的融合剂 融合的温度 细胞混合的比例等方面都可能有所不同 但总 的来说现在大家所采用的方法比较一致 在融合剂作用下融合过程通常只要几分钟就完成 了 在多种生物 化学或物理因素刺激 诱导下细胞间的相互融合被大大促进 具有促进细胞融合作用的生物制剂主要是病毒类融合剂 其中以副粘液病毒中的仙台病 毒为最有效的副粘液病毒 也可使用天花病毒 疱疹病毒等 灭活的病毒已失去感染性 但 病毒外膜蛋白具有神经氨酸酶活性和细胞凝聚作用 能和细胞表面膜蛋白作用 促使细胞相 互凝集 诱导细胞膜蛋白质分子和脂类分子重排 导致质膜开放 发生相互凝集的两个或多 个细胞的融合

185 ３４４ 细胞生物学 病毒融合剂所产生的细胞融合率较低 而利用化学融合剂则具有易于定量操作 重复性 好和细胞融合率高的优点 化学融合剂包括聚乙二醇 ＰＥＧ 聚乙烯 醇 磷脂酰丝氨酸 磷脂酰胆碱 溶血卵磷脂及油酸等 其中 ＰＥＧ 的使用最为广泛和有效 ＰＥＧ 具有很强的吸水作用 ＰＥＧ 作用于细胞会造成细胞不同程度的脱水 改变细胞膜的结 构和表面 电 荷 特 性 造 成 细 胞 间 凝 集 和 细 胞 间 的 融 合 对 大 多 数 细 胞 来 说 ４０ 的 ＰＥＧ４０００能够满足诱导细胞融合的效果 其过程大体如下 将免疫脾细胞和小鼠骨髓瘤细 胞以１ ２ １ １０的比例混匀 置于５０ｍ尖底离心管内 溶液中不含血清 １２００ 转 分离心 ７ １０分钟 尽量吸净上清液 以免残液稀释 ＰＥＧ 而降低细胞融合率 用手指轻弹管壁 使管底沉淀的细胞铺成薄层 在室温条件下轻轻振摇离心管 同时在 ６０ 秒内滴加入 ５０ 的 ＰＥＧ０ ５ｍ Ｈ８ ０ ８ ２ 有人将 ＰＥＧ 滴管直接插入管底细胞沉淀 边滴边搅拌也可 随 后静置９０ 秒 再于５分钟内边振摇边逐滴加入 ５ １０ｍ不含血清的培养液或盐水缓冲液 以终止 ＰＥＧ 的作用 再静置１０分钟 并用滴管轻轻吹打数次 使细胞团块分散后 加入下 面要提到的选择培养液 稀释至骨髓瘤细胞数不超过 ２ １０５ ｍ 即可加入 ９６ 孔培养板内 每孔０ １ｍ 该孔已含有 ０ １ｍ饲养细胞 约为 １ １０４ 个腹腔细胞 这样每孔总量为 ０ ２ｍ 如果采用２４孔板 每孔总量为仍为０ ２ｍ 比例一样 利用物理因素诱导细胞融合的技术主要是电激 方法 应用微电极在细 胞培养液的两端产生一个交流电场 给细胞一个瞬时电脉冲 使细胞表面发生不同程度的电 击穿 从而导致相邻的被电击穿的细胞发生细胞的融合 电激融合技术要根据不同细胞的性 质选择合适的电压 电流和电激时间的条件 达到最佳融合效果 一般说 电激融合具有融 合率高的突出优点 融合率可达８０ 以上 在组织培养中 单个或少数分散的细胞不易生长繁殖 若加入其他细胞可促进生长 这 种加入的细胞称为饲养细胞 在杂交瘤制作和杂交瘤细胞培养中 常用饲养细 胞以促进杂交细胞生长 在杂交瘤制作中 常用的饲养细胞为小鼠腹腔渗出细胞 但也有用 胸腺细胞和脾细胞的 一般一只小鼠可获 ３ ５ １０６ 个腹腔细胞 二 融合细胞的筛选 选择的原理 在融合过程中实际上两种细胞相互融合的融合率是很低的 约为１ １ ０ ４ 为了将杂交瘤从浆细胞瘤或其他作亲本的淋巴瘤系细胞分离出来 一定要设计一种方法能杀 死非融合细胞 否则它们能在体外持续增殖 最终将会超过培养体系中少数的杂交细胞 因 此 在进行细胞融合反应和适当时间的培养后 需要通过一定方法对两种亲本细胞融合产生 的具有增殖能力的杂种细胞进行筛选 筛选方法主要包括药物抗性筛选 营养缺陷筛选和温 度敏感性筛选三种 一 由抗药性细胞组成的杂种细胞的筛选 最常用的方法是建立一种浆细胞瘤突变株 它们缺乏将嘌呤和嘧啶掺入到 ＤＮＡ 和 ＲＮＡ 中的酶 将 骨 髓 瘤 细 胞 培 养 在 某 种 毒 性 的 碱 基 类 似 物 的 培 养 液 中 选 择 ＴＫ 酶 缺 损 或 ＨＧＰＲＴ 酶缺损的浆细胞瘤并培养成克隆 一旦这样的突变系建立 就可以迫使它们使用

186 第十五章 细 胞 工 程 ３４５ ＤＮＡ 合成的应急途径 细胞为合成 ＤＮＡ 所需要的嘌呤和嘧啶可由两条途径获得 一条为主要途径 即从磷酸 核糖 焦 磷 酸 ＰＲＰＰ 和 谷 氨 酰 胺 合 成 肌 苷 酸 ＩＭＰ 进 而 转 变 为 脱 氧 鸟 苷 三 磷 酸 ＧＴＰ 及从脱氧尿苷酸 ＵＭＰ 合成脱氧胸苷酸 ＴＭＰ 再转变为脱氧胸苷三磷酸 ＴＴＰ 这一合成途径 可被叶酸类似物氨基蝶呤所阻断 如果这一条途径被阻断时可应 用另一条应 急 途 径 利 用 次 黄 嘌 呤 Ｌ ｘ Ｈ 通 过 次 黄 嘌 呤 磷 酸 核 糖 转 移 酶 ＨＧＰＲＴ 催化产生肌苷酸 ＩＭＰ 并利用胸腺嘧啶核苷 ｍ Ｔ 通过胸腺嘧啶 核苷激酶 ＴＫ 催化产生脱氧核苷酸来合成 ＤＮＡ 在细胞融合形成杂交瘤之后 细胞培养在选择培养基中 常用的是 ＨＡＴ 选择培养基 含有次黄嘌呤 Ｈ 氨基蝶呤 Ａ 和胸腺嘧啶 Ｔ 氨基蝶呤是一种叶酸的类似物 能 阻断从头合成 ＤＮＡ 的正常途径 在这种含有氨基蝶呤的 ＨＡＴ 培养基中 融合反应后的细 胞只能使用应急途径合成 ＤＮＡ 因此只有具有次黄嘌呤磷酸核糖转移酶 ＨＧＰＲＴ 和胸腺 嘧啶核苷激酶 ＴＫ 的细胞能在这种培养基中生长 ＴＫ 酶或 ＨＧＰＲＴ 酶缺损的骨髓瘤突变 株细胞可以在正常培养液中生长 但不能在 ＨＡＴ 培养液中生长 因为其从头合成途径被 Ａ 所阻断 而应急途径的酶又是缺损的 但正常的淋巴细胞却有一整套应急途径的酶 可在 ＨＡＴ 培养液中生长 当它们和 ＨＧＰＲＴ 或 ＴＫ 酶缺损的浆细胞瘤细胞融合时 能使杂交细 胞产生足够的 ＨＧＰＲＴ 或 ＴＫ 酶 使融合细胞能在含次黄嘌呤和胸腺嘧啶的 ＨＡＴ 培养液中 生存 未融合的浆细胞瘤细胞这两种酶缺陷型系 将在选择培养基中死亡 未融合的正常 Ｂ 细胞在体外只能短期生存约１０ １４天 由于不能增殖最终也是死亡 因而只有融合的杂交 瘤细胞才能存活下去 得以继续生长 二 由营养缺陷变异型细胞组成的杂种细胞的选择 营养缺陷型是指在一些营养物 如氨基酸 碳水化合物 嘌呤 嘧啶或其他代谢产物 的合成能力上出现缺陷 而难以在缺失这些营养物的培养基中存活的变异型细胞 但可按反 选择分离法 在缺失培养基中加入氨甲蝶呤除掉生长中的原养型细胞之后 再补入所需营养 物使其增殖 或 利 用 分 裂 细 胞 具 有 掺 入 ５ 溴 脱 氧 尿 嘧 啶 核 苷 ＢＵＲ 的 能 力 在 含 有 ＢＵＲ 的缺失培养基中 使迅速增殖的原养型细胞因掺入 ＤＮＡ 的 ＢＵＲ 具有光敏性而被光 照杀死后 再移入含有所需营养物的完全培养基 使其长成克隆 由不同营养缺陷变异型细胞生成的杂种细胞 像抗药性细胞的杂种细胞一样 可用适当 的选择培养基来进行筛选 如在缺乏甘氨酸和脯氨酸的培养基中 需甘氨酸营养缺陷型细胞 与需脯氨酸营养缺陷型细胞都会死亡 而只有通过基因互补成为原养型的杂种细胞才能存 活 由此即可将其分离出来 有时 需同一营养的营养缺陷型细胞 是由不同基因突变产生 的 它们的原养型杂种细胞 也可按同法筛选得到 三 由温度敏感突变型细胞组成的杂种细胞的筛选 培养的哺乳类细胞 均可在 ３２ 到近 ４０ 之间的范围内生长 其最适温度则为 ３７ 但用筛选营养突变型细胞的类似方法 也可分离得到不能在 ３８ ３９ 非许可温度 生

187 ３４６ 细胞生物学 长的温度敏感突变型细胞 简单说来 就是先用化学诱变剂诱发细胞突变 再在正常条件下 培养一段时间 使突变固定下来 然后 将培养物移至非许可温度 使温度敏感突变体表型 得以表达 同时 借加入选择性作用物 如 ５ 溴脱氧尿嘧啶核苷 氚标记的胸腺嘧啶脱氧 核苷或氨基酸 以杀死所有能在非许可温度繁殖的正常细胞 而后再回到许可温度进行培 养 凡存活者即为温度敏感突变型细胞 由两不同温度敏感突变型细胞融合而成的杂种细胞 或由温度敏感突变型细胞与抗药性 细胞或营养缺陷型细胞生成的杂种细胞中 温度敏感突变型呈隐性 故采用非许可温度进行 培养 或根据需要结合使用适当的选择培养基 即可将由其组成的杂种细胞筛选出来 在融合５ ２０天后 就可检测杂交瘤细胞集落分泌的特异性抗体 随即对阳性的集落进 行克隆化 一般用９６孔组织培养板 做到一个孔内只有一个杂交瘤细胞 经过多次克隆化 后 这样最终所获得的抗体是真正的单克隆抗体 其抗体的分泌也是稳定的 单克隆的杂交 瘤细胞可以在体外大量培养 也可以通过接种于大鼠 小鼠的腹腔生成的腹水而获得大量异 抗体 通过纯化系统就可得到单一的抗体 也有人使用软琼脂来筛选 将融合的细胞培养在 含有选择培养基的软琼脂上 这样长出的集落都是融合了的杂交细胞 但一般筛选到的杂交 细胞比较少 第二节 Ｂ 淋巴细胞杂交瘤技术和单克隆抗体 １９７５年 Ｋ 和 Ｍ 创建了 Ｂ 淋巴细胞杂交瘤技术 并于 １９８４ 年获得诺贝尔医学 奖 该技术又称之为抗体的细胞工程技术 近年来 细胞工程技术日趋完善 并在小鼠小 鼠杂交瘤的基础上 又发展了小鼠大鼠 小鼠人以及人人杂交瘤技术 免疫系统能对各种抗原起反应 在抗体应答过程中免疫原分子上不同的抗原决定簇 即 表位 可以激活许多具有不同特异性及亲和力的 Ｂ 淋巴细胞克隆 因此 当动物用特定的 抗原免疫后 免疫原上各决定簇或表位激发的一系列 Ｂ 淋巴细胞克隆所分泌的抗体在免疫 血清中都混合在一起 难以分离出所需的特定 Ｂ 淋巴细胞克隆分泌的抗体 因为对抗原产 生真正的单克隆抗体应答是极稀有的 有些应答中只有极少数 Ｂ 淋巴细胞克隆参与抗体产 生 通过源自表位特异的 Ｂ 细胞克隆制备杂交瘤 在克隆杂交细胞以后 可以将针对一个 特定表位的单克隆抗体从其他特异性的抗体分离出来 这样就有可能分离针对同一分子 同 一免疫原 包括同一细胞上不同表位的单克隆抗体 ｍ 这些高度特异的 抗体可用来直接测定一种分子上的不同部位的结构和功能 或不同的细胞类型 而不需要分 离纯化抗体 并且还可以长时间地无限量提供各种特异性和亲和力的抗体 而多克隆抗体即 使只针对一个抗原 也含有一系列不同类别 针对抗原上不同表位的抗体 其比例不但各个 体间不同 就是同一个个体在不同次抽血时也不同 但单克隆抗体就不一样了 它是由一个 克隆的 Ｂ 细胞产生的完全一样的抗体 能提供大量的标准化试剂 这是多克隆的抗血清所 无法比拟的 提供单克隆抗体的细胞系称之为 Ｂ 淋巴细胞杂交瘤 Ｋ 和 Ｍ 将用绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞和体外培养能长期繁殖的小鼠骨 髓瘤细胞融合 获得了具有两种亲本细胞特性的杂交细胞 即既能在培养条件下长期生长增

188 第十五章 细 胞 工 程 ３４７ 殖 又能分泌特异的抗绵羊红细胞的抗体的 Ｂ 淋巴细胞杂交瘤 一 Ｂ 淋巴细胞杂交瘤技术 一 细胞融合杂交瘤技术制备 ＭＡ的基本原理 借助物理或化学手段 将２个或２个以上不同特性的细胞融合在一起 组成一个异型核 ｋ 细胞 新形成的异型核细胞称为杂交细胞 如果 ２ 个细胞中有一个为瘤细 胞 则融合的细胞称为杂交瘤细胞 此项技术称为杂交瘤技术 杂交瘤细胞具有两种亲本细 胞的基因和特性 由浆细胞瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞系可产生单一 特异性 纯化的抗体 该融合 的细胞是经过反复克隆 而挑选出来的 由该克隆细胞所产生的抗体称之为单克隆 抗体 ｍ ＭＡ ＭＡ在分子结构 氨基酸序列以及特异性等方面都 是一致的 利用杂交瘤技术制备 ＭＡ的基本原理是根据以下三个原则 ① 淋巴细胞产生抗体的 克隆选择学说 即一种克隆只产生一种抗体 ② 细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保持 双方亲代细胞的特性 ③ 利用代谢缺陷补救机理筛选出杂交瘤细胞 并进行克隆化 然后 大量培养增殖 制备所需的 ＭＡ 二 Ｂ 淋巴细胞免疫 常用８ １２周龄的 Ｂ Ｃ 小鼠作为接受抗原免疫的动物 因其与制备杂交瘤所用的小 鼠骨髓瘤细胞呈同源性 有利于杂交瘤的建株 用特定抗原免疫动物能够得到对抗原产生相 应特异性抗体的 Ｂ 淋巴细胞 免疫途径可用腹腔内注射或皮内多点注射 如是微量抗原 可采取脾内直接注射法 也可进行脾细胞体外致敏法 在进行与骨髓瘤细胞融合步骤前 ３ ５天 对免疫的动物进行一次加强回忆刺激 可以经尾静脉注射抗原 以加强对 Ｂ 淋巴细胞 的刺激 三 小鼠骨髓瘤细胞 刚复苏的瘤细胞需在含１０ 新鲜小牛血清的 ＲＰＭＩ１６４０培养液中 ５ ＣＯ２３７ 温箱培 养 每２ ３天换液一次 ３ ５天传代一次 待细胞生长稳定后方可供细胞融合用 生长良 好的细胞 在倒置显微镜下观察为圆形明亮 排列整齐 形态完整 密度适宜 ０ １ １０６ １ １０６ 个 ｍ 经台盼蓝染色活细胞数应大于 ９０ 有些实验室将活体内生长的骨髓瘤细 胞用于融合获得更高的成功率 体内生长的肿瘤减少了支原体污染的机会 常用的小鼠骨髓 瘤细胞株有 ＳＰ２ ０和 ＮＳ １ 这些是由某种抗体合成细胞演变而来的肿瘤细胞 ＳＰ２ ０ 细胞 丢失了表达抗体的能力 ＮＳ １细胞能在胞浆内产生原亲本细胞系的Ｉ Ｇ１轻链 但不分泌到 胞外 因此 用这种骨髓瘤细胞融合产生的杂交瘤细胞 不会产生和分泌与融合细胞不相关 的抗体

189 ３４８ 细胞生物学 四 细胞融合 诱导细胞融合的方法有生物学方法 仙台病毒 物理学方法 电场诱导 激光诱导 等 化学方法以及受体指引型细胞融合法 后者是将亲合素化抗原与表面带有特异性抗体 的免疫脾细胞交联 同时将骨髓瘤细胞表面生物素化 由于亲合素和生物素的高度亲和力 大大提高了融合效率 在这些方法中仍以聚乙二醇法最为常用 现将此法介绍如下 １ 骨髓瘤细胞悬液的制备 选好骨髓瘤细胞株 取体外培养对数生长期细胞或体内生 长的肿瘤分离骨髓瘤细胞 制备细胞悬液 ２ 免疫小鼠脾细胞悬液的制备 取 ３ 天前加强免疫的小鼠 眼眶放血 分离血清冻存 备用 拉颈处死小鼠 浸泡于 ７５ 酒精中 ３ ５ 分钟 无菌操作取出脾脏 制备脾细胞悬 液 计活细胞数 一般一只小鼠可得０ ５ １０８ ２ １０８ 个脾细胞 ３ 融合步骤 将准备好的骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按 １ ５ １ １０ 比例混合 加入 ２０ ５０ｍＲＰＭＩ１６４０液 １０００ ｍ ５ １０分钟离心 弃上清 用手指轻轻击打离心管底部 使 沉淀细胞分散 将离心管置 ３７ 水浴中 吸取 １ｍ３７ 预温的 ５０ ＰＥＧ 缓缓滴入离心管 内 １分钟内加完 ３７ 静置１分钟 滴加完全培养液 ３７ 预温 １ｍ １分钟内加完 然 后加１６４０液至５０ｍ使 ＰＥＧ 作用终止 ８００ ｍ ５ １０ 分钟离心 弃上清 将沉淀细胞轻 轻悬浮于所需容积的 ＨＡＴ 培养液中 按种 ２４ 孔或 ９６ 孔培养板 接种完毕后 将培养板放 入３７ ５ ＣＯ２ 温箱中培养 五 杂交瘤细胞的筛选和克隆化 免疫的 Ｂ 淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞经 ＰＥＧ 处理后可能产生多种细胞成分的混合体 包括游离的两种亲本细胞 两种亲本细胞各自融合的共核体和淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合产 生的异核体 后一种即形成为杂交瘤细胞 利用含 ＨＡＴ 的培养液对经过融合的细胞混合物 进行筛选 结果只有杂交瘤细胞在含 ＨＡＴ 的培养液中生长并形成集落 在众多集落的细胞 中 仅有一部分细胞能分泌预期的特异性抗体 因此 要通过对各个集落细胞的培养上清液 检测是否存在会对特定抗原反应的抗体活性 要求所测抗体的方法高度灵敏 快速 特异 且便于大量检测 具体方法依抗原性质及抗体类型而定 常用方法有酶联免疫吸附试验 ＥＬＩ ＳＡ 间 接 血 凝 试 验 ＰＨＡ 放 射 免 疫 测 定 ＲＩＡ 直 接 和 间 接 荧 光 抗 体 技 术 ＤＦＡ ＩＦＡ 以及免疫酶斑点试验等 如测定针对细胞表面抗原的 ＭＡ可用细胞毒试验 而测定可溶性抗原的 ＭＡ 多用 ＥＬＩ ＳＡ 应用亲合素生物素系统检测 ＭＡ 可进一步提 高其敏感性 在初筛获得能分泌与特定抗原起免疫反应的抗体的杂交瘤细胞后 需要对具有 稳定生长和抗体分泌功能的杂交瘤细胞进行克隆化 以求获得能分泌与其他抗原无交叉反 应 对特定抗原有不同亲和力的抗体的杂交瘤细胞克隆 即特异性的单克隆抗体杂交瘤 二 单克隆抗体的应用 从一个建株的单克隆抗体杂交瘤细胞产生的单克隆抗体是同一类或同一亚类的免疫球蛋 白 其独特型和恒定区完全相同 因此单克隆抗体是高度特异性针对单一抗原决定簇的均质

190 第十五章 细 胞 工 程 ３４９ 抗体 基于单克隆抗体的高度特异性 它在生物医学研究中 在临床医学的应用中显示了其 重要的意义和价值 一 在临床诊断中的应用 单克隆抗体现已广泛应用于许多领域的诊断 据估计国际市场每年超过 ３０ 亿美元 例 如在放射免疫测定 酶联测定中常用的双抗体夹心法 其中针对测试抗原一个抗原决定簇的 一个单克隆抗体用于捕获抗原 而针对此抗原另一个表位的单克隆抗体和酶 同位素或其他 报告系统相连以提供信号 应用单克隆抗体制作的试剂盒检测怀孕时的人绒毛膜促性腺素 ＨＣＧ 或排卵时的黄体生成素 ＬＨ 在市场上已有大量供应 其他家庭应用的检测试剂包 括喉部的链球菌感染和性病都已出现 此处要提一下肿瘤的诊断试剂 肿瘤的体外诊断试剂 的进展较为缓慢 其进展速度在很大程度上取决于肿瘤抗原方面的研究进展 至今 很少发 现人肿瘤细胞上的特异抗原 某些肿瘤细胞能表达肿瘤起源组织上不存在的表面抗原 作为 诊断试剂 有人感兴趣于测定肿瘤患者血清或组织中的 肿瘤标志物 的表达水平 例如用 癌胚抗原的单克隆抗体来帮助诊断结肠癌和直肠癌 用前列腺酸性磷酸酶的单克隆抗体来帮 助诊断前列腺癌等 大多数基于单克隆抗体的试剂盒应用颜色反应作为最后的检测系统 但也可应用荧光 生物传感器等 这样的系统可用于持续监测环境中的危险因子 或监控大规模生产抗生素 在实验室中单克隆抗体常用于 ＡＢＯ 血型抗原 血液和组织中的蛋白和多肽激素 但是近十 年中 ＰＣＲ 技术的兴起占据了很多诊断试剂市场 因为 ＰＣＲ 比免疫学方法要敏感得多 但无 论是在 ＨＬＡ 定型还是病原体检测中 单克隆抗体免疫学试剂毕竟有其简单方便 容易操作 的优点 单克隆抗体还被用于制造体内的诊断试剂 用同位素标记的单克隆抗体在特定组织 中成像的技术可用于肿瘤 心血管畸形的体内诊断 例如用同位素铟 １１１ 标记的单克隆抗 体在使乳腺癌 肺癌 结肠癌和胃癌的显影方面已获得临床上的成功 然而其他的体内成像 技术 如核磁共振 超声 计算机断层扫描等正在取代传统的同位素成像方法 因为在质地 坚硬的肿瘤中同位素成像可能受到限制 同时也不容易得到对人体组织高度专一的单克隆抗 体 因此同位素标记的单克隆抗体体内成像的临床应用前途不容乐观 二 在疾病治疗上的应用 适用于治疗的单克隆抗体是很难获得的 它必须具有特异性高 稳定性好 亲和力强 分泌量大 针对的是非脱落抗原而且在靶细胞上分布密度高等特点 现在研究和开发的领域 主要有 肿瘤 细菌 病毒 寄生虫和霉菌性疾病 自身免疫病 移植排斥以及解毒等 单 克隆抗体作为体内应用的导向药物的载体 设想的形式有单抗标记同位素 单抗交联药物 单抗交联毒蛋白 单抗交联细胞因子等等 然而 单克隆抗体就用于治疗而言在近 ２０ 年来 没有达到原先的期望 近２０年来由于对许多人类疾病的了解有很大进展 因此相对分子小 价格低廉 容易渗透入组织 细胞的药物 在对许多人类主要疾病的治疗上 单克隆抗体还 没有显示优势 目前的应用方面大体如下 １ 移植排斥和自身免疫病 抗 ＣＤ３ 所有 Ｔ 细胞都有的表面分子 抗体 ＯＫＴ３ 是

191 ３５０ 细胞生物学 国际上第一个被批准用于人体的小鼠单克隆抗体 在急性移植排斥时 当使用环孢菌素 ＦＫ５０６等常用的免疫抑制药物都无效时才使用它 但价格昂贵得多 虽然是异源的小鼠抗 体但极少遭排斥 因为该抗体本身的功能就是免疫抑制 在自身免疫病方面主要是用于除去免疫系统中某些特定细胞类群 以下调自身免疫反应 而不损及病人的抗感染能力 如对 ＣＤ２ ＣＤ５ ＣＤ７ ＣＤｗ５２以及针对各种细胞因子和细胞 因子受体的单克隆抗体都已通过临床前期试验 但应用的前景尚不明朗 同时费用也是一个 问题 ２ 细菌感染 胞外的细菌和细菌内毒素是抗体的天然靶 应该说单克隆抗体在这些情 况中应有用武之地 然而现有的抗生素能够治疗绝大多数的细菌性疾病 而且价廉 单克隆 抗体难以与之竞争 即使是在抗药性的情况下 价格仍然是个问题 值得提出来的是抗脂多 糖内毒素 ＬＰＳ 的抗体 烧伤或手术后病人有时会发生革兰阴性菌导致的败血症 脓毒 症 而此时病人的特异免疫应答尚未产生 这病常常是致命的 许多革兰阴性菌都会导致 脓毒症 它们的脂多糖内毒素中都有脂类 Ａ Ａ 成分 所以针对脂类 Ａ 的抗体应是有 效的 也已有现成的抗体报道 有鼠源的Ｉ Ｇ 抗体 也有人源的Ｉ Ｍ 抗体 然而临床试验 的结果有矛盾 也许针对脂类 Ａ 的人源Ｉ Ｇ 抗体是最理想的 ３ 肿瘤治疗 从单克隆抗体一产生开始 就期望着肿瘤单克隆抗体不但能用于追踪转 移灶 而且能用于体内治疗 但此愿望大部分未能实现 原因已如上述 在于特异性肿瘤抗 原问题 但对免疫系统的肿瘤情况有点不同 因为在 Ｂ 淋巴瘤中其独特型 应是 肿瘤特异的 另外肿瘤上的 ＣＤ 抗原也可能作为单克隆抗体的靶点 因此有可能在这方面开 展治疗 在肿瘤治疗中 许多种单克隆抗体合并的多抗可能更为有效 然而需要解决抗体的 人源化问题 三 在生物工程和生化工程中的应用 单克隆抗体可以用于分离纯化生物产品 如用单克隆抗体亲和层析柱来分离纯化基因工 程中蛋白质产物 如干扰素 胰岛素 生长激素 尿激酶及疫苗等 也有人探索用单克隆抗 体作为某些化学工业的催化剂 即催化抗体 这是在没有催化该反应的天然酶存在的情况下 设想的 所以单克隆抗体的应用领域广阔 有相当的经济效益和社会效益 在本世纪仍将作 为一个重要的产业存在 四 在理论研究上的应用 利用单克隆抗体可进行表位分析 单克隆抗体突出的优点就是识别复杂抗原结构上的单 个表位 也即抗原决定簇 为分析抗原分子的生物大分子复杂结构提供了有力的工具 但要 注意单克隆抗体有时也能与无关分子起交叉反应 这在上面已提到 因此作分子鉴定时不能 单靠一个单克隆抗体的反应 还要结合使用其他的鉴定方法 但在另一方面交叉反应也能帮 助找出大分子之间在重要结构和生物学上的关系 在免疫学方面 单克隆抗体更是广泛用于 基础和应用免疫学研究 在基础方面 例如免疫活性细胞表面 ＣＤ 分子系统 完全是应用单 克隆抗体确定的 现在已包括两百多种细胞表面标志 可用于鉴定免疫系统细胞的表型 发 育阶段和激活状态 表现了单克隆抗体的巨大应用价值 结合应用流式细胞术 ＣＤ 特异的

192 第十五章 细 胞 工 程 ３５１ 单克隆抗体能用于检测在抗原刺激或感染时某些细胞类群的出现和消失 例如监测 ＡＩＤＳ 获得性免疫缺损综合征 艾滋病 进程中 ＣＤ４ 细胞的下降 或者在淋巴细胞激活过程中 细胞表面淋巴因子受体密度的增加 第三节 ＤＮＡ 和染色体介导的基因转移 ２０世纪４０年代 微生物学家在研究光滑型和粗糙型肺炎球菌的转化现象中发现两种具 有不同遗传性状的细菌在相互接触中导致细菌遗传性状的改变 从转化现象的遗传学特性和 转化因子的理化性质分析 证明导致转化的物质是 ＤＮＡ 到 ６０ 年代初 Ｓ ｚ ｋ 将人的次 黄嘌呤磷酰核糖转移酶 ＨＰＲＴ 基因转移到人的 ＨＰＲＴ 基因缺陷的突变细胞株内 使受体 细胞表达 ＨＰＲＴ 证明哺乳动物细胞可以通过基因转移的方法来改变细胞的遗传性状和生物 学特性 哺乳动物细胞的遗传密码存在于 ＤＮＡ 碱基序列中 形成功能性基因 在细胞中 ＤＮＡ 不是游离存在的 而是与蛋白质形成复合物 以染色质的形式存在于细胞核内 在细胞间期 它呈伸展 松散状态 而在细胞分裂中期 它呈折叠压缩高度凝集的状态 被称作染色体 因此 动物细胞的基因转移可以通过 ＤＮＡ 染色体两个途径和方法进行 一 ＤＮＡ 介导的基因转移 为了探讨基因的功能或各个基因在细胞生长 分化和各种生命活动中的作用 需要通过 实验操作分离一种细胞的 ＤＮＡ 或某一特定基因 将其转移到另一种细胞中 随后分析外源 ＤＮＡ 或外源特定基因的活性和功能 这就是细胞工程研究中重要的一个手段 ＤＮＡ 介导 的基因转移技术 一 显微注射法 显微 注 射 ｍ 法 在 制 备 转 基 因 动 物 时 将 外 源 基 因 通 过 内 径 ０ １ ｊ ０ ５μｍ的玻璃显微注射针 在显微镜下直接注射到受精卵的细胞核内 称为显微注射法 显微注射 ＤＮＡ 转移基因的方法具有其独特的优点 显微注射针被连接在微量推进器 上 可以根据实验需要定量吸取 ＤＮＡ 溶液 定量注入受体细胞 显微注射在显微镜直视下 操作 因此可调整注射针和受体细胞的相对位置 将注射针从特定位置插入细胞 按实验设 计要求将样品注入细胞质中或注入细胞内 由于将 ＤＮＡ 直接注射入细胞 所以 显微注射 细胞的转化率可能达到１ １０ 二 磷酸钙共沉淀法 使外源 ＤＮＡ 或重组质粒 ＤＮＡ 与磷酸钙混合 形成微小颗粒 并加入到宿主细胞培养 液中 使 这 些 颗 粒 沉 积 在 细 胞 表 面 以 利 于 宿 主 细 胞 摄 取 这 些 颗 粒 磷 酸 钙 共 沉 淀 法 ｍ 已被用于一些功能基因的分离 转录调节因子的鉴定以及翻 译 ＲＮＡ 加工信号成分的分析 最初的磷酸钙共沉淀法的转染效率很低 １ １ ０４ １ １ ０６ 几

193 ３５２ 细胞生物学 经改进 其稳定转染效率已超过１ 在转染的前一天 将宿主细胞接种到培养皿中 过夜 生长后使细胞的覆盖率达到１０ ２０ 把磷酸钙和 ＤＮＡ 的混合物逐滴加到细胞表面 于 ３７ ２ ４ ＣＯ２ 中培养 １２ ２４ 小时后 去除培养基 换成含血清的新鲜培养基 于 ３７ ５ ＣＯ２ 中培养 ２４ 小时 这时可收集细胞 提取 ＤＮＡ ＲＮＡ 或蛋白质进行分析研 究 若要得到稳定的转化细胞株 即外源基因整合到宿主细胞基因组 可将细胞在选择培 养基中传代培养 一般需要２周左右才能得到稳定的转化细胞株 三 载体携带法 利用天然的或人工制造的载体携带外源 ＤＮＡ 分子以达到转移基因的目的 也是 ＤＮＡ 介导基因转移的常用手段 红细胞血影 和脂质体是最为常用的两种载体 红细胞血影 哺乳类动物红细胞在低渗条件下迅速发生膨胀 并在细胞膜上出现直径 ５０ｍ 左右的小孔 如果在低渗溶液中混合有适量待转移的目的基因 ＤＮＡ 则 ＤＮＡ 分子同 时通过小孔进入红细胞 当用高渗溶液调节红细胞恢复等渗条件时 红细胞质膜又恢复其不 通透性 使被吸入的外源 ＤＮＡ 包裹在红细胞血影中 不致释放出来 这样制得的红细胞血 影可以通过显微注射方法或红细胞融合技术而将携带的外源 ＤＮＡ 转移到受体细胞中 脂质体 ｍ 利用脂质体将外源基因导入到真核细胞是一种常用的简单而快速 的基因导入方法 其原理是阳离子脂质体与 ＤＮＡ 混合后 形成一种稳定的复合物 这种复 合物可直接加到培养的细胞中 然后粘附到细胞表面并与细胞膜融合 ＤＮＡ 被释放到胞浆 中 进入细胞的基因 可在细胞中酶的作用下进行表达但不能整合 这种温和的基因转移方 法对细胞无损伤 因而其转移效率高 制备脂质体的磷脂分子是存在于生物体内部的组成成 分 所以 在与受体体细胞作用时 对细胞的毒性很低 还由于脂质体是一个封闭型囊状 物 在进入细胞和胞内运转过程中可避免核酸酶对外源 ＤＮＡ 的降解作用 因而提高了外源 ＤＮＡ 整合于受体细胞染色体的几率 增加基因的表达 二 染色体介导的基因转移 真核细胞内 ＤＮＡ 与多种蛋白质结合 以染色体的形式存在于核内 基因转移可以在染 色体水平上进行 即通过对染色体操作 或是分离染色体 或是对染色体进行切割 将包含 有目的基因的染色体或染色体片段转入受体细胞 使其在受体细胞中表达 这就是染色体介 导的基因转移 转移染色体的方法主要有两条途径 其一是染色体直接转移技术 其二是微细胞技术或 称微核体技术 一 染色体直接转移技术 分离纯化的染色体可以直接从供体细胞转移入受体细胞 将染色体供体细胞用秋水仙碱 处理 使细胞停止在细胞分裂中期 在低渗溶液中将分裂中期细胞作低渗处理 并借助机械 力使细胞破裂释放染色体 经洗涤 离心可以获得纯化的染色体 分离纯化的染色体转移入 受体细胞的方法包括 磷酸钙共沉淀 细胞吞噬和脂质体三条途径

194 第十五章 细 胞 工 程 ３５３ 将受体细胞和染色体悬浮液在含 Ｌ 的培养液中培养 受体细胞可能通过 吞噬作用将外源染色体摄入细胞 转移的效率很低 为提高转移效率 可采用磷酸钙共沉淀 方法 染色体磷酸钙沉淀的制备方法见 ＤＮＡ 介导的基因转移 中所述 将染色体磷酸 钙沉淀加入预先经秋水仙碱 细胞松弛素和二甲亚砜处理过的受体细胞培养物中 这样可提 高转移效率上百倍 脂质体转移染色体方法也是有效的技术 二 微细胞技术 用秋水仙碱处理染色体供体细胞 使染色体被阻滞在细胞分裂中期 并在染色体周围形 成核膜将各个染色体包围起来 而成很多微核体 在细胞松弛素 Ｂ 作用下 微核体逐渐逸 出细胞膜外 成为微细胞 离心可以收集这些含有一个微核被一薄层细胞质和质膜包裹的微 细胞 微细胞在体外可存活数小时 将微细胞加入含有受体细胞的培养液中 在融合剂 ＰＥＧ 作用下 微细胞和受体细胞融合 在选择性培养剂中培养 可以筛选出微细胞中的染 色体已整合到受体细胞染色体中的转染细胞 三 基因转移细胞的筛选 将纯化的外源 ＤＮＡ 或染色体引入受体细胞后 需要筛选出已经被外源基因转化了的细 胞 筛选方法的设计取决于所转移基因的特性和受体细胞的遗传性状 最有效和常用的选择 系统是 ＨＡＴ 选择培养基方法 见本章细胞融合部分 被研究的基因绝大多数缺乏这种专一的选择标记特性 例如珠蛋白基因 生长激素基因 等 对这些不具有选择标记特性的基因 可以采用共转化技术 ｍ 进行研 究 将不带选择标记的目的基因和一个选择标记基因 最常用的是 ＴＫ 基因 混合 制备 ＤＮＡ磷酸钙沉淀物 并转化该选择标记基因缺陷的受体细胞 Ｌ ｋ 如将带有 ｋ 基因的 质粒导入 ｋ 细胞 这些细胞则能够存活 所以使用 ＨＡＴ 培养基 能够选择出 ｋ基因转染 的 ｋ 细胞 在基因结构和功能的研究中 如果需要以不具有特殊遗传缺陷的某种特定细胞为受体细 胞 这样就不能利用上述的选择标记基因 而可以选择另一类显性基因作标记 与目的基因 共转移 哺乳动物细胞中最常用的选择性标记物中包括有细菌新霉素抗性基因 此 基因具有对氨基糖苷抗生素 Ｇ４１８ 新霉素衍生物 的抗性 在转入受体细胞后 转化细胞因转录 基因而获得对 Ｇ４１８ 的抗性 因此可以用含 Ｇ４１８ 的培养液来选择获得 转化细胞 四 基因转移技术的应用 ＤＮＡ 介导的基因转移技术是分离基因的有效手段之一 ８０ 年代初以来 国内外利用这 一技术研究肿瘤细胞 ＤＮＡ 的转化作用 证明了肿瘤细胞 ＤＮＡ 中具有转化功能的癌基因存 在 并分离得到多种癌基因 当肿瘤细胞 ＤＮＡ 和磷酸钙共同沉淀物转移入小鼠 ＮＩＨ３Ｔ３细 胞时 由于肿瘤细胞 ＤＮＡ 中癌基因的存在使少量受体细胞发生恶性转化 失去接触抑制 在培养瓶内不再形成贴壁的单层 而是交叉重叠 堆积成一个转化细胞灶 这种特殊的生长

195 ３５４ 细胞生物学 特性和形态成为癌基因转化细胞的选择标记 且易于识别和选出 这被称作初级转化灶 从 中分离得到 ＤＮＡ 对 ＮＩＨ３Ｔ３细胞作第二次转移 重新获得二级转化灶 从转化细胞可以分 离出包含有小鼠细胞基因组的 ＤＮＡ 和整合在小鼠基因组中具有转化能力的人的癌基因顺序 的 ＤＮＡ 构建成基因库 研究表明 人的结构基因附近都有 Ａ 顺序存在 用人的重复顺 序Ａ 作探针进行杂交筛选 可把转化细胞基因库中的人的基因顺序挑选出来 再从中分离 出引起细胞转化的癌基因 利用 ＤＮＡ 介导的基因转移技术 早期从很多种人体肿瘤中 分 离了多种癌基因 如人的膀胱癌的癌基因是 Ｒ Ｈ Ｒ Ｋ 人的肝癌基因有 Ｒ Ｎ 等 ＤＮＡ 介导基因转移结合荧光激活细胞分类器 分析是分离 编码细胞表面抗原基因的有效途径 当含有编码人转铁蛋白受体基因的总 ＤＮＡ 和 ＴＫ 基因转 移到 Ｌ Ｋ 细胞中后 用 ＨＡＴ 选择培养液筛选被转化了的 Ｌ Ｋ 细胞 然后用抗人转铁蛋白受 体的单克隆抗体和荧光素标记的抗小鼠免疫球蛋白抗体对 ＨＡＴ 选择的转化细胞作间接免疫荧 光染色 凡是转移到转铁蛋白受体基因并进行表达的细胞 其细胞表面就存在转铁蛋白受体的 分子 因此能与抗体结合并带上荧光标记 通过荧光激活的细胞分类器分选 能将表达转铁蛋 白受体的细胞分离出来 然后从该细胞的基因库中可以筛选出转铁蛋白受体基因克隆 利用显微注射技术 将外源基因导入受精卵或胚泡内 再转移到假孕动物子宫内继续发 育 是研究基因整合 表达和功能的独特的途径 Ｃ 曾经将插入了１９Ｋ的兔β蛋白 基因和 Φβ２ 假基因的λ噬菌体 注射入小鼠受精卵中 在新生 ２４ 只小鼠中 有 ９ 只小鼠肝 脏 ＤＮＡ 中检测到兔球蛋白基因整合 每个细胞内免疫球蛋白基因拷贝数是 １ ２０ 个 整合 的部位大多数在１号染色体中部 １９８２年 Ｐ ｍ 将大鼠生长激素基因插入到含小鼠启动 子的基因中构建成一个重组质粒 注射到小鼠受精卵的前核内 每个核注射约２００个拷贝的 重组质粒 ＤＮＡ 然后植入假孕母鼠 在２１只新生小鼠中 ７ 只小鼠整合有大鼠生长激素基 因 ６只在生长发育期迅速生长 体型超过同窝其他小鼠 成为超级小鼠 后来 将人的生长 激素基因注射给小鼠受精卵 同样获得整合了人的生长激素基因 生长迅速 体型巨大的小 鼠 人类的不少疾病 是由于基因变异 缺损或基因表达异常所致 例如 地中海贫血病 苯丙酮尿症 自毁容貌症等遗传性疾病 基因发生多种形式的突变或缺失 肿瘤可能是细胞 中与生长控制有关的基因发生变异或表达调控异常的结果 因此 从基因水平上进行治疗 是防治遗传性疾病和恶性肿瘤的理想而又有希望的途径 无论是用正常基因补充缺失的基因 取代突变基因 还是阻遏异常基因的表达等等 都需要采取将外源结构基因和调节基因导入 细胞的方法 用基因转移手段对小鼠生长激素低下症 果蝇 Ｘ 染色体突变造成遗传病的基 因治疗已获得成功 对人类众多遗传基因缺陷性疾病的治疗也已取得令人满意的进展和成 功 利用染色体转移进行基因定位是细胞工程的一项重要技术 自从 １９７３ 年染色体转移技 术首创以来 这一技术正在不断得到完善和发展 由于受体细胞转化子中某一染色体或其片 段的存在 与细胞专一性状表达相联系 可以定位基因于特殊染色体或某一区段上 而且还 可用于确定基因在染色体上的连锁关系 研究病毒 ＤＮＡ 的染色体整合现象以及从遗传角度 去分析培养细胞的成瘤表型

196 第十五章 第四节 细 胞 工 程 ３５５ 干细胞工程 哺乳动物早期胚胎体积小 又在母体子宫内发育 因此在体内对胚胎发育和各类细胞的 分化及其机制进行实验研究几乎不可能 从 ２０ 世纪六七十年代开始 人们一直在致力于寻 找一个既能在体外增殖 又具有胚胎细胞全能性或多能性的 并通过适当条件能被诱导分化 为各种类型分化细胞的实验模型 一 干细胞的培养建系和基本特性 一 ＥＳ和 ＥＧ 细胞培养建系 目前 体外培养建系 ＥＳ细胞和 ＥＧ 细胞的技术以小鼠的最为成熟 成功率最高 其基 本原则是有赖于获得全能性胚胎细胞或细胞团 并建立体外适合其增殖和抑制分化的培养系 统 由于早期胚胎细胞离体后极易发生分化 首先要解决阻止其分化 确保维持其全能性或 多能性这一关键问题 常用的细胞分化抑制物主要有三种 饲养层 细胞 特 殊细胞的条件培养基 ｍ ｍ 如 ＢＲＬ Ｂ 细胞条件培养液 分化 抑 制 因 子 ＤＩＦ 如 白 血 病 抑 制 因 子 Ｌ ｋ ｍ 此外 也有添加通过 信号转导途径的细胞因子 例如 白介 ＬＩＦ １３０ 素６ ＩＬ ６ Ｏ Ｍ 和睫状神经营养因子 ＣＮＴＦ 等同样 可达到维持小鼠 ＥＳ 细胞的未分化状态 因此 体外培养 ＥＳ 和 ＥＧ 细胞可划分为两大类 饲养层培养法和无饲养层培养法 １ 饲养层细胞培养法 不论 ＥＳ细胞或 ＥＧ 细胞 原代或初期培养阶段一般都需依赖于 能分泌使它们在体外存活和增殖所必需生长因子的饲养层细胞 不同类型的饲养层细胞分泌 的生长因子略有不同 但都要求在 ＥＳ或 ＥＧ 细胞培养过程中的饲养层细胞保持不分裂增殖 而仍然保持代谢活性的特性 常用的饲养层细胞有下列两种 １ 小鼠胚胎成纤维细胞 ｍ ｍ ＭＥＦ 取自各种品系小鼠的 １２ 的胚胎 经剪碎和胰蛋白酶消化 行常规分离 散 细胞培养为单层散布的成纤维细 胞 经丝裂霉素 Ｃ ｍ ｍ Ｃ 处理以终止细胞分裂后 用作 ＥＳ细胞培养的饲养层 实 验证明 一般常用原代或最初几代 ８代前 的 ＭＥＦ 细胞 抑制小鼠 ＥＳ细胞分化的效果更 好一些 这种小鼠 ＭＥＦ 饲养层细胞在分离和培养人 ＥＳ细胞中证明也是可行的 ２ ＳＴＯ 细胞 来自 Ｓ ＩＭ 小鼠 Ｓ 胚胎的对硫代鸟嘌呤 Ｔ 和乌本苷 Ｏ 有抗性的成纤维细胞系 主要分泌干细胞生长因子 ｍ ＳＣＦ 和白血病抑制因子 ＬＩＦ ＳＬ Ｍ２２０细胞是小鼠胚胎造血的基质细胞 Ｓ１ Ｓ１４ 经基因改造产 生专一性跨膜型 ＳＣＦ 的细胞系 以它作为饲养层更有利于促进 ＥＧ 细胞生长 用作 ＥＳ细胞或 ＥＧ 细胞培养的饲养层的 ＭＥＦ 或 ＳＴＯ 细胞均需用 １０ｍ Ｌ 丝裂霉素 Ｃ 在３７ 处理４ 小时 用前经 ＰＢＳ彻底洗涤

197 ３５６ 细胞生物学 ２ 无饲养层培养法 近来以添加 ＬＩＦ 生长因子或某些特定细胞的条件培养液至含 ＦＣＳ 的正常培养液 借此 替代饲养层细胞 有３种条件培养液可用于小鼠 ＥＳ 细胞培养 ① 直接在 ＥＳ 细胞基础培养 液中加入重组 ＬＩＦ 使终浓度为１０００Ｕ ｍ ② Ｂ 大鼠肝细胞条件培养液 ＢＲＬ ＣＭ ③２ ３周幼年大鼠心肌细胞条件培养液 ＲＨＣＭ 收集的 ＢＲＬ ＣＭ 和 ＲＨＣＭ 均应经 分离去细胞碎片 经 滤膜过滤 直接使用或冰冻保存备用 一般以 １０００ ０ ２２μｍ ２ ３ ｍ 份上述细胞条件培养液加１ ２份新鲜的 ＥＳ 细胞培养液 再添加 １０ ２０ 胎牛血清 共 同组合成无饲养层的 ＥＳ 细胞培养系统 但往往在胚胎干细胞原代和建系初期缺乏饲养层 时 用这种条件培养液培养 ＥＳ ＥＧ 细胞成功率不高 因此 正确使用饲养层细胞和条件培 养液在 ＥＳ ＥＧ 细胞建系初期仍是成败的一个关键因素 特别是 ＥＧ 细胞培养建系时除了饲 养层外还需补充适当的生长因子 一旦建系成功后 在一定的实验期间 则一般可撤除饲养 层细胞 只需在常规培养液中添加适量 ＬＩＦ 和其他细胞因子或含有 ＬＩＦ 的 ＢＲＬ 细胞的条件 培养液 ＥＳ ＥＧ 细胞就可在体外增殖 维持不分化的生长状态 但人 ＥＳ细胞不能与 ＬＩＦ 起 反应 ＬＩＦ 难以抑制 ＥＳ 细胞的分化 但人 ＥＧ 细胞在很大程度上却依赖 ＬＩＦ 和 ＦＧＦ 同 样 与猪有高度同源性的人重组 ＬＩＦ 和其他异源性 ＬＩＦ 也不能维持猪 ＥＳ细胞在体外较长期 的生长 原因还不清楚 ３ 胚胎干细胞来源 不同种的动物 甚至同种不同品系动物的胚胎发育速度和方式存在着较大差异 因此 需根据各个物种选择不同发育阶段的早期胚胎 例如 一般小鼠多选用 ３ ４ 天的胚泡或 ２ ３天的桑椹胚 猪取８ １０天的胚泡 绵羊取 ８ ９ 天的胚泡 人和牛取 ７ ８ 天的胚泡 同时 经体外授精的胚胎或由核移植获得的重构胚胎在体外培养至所需发育阶段也是选取 ＥＳ细胞培养的有效材料来源 ＥＳ和 ＥＧ 细胞分离建系成功的关键有两点 第一 从全能性或多能性的胚胎细胞或细 胞团 小鼠超排卵收集早期胚胎或人体外授精发育至囊胚期的早期胚胎分离 ＥＳ 细胞 或从 ８ ５ １０ ５天小鼠胚胎生殖嵴或５ ９周人类的人流胚胎生殖腺分离 ＥＧ 细胞 在体外培养 第二 建立一套体外适合胚胎干细胞增殖和抑制分化的培养系统 由于早期胚胎细胞离体后 极易发生分化 为了阻止其分化 常用的细胞分化抑制物主要有 ① 小鼠胚胎成纤维细胞 ＭＥＦ ＳＴＯ 等饲养层细胞 ② 特殊细胞的条件培养液 如 Ｂ 大鼠肝细胞 ＢＲＬ 条件 培养液 ③ 分化抑制因子 如白血病抑制因子等 不同种动物的早期发育模式有所不同 因此 根据不同物种的早期胚胎或ＩＣＭ 细胞生 长特点 设计和调整体外培养体系的生长微环境或条件 是 ＥＳ细胞建系成败的关键 二 形态学特征和细胞的标志分子 详见第十四章干细胞 三 发育全能性和分化潜能 将 ＥＳ细胞和 ＥＧ 细胞接种于缺乏饲养层细胞和 ＬＩＦ 生长因子培养液的琼脂平板上 或

198 第十五章 细 胞 工 程 ３５７ 添加适当的分化诱导物质 如维甲酸 或悬滴培养 细胞粘附成团 培养３ ４天后形成拟 胚体 最外层分化为较大细胞组成的内胚层样 ｍ ｋ 结构 中间为未分化的干细 胞 培养８ １０天 拟胚体增大 内部出现囊腔 形成囊状胚体 在囊腔和早期分化出的内 胚层之间的细胞发育成类外胚层 ｍ ｋ 为一层上皮样细胞 这样的结构可持续存 在３周左右 若把培养３ ４天的拟胚体移至无琼脂层的培养皿贴壁生长 则可见拟胚体中 间的细胞团保持着干细胞生长特点 而其周边细胞逐渐分化为多种不同类型的细胞 包括上 皮细胞和成纤维细胞等 这类细胞一般多为自发分化 随培养条件和细胞密度而有所不同 常见多种类型细胞混杂在一起 ＥＳ 和 ＥＧ 细胞在体外被刺激分化为各种类型细胞是其最基 本的属性 在 Ｂ 裸鼠腋下每注射点接种不少于 ２ １０６ 个 ＥＳ 或 ＥＧ 细胞 则迅速长 出瘤状物 ２ ３周取出瘤块 切片可观察到瘤块类似畸胎瘤 除大量的干细胞巢和间质细 胞外 还包括神经管 腺管 上皮组织 软骨和肌肉等多种类型的分化细胞和组织 根据近２０年来对小鼠 ＥＳ细胞体外培养和生长分化特性的研究结果 可以认为 ＥＳ 细 胞在体外经多次传代后 其特性易发生变化 因此有必要多次重复地建立新的 ＥＳ 细胞系 主要原因是 第一 ＥＳ细胞特性的不同决定于所用的建系条件和方法 在有些条件下建系 的 ＥＳ细胞 其分化为某一特殊类型细胞的潜能是有限的 第二 ＥＳ 细胞本身属于一种不 稳定的细胞类型 在体外较长期培养条件下会积累起不可逆的变化 实际上 被众多研究者 共同使用的一些 ＥＳ细胞系 其中有的已丧失了产生小鼠全部完整组织的能力 因而常难以 获得健康的活小鼠 一般而言 新的 ＥＳ细胞建系后在体外生长时间越短 产生所有类型组 织的可能性就越大 大约经体外传代 １４ 代以后 有可能局部失去分化为某种组织的潜能 因此 ＥＳ 细胞经体外多次传代培养 总体上会减少其分化潜能 或者说在 ＥＳ 细胞系的群体 中 保留全能性的细胞比例随着进一步传代而减少 二 ＥＳ ＥＧ 细胞体外诱导分化 一 基本原理 细胞诱导分化是一个细胞与其微环境相互间复杂而又精密协调的分子细胞学过程 早在 六七十年前 实验胚胎学家就发现蛙类早期原肠胚 的背唇 的背方区 域能够诱导外胚层分化为神经管 而靠近腹侧面则诱导出尾部结构 后来又发现胚胎发育中 组织发生和身体构造形成是一连串的诱导连锁过程 例如神经组织听囊形成后 则诱导邻近 的间质细胞形成软骨囊 水晶体则刺激覆盖的外胚层诱导出角膜 所以 诱导分化是胚胎正 常发育过程中最重要而基本的现象 在体胚胎的细胞分化过程中 诱导作用的结果不只是决 定于各种诱导物质的性质和专一性 同时也决定于被诱导细胞的反应能力 ｍ 后者受遗传 发育潜能等内在因素的限制 诱导物质的专一性和被诱导细胞的反应能力必须 在时空上相互巧妙配合 才能保证被诱导细胞按预定的细胞类型方向分化 ＥＳ 细胞是体外 研究诱导分化的较理想模型 其在体外被诱导分化的途径可能不一定与在体胚胎细胞的完全 相同 但在实验操作时 也应同时考虑诱导物的性质和 ＥＳ 细胞本身所具有的反应能力这两 个基本问题

199 ３５８ 细胞生物学 正常胚胎发育过程是按严格的时空程序进行一系列细胞与细胞之间 核质之间相互作用 的结果 从全能胚胎干细胞或组织谱系干细胞最终分化为具有独特功能的体细胞主要取决于 哪些基因被激活和在什么时间与位点被激活 细胞环境中的各种因子的类别和浓度则是基因 选择性被激活的重要影响因素 因此可以认为 细胞分化是部分基因选择性地被激活或差异 性表达 从而控制专一性蛋白质的合成和分布的结果 对细胞分化来说 最重要的是多个基 因表达过程在数量和时空上的精确联系和密切配合 并受不同层次的基因调控网络系统精确 无误地调节和控制 这是一个彼此协调而又制约的复杂过程 通常称为发育的遗传程序 ｍ 被记录在细胞基因组的结构中 不同物种有不同的遗传程序 可能是在 物种进化过程中逐渐形成的 诱导胚胎细胞分化实验中 诱导物质种类繁多 诱导模式也不尽相同 难以归类论述 但按作用机理大致可分为两类 一类是使被诱导细胞可逆性地轻度损伤 例如无机物 有机 酸 醇 亚甲基盐 硫氢化物 氨水甚至蒸馏水或缺钙的盐水 都能使两栖类胚胎细胞渗透 压改变致成轻度损伤 导致神经细胞分化 另一类诱导物例如类固醇激素 维甲酸衍生物 ＲＡ 等 和多肽生长因子 ＦＧＦ ＴＧＦ 等 则是通过其与被诱导细胞表面各自 β 的受体结合而诱导细胞分化 同一种诱导物可以诱导出不同类型细胞或变化多端的构造 问 题较复杂 不仅涉及诱导剂的浓度差别 诱导作用模式和微环境的未知因素等 而且也可能 与被诱导细胞本身的发育潜能和对诱导剂的反应性差别等有关 二 ＥＳ细胞和 ＥＧ 细胞定向诱导分化 体外 诱 导 分 化 分 为 谱 系 分 化 和 定 向 分 化 ｍｍ 谱系分化包括 细胞经谱系祖细胞 谱系定型细胞 ＥＳ 到终末分化细胞的整个细胞分化的全过程 在这过程中 会出现一 ｍｍ 些不稳定的 过渡型的前体细胞 研究和分析这种过渡型的前体细胞 对认识组织谱系细胞 分化机理和全过程是有帮助的 但因为细胞呈一过性或连续性 定性和判断的标准尚有待探 索 由于 ＥＳ细胞在体外被诱导时常同时出现不同胚层类型的多种分化细胞 增加了识别谱 系祖细胞和谱系定型细胞的困难性 同时也表明 ＥＳ 细胞具有一种不受约束的 无序的自我 发育特性 ＥＳ细胞定向诱导分化则要设法控制导向产生单一类型的分化细胞 这是至今仍 未解决 正在探索中的难题 根据国外少数报道和国内的经验 对 ＥＳ 细胞专一的转录因 子 标志基因或有关细胞分化因子等遗传操作 并结合报告基因和诱导条件选择等手段 是 一条可能的探索 ＥＳ细胞定向诱导分化的途径 具体实例参考本节下文有关被诱导的一些相 关的分化细胞 三 ＥＳ细胞体外可能被诱导分化的几种细胞 １ 内皮细胞与血管发生 普遍认为内皮细胞和原红细胞来源于共同的祖细胞 这是因 为人们观察到小鼠在体胚胎的卵黄囊血岛内原红细胞的产生总是伴随着内皮细胞的出现 ＥＳ细胞体外分化时 拟胚体的血岛样结构中原红细胞集落周围也有内皮细胞出现 ＥＳ细胞 衍生的拟胚体分化的管状结构是由内皮细胞排列组成的 管道内还含有一些造血细胞 类似

200 第十五章 细 胞 工 程 ３５９ 于胚胎发育中的早期血管发生 将 ＥＳ 细胞单层培养在含重组 ＴＧＦ β１ 的 Ｉ型胶原蛋白为基 质的三维系统内 或直接将过度表达 ＴＧＦ β１ 的 ＥＳ 细胞单层培养在 Ｉ型胶原蛋白为基质的 三维系统内都能获得内皮细胞组成的血管样结构 用重组 ＴＧＦ β１ 处理的 ＥＳ 细胞中 能检 测到碱性成纤维细胞生长因子 ＦＧＦ 基因表达 所以 ＴＧＦ β１ 可能调节 ＥＳ细胞和 或 其分化细胞的 ＦＧＦ 基因表达 ＦＧＦ 可能作为血管内皮细胞的生长因子之一 促进内皮细 胞分化和形成血管 ２ 造血细胞 小鼠 ＥＳ 细胞拟胚体在体外可分化为类似于早期胚胎卵黄囊血岛样的结 构 分化产生红细胞 髓细胞和淋巴细胞等各种造血系统的细胞 常采用分阶段诱导小鼠 ＥＳ细胞分化为造血细胞和 Ｂ 淋巴细胞 首先用巯基乙醇等药物或细胞基质处理 使 ＥＳ 细 胞发育成拟胚体 然后用胰蛋白酶消化成单个细胞 经干细胞因子 ＳＣＦ 血小板生成素 ＴＰＯ 和胚胎细胞的条件培养液处理 使其定向分化为造血干细胞 再用原代骨髓基质细 胞作饲养层和 ＳＣＦ 及ＩＬ ６细胞因子处理 可进一步使 ＥＳ 细胞来源的造血干细胞分化为 Ｂ 淋巴细胞系 根据小鼠 ＥＳ 细胞体外分化为造血细胞的研究 发现 ＥＳ 细胞体外分化为造血 细胞体系的一系列发育顺序类似于在体胚胎的发育过程 在体胚胎研究表明 ７ ５ 天的小鼠 胚胎最初在卵黄囊 ｋ 内出现大而有核的前成红细胞 当胚胎长至第 １０ １２ 天肝脏 形成时 则卵黄囊前成红细胞逐渐消失 这表明胚胎造血器官是从卵黄囊转移到胚胎肝脏 的 而在 ＥＳ细胞体外分化实验中 生长 ４ 天的拟胚体首先出现前成红细胞 拟胚体生长至 第１０ １２天时前成红细胞逐渐消失 成熟红细胞和成髓细胞都是在前成红细胞出现后不久 才产生 利用骨髓基质细胞或其条件培养液 可以诱导小鼠 ＥＳ 细胞在体外分化为造血干细 胞 这一重要进展不仅为分析研究 ＥＳ细胞分化为造血干细胞的早 ｍ ｍ 期决定以及分化机理和过程提供了实验模型 而且也为临床上移植或输血应用的血源找到了 一个新的突破口 ３ 心肌和其他肌肉细胞 悬浮或悬滴培养小鼠 ＥＳ细胞的拟胚体在 ＲＡ 诱导条件下贴壁 生长数天 常出现某些具节律性自发收缩活力的分化细胞集落 电镜观察证实 收缩的细胞 内存在着肌原纤维和肌小节等典型心肌细胞特有结构 将小鼠 ＥＳ 拟胚体与 ＥＣ 细胞衍生的 内胚层样 ＥＮＤ ２细胞联合培养 也发现 ＥＳ细胞被诱导分化为有节律搏动的心肌细胞和骨骼 肌细胞的现象 ４ 神经细胞 单层培养 ＥＳ 细胞的诱导分化实验中 在 １０μｍ Ｌ 维 甲 酸 ＲＡ 与 １ｍｍ Ｌ双丁酰基环腺苷磷酸 ｍ ＢＡＭＰ 共同作 用下 ９０ ９５ 的分化细胞为神经胶质细胞 小鼠 ＥＳ细胞也可在体外被诱导分化为少突 胶质细胞 和运动神经元 ＥＳ细胞拟胚体在特定条件贴壁培养时也能被诱 导分化为神经元 用悬浮培养４天的拟胚体在含 ＲＡ 的培养液中继续培养 ４ 天 再使拟胚体 贴壁培养则可高效重复地分化出神经细胞 不仅表达专一性的神经微丝 Ｍ 和 β微管蛋白 还有钠 钾 钙等离子信号通道的特征 分化的神经细胞还表达神经递质 ＧＡＢＡ 和 受体 ＮＭＤＡ 等不同物质 甚至在体外诱导分化早期的拟胚体中检测到神经元和神经胶质细 胞的共同前体细胞的专一性标志巢素蛋白 用 ＲＡ 诱导 ＥＳ 细胞分化为表达 γ 氨基 丁酸的神经细胞 植入 Ｈ 病 一种遗传性舞蹈病 大鼠模型体内 具有神经细

201 ３６０ 细胞生物学 胞功能的移植物使患鼠症状有所改善 并存活了 ６ 周 因此 ＥＳ 细胞体外诱导分化细胞有 可能成为移植物的新来源途径之一 这些工作都表明通过用某一简单的化合物 有可能激括 ＥＳ细胞基因组中一套仅用于神经细胞分化的基因 而抑制了沿着其他细胞类型分化途径中 应表达的基因 ５ 脂肪细胞 通过悬滴培养小鼠 ＥＳ细胞或 ＥＧ 细胞形成的拟胚体被转移到铺有琼脂的 培养皿中 悬浮培养３天 每天更换含有诱导剂二甲亚砜 ＤＭＳＯ 的培养液 ３ 天后 经 过诱导剂处理的拟胚体移入表面事先用明胶 包被的培养皿中进一步贴壁培养 这 时给培养液中加胰岛素 三碘甲状腺原氨酸 和胎牛血清 约１０ １５天后 大部分拟胚体分化为脂肪细胞 用维甲酸 ＲＡ 替代二甲亚砜诱导剂 其余条件同上 约 ６０ 以上的 ＥＧ 细胞拟胚体被诱导分化出脂肪细胞 ６ 软骨细胞 ＥＳ细胞诱导分化为软骨细胞的条件较苛刻 成功率较低 ＲＯＳＡβ 基 因转染的小鼠 ＥＳ细胞 在缺乏 Ｇ４１８的情况下聚集成拟胚体 用 １０ 小牛血清代替胎牛血 清 培养液中含有分化诱导剂 Ｌ 地塞米松 ｘ ｍ ２ ３ 天更换培养液 ５０ μｍ 天后 这种拟胚体发育成软骨细胞 第五节 转基因动物 一 概述 转基因动物 ｍ 是指用人工方法将外源基因导入或整合到所有细胞基 因组内 并能稳定遗传给后代的一类动物 转基因动物技术是在动物整体水平研究目的基因 的生物技术 其特点是分子及细胞水平操作 组织及动物整体水平表达 自２０世纪８０年代 初发展起来后 已迅速 广泛地应用于生物及医学的基础研究 动物育种及基因治疗的探 索 基因产品的制备及营养成分的改进等方面 ２０世纪５０年代末发展起来的细胞核移植技术 使人们可以从一个细胞中取出整个细胞 核 含完整的基因组 并将其转移到去核卵中 发育 生长成完整的个体 并带有外源性全 套基因 随着分子生物学的发展 ２０世纪７０年代初科学家将分离纯化的 ＤＮＡ 和 ｍｒｎａ 注 入爪蟾卵 英国 和鱼卵 中国 以研究 ＤＮＡ 和 ＲＮＡ 的功能 １９８１ 年 美国的 Ｂ 和 Ｐ ｍ 用小鼠进行了转基因实验 将大鼠生长激素基因与小鼠 １ 的金属硫蛋白 的基因 ＭＴ 连在一起 构成 ＭＴＧＨ 基因 然后用微注射法注射到小鼠受精卵中 再移 植入假孕鼠的子宫中 发育生长 共产出２１ 只小鼠 其中 ７ 只带外源基因 而 ６ 只体型较 原小鼠大一倍左右 即著名的转基因超级小鼠或巨鼠 目前 转基因动物种类很多 例如 将人凝血因子Ⅸ的基因转入羊的受精卵中制造出能 产生人凝血因子Ⅸ的转基因羊 也有人用同样的方法得到了能产生人凝血因子 Ⅸ 的转基因 猪 可见 用转基因动物技术可以产生人类所需的生物活性物质 也可以改变动物的基因 型 使其表现型更符合人类需要

202 第十五章 细 胞 工 程 ３６１ 二 基本原理 转基因动物的基本原理是将目的基因 或基因组片段 用显微注射等方法注入实验动物 的受精卵或着床前的胚胎细胞中 使目的基因整合到基因组中 然后将此受精卵或着床前的 胚胎细胞再植入受体动物的输卵管 或子宫 中 使其发育成携带有外源基因的转基因动 物 人们可以通过分析转基因和动物表型的关系 揭示外源基因的功能 也可以通过转入外 源基因培育优良的动物品种 转基因技术中所用的外源基因是由顺式作用元件和结构基因组成的完整基因 即完整的 转录单位 由于哺乳类动物之间基因的同源性较高 为了检测方便 有时需引入报告基因 或报告序列 构建外源基因时 可选择适当的顺式作用 ｑ 元件与目的基因 结构基因 拼接 或直接以报告基因作为目的基因与顺式作用元件拼接 也可以将特定的目的基因与报告基因拼接成融合基因 并与顺式作用元件拼 接成完整的基因 顺式作用元件主要选用有较高表达活性的强启动子 有时包括增强子 或者直接选用目的基因的天然启动子序列 目的基因可来自基因组片段或ＤＮＡ 序列 单独 以报告基因作为目的基因的目的是研究基因的调控元件 报告基因通常比较容易检测 除了 可作为目的基因研究基因调控元件以外 在转基因研究中常用于构建融合基因 通过检测其 在转基因动物中的存在与否来判断目的基因的存在及其表达行为 这可以使检测变得容易而 且准确性也相应提高 三 基本方法 转基因所用的外源 ＤＮＡ 的构型 浓度及纯度等都能影响基因的转移 如线性 ＤＮＡ 和 环状 ＤＮＡ 均可用于显微注射 但线性 ＤＮＡ 整合效率比超螺旋 ＤＮＡ 高出数倍 因为线性 ＤＮＡ 可以首尾相连 然后整合到染色体上 外源 ＤＮＡ 的纯度亦十分重要 完成外源 ＤＮＡ 的制备后 导入基因的方式主要有显微注射法 胚胎干细胞法和逆转录病毒感染法等方法 一 显微注射法 显微注射是目前最常用的转基因方法之一 其基本原理是用显微注射针将外源基因直接 注入实验动物受精卵的原核 使外源基因整合入动物基因组中 从而得到转基因动物 此技 术的优点是导入基因的速度快且操作简单 对 ＤＮＡ 大小无限制 最大已达 ２５０ｋ 显微注 射法建立转基因鼠的一般实验程序 图１５ １ 受精卵经显微注射后 约有 ６０ 左右的卵存 活 由此发育成的小鼠中 有１０ ４０ 的小鼠整合有外源基因 其中 ８０ 的基因整合发 生在单细胞期 成为典型的转基因动物 ２０ 在细胞分裂后整合 这部分动物并不是所有细 胞中都有外源基因 称为嵌合动物 ｍ ｍ 外源 ＤＮＡ 整合的拷贝数从一至数百 个不等 一般情况下在染色体的单个位点整合 有时可能在不同染色体的不同位点整合 外 源 ＤＮＡ 可以是几个片段首尾相连插入到一个整合位点 例如 线性 ＤＮＡ 片段注射入受精卵 后 卵细胞内的酶就会将外源线性 ＤＮＡ 片段首尾相连 并整合到染色体的一个随机位点中

203 ３６２ 细胞生物学 图１５ １ 显微注射法建立转基因鼠的一般实验程序 引自 冯作化 二 ＤＮＡ 导入胚胎干细胞 产生转基因动物的另一个方法 是利用小鼠胚胎干细胞 ｍ ｍ ＥＳ 细 胞 作为外源基因的受体细胞 向 ＥＳ细胞导入外源 ＤＮＡ 的技术常用电激方法 ＥＳ 细胞介 导的转基因优点明显超过如逆转录病毒载体整合至早期胚胎或显微注射 ＤＮＡ 至受精卵原核 等一般转基因方法 主要是因为在后一途径中 导入的多拷贝 ＤＮＡ 存在着随意整合的问 题 产生的转基因动物效果一般不太理想 利用 ＥＳ细胞技术的优点是 在产生一种新的经 生殖系传递的转基因动物以前 可通过在体外 ＥＳ 细胞系统中 研究和筛选外源 ＤＮＡ 表达 质粒的构建 整合和表达 从而可提高产生转基因动物的效率 同时 ＥＳ 细胞在体外增殖 迅速 可作为已同源重组过的 ＥＳ细胞取之不尽的来源 ＥＳ细胞的基因改造技术 如剔除 敲入能够精确地改造细胞内存在的基因 克服位置效应 插入失活和特殊内源性基因失活等 弊病 ＥＳ细胞改造过的基因组经生殖系传递途径 可成为不断地提供和产生同样基因型的 丰富的转基因动物的来源 三 逆转录病毒感染法 将外源基因与逆转录病毒载体在体外构建成重组逆转录病毒载体 然后将其转染包装细 胞 这时 既可以收获重组病毒颗粒 用于早期胚胎的转染 又可以将胚胎直接加入包装细 胞培养物中共培养进行转染 转染后的胚胎可移植给假孕动物完成发育过程 逆转录病毒载 体法一般用于分裂后的早期胚胎 ８细胞胎 的转基因操作 这尤其对于鸡等家禽类的转基 因研究有重要意义 因为鸡受精卵在产出后已发育到桑椹胚期 不可能对其进行显微注射操 作 所以 逆转录病毒载体法在培育转基因禽类研究中广泛应用 四 精子载体法 通过 ＤＮＡ 与精子共育法 电穿孔导入法和脂质体转染法获得吸附有外源 ＤＮＡ 的精子 然后利用其进行受精 将外源 ＤＮＡ 导入卵细胞中 经过胚胎的发育 获得整合有外源 ＤＮＡ

204 第十五章 细 胞 工 程 ３６３ 的转基因个体 目前 利用此方法进行转基因动物的研究 在国内外均有成功的范例 但是 在实践中还存在着分歧 其具体机制尚不清楚 所以仍处于完善和发展阶段 五 转基因动物中外源 ＤＮＡ 的检测 检测可在不同层次上进行 首先是染色体及基因水平的检测 从转基因个体组织中提取 基因组 ＤＮＡ 进行斑点杂交 Ｓ 杂交和 ＰＣＲ 分析等 以确定转基因动物中是否整合了 外源 ＤＮＡ 以及整合的拷贝数 还可以利用染色体原位杂交技术进行外源基因整合位点的检 测 其次是转录水平的检测 利用 Ｎ 杂交 ＲＮ 保护分析及 ＲＴＰＣＲ 方法检测转基 因 ｍｒｎａ 的存在及表达水平 最后是蛋白质水平的检测 主要是采用 Ｗ 印迹分析的 方法 利用微生物系统可以表达人的基因产物 但缺乏基因表达产物翻译后修饰加工的机制 而转基因动物作为生物反应器具有在体内正确表达基因产物 正确进行产物修饰加工的能 力 同时具有廉价高效 安全的特点 １９８７年在英国罗斯林研究所诞生了世界上第一只转基因羊 这只转基因母羊的乳腺分 泌的乳汁中含有α 抗胰蛋白酶 而且在乳汁中的含量高达 ３０ｍ Ｌ 这一成功开创了利用转 基因动物生产药用蛋白的先河 同时 创造了 生物反应器 乳腺反应器 这一生物工程 技术的新概念 为医药产业开辟了一条全新的生物制药新途径 利用转基因动物生物反应器 生产用于医疗目的的人蛋白质已获得巨大的成功 到 ９０ 年代中期 国际上已培育出转基因 羊 牛 猪等 生产出多种药用蛋白 α １抗胰蛋白酶 乳铁蛋白 人血清清蛋白 人凝血 因子Ⅸ 人凝血因子Ⅷ 抗凝血酶Ⅲ及胶原等等 第六节 蛋白质工程 一 概述 蛋白质工程 就是以蛋白质分子结构规律及其与生物功能的关系为 基础 通过控制基因修饰和基因合成 对现有蛋白质加以定向改造 设计构建并最终生产出 性能比自然界存在的蛋白质更加优良更加符合人类需要的新型蛋白质 蛋白质工程最早是 １９８１年由美国基因公司的 Ｕｍ 提出 随着分子生物学 晶体学及计算机技术的迅猛发展 蛋白质工程在最近十几年中取得了长足的进步 成为研究蛋白质结构和功能的重要手段 同 时广泛应用于制药及生产中 图１５ ２给出蛋白质工程实施有关的五个主要方面 一 蛋白质分子的结构分析 广泛地获得蛋白质分子的结构信息 将蛋白质分子的结构特性同其特定的功能有效地联 系起来 对于蛋白质分子的结构设计和预测以及其后利用基因工程技术构建和表达的新蛋白 质分子是至关重要的 蛋白质结构分析的方法大体分为两种 首先是晶体结构分析 通过单 晶体衍射方法测定蛋白质分子的三维空间结构 以此对其结构和功能的关系进行研究 其次

205 ３６４ 细胞生物学 是蛋白质溶液构象的研究 用核磁共振 ＮＭＲ 的方法 对蛋白质或多肽分子的溶液空间 结构进行研究 图１５ ２ 蛋白质工程的五个方面及相互关系 引自 闫桂琴 二 蛋白质的结构预测 根据蛋白质分子的氨基酸顺序 来对其高级结构进行预测 预测的目的就是利用已知的 一级结构 氨基酸序列 来构建出蛋白质的立体结构模型 从而进行结构与功能的研究以及 蛋白质分子设计 三 基因工程 基因工程是实现蛋白质工程的关键技术 对于目前所进行的蛋白质工程 无论是改造蛋 白质分子中的几个氨基酸残基 替换蛋白质中一个肽段或者一个特定的结构域 还是从头设 计蛋白质 无论是你在对蛋白质结构 功能研究分析的基础上 做出怎么合理的分子设计 要想实现并验证你的设计 最关键的技术就是基因工程 这一步包括基因工程的方方面面 从基因分离 克隆 表达 突变 一直到各种工程蛋白质特性的分析 因此 蛋白质工程又 常常被人们称为第二代的基因工程 四 蛋白质纯化 功能和结构分析 蛋白质的纯化 功能和结构分析是对蛋白质工程实施质量的评估 也是对进一步的结构 预测 分子设计提供更直接的背景材料 在对工程化的蛋白质纯化的基础上 通过各种物理 学及生物学的手段对工程蛋白的特性进行分析 这些技术包括蛋白质结构分析以及蛋白质功 能分析 通过对工程蛋白的结构和功能的分析 为蛋白质分子再设计提供可以借鉴的资料 二 蛋白质分子设计及改造 蛋白质是一类非常有用的物质 在人体的进化过程中蛋白质执行了在体内及体外的许多 重要任务 例如 酶是催化化学反应的蛋白质 抗体起到防护的作用 角蛋白或胶原蛋白用 于稳定结构 激素用于传递信号 作为电子传递及氧输送的载体 从生态角度 蛋白质也是 非常理想的物质 它的生物合成不需要消耗很多能量 它的专一性非常强 不会产生副作用 并且能很快降解 但是到目前为止蛋白质没有像化学试剂那样被普遍应用 其原因是 与化学试剂比较

206 第十五章 细 胞 工 程 ３６５ 蛋白质的分子量是非常大的 通常在１００００到１００００００之间 因此它们之中的大多数不能 通过化学方法生产 在进化过程中蛋白质的功能是在生理条件下发挥的 在其他条件 如在 有机溶剂中它是不稳定的 另外专一性很强是蛋白质一大优点 但从另一角度它的应用范围 却受到影响 这又是它的缺点 分子生物学的迅速发展很快克服了上述缺 点 或 不 足 特 别 是 定 位 突 变 ＰＣＲ 使得蛋白质可以工程化 ｍ 及聚合酶链反应 ｍ 通过序列修饰改造改变蛋白质的性质并有应用价值的第一个报道引起了人们广泛的关注 纷 纷成立了蛋白质工程及设计的专门机构 尽管通过蛋白质工程研究已取得许多激动人心的成 果 但是通过蛋白质设计产生一个结构确定 性质稳定的新蛋白质并不容易 迄今为止已成 功的例子不是很多 尽管已报道了数以万计的突变实验结果 蛋白质比标准的化学化合物要 大得多 用随机方法从事蛋白质工程研究的效率是非常低的 例如一个由２５０个残基组成的 蛋白质 可能存在１０３２５种氨基酸的排列序列 也根本不可能合成那么多种蛋白质 因此蛋 白质设计 即蛋白质的结构 功能预测 及结构与功能关系的研究是非常必要的 蛋白质设 计是多学科的交叉领域 它涉及材料科学 化学 生物学 物理及计算机科学等 蛋白质设 计涉及药物 食品工业中的酶 污水处理 化学合成 疫苗及生物传感器等 设计的蛋白质 不仅限于２０种天然氨基酸 也可以包括非天然氨基酸以及有机 无机模板等 从有机化学 无机化学 生物化学及分子生物学得到的建筑模块的结合及通过序列的改变 将产生蛋白质 结构与功能的多样性 虽然目前还没有通过蛋白质设计得到具有所希望的结构与功能并有重 要应用价值的新蛋白质 但在许多方而已取得显著的进展 如通过纳米管 血红素结合蛋 白 氧化还原活性蛋白 ＤＮＡ 结合蛋白以及基于蛋白质的高分子材料等方面 蛋白质的分子设计就是为有目的的蛋白质工程改造提供设计方案 分子设计的主要依据来自三方面关系的知识 ① 蛋白质分子间的进化关系 从同源蛋 白质序列的微观差异可找出对空间结构和生物功能的影响 另一方面蛋白质的进化研究也为 蛋白质的构造规则提供了信息 ② 蛋白质一级结构与空间结构的关系 由此可以从一级结 构预测三级结构 ③ 蛋白质结构与功能的关系 找出结构改变对功能的影响 蛋白质设计的目的有二 一是为蛋白质工程提供指导性信息 二是探索蛋白质的折叠机 理 蛋白质 设 计 分 为 天 然 蛋 白 质 结 构 的 分 子 设 计 及 全 新 蛋 白 质 设 计 或 蛋 白 质 从 头 设 计 简单蛋白质建筑或骨架的从头设计是研究蛋白质内相互作用力的类 型及本质的很好途径 也为解决蛋白质折叠问题寻找定性和定量的规律 蛋白质设计目前存在的问题是设计的蛋白质与天然蛋白质比较 缺乏结构的独特性及明 显的功能优越性 所有设计的蛋白质有正确的形貌 显著的二级结构及合理的热力学稳定 性 但一般说来它们的三级结构的确定性较差 如设计的蛋白质的核磁共振谱有限的分散 非协同的热去折叠等 目前 蛋白质工程主要集中在改造现有的蛋白质这一领域 可以按改造部位的多寡分为 以下三类

207 ３６６ 细胞生物学 一 改造蛋白质分子中的几个氨基酸残基 通过基因工程的突变技术 有目的地改造蛋白质分子中的几个氨基酸残基 借以研究和 改善蛋白质的性质和功能 定点诱变技术是蛋白质工程中最广泛使用的方法 一般来说对蛋 白质所做的改造包括以下几个方面 １ 改善酶的特异性 酶的底物专一性即特异性 是指酶对它所作 用的底物有严格的选择性 一种酶只能催化某一类 甚至只催化某一种物质的化学反应 但 通过蛋 白 质 工 程 人 们 可 以 设 计 具 有 特 殊 催 化 活 性 的 酶 例 如 葡 萄 球 菌 核 酸 酶 经突变后 蛋白产物可与单链寡核苷酸共价结合 得到具有新的序 列特异性的单链 ＤＮＡ 核酸酶 ２ 提高酶对底物的亲和力 增强酶的专一性 了解酶活性中心的空间结构 推断出哪 些特定的氨基酸变化可以改变酶的底物结合特异性 从而提高酶的活性 科学家们利用 Ｂ ｍ 的 Ｔ ＲＮＡ 合成酶的突变就改变了其与底物结合的特异性 从而 提高了催化效率 ３ 改造蛋白质提高专一活性 当表达的外源蛋白的活性比预期值低时 也可以通过蛋 白质工程的方法来提高其活性 例如人的 β干扰素 ＩＦＮβ 的 ＤＮＡ 在大肠杆菌中表达 产物的抗病毒活性为１０６Ｕ ｍ 只有天然糖基化蛋白的 １０ 人们推测可能有一个或几个 Ｃ 形成了不正确的二硫键 在大肠杆菌中形成二聚体与寡聚体 根据推测进行定点诱变 把 Ｃ １７突变成 Ｓ 实验证明突变的干扰素的抗病毒活性提高到了 １０８Ｕ ｍ 与天然 β干 扰素相比其贮存稳定性大大增强了 ４ 改变蛋白质Ｈ 值或提高蛋白质温度稳定范围 利用定点突变技术 专一改变基因中 某个碱基以改变某个特定氨基酸 以提高蛋白质的热稳定性 有以下三种方法 １ 在蛋白质分子中导入二硫键 热稳定性较高 在极端条件下也不易变性 人们通过 定点诱变产生突变型的 Ｔ４溶菌酶 Ｔ４ ｚ １ 进行酶活性的测定 结果表明 ｍ 表１５ 有二硫键存在时 酶的热稳定性升高 二硫键越多酶就越稳定 但在表中我们也可以看出 Ｃ ２１与 Ｃ １４２双突变蛋白比野生型或假野生型更稳定 但却失去了酶活性 这说明 ２１ 位 与１４２位之间形成的二硫键可能使肽链骨架发生了扭曲 从而破坏了酶活性中心的构象 通 常人们不对位于酶活性中心的氨基酸进行突变 因为活性中心对小的构象变化非常敏感 表１５ １ 酶 野生性 Ｔ４溶菌酶 Ｔ４溶菌酶及其６个突变体性质 闫桂琴 半胱氨酸位置和数目 Ｔｍ ５４ ９７ Ｃ Ｃ 无 １００ ４１ ９ 无 无 １００ ４１ ９ 假野生性 Ｔ４溶菌酶 突变酶 Ａ ３ ９７ １ ９６ ４６ ７ １ １０６ ４８ ３ １ ０ ５２ ９ ２ ９５ ５７ ６ Ｃ Ｃ 突变酶 Ｂ ９ １６４ Ｃ Ｃ 突变酶 Ｃ ２１ １４２ 突变酶 Ｄ 二硫键数目 相对活性 Ｃ ３ ９ Ｃ ９７ Ｃ Ｃ Ｃ １６４ Ｃ

208 第十五章 细 胞 工 程 ３６７ 续表 酶 半胱氨酸位置和数目 二硫键数目 相对活性 Ｔｍ 突变酶 Ｅ ９ ２１ １６４ １４２ Ｃ Ｃ Ｃ Ｃ ２ ０ ５８ ９ 突变酶 Ｆ ３ ９ ２１ ９７ １４２ １６４ Ｃ Ｃ Ｃ Ｃ Ｃ Ｃ ３ ０ ６５ ５ ２ 把 Ａ 与 Ｇ 突变为 Ａ 以提高蛋白的热稳定性 将酿酒酵母的磷酸丙糖异 与 Ｇ 构酶 ｍ 表 １５ ２ 任意一个 Ａ 突变为 ＡＣＵ ＡＣＣ 或Ｉ 都有助 于增强酶的热稳定性 而将任一个 ＡＡＵ ＡＡＣ 突变为 ＧＡＶ ＧＡＣ 都会降低酶的热稳定 性 当两个 Ａ 均突变为 Ａ 时 酶的热稳定性与酶活性均很低 有人还检验了酵母磷酸 丙糖异构酶对蛋白水解作用的抗性 发现酶的热稳定性与对蛋白水解作用的抗性呈正相关 表１５ ２ 酵母磷酸丙糖异构酶及其突变酶在１００ 下的稳定性 闫桂琴 酶 野生性磷酸丙糖异构酶 突变酶 Ａ 突变酶 Ｂ 突变酶 Ｃ 突变酶 氨基酸及其位置 半衰期 分 １４ １３ ＤＡ Ａ １４ Ａ ７８ ７８ Ｔ １７ １４ ７８ １６ １４ ７８ Ｔ Ｉ ２５ １４ １１ Ａ Ａ Ｉ ７８ Ａ ３ 把 Ｇ 可以提高蛋白稳定性 可能由于 Ｇ 换成 Ａ 没有 β碳原子 在多肽链上比 Ａ 具有更大的构象自由度 ５ 改造蛋白质提高抗氧化能力 如对 α１ 抗胰蛋白酶 α１ ＡＡＴ 的改造 嗜中性粒细胞弹性硬蛋白酶可对肺造成损害 α１ 抗胰蛋白酶主要功能是抑制嗜中性粒细胞 弹性硬蛋白酶的活性 但氧化作用可使α １ 抗胰蛋白酶的抑制作用下降 通过寡核苷酸介导 的点诱变把 Ｍ ３５８转变为 Ｖ ３５８ 既可有效地抑制弹性硬蛋白酶的活性 又不会因氧化而 失活 ６ 改变酶促反应的 Ｋｍ 和 Ｖｍ ｘ 提高反应催化效率 Ｍ 和 Ｍ 在前人工作 的基础上 根据酶反应的中间复合物学说推导出一个表示底物浓度与酶反应速率之间的定量 关系 称为米氏方程 ν Ｖｍ ｘ Ｓ Ｋｍ Ｓ 式中 Ｖｍ ｘ 为 酶 完 全 被 底 物 浓 度 饱 和 时 的 最 大 反 应 速 率 Ｋｍ 或 米 氏 常 数 Ｍ 表示反应达到最大反应速度一半时的底物浓度 用 表示 值越低 酶 ｍ Ｌ Ｋｍ 与底物形成的复合物就越稳定 Ｋ 则表示当酶被底物饱和时每秒钟每个酶分子转换底物 的分子数叫做转换数或催化常数 Ｋ Ｋ 值越大 表示酶的催化效 率越高 去污剂中添加的蛋白酶和脂酶需要具有耐热 耐碱和耐氧化剂的性能 为提高酶的热稳 定性 可在蛋白质分子中引入二硫键 置换不稳定的氨基酸残基 增加内部疏水性氨基酸

209 ３６８ 细胞生物学 等 枯草杆菌蛋白酶是一种生物去污剂的成分 它的活性中心有一个 Ｍ 易被氧化并失去 活性 科学家们通过寡核苷酸介导的定点诱变 得到的突变酶活性从表 １５ ３ 中可以看出 用 Ｃ 代替 Ｍ 的突变体 酶活性和转化数都提高了 而在有氧的环境中 Ｓ Ａ 或 Ｌ 取代 Ｍ 虽酶的活性略有下降 但抗氧化的能力却明显提高 表１５ ３ 枯草杆菌蛋白酶的 Ｍ ２２２被其他氨基酸替换后的动力学常数 闫桂琴 氨基酸 Ｋ Ｋｍ ｍ Ｌ Ｋ ｋｍ ２２２ Ｍ ５０ １ ４ １０ ４ ３５ ７ ２２２ Ｃ ８４ ４ ８ １０ ４ １７ ５ ２２２ Ｓ ２７ ６ ３ １０ ４ ４ ２８ Ａ ２２２ ４０ ７ ３ １０ ４ ５ ５ Ｌ ２２２ ５ ２ ６ １０ ４ ２ ０ 二 替换蛋白质中一个肽段或者一个特定的结构域 蛋白质的立体结构可以看作由结构元件组装而成的 可以在不同的蛋白质之间成段地替 换结构元件 期望能够转移相应的功能 常利用的是缺失诱变技术和结构域互换技术 缺失诱变 将编码蛋白质的基因通过诱变将其中的小片段缺失掉从而产生新的编码蛋白 质的基因 Ｋ ｗ 片段的生产即是应用缺失诱变进行蛋白质改造的典型例子 目前人们已 从真核生物和原核生物中分离鉴定出了许多种 ＤＮＡ 聚合酶 在克隆了大肠杆菌 ＤＮＡ 聚合 酶Ｉ基因以后 通过缺失诱变 将编码小片段的基因缺失掉 然后把缺失后的基因大片段送 回大肠杆菌中去大量表达 这样就可以产生 Ｋ ｗ 片段了 结构域互换 ｍ ｗ 把相关基因的相类似功能的区域进行互换 然后检查 互换后的蛋白质的功能 实际上对干扰素的改造就是结构域互换在蛋白质工程中的应用 三 蛋白质从头设计 蛋白质从头设计 从氨基酸残基出发 即从一级序列出发 设计 制造自然界中不存在的全新蛋白质 使之具有特定的空间结构和预期功能 对蛋白质分子的 从头设计的例子尚不多 只限于几个较小的多肽 其结构完全由α螺旋或β折叠组成 只有 当人们完全掌握了一级结构决定高级结构的规律 掌握了高级结构与生物功能的相关性 才 能真正从头设计蛋白质分子 但从用蛋白质工程对限制性内切酶的改造实例说明 通过蛋白 质工程人们完全有可能创造出自然界根本不存在的酶类 三 胰岛素蛋白质工程 １９５３年 英国生物化学家桑格破译出由 １７ 种 ５１ 个氨基酸组成的两条多肽链牛胰岛素

210 第十五章 细 胞 工 程 ３６９ 的全部结构 这也是人类第一次搞清一种重要蛋白质分子的详细结构 见图 １５ ３ １９６５ 年 ９月７日 中国科学院上海生化研究所 上海有机化学研究所和北大生物系三个单位联合协 作组完成了结晶牛胰岛素的全合成 人工合成结晶牛胰岛素是世界上第一个人工合成的蛋白 质 成了轰动世界的大事 经过严格鉴定 这种人工合成的结晶牛胰岛素在结构 生物活 力 物理化学性质及结晶形状上都与天然的牛胰岛素完全一样 图１５ ３ 胰岛素的化学结构 一级结构 上 空间结构 下 引自 结构分子生物学 刘次全编著 １９９７ 胰岛素是迄今为止人类对其一 二 三级结构了解得较为清楚的少数几种蛋白之一 这 就为通过蛋白质工程改造胰岛素创造了良好的条件 Ｉ型糖尿病 即胰岛素缺乏型糖尿病 患者胰岛素注射人体内后会堆积在皮下 要经过 ３０ 分钟甚至更长的时间才能在血液中达到 最高浓度 而且血液中的胰岛素会不断被分解 无法维持相对稳定的胰岛素浓度 同时 目 前Ｉ型糖尿病患者需天天注射胰岛素２ ３ 次 这给患者带来了很大的痛苦和不便 因此利 用蛋白质工程获得稳定 长效 甚至可以口服的胰岛素成为糖尿病患者的迫切要求 人们认为 注射的胰岛素进入血液速度缓慢主要是由于胰岛素分子可以聚合为二聚体或 六聚体 这些庞大的聚合体难以进入血液 因此 研究人员首先着手实验如何获得稳定的单 体胰岛素分子 有活性的胰岛分子是由两条多肽链组成的 Ａ 链由 ２１ 个氨基酸组成 Ｂ 链 由３０个氨基酸组成 两条链之间由两个二硫链连接 三维结构分析表明 胰岛素分子的受

211 ３７０ 细胞生物学 体结合部位和活性中心主要集中于由 Ｇ 等极性氨基酸所构成的亲水表面 而这些亲水表面 位于由 Ｐ Ｂ２４ Ｐ Ｂ２５ Ｔ Ｂ１６ Ｖ Ｂ１２等组成的疏水区周围 而且在疏水区中芳香环非 常重要 研 究 人 员 设 计 把 Ｓ Ｂ９ 突 变 为 Ａ Ｂ２７ 突 变 为 Ｇ 结 果 表 明 双 突 变 的 Ｔ Ｓ Ｂ９Ａ Ｔ Ｂ２７Ｇ 胰岛素可以有效地使二聚体解聚为单体 它进入血液的速度也比天然 胰岛素提高了３倍 核磁共振 ＮＭＲ 分析表明它仍然保持了天然胰岛素分子的主要构象 第七节 细胞工程在医学中的应用 一 医用蛋白质 在应用方面 几乎所有具开发前景的蛋白质和多肽都用蛋白质工程作过改造尝试 并取 得不同程度的效果 研究最多 取得成果最显著的是生物技术药物和工业用酶的蛋白质工 程 蛋白质和多肽类药物包括激素 细胞因子 酶 酶的激活剂或抑制剂 受体和配体 细 胞毒素和杀菌肽以及抗体等 作为药物 希望通过改造以提高其活性 特异性和稳定性 控 制分子聚集 降低免疫原性和毒副作用 延长在体内的半衰期 增加对靶位点的导向性等 一 医用抗体 利用通过杂交瘤方法产生的鼠源单克隆抗体来处理癌细胞有几个限制因素 首先 受 Ｉ Ｇ 亚型的限制 鼠源单克隆抗体只能对人体免疫系统效应器功能产生弱的激活作用 其 次 鼠源的抗体在人的血浆中有非常短的半衰期 最后 鼠源抗体容易引起人体的免疫反 应 产生抗鼠源抗体的抗体来中和鼠源抗体的活性 这种人抗鼠抗体 ＨＡＭＡ 的产生可 使人产生包括高过敏性在内的各种严重的副反应 为了避免 ＨＡＭＡ 反应 利用人源的单克隆抗体是首先考虑到的选择 然而 开发人的 杂交瘤工作并不成功 此外 用对人有害的癌细胞标记物作为抗原来对人进行免疫有悖伦 理 因此 就促使人们应用蛋白质工程的方法产生嵌合抗体和人源化抗体来减少鼠单抗的免 疫原性 所谓嵌合抗体就是这种抗体含有鼠源的单抗的可变结构域 这个可变结构域含有所 有结合抗原的元件 而抗体的恒定区是来自于人 这种用鼠可变区和人恒定区融合形成的嵌 合抗体能支持人的效应器功能 在血浆中也有较长的半衰期 然而 这种嵌合抗体中的鼠源 可变区仍然存在足够的免疫原性 不利于重复使用这样的嵌合抗体进行治疗 嵌合单克隆抗体潜在的免疫原性可进一步通过人源化技术得以减少 只与抗原接触的抗 体环区 被称为超可变序列或互补性决定区 ＣＤＲ 被嫁接到人的抗体骨架上 从而形成 人源化单克隆抗体 因为这种抗体可以使人的免疫系统产生抗 ＣＤＲ 的抗体 所以人源化的 单克隆抗体仍然还有免疫原性 然而经过这种改造 这种抗体独特型反应的频率和强度将比 对嵌合单克隆抗体的免疫反应低 因此 利用蛋白质工程手段对单克隆抗体进行改造 使其 更适于临床应用

212 第十五章 细 胞 工 程 ３７１ 二 组织型纤溶酶原激活剂 组织型纤溶酶原激活剂 ＰＡ 可以在临床上用于分解血栓块 医治心肌梗死和肺栓塞 但当病人服用 ＰＡ 时 ５分钟后血液中的５ ０ 以上的药都会被身体清除掉 为了解决这个问 题 药物就必须通过较长时间的静脉输液来输送 ＰＡ 是糖基化的蛋白 许多血浆中糖蛋白的 某些寡糖键都能为肝脏受体所特异识别 糖基化的 ＰＡ 分子中第１ ２ ０位的天冬酰胺就是这样一 个识别位点 如果用 Ｇ 代替 Ａ 那么 ＰＡ 在血液循环中的半衰期就会大大延长 三 水蛭素 一个由６５个氨基酸组成的蛋白质 由水蛭的唾液腺分泌 它是一个效果很好的凝血酶 抑制剂 于是科学家们就考虑对它进行改造 以使它成为一种效果更强的抗凝血剂 当人们 把４７位的 Ａ 变成 Ｌ 或是 Ａ 时 它在试管中的抗凝血效率提高了 ４ 倍 在动物模型上 检验其抗血栓形成的效果 发现其效率提高了２０倍 甚至比肝素 高５倍 四 生长激素 生长激素 ｗ ｍ ＧＨ 既可以结合生长激素的受体 又可以结合许多不同 细胞类型的催乳激素的受体 如果想要尽量避免治疗中出现副作用 就必须使人的生长激素 只与生长激素的受体结合 而尽量减少它与其他细胞类型的激素受体结合的可能性 通过结 构分析人们发现 人的生长激素与生长激素受体的结合区域与生长激素同催乳激素受体结合 的区域有一部分重叠 但并不完全相同 因此 可以选择性地降低人的生长激素结合催乳激 素受体的活性 而不影响它与生长激素受体结合的活性 这就要靠定点诱变来完成 人的生 长激素的ＤＮＡ 是最早克隆的人的基因之一 对这个ＤＮＡ 进行定点诱变 先要了解它的作 用方式 人们选择了突变人的生长激素ＤＮＡ 中一些充当锌离子配基的氨基酸侧链的方案 比如 第１８和２１位的 Ｈ 第１７４ 位的 Ｇ 由于人的生长激素和催乳激素受体的高亲和 性结合必须有锌离子 而它和生长激素受体的结合则不一定需要锌离子 因此 科学家们就 想到要改造这些配基 使这些侧链无法结合锌离子 最终使人的生长激素只结合生长激素受 体而不结合催乳激素的受体 这个工作非常有意义也非常成功 初步的结果完全符合设计要 求 但最终这种改造过的人类生长激素能否变成商品化的药物还需要做许多检测工作 二 基因工程动物的应用 目前 科学家们已成功地建立了转基因大鼠 转基因小鼠 转基因兔 转基因猪 转基 因羊 转基因牛 转基因鱼 转基因昆虫等 我国的转基因研究起步较晚 但转基因鱼 小 鼠 大鼠 兔 猪 羊和牛也已制备成功 转基因动物技术在医药及生物学领域都有广泛的应用 主要有以下几个方面 ① 对基 因组织或阶段特异表达的研究 ② 通过研究转入外源基因后的新表型 可以发现基因的新 功能 ③ 导入外源基因后 由于基因的随机插入 可能会导致内源基因的突变 对这些突 变表型进行分析 可以发现新的基因 ④ 可用于只在胚胎期才表达的基因的结构和功能的 研究 ⑤ 建立研究外源基因表达 调控的动物模型 ⑥ 对遗传性疾病的研究 ⑦ 建立人类

213 ３７２ 细胞生物学 疾病的动物模型 为人类的基因治疗提供依据 ⑧ 基因产品的制备 ⑨ 在免疫学中 可用 于对免疫机制 免疫相关疾病的研究及建立免疫性疾病动物模型等 一 转基因动物用于生物医学基础研究 １ 研究基因功能 基因表达与调控的研究是当今分子生物学研究的热点 转基因动物 是一个四维时空体系 用于研究基因调控颇为理想 从目的基因导入受精卵后产生的转基因 动物可以观察到目的基因在该动物发育过程中表达的时间 组织特异性 影响表达的诸多因素 及产生的生理效应 能够从整体水平确定该基因的表达调控 主要的研究策略是从单基因调控 到多基因调控 以至基因敲除等复杂系统 具体方案可通过改变转移基因的调控序列及基因编 码序列进行研究 单基因调控系统简单有效 通过观察转移的单基因表达水平 生理效应 可表明基因表 达的组织特异性 发育阶段特异性及该基因的调控机制 研究多基因复杂调控系统 可转入 多个基因 目的基因需另一种或多种转基因表达产物激活后才表达 也可用不同的单基因转 基因鼠 杂交产生双转基因鼠 用来研究两种基因间的相互作用 基因敲除是利用同源重组 原理 基因打靶技术 以突变基因删除正常基因 或反之 由基因表达水平 表型异常研究 基因的功能 调控及突变的部位等 基因突变与遗传病 肿瘤等疾病的发生均有密切关系 对此进行深入研究 将对阐明生物学中许多基本问题有重要意义 特别是转基因动物可使基因 突变的研究在整体动物进行 有高度的真实性 为活体水平研究基因结构与功能提供了条件 ２ 研究生物的发育过程 同源异形盒基因 ｍ ｘ ｘ 是与胚胎发育及细胞 分化调节相关的基因 其基因家族表达的时空特异性很复杂 用转基因小鼠研究此类基因 可探讨其如何控制胚胎发育过程中细胞的分化 另外诱捕载体 与 ＥＳ 细胞结 ｍ 合 形成了一种新技术 可识别小鼠发育中的任何基因及其活动 ３ 在免疫学研究中的应用 转基因及基因敲除小鼠已成为从整体水平 组织器官水 平 细胞水平和分子水平研究各种免疫现象的重要工具 如 Ｔ 细胞和 Ｂ 细胞的个体发育 细胞因子及其受体的作用 抗原提呈 抗体产生 免疫应答等等 主要是将特定抗原及抗原 受体基因 人免疫球蛋白及主要组织相容复合物基因 细胞因子及细胞因子受体基因导入小 鼠 观察转基因鼠的免疫反应 许多研究结果已为自身免疫 免疫耐受机制 抗感染机制 Ｔ 淋巴细胞克隆灭活 等位排斥学说等提供了充分依据 并已为免疫相关疾病的研究奠定了 基础 二 转基因动物用作人类疾病及基因治疗的实验模型 １ 肿瘤转基因动物模型 癌基因转基因小鼠的产生为肿瘤学研究提供了新的途径 使 癌基因功能得以在活体检测 组织特异性启动子调控的特异表达有助于认识肿瘤发生的机 制 在 ＳＶ４０转基因鼠可见到在不同启动子调节下 可引起胰腺 肝脏等不同部位的肿瘤 多瘤病毒 Ｔ 抗原基因可使鼠血管内皮产生多发性肿瘤 Ｔ 细胞白血病病毒转基因鼠则长出 了神经纤维瘤 另有研究表明 导入多个癌基因时 也可引起肿瘤发生 因此可研究癌基因 的协同作用 此外也可通过给肿瘤转基因鼠用化疗或反义核酸等来研究抗癌治疗

214 第十五章 细 胞 工 程 ３７３ ２ 病毒性疾病的转基因动物模型 转基因动物可以说是能在活体研究病毒唯一理想的 工具 无论是对病毒本身 还是对病毒与宿主相互作用的研究 用体外试验或普通实验动物 都是无法替代的 转基因动物主要适用于研究流行性强 危害大 宿主范围又很窄的病毒 乙型肝炎病毒 Ｂ ＨＢＶ 严重危害人类健康 一般不感染培养细胞及实 验动物 故缺乏理想的实验动物模型 限制了人们对乙肝和肝癌发病机制及防治的研究 ２０ 世纪８０年代以后 ＨＢＶ 转基因小鼠的建立 才为这些研究提供了有价值的可用模型 已有 人用此研究了 ＨＢＶ 生物学特性 证明了 ＨＢＶ 表达的组织特异性 发病及免疫机制 病理 改变 并用此模型研究了治疗乙肝的药物筛选及疫苗验证等 另外也有人用 ＨＢＶＸ 基因转 基因小鼠证明这一 ＨＢＶ 基因转录反式激活因子与乙肝及其相关肝癌的关系 在艾滋病 ｍｍ ｍ ＡＩＤＳ 的研究中 目前也缺乏理想的 ｑ 天然 动 物 模 型 猿 猩 猩 等 珍 稀 大 动 物 虽 然 可 感 染 人 类 免 疫 缺 陷 病 毒 ｍ 但也难以致病 转基因小鼠虽然尚难稳定复制和表达 ＨＩＶ ｍｍ ＨＩＶ 基因产物 使其应用受限 但还是给能在活体研究 ＨＩＶ 与宿主的关系提供了机会 ＣＤ４ 分 子是介导 ＨＩＶ 进入靶细胞的受体 在转入 ＣＤ４基因的家兔 其外周血淋巴细胞有人 ＣＤ４的 表达 在体外用 ＨＩＶ １感染这些淋巴细胞后 细胞死亡率大大高于非转基因兔 证明这种 转基因兔可作为 ＨＩＶ 感染的动物模型 用于淋巴细胞功能及疫苗学的研究 也有实验发现 ＨＩＶ 反式转录激活后转基因小鼠可出现类似 ＡＩＤＳ 病的皮肤病变 肝癌等 整合有 ＨＩＶ 前 病毒 ＤＮＡ 的转基因鼠子代 许多组织有 ＨＩＶ 并出现了类似 ＡＩＤＳ的临床综合征 除 ＨＩＶ 外其他的嗜 Ｔ 淋巴细胞病毒转基因鼠中也发现有 Ｔ 细胞肿瘤形成 出现神经纤维瘤 类风 湿性关节炎表现等 可作为研究 ＡＩＤＳ及一些白血病的模型 ３ 遗传病的转基因动物模型 遗传性疾病的动物模型 主要靠自发突变的动物传代繁 殖保留下来 转基因技术为此模型提供了快速准确的方法 其制备主要通过随机突变 定点 整合及直接插入基因等 此类模型可用来研究单个基因在发病中的作用 研究药物干预后的 反应及机理 镰刀状红细胞贫血有血红蛋白的结构异常 病理机制很复杂 根据发病的不同程度和特 点 已建立了５种以上转基因小鼠模型 可得出不同程度表型的动物 来详细研究发病机 制 病程 药物作用及部位等 已获得该病肾小球滤过率增加并非贫血引起心排量增加所致 等重要结果 家族性高胆固醇血症是由低密度脂蛋白 ｗ ＬＤＬ 受体遗传缺陷 所致 用胚胎干细胞基因敲除技术已成功建立了 ＬＤＬ 受体基因缺陷小鼠模型 可用于研究 ＬＤＬ 的代谢和调控 ＬＤＬ 受体的作用 将人 ＬＤＬ 受体基因转移至该鼠后 能逆转 ＬＤＬ 受 体缺陷引起的高胆固醇血症 从基因治疗的角度 证实 ＬＤＬ 受体基因能调节血浆胆固醇 因而此模型也可看作基因治疗的模型 高血压是病因不明有遗传倾向的疾病 涉及多个基因改变 近年来 多种转基因高血压 大鼠 小鼠模型均已建立 可验证涉及高血压的多种候选基因 阐明高血压的发生机制 也 可进行药理学鉴定 为降压药筛选提供依据 此外 涉及动脉粥样硬化 肥胖及囊性纤维化的转基因动物模型也使人们对脂质运输

215 ３７４ 细胞生物学 基因突变及基因治疗有了新的认识 ４ 基因治疗的模型 基因治疗为许多有基因缺陷的遗传病 肿瘤及病毒性疾病的治疗 甚至治愈带来了希望 治疗途径主要包括 引入功能正常的基因 取代或去除致病基因及修 饰缺陷基因 前者将目的基因直接注入体内或转入人体外细胞再回输至体内 其他途径则需 通过同源重组等复杂的基因技术对 ＤＮＡ 定点整合或修饰 基因治疗的方式包括体细胞与生 殖细胞基因治疗二类 仅后者为一些疾病的根治提供了有效方法 现有的转基因动物为基因 治疗 特别是生殖细胞的基因治疗提供了许多第一手资料 使人类疾病的基因治疗将成为现 实 以转基因小鼠为模型探讨基因治疗的效果 已获得许多成功的例子 例如 将β 珠蛋白 基因转入β 地中海贫血小鼠受精卵后 贫血得到纠正 给转膜传导调节因子基因缺陷的肺囊 性纤维化小鼠的呼吸道内皮细胞转入人的该基因后 小鼠呼吸道生理功能恢复正常 ５ 其他疾病的转基因模型 从能分泌识别小鼠红细胞抗体的杂交瘤细胞中分离出免疫 球蛋白基因建立的转基因小鼠 出现了自身免疫溶血性贫血 这一自身免疫性疾病的动物模 型为此类疾病的研究奠定了基础 用定点突变方法制备的神经生长因子受体基因 Ｐ７５ 定点 突变的转基因鼠 出现了外周神经支配能力显著降低 证明该受体在外周神经发育及功能上 起重要作用 用大鼠胰岛素启动子调控 ＭＨＣ １ 基因的重组基因建立的转基因小鼠 研究胰 岛素依赖性糖尿病时发现此病是由于 ＭＨＣ １在胰岛 细胞中过量表达 导致胰岛功能障碍 所致 并非以往认为是自身免疫反应造成 在眼疾病中 可通过转入 Ｖｍ 或 ＨＩＶ １基 因制备出白内障小鼠 或转入 Ｔ 致癌基因 产生出组织学 组化等与人相似的视网膜母 细胞瘤 用多种融合基因制备出的多种转基因小鼠可在晶体上表达不同的蛋白 对研究晶体 与其他眼组织发育及相关疾病有重要意义 最近有人将转基因猪作为人视网膜炎 致夜盲或 失明 模型 为患者试验手术程序及药物治疗提供了宝贵的模型 三 转基因动物作为生物反应器生产药用蛋白 用转基因动物来大量生产医药用的天然蛋白 如抗体 疫苗 激素 血液组分蛋白 细 胞因子和营养保健品等等 是医药产业的一场革命 具有十分诱人的前景 其基本程序是 将具有生物活性蛋白的基因导入动物受精卵 制备出转基因动物 在全程的调控元件控制 下 外源基因在动物体内特异部位高效表达后 通过提取及纯化获得这些基因的表达产物可 作为药用蛋白用于临床 这类转基因动物就像活体的生物工厂 因而被称为生物反应器 用 生物反应器制备药用蛋白 生产流程性强 生产成本低 产量高 还可进行翻译后修饰与加 工 使产品具有天然生物活性 纯度高 比传统的基因产品制备 分离 纯化等生产程序更 为简化 更适于一些需要量大 结构复杂 其他方法不易获得的稀有 昂贵蛋白类物质 而 且还具有不受来源限制 没有污染等优点 用转基因动物制备基因产物 从其不断更新的体液中获取表达蛋白 比用固体组织更为 理想 现有人从乳汁 血液甚至尿液中来提取所需蛋白 因而转基因动物定位表达的部位是 有选择的 相比之下靠乳腺来表达外源基因具有很大优势 因乳腺有外分泌功能 分泌的某 些蛋白含量丰富 利用这些蛋白的启动子可指导外源基因在乳中表达 且乳汁产量丰富 易 于纯化 采集方便 采后对动物本身无任何影响 因而 自 １９８７ 年报道转基因小鼠乳汁中

216 第十五章 细 胞 工 程 ３７５ 可表达分泌人组织纤溶酶原激活剂及１９９０年生产人 α 抗胰蛋白酶的转基因羊诞生以来 至 今已在鼠 兔 猪 羊 牛多种转基因动物乳腺中表达出了多种药用价值很高的人类蛋白 如 抗凝血酶Ⅲ 乳铁蛋白 抗胰蛋白酶 生长激素 尿激酶 纤溶酶原激活因子 促红细 胞生成因子 人 Ｃ 蛋白 ＣＤ４ 蛋白 白介素 ２ 白蛋白 γ 干扰素及凝血因子 Ⅸ Ⅷ 等等 其中已有多种进入了临床试验 最近 已有人工染色体转移至小鼠并能传给子代的新突破 实验者也准备用此技术制备乳腺生物反应器来生产药物 血液也是获得生物活性蛋白的一个较好环境 肝脏等脏器合成的蛋白大部分可进入血 液 因而可利用肝细胞或其他细胞来表达外源基因 经血液来获得基因产品 用转基因兔的 肝脏表达人α１抗胰蛋白酶 血液中浓度高而稳定 且对转基因兔本身无明显影响 用转基因猪生产人的血红蛋白 作为血液代用品 也已开始临床试验 当然有些蛋白在 血中不稳定 易被代谢或过量堆积影响动物健康 但本身存在于血液中的蛋白 却适合于从 血液中获取 近年已有人用尿血小板溶素 ｋ 基因启动子制备出转基因小鼠的膀胱生物反应 器 使鼠尿中持续表达人生长激素 与乳腺生物反应器相比 膀胱生物反应器最大的优势是 可短期获益 从显微注射基因至胚胎到产生转基因牛 得到能获取蛋白的牛奶约需７年 而 得到表达所需蛋白的尿只需３年 收集尿液不仅简单 无创伤 且尿液本身蛋白 脂质等含 量少 使所需的蛋白更易提取 纯化 而且产生的转基因动物还可不分性别 终身使用 因 而成本将会更低 从鸡蛋中生产和表达药物蛋白 目前尚鲜为人知 但家禽生物反应器具备更多的优点 特别是易提取 纯化 繁殖快 成本低等 将逐步引起人们的关注 目前 用转基因动物作为生物反应器来生产药用蛋白的技术基本到位 并已取得许多可 喜的结果 如果在解决了转基因动物的成功率 基因定点整合和可控表达及产品的安全性等 关键性技术难题后 将具有充满魅力的应用前景 ２１ 世纪药用蛋白的生产已不会仅仅局限 在小小的车间 而会是从辽阔草原上奔跑的牛羊中源源不断的吸取 转基因动物药厂将成为 具有高额利润的新型产业 三 组织工程 组织工程的核心是由种子细胞和生物活性材料构成三维空间复合体 尽管构建成一个完 整的器官 尤其是像心 肝 肾 肺等大型精细复杂的器官还需要技术上的突破 但是 作 为构成组织 器官的基本单元 具备足够数量并保持特定生物学活性的种子细胞是组织工程 最基本的要素 目前组织工程化组织的构建主要是应用自体组织的同源细胞作为种子细胞来 源 尽管存在来源有限 易老化 不易大量扩增以及取材时对机体造成创伤等弊病 自体或 异体的同源干细胞仍不失为组织工程种子细胞来源较理想的途径之一 目前 组织工程化的 皮肤 骨骼构建研究已有所进展 从二维结构发展三维结构 动物实验也取得了较好的成 效 给临床应用带来了希望

217 ３７６ 细胞生物学 一 组织工程化皮肤 持久性的组织修复必然需要具有连续不断地自我更新旺盛的干细胞 造血干细胞是自我 更新强烈的代表性典范之一 同样 皮肤中角质细胞 ｋ 的前体细胞在体外培养 时 常形成三种类型的克隆 完全克隆 局部克隆 ｍ 和辅助克隆 这三种克隆的自我更新和产生分化表皮的能力有所不同 只有完全克隆才是 真正的干细胞群落 有超常的自我更新能力 而局部克隆和辅助克隆却没有这种能力 前者 是短暂性扩增的细胞群落 后者是开始衰老或分化中的细胞群落 因此 实际上 只有少量 而纯净的 产生 完全克隆 的细胞可被选作为皮肤移植的种子细胞 而且 近来已证明 Ｐ６３蛋白是角质细胞的干细胞标志 可以作为大量培养角质干细胞筛选的指标 鉴于皮肤的 生理结构较为简单 用合适的生物活性材料构建成类似皮肤样形态的支架 先后种植上皮肤 成纤维细胞和角质干细胞 然后移植入受损皮肤部位 继续保持产生 完全克隆 的生长条 件 并使周围神经和微血管伸入其间 这种设想在临床应用是完全有希望的 二 组织工程化骨骼 骨骼比皮肤复杂得多 涉及三维立体结构 骨骼干细胞 ＳＳＣ 取自骨髓基质干细胞 或间充质干细胞 通过体外培养可使其扩增 骨作为一个器官 其所有组织 包括骨 软 骨 脂肪细胞和血发生支持基质 都可在这个模型系统中产生 从培养得到的 ＳＳＣ细胞在 移植前必须在适当的由生物活性材料构建成的三相支架上进一步培养 并结合添加适当的生 长因子如骨形态发生蛋白 ｍ ＢＭＰ 以支持骨再生 这一方法大 多数是有效的 在 ＳＳＣ细胞移植后位置的骨损害可以得到较好的修复 至少比仅由骨损害 部位残存的干细胞自发性修复快 这已在人类骨缺损病例中做了初步的观察 三 骨髓与组织工程 骨髓作为一个器官对组织工程中未来技术发展起着极为重要的作用 这不仅因为它是已 知至少含有两类干细胞 ＨＳＣ 和 ＳＳＣ 的唯一器官 而且发现它也是许多远距离组织中一 些前体细胞的来源器官 能够产生血管 骨 软骨 骨骼肌 心肌和肝以及神经等细胞 表 ９ １ 特别是骨髓的 ＨＳＣ和 ＭＳＣ ＳＳＣ 具有不可想像的生肌 ｍ 和生心肌 ｍ 的潜能 而纯化的 ＨＳＣ能产生肝细胞 ＳＳＣ可能产生神经元或神经胶 质细胞 因此 人们通常认为骨髓中具造血功能的干细胞可能是一种真正的多潜能干细胞 在组织工程化各种组织和器官构建中 可优先考虑选作种子细胞来源 组织工程化的组织和 器官构建中 应用骨髓干细胞作为种子细胞的主要优点是容易从成年机体收集和体外培养 因 ＨＳＣ具有表面标志 容易与 ＳＳＣ分离和纯化 特别是自体骨髓作为种子细胞 可直接 克服免疫排斥问题 虽然上述细胞的组织工程化在临床直接应用尚有较长一段路要走 但是 这些研究将促使人们去思索有关成体干细胞的一些基本科学问题的研究 例如成体干细胞的 可塑性 问题 除了理论问题以外 组织工程化组织的构建还处在初步阶段 尤其是组织 工程化组织的功能恢复等问题的资料更少

218 第十五章 细 胞 工 程 ３７７ 再生医学和组织工程的发展将是十分诱人的 美国人类基因组科学公司的主席和首席执 行官 Ｈ 认为 再生医学将包括 ４ 个阶段 第一阶段是模拟生长因子的作用来刺激机 体的自我修复功能 第二阶段是在鉴定出必需的生长因子后在体外培植组织或器官用于移 植 第三阶段将包括通过重建细胞的生物钟 使老年组织返老还童的技术 第四阶段将会是 探索纳米技术和材料科学的新发展 这些新技术的发展将使人类可能构建出细胞 器官和组 织的新部件 与人体自然组成浑然一体的新组合 四 细胞治疗 一 概述 细胞治疗是用遗传改造过的人体细胞直接移植或输入病人体内 达到控制和治愈疾病为 目的的治疗方法和手段 遗传改造包括纠正病人中存在的基因突变 或使所需基因信息传递 到某些特定类型细胞 目前常说的基因治疗技术虽然能把编码正常序列的基因导入突变细 胞 从而使突变基因的功能得到纠正 但导入基因的整合和表达难以精确控制 特别是该基 因插入对其他细胞基因产生的效应尚无法预知 更大的问题是许多被用作基因操作的细胞在 体外不易稳定地被转染和增殖传代 人 ＥＳ细胞不仅在体外有自我更新的能力 而且也能产 生一些分化类型细胞的干细胞 即使经遗传操作后一般仍能稳定地在体外增殖传代 克服了 目前基因治疗中需大量靶细胞来源的主要问题 为克服异体移植中的免疫排斥反应 首先将人 ＥＳ 细胞进行 ＭＨＣ 基因操作 建立可供 移植对象配对选择的各种 ＭＨＣ 组合的 ＥＳ 细胞库 在这基础上 根据不同的移植对象和要 求 或直接定向诱导分化为功能性细胞 如神经细胞 神经胶质细胞 软骨细胞等 或定 向诱导分化为组织干细胞 如造血干细胞 神经干细胞等 这类组织干细胞也可直接取材 于成体组织或器官 通过进一步遗传操作 改造和修正 ＥＳ细胞基因组 再定向诱导分化为 组织谱系干细胞或特定的分化细胞 最终移植输入患者 另一种途径是将患者的体细胞核导 入去核卵细胞 体外发育至胚泡期 从中分离培养出供核患者专用的 ＥＳ细胞 再经诱导产 生所需的分化类型的细胞 回输给供核的患者 同样也避免了免疫排斥问题 但这种途径在 实际应用中遇到核移植和建立特定 ＥＳ细胞的增值问题 新近有人设想将患者的体细胞核直 接导入去核 ＥＳ或 ＥＧ 细胞 培养专用 ＥＳ 细胞 因为体细胞核的遗传程序可再程序化 导 入的细胞核按核供者的遗传信息指导 ＥＳ细胞增殖和分化 美英等国已有数家商业机构利用 ＥＳ细胞技术制备和供应临床治疗用的不同类型细胞 表明 ＥＳ 细胞工程成为新兴的商业竞 争热点 将在临床医学中产生巨大的经济效益和社会影响 二 细胞治疗的临床应用 １ 血液病 珠蛋白 在血液中主要是转输氧 哺乳类珠蛋白在不同的发育阶段 有不同形式的表达 ε 珠蛋白基因仅在胚胎红细胞中表达 在正常成年体内并不表达 这种 ε 珠蛋白基因在镰刀状血细胞病人中被激活时 则能封阻含有镰刀状血细胞血红蛋白的红细 胞被镰刀状化 ＥＳ细胞及其基因操作的研究有可能回答如何在成年镰刀状血细胞病人中启

219 ３７８ 细胞生物学 动ε 珠蛋白基因表达的问题 从而阻止疾病进一步进展 ＥＳ 细胞和造血干细胞研究也有助 于产生供细胞治疗移植用的 不含有镰刀状血细胞突变的血细胞 ２ 神经系统疾病 各种类型神经细胞 神经元 因某种原因死亡 成熟神经元不能分 裂 补充和替代那些死亡的细胞从而引起多种神经系统疾病 Ｐ ｋ 病是因缺损产生 神经递质多巴胺的神经元 Ａ ｚ ｍ 病是因丧失产生乙酰胆碱的神经元 Ｈ 病是缺失产生 γ 氨基丁酸的神经元 若产生髓磷脂的神经元死亡 则引起多发性硬化症 若激活肌肉的运动神经元丧失 则引起肌萎缩性侧索硬化症 科学家已成功地从脑部产生多 巴胺的区域分离出分泌多巴胺的前体细胞 并在体外培养系统中进一步增殖 然后移植入患 有实验性 Ｐ ｋ 病的鼠类脑部 则动物明显地改善了对运动和动作的控制及协调性 产生多巴胺的神经干细胞已能从小鼠 ＥＳ 细胞衍生而来 为用 ＥＳ 细胞治疗 Ｐ ｋ 病 提供了实验依据 同样 应用 ＥＳ细胞在实验性治疗多发性硬化症方面也取得重要结果 同 时 功能恢复实验也证明 接受细胞治疗的大鼠的后肢持重和运动协调性也有很大改善 在 人 ＥＳ细胞建系成功后 人们正在探索发展和培养神经胶质细胞 星形胶质细胞和少突神经 胶质细胞 以用于临床神经损伤的病人 ｗ ｍ 成 ３ 肝病 通过转基因途径将人肝干细胞导入生长促进基因 为永生化细胞时 可在体外大量增殖 同时保留着分化为肝细胞的能力 这些细胞被移植入 肝病动物模型 则改善了动物的肝功能 但是 利用永生化的细胞作细胞治疗时 却存在着 易发生肿瘤的危险 有人提出在细胞永生化的同时 给 予 一 种 药 物 激 活 细 胞 自 杀 基因 使永生化细胞被控制在一定数量范围内 可能避免或减少生瘤的危险性 ４ 骨和软骨疾病 ＥＳ和 ＥＧ 细胞可能在体外培养系统中被诱导发育成为骨和软骨 然 后这些细胞被导入骨关节炎患者的关节软骨损伤区域 或者导入因骨折或手术而引起的较大 骨隙中 这类从 ＥＳ细胞衍生的骨和软骨细胞在被移植部位自我修复的优点远远超过现行的 组织 移 植 这 种 方 法 有 希 望 治 疗 骨 和 软 骨 的 遗 传 缺 损 例 如 成 骨 不 全 症 和各种软骨发育异常 等骨和软骨的疾病 ｍ

220 附录一 英汉名词对照 ３７９ 附录一 英汉名词对照 Ａ Ａ Ｌ ｗ ｋ 列文虎克 １ ｍ 酸性的突出结构域 ｊ １６１ ｍｍ ｍ ＡＩＤＳ ｑ 艾滋病 ３７３ ｍ 顶体 ２４６ ＡＣＴＨ 促肾上腺皮质激素 ２４２ 肌动蛋白 １４７ ｘ 肌动蛋白皮层 １５４ ＡＤＦ 肌动蛋白解 ｍ 聚因子 １５３ ｍ ｍ 肌动蛋白单 体结合蛋白 １５３ ｍ ＡＢＤ 肌动蛋白结合区 １７６ ｍ Ａ 抗霉素 Ａ ２１２ 肌动蛋白相关蛋白 １５４ 激活蛋白 ２５８ 主动运输 ５５ ｊ 锚定连接 ６５ ｋ 锚定蛋白 １５４ ｘ 膜联蛋白 ２６１ 抗凋亡基因 ３１７ 反编码链 １２６ 反密码子 ３０ 反向协同 ５８ 表达反意 ３０２ 反义链 １２６ 细胞凋亡 ４ Ａ 凋 亡蛋白酶活化因子 ３１７ 凋亡 ３０４ 凋亡小体 ３１４ 星体 ２６７ ｍ 星体微管 ２６７ 不对称分裂 ３２４ ｍｍ ｍｍ 不对称性 ４９ ｍ ｍ ＡＦＭ 原子力显微镜 ８ 腺苷酸环化酶 ２５８ ｊ 粘着连接 １５４ ｍ 接合 １５６ 衰减 ３０２ ｍ 附着核糖体 ２２３ ｍ ＡＭ 粘附分子 ９４ 辅剪切蛋白 １５３ 自溶作用 ２４７ ｍ 自噬性溶酶体 ２４５ ｘ 有氧氧化 １９４ ｍ ｍ ＡＥＲ 无 ｍ 自噬体 ２４５ 自噬作用 ２４６ 颗粒内质网 ２２８ Ｂ 醛缩酶 １９６ 细菌 ３５ 带纹 １１７ 选择性剪接 １３１ ｍ 扁囊 ２２７ ｍ ＲＮＡ 氨酰ＲＮＡ １３７ ｍ 无丝分裂 ２６５ ｍ ｍ 变形运动 阿米巴运动 １５７ 后期 ２６８ ｍ ｍ ｘ ＡＰＣ 促后期复 合物 ２７９ 碱基对 １１６ ｍ ｍ 微管结合结 构域 １６１ ｍ ｋ ｍ ２ ２ Ｂ 细胞 ｍ 淋巴瘤 白血病 ２ ３１６ ｍ ｍ 带状桥粒 ６６ Ｂ 结合蛋白 ２３０

221 ３８０ 细胞生物学 ｍｍ 生物膜 ４０ １ ３ Ｂ １ ３ ＢＰＧ １ ３ 二磷酸甘油酸 １９６ 二价体 ２７２ ＢＭＲ 基础代谢率 ２１３ ｍ ＢＭＰ 骨形态发 生蛋白 ３７６ ｘ 细胞皮层 １５４ 细胞培养 ２０ 细胞周期 ２７５ ｍ 细胞决定 ２９４ 细胞分化 ２９３ ３２１ 细胞分裂周 期基因 ２８５ 发芽 ３１４ ｋ 批量内吞 ６０ 细胞工程 ３４３ 细胞分级分离 １８ 集束蛋白 １５３ ｚ 起泡 ３１４ 细胞融合 ２０ ３４３ ｚ 细胞杂交 ２０ Ｃ Ｃ２ ｍ ｍ 钙离子依赖的粘附分子家族 ９８ ＣＡＡＴ ｘ ＣＡＡＴ 框 １２６ 钙粘连素 ９５ ９９ ｍ Ｉ ｍ 钙离子依赖 的外源凝集素功能区 ９７ ｍ 磷酸钙共 沉淀法 ３５１ ｍ 钙调蛋白 １５２ ２６０ ＣＭＫ 钙调素依赖性激酶 ２６１ ＡＭＰ ｍ ＡＭＰ应答元件 ２５７ ＡＭＰ ｍ ＡＭＰ 应答元件结合蛋白 ２５７ 戴帽 １３１ 封端蛋白 １５３ 荚膜 ３５ 捕获 １５ ｍ 生心肌 ３７６ 载体 ５５ 载体蛋白 ５１ ｍ ｍ ＣＡＲＤ 募 集结构域 ３１８ Ｋ 转换数或催化常数 ３６７ ｊ 细胞连接 ６３ ｍｍ 细胞膜 ３６ ４０ 细胞表面 ６３ Ｔ 细胞学说 １ ｗ 细胞壁 ３５ 细胞自杀 ３７８ ｍ 细胞信号转导系统 ２５２ 细胞衰老 ３０４ Ｃ 细胞癌基因 ２８６ 纤维素 ２８ ｍ 中心法则 １２３ 中心粒 ３８ １６８ ｍ 着丝粒 １０７ ２６７ ｍ 中心体 ３８ 通道蛋白 ５１ ｋ 调控点 ２７９ ｍ 化学突触 ６８ ｍ ｍ 化学渗透学说 ２１０ ｍ 交叉 ２７３ ｍ ｍ 嵌合动物 ３６２ 几丁质 ２８ 叶绿体 ３８ 胆固醇 ４３ 软骨发育异常 ３７８ ＣＳ 硫酸软骨素 ８９ 软骨粘连蛋白 ８６ 细胞 １ ｍ ＣＡＭ 细胞粘附分子 颗粒 １８４ ｍ 染色单体 １１２ ９４ ｍ 染色单体 １１２ ｍ 染色质 ３７ １０５ 细胞生物学 １

222 附录一 英汉名词对照 ３８１ ｍｍ 染色粒 ２７２ ｍ ｍ 染色体 ３７ １０５ 收缩环 ２７０ ｚ ｍ 核心酶 １２７ ｍ ｍ 染色体显带术 １１７ ｍ ｍ 显带技术 １１７ 核小体核心颗粒 １１１ 肾上腺皮质激素 ２４９ 纤毛 ６９ １６６ ＣＮＴＦ 睫状神经营 ｍ 共转化技术 ３５３ 协同运输 ５７ 养因子 ３５５ 联偶 １５ 横桥 １５５ 顺面 ２３５ ｍ 顺式作用元件 １４０ Ｇ ｗ ｋ ＣＧＮ 顺面高尔基网络 ２３５ 扁平囊 ２３５ 柠檬酸 １９８ 柠檬酸合成酶 １９８ 三羧酸循环或柠檬酸循环 １９８ 包涵素被 ２４１ ｗ 分裂沟 ２７０ １ ６ １ ６ 二磷酸果糖裂解反应 １９６ 克隆 ３４７ 有被小窝 ６０ ｋ 直立 １５６ 编码链 １２６ 螺旋化螺旋 １４１ ｍｍ 双股超螺旋二聚体 １７３ 秋水仙碱 １６６ 胶原 ７２ ｍ ＣＦＵ Ｓ 脾集落 形成单位 ３３７ ｍｍ 定向分化 ３５８ 普通缺失 ２１８ ｍｍ ｋ 交联蛋白 １５３ ｋ Ｃｋ 细胞周期蛋白 依赖激酶 ２８０ 胞质环流 １５７ 细胞松弛素 １５０ ｍ 细胞化学 ５ ｍ 细胞化学技术 １５ ｍｃ ｘ ＣＯＸ 细胞色素 Ｃ 氧 化酶 １８９ ｍｃ Ｃ Ｃ 细胞色素 Ｃ ３１８ ｍ 细胞动力学 ６ 细胞生态学 ６ 细胞能力学 ６ 细胞遗传学 ５ 细胞学 １ ｍ 细胞形态学 ５ 细胞生理学 ５ ｍ 细胞质 ３６ ３７ ｍ 细胞间胞质间桥 ３３３ ｍ ｍ ｘ 细胞质基质 ３７ 吞排作用 ５９ ｍｍ ｊ 通讯连接 ６４ ６６ 区隔 区室 ２２１ ｍ ｍ ｋ 细胞骨架 ３８ １４６ 细胞社会学 ５ ｍ ｍ ｚ 区隔化 ３６ ｍ ｍ 补体结合蛋白 ９７ 胞质溶胶 ３７ Ｄ 分泌泡或浓缩泡 ２３６ ｍ ｍ 条件培养基 ３５５ ｋ ｍ 暗视野显微镜 １０ ｍ ｘ ＤＩ ＳＣ 死亡 ｍ 结构 或恒定 异染色质 １０９ 诱导信号复合物 ３１８ 基本的表达 ３００ 收缩蛋白质 １４７ 缢环 １５６ 去分化 ３２６ ｘ ｗ 组成型外排途径 ６２ ｍ 退化消除 ２１８ 衰减子 １４０

223 ３８２ 细胞生物学 缺失 ２１７ 致密颗粒 １８７ Ｅ 密度梯度离心法 １８ 初级细胞板 ２７０ ｍ ｋ 类外胚层 ３５７ 弹性蛋白 ８６ ｘ 脱氧胆酸 ２０５ ｘ ＤＮＡ 脱氧核糖核酸 ２８ ｍ ｚ ｍ ｍ 电 镜酶细胞化学 １５ 丢失 ２１７ ｍ ＤＳ 硫酸皮肤素 ８９ ｍ 电子传递体系 ２２９ 电激 ３４４ ｍ ｋ 板桥蛋白 １７６ ｍ ｍ 桥粒 ６５ 延长期 １６２ ｍ 胚胎诱导 ２９７ ｍ 决定子 ２９６ ｘ ｍ 地塞米松 ３６０ ｍ ｍ ＥＧＣ 胚胎生殖细胞 ３２８ ｍ 胚胎有核红 ｋ 终变期 ２７４ ｍ 双丁酰基环腺苷磷酸 ３５９ ＢＡＭＰ ｍ 双香豆素 ２１２ ｘ ｍ ＤＣＣ 二环己基碳 二亚胺 ２１２ 差速离心法 １８ ｋ ｍ ＤＩＡ ＬＩ Ｆ 细胞分化抑制 因子 白血病抑制因子 ３３０ ＤＩ Ｆ 分化抑 制因子 ３５５ ｘ ＤＩＧ 地高辛 ２２ ｘ ＤＨＡＰ 磷酸二羟丙酮 １９６ ＤＮＰ ２ ４ 二硝基酚 ２１２ ｍ 二联微管 １６１ 双线期 ２７４ 直接分裂 ２６５ ＮＡ ｍ ＤＮＡ 识别结构域 １４１ ｋ 停泊蛋白 ２２９ 多萜醇 ２３１ ｍ ｗ 结构域互换 ３６８ 背唇 ３５７ 重复 ２１７ ｍ 非稳态动力学模型 ｍ １４９ ｍ 动力蛋白臂 １６７ ｘ 脱氧核糖 ２７ 细胞 ３３７ ｍ ｍ ＥＳＣ 胚胎干细胞 ３２１ ３６２ 内吞作用 ５９ ｍ ｋ 内胚层样 ３５７ ｍ 内体性溶酶体 ２４１ ２４５ ｍｍ ｍ 细胞的内膜系统 ２２１ ｍｍ ｍ 内膜系统 ３６ 内源性核酸内切酶 ３１５ ｍ ｍ ＥＲ 内质网 ３７ ２２７ 增强子 １２６ 烯醇化酶 １９７ 诱捕载体 ３７２ ｍ ｚ ｍ 酶 １５ ｚ ｍ ｍ 酶细胞化学技术 １５ 伊红 ８ 嗜酸细胞 ３３８ ｍ ｗ ＥＧＦ 表皮生 长因子 ８５ ２８３ ３４０ ｍ ｗ ｋ ｍ 表皮生长因子 样功能区 ９７ ｍ ｍ 表皮干细胞 ３２７ ３４１ ｍ ｍ ｘ ＥＢＳ 单纯性大 泡性表皮松解症 １８１ ｍ 平衡期 １４９ ｑ 红细胞 ３３８ 蚀刻 １３ ｍ 常染色质 １０９

224 附录一 ｋ 真核细胞 ３４ ｘ Ｅ 位点 １６４ ｘ 外排作用 ６１ ｘ 外显子 １２５ ｘ ｍ ｘ ＥＣＭ 细胞外基质 ７１ ３２７ 异染色质 力产生 １５６ ｍ 形成面 ２３５ 片段化 ３１５ ｍ 断裂蛋白 １５３ ｍ 自由扩散 ５２ ｍ 游离核糖体 ２２３ ５４ ｚ 冷冻蚀刻技术 １３ ｚ 冰冻断裂技术 １３ １０９ ６ Ｆ ６ Ｐ ６ 磷酸果糖 １９５ 延胡索酸 Ｆｍ ２００ Ｆ 易化扩散 ｍ 功能 或兼性 英汉名词对照 ３８３ ｍ ｍ 家族性肠息 肉腺癌 ３４２ 融合基因 ３６１ Ｆ Ｌ Ｆ 配体 ３２０ 束捆蛋白 １５３ 缝隙连接 ６６ ｊ 原肠胚 ３５７ ＧＣ ｘ ＧＣ 框 １２６ ＦＣＣＰ 羰基 氰 对 三氟甲氧基苯肼 ２１２ 饲养细胞 ３４４ 饲养层 ３５５ ｍ 鞭毛 ６９ １６６ ｍ 纤维成分 １２０ ｗ １ ＦＧＦ １ 成纤维细 胞生长因子 １ ３３８ 纤维粘连蛋白 ７７ 聚纤蛋白 １７６ Ｇ 明胶 ３６０ 凝溶胶蛋白 １５３ 基因簇 ４２４ ｋ ｋ 基因敲进 ２３ ３３１ ｋ ｋ 基因敲除 ２３ ３３１ 基因打靶 ３３２ ｍ 遗传程序 ３５８ ｍ 基因组 １１６ ２９５ ｍ Ｆ 纤维状肌动蛋白 １４７ ｍ 细丝蛋白 １５３ 红细胞血影 ３５２ ＧＦＡＰ 胶质原 ｍ 丝状假足 １５４ ｍ 毛缘蛋白 １５３ 纤维酸性蛋白 ３４０ ＦＲＰ 最终反应产物 １５ ｋ 侧翼序列 １２５ ｑ 翻转酶 ２２３ ｗ ｍ ＦＣＭ 流式细胞仪 １７ ｗ ｍ 流式细胞计量术 流式细胞术 １７ ｍ ｍ 液态镶嵌模型 ４７ 荧光 ９ ｍ 荧光显微镜 ９ 荧光激活细 胞分类器 ３５４ 掺入因子 １５３ 粘着斑 １５４ 珠蛋白 ３７７ Ｇ 球状肌动蛋白 １４７ 糖原 ２８ 糖脂 ４１ ６ Ｇ ６ Ｐ ６ 磷酸葡萄糖 １９５ 转运载体 ＧＬＵＴ １ １ １９４ ＧＬＵＴ ４ 转运载体 ４ １９４ ３ ＧＡＰ ３ 磷酸甘 油醛 １９６ ３ ３ 磷 酸甘油醛脱氢酶 １９６ Ⅱ Ⅱ型糖原累 积病 ２４８ ｍ ＧＡＧ 氨基聚糖 ８７

225 ３８４ 细胞生物学 Ｇ 高尔基体 ３７ ２３５ Ｇ 高尔基复合体 ２３５ Ｇ ｍ ｘ Ｇ ｋ 高尔基堆 ２３５ ｍ ＧＲＨ 促 Ｉｍ １ ｍ ２ 异二聚体内膜蛋白酶 １９２ ＲＮＡ ＲＮＡ 核内异 质 ＲＮＡ １３０ 性腺激素释放激素 ３３４ ｋ 异核体 ２０ ｋ 异型核 ３４７ 生精母细胞 ３３２ ｍ 颗粒成分 １２０ ｍ ｍ 异源染色体 ２７２ ｍ 异噬性溶酶体 ２４５ ｍ ｍ ＧＥＲ 颗粒 内质网 ２２８ 异噬作用 ２４６ ｘ ｋ ＨＫ 己糖激酶 １９５ 粒溶作用 ２４８ ｗ ｍ ＧＨ 生长激素 ３７１ ｗ 生长期 １４９ ｍ ＨＶＥＭ 高 压电子显微镜 １３ ｗ ｍ 生长促进基因 ３７８ ＧＴＰ Ｇ 蛋白 ２５５ 鸟苷酸环化酶 ２５９ Ｈ Ｈ 重链 １８９ 发夹结构 １２８ ｍ ｍ 嗜盐菌 铰进 ２１２ １９４ ｍ 头部区 Ｎ 端 １７２ ｋ ＨＳＰ 热休克蛋白 ２３０ 解螺旋酶 １２８ ｘ ｘ ＨＬＨ 螺旋 环 螺旋结构 域 １４２ ｘ ｘｍ α螺旋 转角 α螺旋 结构域 １４２ ｍ 造血祖细胞 ３３７ ｍ ｍ ＨＳＣ 造血干细胞 高度重复序列１０７ ｑ ｍ 组织化学 １５ 完全克隆 ３７６ ｍ ｘ ｘ 同源异形盒基因 ３７２ ３２１ ｍ 自体稳定性 ｍ ｋ 同核体 ２０ ｋ 管家基因 ３００ ｋ 管家蛋白 ３００ ｍ ｍ ｍ ＥＳＣ 人胚胎干 细胞 ３２８ ｍ ｍｍ ＨＩＶ 人类免 疫缺陷病毒 ３７３ ｍ ｍ ｗ ＦＧＦ 人重组碱性成纤维细胞生 长因子 ３２８ ｍ ｍ ｋ ｍ 人重组白血病抑制因子 ＬＩ Ｆ ３２８ ３２３ ３３６ ３５９ 透明质酸蛋白 ８６ ＨＡ 透明质酸 ８９ ｍ ｘ 苏木精 ８ ｍ ｍ ｍ 半桥粒 ６５ 杂种细胞 ２０ 高异倍性 １４４ 肝素 ８７ 硫酸乙酰肝素 ８７ 超二倍体 １４４ 亚二倍体 １４４ ｍ 肝干细胞 ３４２ Ｂ ＨＢＶ 乙型肝炎病毒 ３７４ 异性活化 ３１８ ｍ 异染色质 １０９ ｍ 异源双体 ９６ ｍ ｍｍ Ｉ 核仁组织区 １２０ 独特型 ３５０ Ｉ Ｆ 起始因子 ２２４ Ｉ Ｆ Ｉ ＦＡＰ 中间纤维结合 蛋白 １７４

226 附录一 英汉名词对照 ３８５ ｍ 成虫盘 ２９５ ｍｍ ｍ 免疫细胞化学 １６ 萄糖的异构反应 １９５ ｍｍ ｍ ＩＧＳＦ 免疫球蛋 白超家族 ９８ Ｊ Ｅ Ｐ ｋ 普金耶 ２ ｊ Ｊ Ｂ 詹纳斯绿 Ｂ １８４ ｍｍ ｍ 免疫组织化学 １６ ｚ ｍ ＳＨＨ 原 Ｉ 位杂交组织化学 ２２ ｚ Ｉ ＳＨ 原位核酸分子杂交 简称原位杂交 ２２ 间接分裂 ２６６ ｍ 消炎痛 ２４９ 诱导者 ２９７ ＩＡＰ 凋亡抑制因子 ３１３ 抑制型 Ｇ 蛋白 ２５６ Ｇ ＩＲＰ 初级反应产物 １５ ｍ ＩＣＭ 囊胚内细胞团 ３２１ ｍｍ 内膜 １８６ ｍｍ 内膜亚单位 １８７ ｍｍ 内核膜 １０３ ｍ 无机化合物 ２６ 胰岛素受体 ２６２ 整体 ９５ 整合素 ６５ ｍ 整合素家族 ９５ Ｊ Ｋ ｋ ｍ 核型图 １１７ ｋ 核型 １１７ ｋ ＫＳ 硫酸角质素 ８９ ｋ 角质细胞 ３７６ ｋ 角蛋白 ６５ ３４１ ｋ ｚ ｍ 关键酶 １９５ Ｋ 驱动蛋白 １６５ ｋ ｍ 动粒微管 ２６７ ｋ 动粒 ２６７ Ｌ 套索状 １３１ ｚ Ｌ Ｚ 亮氨酸拉链 １４１ Ｌ 轻链 １８９ 标记滞留细胞 ３４１ 乳酸 １９４ 梯状条带 ３１５ 延迟期 １６２ ｍ ｍ 片状伪足 １５４ 分裂间期 ２７５ ｋ ＩＬ 白细胞介素 ２８３ ｍ 核纤层蛋白 １０４ ｍ ＬＮ 层粘连蛋白 ８２ ｋ １β ｚ ｍ ＩＣＥ 白细胞 介素 １β转化酶 ３１７ Ｌ Ｌ 精氨酸 ２６０ ｍ ＬＳＣＭ ｍ ｍ Ｉ Ｆ 中间纤维 １４６ 膜间隙 １８７ ｍｍ 内信号肽 ２３１ 嵴内间隙或嵴内腔 １８６ 激光扫描共焦显微镜 １１ ｍ 晚胞内体 ２４１ 枸橼酸铅 １３ １２３ １２５ 或 ｑ ｑ 导肽 前导肽或转运肽 １９０ 反向重复序列 １２６ ｑ ｍ 倒置相差 细线期 ２７２ ｋ ｍ ＬＩ Ｆ 白血病抑制 显微镜 １０ 因子 ３５５ 通道扩散 ５３ 同源性 １６７ 配体 ２５３ 配体门通道 ５３ ｍ ｚ ｘ 磷 酸二羟丙酮的异构反应 １９６ 配体闸门离子通道 ２５４ ｍ ｚ ６ ６ 磷酸葡 ｍ 光学显微镜 ８ ｍ 内含子

227 ３８６ 细胞生物学 ｋ ＤＮＡ 连接线 ＤＮＡ １１１ ｍ 胚胎肢牙 ３１９ ｍ 局部克隆 ３７６ ｍ ｍ ｍ ＭＳＣ 骨髓间充质干 ｍｍ 谱系定型细胞 ３５８ 谱系分化 ３５８ 细胞 ３３８ 谱系祖细胞 ３５８ ｋ ＤＮＡ 间隔 ＤＮＡ １２４ ｋ 连接组蛋白 １１１ ｋ 连接蛋白质 １４７ ｍ ＡＧＭ 中期肾 ３３７ ｍ ｍ 中间体 ３６ ｍ ＲＮＡ ｍｒｎａ 信使 ＲＮＡ ３０ ｍ ｍ ｍ 中着丝粒染色体 １１５ ｍ 中期 ２６８ ｍ 脂筏模型 ４８ 脂褐质 ２４６ Ｍ Ｋｍ 米氏常数 ３６７ 微体 ３８ ２４９ ｍ ＬＰＬ 脂蛋白脂肪酶 ３３９ 脂质体 ４４ ３５２ ｍ ｍ ｍ 微丝结合蛋白 １５０ Ｌ ｍ ｍ 片层结构模型 ４６ ｍ ｍ ｍ ＬＴ ＨＳＣ 长期造血干细胞 ３２４ ｗ ＬＤＬ 低密度脂蛋白 ３７３ ｘ 奢侈基因 ３００ ｘ 奢侈蛋白 ３００ ｍ 淋巴细胞归巢 ９７ ｍ ｘ Ｈ 次黄嘌呤 ３４５ ｍ 溶酶体 ３８ ２４３ Ｍ Ｍ ６ Ｐ ６ 磷酸 甘露糖 ２４１ ｍ 苹果酸脱氢酶 ２００ ｍ ｋ ｍ ｍ 标记染色体 １４４ ｍ ｗ 骨髓腔 ３３８ ｍ ｍ ＭＦ 微丝 １４６ ｍ 显微注射 ３５１ ｊ ｍ 显微结构 ８ ｍ ｍ 微粒体 ２２８ ｍ ｋ 微穗 １５４ ｍ ｚ ＭＴＯＣ 微管组 织中心 １６２ ｍ ＭＴ 微管 １４６ １５９ ｍ ＭＡＰ 微管结 合蛋白 １６１ ｍ ｍ ＭＢＤ 微管结合区 １７６ ｍ 微绒毛 ６９ ５４ ｍ 线粒体嵴 １８６ ｍ 线粒体 ３８ １８３ 微带 １１３ ｍ ｍ ｍ 基质颗粒 １８７ 基质 １８７ ｍ ｘ ｍ 负端 １４７ ｍ ｍ Ｃ 丝裂霉素 Ｃ ３５５ Ｍ Ｊ Ｓ 施莱登 １ ｍ ｍ ＭＰＦ 促成熟因子 ｍ 线 １８４ ｍ 有丝分裂 ２６５ ２７８ ２８１ ｍ 成熟面 ２３５ Ｍ ｘｓ ｚ 舒尔策 ２ ｍ 分裂期 ２７５ ｍ 有丝分裂器 ２６６ ｍ 机械门通道 ５４ ｍ ｋ 巨核细胞 ３３７ ｍｍ ｗ 膜流 ６２ ２５０ １０７ ｍｍ ｍ 细胞膜上的细胞定向决定因子 ３２４ ｍ 减数分裂 ２６５ ｍ ｍ 众数 １４４ ｍ 中度重复序列 ｑ ｍ 分子伴侣 ２３０ ｍ 分子细胞学 ６ ｍ 单克隆抗体 ３４６ ３４７ 镶嵌蛋白 ４５ ｍ

228 附录一 英汉名词对照 ３８７ ｍ ｍ 运动区 １５１ ｍ 微管马达蛋白 １６９ ｚ ＮＯＲ 核仁组织区 １２０ １３３ ｍ ｍ 小鼠胚胎成纤维 细胞 ３５５ 核仁 ３７ １２０ ｋ 核骨架 １０８ ｍｄｎａ 线粒体 ＤＮＡ １８８ ｍ 副中肾管 ２９９ ｍ 核小体 １１１ 细胞核 ２７ ３６ ３７ １０１ ｍ ｍ 多基因家族 １２４ ｍ ｍ 多极螺旋化模型 １１３ ｍ 镜口率 ７ ｍ ＭＰＰ 专能性先祖细胞 ３２３ ｊ 封闭连接 ６４ 嗅球 ３４０ ｍ ｍ ｍ 多能造 血干细胞 ３３６ 少突胶质细胞 ３５９ ｍ 寡聚体 １６２ ｍ 多泡体 ２４６ ｍ ｍ 支原体 ３５ ｍ 寡霉素 ２１２ ｍ ＯＳＣＰ ｍ 髓样结构 ２４６ ｍ ＭＥＲＲＦ 寡霉素敏感蛋白质 ２１０ Ｏ 肌阵挛性癫痫合并破碎红纤维 ２１８ 癌基因 ２８５ 原癌基因相关基因 ３０２ ｍ 生肌 ３７６ ｍ 肌球蛋白 １５１ ＯＲＦ 开放阅读框架 １３７ 细胞器 ３７ Ｎ ｍ 有机化合物 ２７ ｍ 成骨不全症 ３７８ 坏死 ３０４ ｗ ＮＦＧ 神经生长因子 ９４ 巢素蛋白 ３２３ ３５９ ｍ ＮＳＣ 神经干细胞 ３２３ ３２６ ｘ 微管连接蛋白 １６７ ｍ ＮＡＤ 骨粘连蛋白 ８６ Ｏ 乌本苷 ３５５ ｍ 外室 １８６ ｍｍ 外膜 １８６ 烟酰胺嘌呤二核苷酸 ２０３ ｍｍ 外核膜 １０２ 卵圆细胞 ３４２ ｘ 一氧化氮合酶 ２６０ ｘ Ｎ 位点 １６４ 重叠带 ２６８ ｚ ｘ 草酰乙酸 １９８ ２００ 核被膜 ３７ ｍ 核纤层 １０４ ｘ 草酰琥珀酸 １９９ ｍ ｘ 核基质 １１８ ｍ ｘ 核孔复合体 １０３ 成核期 １４９ ｘ ３ ３ 磷酸甘油醛氧化反应 １９６ ｘ 氧化磷酸化 ２０８ Ｐ 核酸 ２８ 类核体 ２４９ 拟核 ３５ 粗线期 ２７３ ｘ 紫杉醇 １６５ ｍ ＰＨＦ 成对螺旋状纤维 ｍ 核仁染色质 １２０ ｍ ｘ 核仁基质 １２０ １８０ ｚ 核仁组织者 １３３ 配对期 ２７３ 辅助克隆 ３７６

229 ３８８ 细胞生物学 被动运输 ５２ 蛋白二硫异构 ２３０ ＰＤＩ ｍ 环状质粒 ３６ 可塑性 ３２５ 肽 ３１ 肽聚糖 ３５ ｗ ＰＤＧＦ 血小板 衍生生长因子 ２８３ 核间隙 １０３ 外周蛋白 ４５ 网蛋白 １７６ 多能细胞 ２９５ ｍ 膜的通透性 ５２ ｍ 通透酶 ５１ ｍ 多能性干细胞 ３２３ ｍ 多能淋巴细胞 ｍ ｘ ｍ 过氧化物酶体 ２４９ ｘ ｍ λ ３３７ ＰＰＡＲλ ２过氧化物酶体增殖激活受体 λ ２ ３３９ 吞噬活动 １５７ 吞噬作用 ５９ ｍ 吞噬性溶酶体 ２４５ ｍ ｍ ＰＭＳＣ 多能 髓性造血干细胞 ３３７ 正端 １４７ ｍ 极间微管 ２６７ Ｐ Ｕ 多聚尿苷酸 １３５ Ａ 多聚腺苷酸 １３２ ｍ 吞噬体 ２４６ ｍ 相差显微镜 １０ 多聚腺苷酸化 １３２ ＰＥＧ 聚乙二醇 ３４４ 细胞表现型 １３９ 鬼笔环肽 １５０ ＰＣＲ 聚合酶链反应 ｍ ２２ ３６５ ｋ ＰＧＫ 磷酸甘油酸 激酶 １９６ ｚ 聚合因子 １５２ ｍ ｚ 聚合期 １５２ ｍ 磷脂酰丝胺酸 ３１３ 磷酸二酯键 ２８ ｍ 多聚核糖体 １３８ ２２３ 种群不对称 ｍｍ 磷酸二酯酶 ２５８ ＰＥＰ 磷酸烯醇式丙酮酸 分裂 ３２４ １９７ ｍ 有丝分裂后细胞 ３４１ ｍｍ 突触后膜 ６８ ｋ ＰＦＫ１ 磷酸果糖激酶１ １９５ 后转译 １９０ 塞尔托利前体细胞 ３３２ ３ Ｐ ３ 磷酸甘油酸 １９６ ｍ 磷酸甘油酸变位酶 ｋ 前角质蛋白 １７７ 前成骨细胞 ３３８ １９７ ｍｍ 突触前膜 ６８ ｍ 原代细胞 ２０ ｘ ｍ 磷酸己糖异构酶 １９５ 磷脂 ４１ ６ ６ 磷 酸果糖的磷酸化 １９５ 葡萄糖的磷酸化 １９５ ＰＴＡ 磷钨酸 １３ 成膜体 ２７０ ｍ 胞饮作用 ５９ ｍ 吞饮泡 ２４６ ｍｍｍ 质膜 ６ ４０ ｍ 第一信使 ２５３ ｍ ｍ 引物 ２３ ｍ ｍ ＰＧＣ 原始生殖细胞 ３２８ ｍ 原纤维 １６０ 前纤维蛋白 １５３ ｍｍ ＰＣＤ 编程性细胞死亡 ３０９ 祖细胞 ３３６ ｋ 原核细胞 ３４

230 附录一 英汉名词对照 ３８９ ｍ 启动子 １２６ １４０ 前期 ２６７ ｍ 重组期 ２７３ 再凝聚期 ２７４ ｍ 蛋白原 ２３９ ｋ Ａ 蛋白激酶 Ａ ２５６ ｘ ｗ 调节型外排途径 ６２ 蛋白质从头设计 ３６５ ３６８ 调控序列 １２７ ｑ 调解蛋白质 １４７ 蛋白质工程 ３６３ ｋ Ｃ 蛋白激酶 Ｃ ２６０ 释放 １５６ 重复序列 １０６ １０７ ｑ 蛋白质 ３１ ｋ 酪氨酸蛋白激酶 ２５４ 复膜 １３ ｋ 复制叉 １０７ 假基因 １２５ ｍ 原丝 １７３ ｍ 质子泵 ２４４ 复制起始点 １０７ 报告基因 ３６１ ｍ 质子动力势 ２０６ 原癌基因 ２８６ 原生质体 ２ ｍ 原生质 ２ ２６ 原型 ３１７ 丙酮酸 １９７ 报告序列 ３６１ ｑ 残余体 ２４５ ３０５ 分辨率 ７ Ｒ 限制点 ２７６ 驻留蛋白 ２２９ 驻留信号肽 ２３０ ｘ ＰＤＣ 丙酮酸脱羧酶 １９７ ｍ Ｒ 儿童视网膜母细胞肿瘤 ２８７ ３０３ ＲＦ 终止因子 ２２４ ｍ 丙酮酸脱氢酶系 １９８ ＲＮＡ 核糖核酸 ２８ 核糖体结合蛋白 ２２９ ｋ ＰＫ 丙酮酸激酶 １９７ Ｑ 糖 ２７ ｍ ＲＮＡ ＲＮＡ 核糖体 ＲＮＡ ３０ ＱＨ 自由基半醌 ２０４ ＱＨ２ 还原型氢醌 ２０４ ｍ 核糖体 ２２１ ｍ 强直构象 １５６ 栎皮酮 ２１２ ｑ Ｒ Ｈ ｋ 胡克 １ ｍ 杆状区 １７２ 鱼藤酮 ２１２ Ｒ Ｒ Ｖ ｗ 魏尔肖 １ 放射自显影 技术 １６ ｍ ｚ ｍ 限速酶 １９５ ｍ 重新结合 １５６ 受体 ２５３ ｍ 受体介导的内吞 ｍ ｍ ＲＥＲ 粗面内质网 ３７ ２２７ ２２８ ＲＮＡ 核糖体 ＲＮＡ ２２１ ｍｍ ｍ 变皱膜运动 １５８ Ｓ ６０ ｍ 肌节 １５５ ｍ ｍ 肌质网 ２３４ ｋ 酪氨酸蛋白激酶受体 ２５４ 随体 １１５ ＤＮＡ 卫星 ＤＮＡ １０７ ｍ 重组节 ２７３ ｍ ＳＥＭ 扫描电子

231 ３９０ 细胞生物学 显微镜 １３ 质网 ３７ ２２７ ２２８ ｍ ＳＰＭ 扫描探针显微镜 ８ 螺线管 １１１ 单一基因 １２４ ｍ ＳＴＭ 扫描隧道 显微镜 ８ １５ ｍ ＡＭ 可溶性粘附 分子 １００ ｚ ｍ ｍ 裂殖酵母 ２８５ ｍ 寻找 捕获模型 １６５ ｍ ｍ 成体干细胞 ３２１ 间距因子 １５３ 分泌因子 ３２６ 选择素 ９５ 挽救受体 ２４０ 血影蛋白 １５４ 选择同步法 ２８８ ｍ 自稳定性 ３２４ ｍ ｍ 精原干细胞 ３３２ 纺锤体 ２６７ ｗ 自我更新 ３２４ ｍ ｍ 半自主性的细胞器 ｍ 剪切体 １３０ 剪切 １３０ １８３ 断裂基因 １２５ ｍ ｍ 点状桥粒 ６５ 衰老相关基因 ４ 有义链 １２６ ＤＮＡ 序列 ｑ 特异性 ＤＮＡ 结合蛋白 １０９ 剪切蛋白 １５３ Ｌｗ 路易斯寡糖 ９８ 旁系 １４４ ｍ １ ＳＳＥＡ １ 胚胎阶段特异性抗原 １ ３２９ 葡萄球菌核酸酶 ３６６ 淀粉 ２８ 稳定期 １６２ 干细胞 ３２１ ｍ ｍ 含铁小体 ２４６ 信号密码 ２２９ ｍ ＳＣＦ 干细胞生长因子 ３５５ ｍ 干细胞巢 ３２６ 信号假说 ２２９ 信号肽酶 １９０ 信号肽 ２２９ ｍ 干系 １４４ ｍ 激动型 Ｇ 蛋白 ２５６ Ｇ ＳＲＰ 信号识别颗粒 ２２９ 终止密码 １３５ 应力纤维 １５４ ｍ 结构域 １４７ 沉默子 １４０ ｍ 简单扩散 ５２ 结构基因 １０６ 传代细胞 ２０ 单微管 １６０ ｍ 姐妹染色单体 １１４ ｍ ｍ ｍ 近中着丝粒染色体 １１５ ｍ 定位突变 ３６５ ｍ 肌丝滑动学说 １５５ 特异性 ３６６ 底物水平磷酸化 ｗ 慢周期性 ３４１ ｍ 小肝细胞 ３４２ １９７ ２０８ ｍ ＲＮＰ 小分子细胞核糖核蛋白颗粒 １３０ ｍ ＲＮＡ ＲＮＡ 小核 ＲＮＡ １３１ ｍ 弥散状 ３１５ ｍ ｍ ｍ ＳＥＲ 滑面内 ｍ ｍ 近端着丝粒染色体 １１５ 亚单位 ２０６ 琥珀酸 ２００ 琥珀酸脱氢酶 ２００ 琥珀酸硫激酶 １９９ ｋ

232 附录一 英汉名词对照 ３９１ ＣＡ 琥珀酰 ＣＡ １９９ 超螺线管 １１２ ｍ ＴＳＰ 血小板反应素 ８６ ｍ Ｔ 胸腺嘧啶核苷 ３４５ 抑癌基因 ２８５ 对称分裂 ３２４ ｍｍ ｍ ４ 胸腺素β ４ １５３ β ｊ 紧密连接 ６４ 组织特异性基因 ３００ 同向协同 ５８ ｍ 联会 ２７３ 突触间隙 ６８ 突触小泡 ８ ｍ ｍ ｘ ＳＣ 联会复合体 ２７２ 全能性 ２９４ ｍ 全能性干细胞 ３２３ 反面 ２３５ 反式作用因子 １４０ ｚ 细胞同步化 ２８８ ｚ 同步分裂 ２８９ ｍ 转录活化结构域 １４１ 转录间隔 １３４ Ｔ 转录 １２３ Ａ ＴＦＡ 转录因子 Ａ ２１７ Ｔ４ ｚ ｍ Ｔ４溶菌酶 ３６６ ｍ 尾部区 Ｃ 端 １７２ 加尾 １３２ ＴＦ 转录因子 １２９ １４０ 转录调控 ３００ 踝蛋白 １５４ ｍ 串联重复基因 １２４ 横向分化 ３２２ 转分化 ３２５ ＴＡＴＡ ｘ ＴＡＴＡ 框 １２６ Ｔ Ｓ 台 萨氏病又称黑蒙性先 ＲＮＡ ＲＮＡ 转运 ＲＮＡ ３０ 运输小泡 ２３５ 天愚病 ２４８ ｍ 运输泵 ５６ ｍ ｗ ＴＧＦ 转化生长 ｍ ｍ 端着丝粒染色体 １１５ ｍ 端粒 １０８ 末期 ２６９ ｍ ｗ 时空性开关 ３０２ 腱蛋白 内动囊 ８６ ｍ 末端结构 ３５ ｍ ｗ 终末网 １５５ ｍ ｚ 交叉端化 ２７４ ｍ 终末分化细胞 ３４１ ｍ 终止子 １２６ 四分体 ２７３ 因子 ２８３ ｍ ｗ β ＴＧＦ β 转化 生长因子 β ３２６ ｍ 转基因动物 ３６１ Ｇ ｗ ｋ ＴＧＮ 反面高尔基网络 ２３６ ｍ 过渡放大细胞 ３２３ ｍ 短暂扩充细胞 ３４１ 翻译 １２３ １３５ 翻译调控 ３０１ ｍ 四聚体 １７３ Ｔ Ｓ ｗ 施旺 １ 转位因子 １９２ ｍ ｍ 透射电子显 密码子限制学说 ３０８ 微镜 １２ Ｔ ｍ 嗜热水生菌 ２３ ｑ ｍ 硫胺素焦磷酸酶 ３０５ ｋｍ ｍ 粗肌丝 １５５ ｍ ｍ 细肌丝 １５５ Ｔ 硫代鸟嘌呤 ３５５ 转运器 ５１ ｍ ｍ 踏车模型 １４９ ｍ 踏车行为 １６５ 三碘甲状腺原氨酸 ３６０ ｍ 磷酸丙糖异构酶 １９６ ３６７

233 ３９２ 细胞生物学 ｍ ｍ 复扩增突变 １０７ 小囊泡 ２３５ 小泡 ２２７ ｍ 三联微管 １６１ 原肌球蛋白 １５５ ｍ 绒毛蛋白 １５３ 纽带蛋白 １５３ 肌钙蛋白 １５５ Ｔ Ｃ 肌钙蛋白 ２６０ 亲玻粘连蛋白 ８６ 电压门通道 ５３ 小管 ２２７ 微管蛋白 １５９ ＶＷＦ 威布兰德因子 ８６ ＧＴＰ 微管蛋白 ＧＴＰ帽 １６３ ｍ 抑癌基因 ３０２ ｗ ｍ ｍ ＷＴ 胚胎肾母细胞瘤 ３０３ ｗ 摇摆 １３８ ｗ 摆动假说 １３８ Ｕ ｍ ｍ 超薄切片机 １２ ｍ 超高压电子 显微镜 １４ 解偶联剂 ２１２ ｍ 单能干细胞 ３２３ 单一序列 １０６ ｑ ｑ ｍｍ 单位膜 ４０ 单位结构 ２２７ 单价体 ２７２ Ｗ ｗ 中肾管 ２９９ Ｙ ｋ 卵黄囊 ３５９ Ｚ ｚ ｍ 锌指型结构域 １４１ ｚ 封闭小带 ６４ ｚ 偶线期 ２７３ 其他 ＤＮＡ Ｓ期外的 ＤＮＡ 合成 ２７８ α１ ＡＡＴ α１抗胰蛋白酶 ３６７ α α 辅肌动蛋白 １５３ α ｘ α螺旋 ３２ 不稳定蛋白 ２７７ 醋酸铀 １３ α ｋ α 酮戊二酸 １９９ β 连环蛋白 ３２６ β Ｕ 尿嘧啶 １３０ ｋ 尿血小板溶素 ３７５ Ｖ 大囊泡 ２３６ β折叠 ３２ β γ ｍ ｘ γｔｒｃ γ 微管蛋 白环形复合体 １６５ π ｘ π螺旋 ３２

234 附录二 汉英名词对照 ３９３ 附录二 汉英名词对照 一 画 一氧化氮合酶 ｘ ２６０ 乙型肝炎病毒 Ｂ ＨＢＶ ３７４ 二 画 小肝细胞 ｍ ３４２ 小分子细胞核糖核蛋白颗粒 ｍ ＲＮＰ １３０ １ ３ 二磷酸甘油酸 １ ３ Ｂ ＢＰＧ １９６ １ ３ 小泡 ２２７ 小核 ＲＮＡ ｍ ＲＮＡ ＲＮＡ １３１ １ ６ 二磷酸果糖裂解反应 １ ６ １９６ 小鼠胚胎成纤维细胞 ｍ ｍ ＭＥＦ ３５５ ２ ４ 二硝基酚 ＤＮＰ ２１２ 二价体 ２７２ 小管 ２２７ 小囊泡 ２３５ 二环己基碳二亚胺 ｘ ｍ ＤＣＣ ２１２ 己糖激酶 ｘ ｋ ＨＫ １９５ 卫星 ＤＮＡ ＤＮＡ １０７ 二联微管 ｍ １６１ 人类免疫缺陷病毒 ｍ ｍｍ ＨＩＶ ３７３ 不对称分裂 ３２４ ｍｍ 不对称性 ｍｍ ４９ 人胚胎干细胞 ｍ ｍ ｍ ＥＳＣ ３２８ 不稳定蛋白 ２７７ 专能性先祖细胞 ｍ ＭＰＰ 人重组白血病抑制因子 ｍ ｍ ｋ ｍ ＬＩ Ｆ ３２８ 人重组碱性成纤维细胞生长因子 ｍ ３２３ 开放阅读框架 ＯＲＦ １３７ 支原体 ｍ ｍ ３５ 无丝分裂 ｍ ２６５ ｍ ｗ ＦＧＦ ３２８ 无机化合物 ｍ ２６ 无颗粒内质网 ｍ 儿童视网膜母细胞肿瘤 ｍ Ｒ ２８７ ３０３ ｍ ＡＥＲ ２２８ 区隔 区室 ｍ ｍ ２２１ 几丁质 ２８ 力产生 １５６ 区隔化 ｍ ｍ ｚ ３６ 引物 ｍ ２３ 三 画 四 画 双丁酰基环腺苷磷酸 三联微管 ｍ １６１ 三碘甲状腺原氨酸 ３６０ ｍ ＢＡＭＰ ３５９ 双线期 ２７４ 三羧酸循环或柠檬酸循环 １９８ 干细胞 ｍ ３２１ 双股超螺旋二聚体 ｍｍ １７３ 双香豆素 ｍ ２１２ 干细胞生长因子 ｍ ＳＣＦ ３５５ 干细胞巢 ｍ ３２６ 中心体 ｍ ３８ 中心法则 ｍ １２３ 干系 ｍ １４４ 大囊泡 ２３６ 中心粒 ３８ １６８ 中间纤维 ｍ ｍ Ｉ Ｆ １４６

235 ３９４ 细胞生物学 中间纤维结合蛋白 Ｉ Ｆ Ｉ ＦＡＰ １７４ 反密码子 ３０ 反编码链 １２６ 中间体 ｍ ｍ ３６ 中肾管 ｗ ２９９ 毛缘蛋白 ｍ １５３ 片层结构模型 Ｌ ｍ ｍ ４６ 中度重复序列 ｍ ｑ １０７ 片状伪足 ｍ ｍ １５４ 片段化 ３１５ ｍ 中着丝粒染色体 ｍ ｍ ｍ １１５ 中期 ｍ ２６８ 长期造血干细胞 ｍ ｍ ｍ ＬＴ ＨＳＣ ３２４ 中期肾 ｍ ＡＧＭ ３３７ 内体性溶酶体 ｍ ２４１ ２４５ 内吞作用 ５９ 半自主性的细胞器 ｍ ｍ １８３ 内含子 ｍ １２３ １２５ 内质网 ｍ ｍ ＥＲ ３７ ２２７ 内信号肽 ２３１ 内胚层样 ｍ ｋ ３５７ 内核膜 ｍｍ １０３ 内源性核酸内切酶 ３１５ 内膜 ｍｍ １８６ 内膜亚单位 ｍｍ １８７ 内膜系统 ｍｍ ｍ ３６ 少突胶质细胞 ３５９ 乌本苷 Ｏ ３５５ 分子伴侣 ｍ ２３０ 分子细胞学 ｍ ６ 分化抑制因子 ＤＩ Ｆ ３５５ 分泌因子 ３２６ 分泌泡或浓缩泡 ２３６ 五 画 半桥粒 ｍ ｍ ｍ ６５ 主动运输 ５５ 头部区 Ｎ 端 ｍ １７２ 丙酮酸 １９７ 丙酮酸脱氢酶系 ｍ １９８ 丙酮酸脱羧酶 ｘ ＰＤＣ １９７ 丙酮酸激酶 ｋ ＰＫ １９７ 可塑性 ３２５ 可溶性粘附分子 ｍ ＡＭ １００ 功能 或兼性 异染色质 ｍ １０９ 去分化 ３２６ 巨核细胞 ｍ ｋ ３３７ 分裂沟 ｗ ２７０ 分裂间期 ２７５ 平衡期 ｍ １４９ ｑ 末期 ２６９ 分裂期 ｍ ２７５ 分辨率 ７ 末端结构 ｍ ３５ 正端 １４７ 化学突触 ｍ ６８ 化学渗透学说 ｍ ｍ ２１０ 艾滋病 ｍｍ ｍ ｑ ＡＩＤＳ ３７３ 反义链 １２６ 反向协同 ５８ 加尾 １３２ 叶绿体 ３８ 反向重复序列 １２６ ｑ 反式作用因子 １４０ 四分体 ２７３ 四聚体 ｍ １７３ 反面 ２３５ 反面高尔基网络 Ｇ ｗ ｋ ＴＧＮ 电子传递体系 ｍ ２２９ 电压门通道 ５３ ２３６ 电激 ３４４

236 附录二 汉英名词对照 ３９５ 电镜酶细胞化学 ｍ ｚ ｍ １５ ｍ 交叉 ｍ ２７３ 交叉端化 ｍ ｚ ２７４ 丝状假足 ｍ １５４ 丝裂霉素 Ｃ ｍ ｍ Ｃ ３５５ 交联蛋白 ｋ １５３ 共转化技术 ｍ ３５３ 再凝聚期 ２７４ 发夹结构 １２８ 发芽 ３１４ 台 萨氏病又称黑蒙性先天愚病 Ｔ Ｓ ２４８ 包涵素被 ２４１ 外周蛋白 ４５ 外室 ｍ １８６ 外显子 ｘ １２５ 外核膜 ｍｍ １０２ 外排作用 ｘ ６１ 外膜 ｍｍ １８６ 对称分裂 ３２４ ｍｍ 生心肌 ｍ ３７６ 生长促进基因 ｗ ｍ ３７８ 生长期 ｗ １４９ 生长激素 ｗ ｍ ＧＨ ３７１ 生肌 ｍ ３７６ 生物膜 ｍｍ ４０ 生精母细胞 ３３２ 白血病抑制因子 ｋ ｍ ＬＩ Ｆ ３５５ 白细胞介素 １β转化酶 ｋ １β ｚ ｍ ＩＣＥ ３１７ 白细胞介素 ｋ ＩＬ ２８３ 鸟苷酸环化酶 ２５９ 六 画 亚二倍体 １４４ 亚单位 ２０６ 成纤维细胞生长因子 １ ｗ １ ３３８ １ ＦＧＦ 成虫盘 ｍ ２９５ 成体干细胞 ｍ ｍ ３２１ 成骨不全症 ｍ ３７８ 成核期 １４９ 成膜体 ２７０ ｍ 成熟促进因子 ｍ ｍ ＭＰＦ ２８１ 成熟面 ｍ ２３５ 成对螺旋状纤维 ｍ ＰＨＦ １８０ 扫描电子显微镜 ｍ ＳＥＭ １３ 扫描探针显微镜 ｍ ＳＰＭ ８ 扫描隧道显微镜 ｍ ＳＴＭ ８ １５ 列文虎克 Ａ Ｌ ｗ ｋ １ 动力蛋白臂 ｍ １６７ 动粒 ｋ ２６７ 动粒微管 ｋ ｍ ２６７ 协同运输 ５７ 地高辛 ｘ ＤＩＧ ２２ 次黄嘌呤 ｘ Ｈ ３４５ 低密度脂蛋白 ｗ ＬＤＬ 地塞米松 ｘ ｍ ３６０ 有丝分裂 ｍ ２６５ ３７３ 有丝分裂器 ｍ ２６６ 有义链 １２６ 米氏常数 Ｍ Ｋｍ ３６７ 决定子 ｍ ２９６ 关键酶 ｋ ｚ ｍ １９５ 冰冻断裂技术 ｚ １３ 光学显微镜 ｍ ８ 光面内质网 ｍ ｍ ｍ ＳＥＲ ３７ 有丝分裂后细胞 ｍ ３４１ 有机化合物 ｍ ２７ 有氧氧化 ｘ １９４ 有被小窝 ６０ 机械门通道 ｍ ５４ 死亡诱导信号复合物

237 ３９６ 细胞生物学 ｍ ｘ ＤＩ ＳＣ ３１８ 过氧化物酶体 ｘ ｍ ２４９ ｍ ＰＭＳＣ ３３７ 多基因家族 ｍ ｍ １２４ 过氧化物酶体增殖激活受体λ ２ ｘ ｍ λ ２ ＰＰＡＲλ ２ 多萜醇 ２３１ 多聚尿苷酸 Ｕ １３５ ３３９ 过渡放大细胞 ｍ ３２３ 异二聚体内膜蛋白酶 ｍ ｍ 多聚核糖体 ｍ １３８ ２２３ 多聚腺苷酸 Ａ １３２ ｍ Ｉｍ １ ｍ ２ １９２ 异性活化 ３１８ 异染色质 ｍ １０９ 异型核 ｋ ３４７ 异核体 ｋ ２０ 异源双体 ｍ ９６ 异源染色体 ｍ ｍ ２７２ 异噬作用 ２４６ 异噬性溶酶体 ｍ ２４５ 收缩环 ２７０ 收缩蛋白质 １４７ 同步分裂 ｚ ２８９ 同向协同 ５８ ｍ 多聚腺苷酸化 １３２ 寻找 捕获模型 ｍ １６５ 导肽 前导肽或转运肽 ｑ １９０ ｑ 延长期 １６２ 延迟期 １６２ 延胡索酸 ｍ ２００ 杂种细胞 ２０ 肌丝滑动学说 ｍ １５５ 肌节 ｍ １５５ 肌动蛋白 １４７ 肌动蛋白皮层 ｘ １５４ 肌动蛋白单体结合蛋白 ｍ ｍ １５３ 同核体 ｍ ｋ ２０ 同源异形盒基因 ｍ ｘ ｘ ３７２ 肌动蛋白相关蛋白 １５４ 肌动蛋白结合区 ｍ ＡＢＤ 同源性 １６７ 网蛋白 １７６ １７６ 肌动蛋白解聚因子 ｍ ＡＤＦ １５３ 丢失 ２１７ 伊红 ８ 众数 ｍ ｍ １４４ 传代细胞 ２０ 全能性 ２９４ 肌阵挛性癫痫合并破碎红纤维 ｍ ＭＥＲＲＦ ２１８ 肌质网 ｍ ｍ ２３４ 肌钙蛋白 １５５ 全能性干细胞 ｍ ３２３ 后转译 １９０ 肌钙蛋白 Ｔ Ｃ ２６０ 肌球蛋白 ｍ １５１ 后期 ２６８ 多极螺旋化模型 ｍ ｍ １１３ 自由扩散 ５２ 自由基半醌 ＱＨ ２０４ 多泡体 ｍ ２４６ 多能性干细胞 ｍ ３２３ 自体稳定性 ｍ ３２１ 自我更新 ｗ ３２４ 多能细胞 ２９５ 多能造血干细胞 ｍ ｍ 自溶作用 ２４７ 自稳定性 ｍ ３２４ ｍ ３３６ 多能淋巴细胞 ｍ ｍ 自噬体 ｍ ２４５ 自噬作用 ２４６ ３３７ 自噬性溶酶体 ｍ ２４５ 血小板衍生生长因子 多能髓性造血干细胞 ｍ

238 附录二 ｗ ＰＤＧＦ ２８３ 血小板反应素 ｍ ＴＳＰ ８６ 血影蛋白 １５４ 负端 ｍ １４７ 红细胞 ３３８ 红细胞血影 ３５２ 纤毛 ６９ １６６ 纤维成分 ｍ １２０ 纤维状肌动蛋白 ｍ Ｆ １４７ 纤维素 ２８ 纤维粘连蛋白 ７７ 七 画 ＡＭＰ应答元件 ＡＭＰ ｍ ２５７ ＡＭＰ应答元件结合蛋白 ＡＭＰ ｍ ２５７ ＤＮＡ 识别结构域 ＤＮＡ ｍ １４１ 沉默子 １４０ 间距因子 １５３ 间隔 ＤＮＡ ｋ ＤＮＡ １２４ 间接分裂 ２６６ 补体结合蛋白 ｍ ｍ ９７ 序列特异性 ＤＮＡ 结合蛋白 ｑ ＤＮＡ １０９ 应力纤维 １５４ 克隆 ３４７ 完全克隆 ３７６ 启动子 ｍ １２６ １４０ 冷冻蚀刻技术 ｚ １３ 初级反应产物 ＩＲＰ １５ 初级细胞板 ２７０ 形成面 ｍ ２３５ 批量内吞 ｋ ６０ 汉英名词对照 ３９７ 拟核 ３５ 杆状区 ｍ １７２ 束捆蛋白 １５３ 吞饮泡 ｍ ２４６ 吞排作用 ５９ 吞噬体 ｍ ２４６ 吞噬作用 ５９ 吞噬活动 １５７ 吞噬性溶酶体 ｍ ２４５ 坏死 ３０４ 苏木精 ｍ ｘ ８ 运动区 ｍ ｍ １５１ 运输泵 ｍ ５６ 运输小泡 ２３５ 还原型氢醌 ＱＨ２ ２０４ 连接线 ＤＮＡ １ ｋ ＤＮＡ １１１ 连接组蛋白 １ ｋ １１１ 连接蛋白质 ｋ １４７ 极间微管 ｍ ２６７ 驱动蛋白 Ｋ １６５ 尾部区 Ｃ 端 ｍ １７２ 尿血小板溶素 ｋ ３７５ 尿嘧啶 Ｕ １３０ 局部克隆 ｍ ３７６ 层粘连蛋白 ｍ ＬＮ ８２ 附着核糖体 ｍ ２２３ 时空性开关 ｍ ｗ ３０２ 串联重复基因 ｍ １２４ Ｅ 位点 ｘ １６４ 位点 Ｎ ｘ １６４ 免疫组织化学 ｍｍ ｍ １６ 免疫细胞化学 ｍｍ ｍ １６ 免疫球蛋白超家族 ｍｍ 抑制型 Ｇ 蛋白 ２５６ Ｇ 抑癌基因 ｍ ３０２ ｍ ＩＧＳＦ ９８ 卵圆细胞 ３４２ 卵黄囊 ｋ ３５９ 抑癌基因 ２８５ 抗凋亡基因 ３１７ 含铁小体 ｍ ２４６ 条件培养基 ｍ ｍ ３５５ 抗霉素 Ａ ｍ Ａ ２１２ 报告序列 ３６１ ｑ 肝干细胞 ｍ ３４２ 肝素 ８７ 报告基因 ３６１ 角质细胞 ｋ ３７６

239 ３９８ 细胞生物学 角蛋白 ｋ ６５ ３４１ 近中着丝粒染色体 ｍ ｍ ｍ １１５ 近端着丝粒染色体 ｍ ｍ １１５ 纺锤体 ２６７ 纽带蛋白 １５３ 细胞信号转导系统 ｍ ２５２ 八 画 单价体 ２７２ 单位结构 ２２７ 单位膜 ｍｍ ４０ 单克隆抗体 ｍ ３４６ ３４７ 单纯性大泡性表皮松解症 ｍ ｍ ｘ ＥＢＳ １８１ 单能干细胞 ｍ ３２３ 单微管 １６０ 单一序列 １０６ ｑ ｑ 单一基因 １２４ 定向分化 ｍｍ ３５８ 定位突变 ｍ ３６５ 底物水平磷酸化 １９７ ２０８ 放射自显影技术 １６ 板桥蛋白 ｍ ｋ １７６ 环状质粒 ｍ ３６ 直立 ｋ １５６ 直接分裂 ２６５ 苹果酸脱氢酶 ｍ ２００ 表皮干细胞 ｍ ｍ ３２７ ３４１ 表皮生长因子 ｍ ｗ ＥＧＦ ８５ ２８３ ３４０ 表皮生长因子样功能区 ｍ ｗ ｋ ｍ ９７ 表达反意 ３０２ 转分化 ３２５ 转化生长因子 ｍ ｗ ＴＧＦ ２８３ 转化生长因子 β ｍ ｗ β ＴＧＦ β ３２６ 转位因子 １９２ 转运 ＲＮＡ ＲＮＡ ＲＮＡ ３０ 转运载体 １ ＧＬＵＴ １ １９４ 转运载体 ４ ＧＬＵＴ ４ １９４ 转运器 ５１ 转录 １２３ 转录因子 ＴＦ １２９ １４０ 转录因子 Ａ Ａ ＴＦＡ ２１７ 转录间隔 １３４ 转录活化结构域 ｍ １４１ 转录调控 ３００ 转换数或催化常数 Ｋ ３６７ 转基因动物 ｍ ３６１ 软骨发育异常 ３７８ 软骨粘连蛋白 ８６ 顶体 ｍ ２４６ 限速酶 ｍ ｚ ｍ １９５ 驻留信号肽 ２３０ 驻留蛋白 ２２９ 弥散状 ｍ ３１５ 限制点 Ｒ ２７６ 肾上腺皮质激素 ２４９ 非稳态动力学模型 ｍ ｍ １４９ 明胶 ３６０ 易化扩散 ５４ 鱼藤酮 ２１２ 饲养层 ３５５ 饲养细胞 ３４４ 乳酸 １９４ 侧翼序列 ｋ １２５ ｑ 姐妹染色单体 ｍ １１４ 肽 ３１ 肽聚糖 ３５ 质子动力势 ｍ ２０６ 质子泵 ｍ ２４４ 质膜 ｍｍｍ ３６ ４０ 线 ｍ １８４ 线粒体 ｍ ３８ １８３

240 附录二 汉英名词对照 ３９９ 线粒体 ＤＮＡ ｍｄｎａ １８８ 线粒体嵴 ｍ １８６ 细胞学说 Ｔ １ 细胞松弛素 １５０ 组成型外排途径 ｘ ｗ ６２ 组织化学 ｍ １５ 细胞的内膜系统 ｍｍ ｍ ２２１ 细胞表现型 １３９ 组织特异性基因 ３００ 细丝蛋白 ｍ １５３ 细胞表面 ６３ 细胞质 ｍ ３６ ３７ 细肌丝 ｍ ｍ １５５ 细线期 ２７２ 细胞质基质 ｍ ｍ ｘ ３７ 细胞骨架 ｋ ３８ １４６ 细胞 １ 细胞工程 ３４３ 细胞凋亡 ４ 细胞核 ２７ ３６ ３７ １０１ 细胞分化 ２９３ ３２１ 细胞分化抑制因子 白血病抑制因子 细胞能力学 ６ 细胞衰老 ３０４ ｋ ｍ ＤＩＡ ＬＩ Ｆ ３３０ 细胞分级分离 １８ 细胞分裂周期基因 ２８５ 细胞化学 ｍ ５ 细胞化学技术 ｍ １５ 细胞外基质 ｘ ｍ ｘ ＥＣＭ ７１ ３２７ 细胞生态学 ６ 细胞生物学 １ 细胞生理学 ５ 细胞皮层 ｘ １５４ 细胞决定 ｍ ２９４ 细胞动力学 ｍ ６ 细胞同步化 ｚ ２８８ 细胞杂交 ｚ ２０ 细胞自杀 ３７８ 细胞色素 Ｃ ｍｃ Ｃ Ｃ ３１８ 细胞色素 Ｃ 氧化酶 ｍｃ ｘ 细胞培养 ２０ 细胞粘附分子 ｍ ＣＡＭ ９４ 细胞遗传学 ５ 细胞膜 ｍｍ ３６ ４０ 细胞膜上的细胞定向决定因子 ｍｍ ｍ ３２４ 细胞器 ３７ 细胞壁 ｗ ３５ 细胞融合 ２０ ３４３ 细胞癌基因 Ｃ ２８６ Ｂ 细胞淋巴瘤 白血病 ２ Ｂ ｍ ｋ ｍ ２ ２ ３１６ ｍ 细菌 ３５ 终止子 ｍ １２６ 终止因子 ＲＦ ２２４ 终止密码 １３５ 终末分化细胞 ｍ ３４１ 终末网 ｍ ｗ １５５ ＣＯＸ １８９ 细胞形态学 ｍ ５ 终变期 ｋ ２７４ 细胞社会学 ５ 细胞连接 ｊ ６３ 亮氨酸拉链 １ ｚ Ｌ Ｚ １４１ 亲玻粘连蛋白 ８６ 细胞间胞质间桥 ｍ ３３３ 细胞周期 ２７５ 前成骨细胞 ３３８ 前纤维蛋白 １５３ 前角质蛋白 ｋ １７７ 细胞周期蛋白依赖激酶 ｋ Ｃｋ ２８０ 细胞学 １ 九 画 前期 ２６７ 变形运动 阿米巴运动 ｍ ｍ １５７

241 ４００ 细胞生物学 变皱膜运动 ｍｍ ｍ １５８ 扁平囊 ２３５ 荚膜 ３５ 荧光 ９ 扁囊 ｍ ２２７ 施旺 Ｔ Ｓ ｗ １ 荧光显微镜 ｍ ９ 荧光激活细胞分类器 施莱登 Ｍ Ｊ Ｓ １ 染色体 ｍ ｍ ３７ １０５ 染色体显带术 ｍ ｍ １１７ ３５４ 轻链 Ｌ １８９ 退化消除 ｍ ２１８ 染色单体 ｍ １１２ 染色质 ｍ ３７ １０５ 背唇 ３５７ 点状桥粒 ｍ ｍ ６５ 染色粒 ｍｍ ２７２ 神经干细胞 ｍ ＮＳＣ ３２３ ３２６ 星体 ２６７ 星体微管 ｍ ２６７ 神经生长因子 ｗ ＮＦＧ ９４ 差速离心法 １８ 显带技术 ｍ ｍ １１７ 显微注射 ｍ ３５１ ｊ 突触小泡 ６８ 突触后膜 ｍｍ ６８ 显微结构 ｍ ８ 骨形态发生蛋白 ｍ 突触间隙 ６８ 突触前膜 ｍｍ ６８ ＢＭＰ ３７６ 骨粘连蛋白 ８６ 类外胚层 ｍ ｋ ３５７ 类核体 ２４９ 骨髓间充质干细胞 诱导者 ２９７ 诱捕载体 ３７２ ｍ 祖细胞 ３３６ 相差显微镜 ｍ １０ 威布兰德因子 ＶＷＦ ８６ 封闭小带 ｚ ６４ 封闭连接 ｊ ６４ 封端蛋白 １５３ Ｍ ｍ ｍ ＭＳＣ ３３８ 骨髓腔 ｍ ｗ ３３８ 促后期复合物 ｍ ｍ ｘ ＡＰＣ ２７９ 促成熟因子 ｍ ｍ ＭＰＦ ２７８ ２８１ 促性腺激素释放激素 ｍ ＧＲＨ ３３４ 带状桥粒 ｍ ｍ ６６ 带纹 １１７ 促肾上腺皮质激素 ＡＣＴＨ ２４２ 信号识别颗粒 ＳＲＰ ２２９ Ⅱ型糖原累积病 Ⅱ ２４８ 信号肽 ２２９ 信号肽酶 １９０ 枸橼酸铅 １３ 柠檬酸 １９８ 信号假说 ２２９ 信号密码 ２２９ 柠檬酸合成酶 １９８ 标记染色体 ｍ ｋ ｍ ｍ １４４ 标记滞留细胞 ３４１ 信使 ＲＮＡ ｍ ＲＮＡ Ｍ ３０ 受体 ２５３ 栎皮酮 ｑ ２１２ 残余体 ２４５ ３０５ 胡克 Ｒ Ｈ ｋ １ 草酰乙酸 ｘ １９８ ２００ 草酰琥珀酸 ｘ １９９ 受体介导的内吞 ｍ ６０ 复扩增突变 ｍ ｍ １０７ 复制叉 ｋ １０７ 复制起始点 １０７

242 附录二 汉英名词对照 ４０１ 复膜 １３ 胚胎干细胞 ｍ ｍ ＥＳＣ 钙离子依赖的粘附分子家族 Ｃ ２ ｍ ｍ ９８ ３２１ ３６２ 胚胎生殖细胞 ｍ ｍ ＥＧＣ ３２８ 胚胎有核红细胞 ｍ 钙调素依赖性激酶 ＣＭＫ ２６１ 顺面 ２３５ ３３７ 胚胎阶段特异性抗原 １ ｍ １ ＳＳＥＡ １ ３２９ 胚胎肢牙 ｍ ３１９ 胚胎肾母细胞瘤 Ｗ ｍ ｍ ＷＴ ３０３ 胚胎诱导 ｍ ２９７ 胞饮作用 ５９ 胞质环流 １５７ 胞质溶胶 ３７ 胆固醇 ４３ 独特型 ３５０ 秋水仙碱 １６６ 种群不对称分裂 ｍｍ ３２４ 蚀刻 １３ 绒毛蛋白 １５３ 结合蛋白 Ｂ ２３０ 结构 或恒定 异染色质 ｍ １０９ 结构域 ｍ １４７ 结构域互换 ｍ ｗ ３６８ 结构基因 １０６ 顺式作用元件 ｍ １４０ 顺面高尔基网络 Ｇ ｗ ｋ ＣＧＮ ２３５ 鬼笔环肽 １５０ 十 画 旁系 １４４ 消炎痛 ｍ ２４９ 被动运输 ５２ 烟酰胺嘌呤二核苷酸 ｍ ＮＡＤ ２０３ 家族性肠息肉腺癌 ｍ ｍ ３４２ 流式细胞仪 ｗ ｍ ＦＣＭ １７ 流式细胞计量术 流式细胞术 ｗ ｍ １７ 凋亡 ３０４ 凋亡小体 ３１４ 凋亡抑制因子 ＩＡＰ ３１３ 凋亡蛋白酶活化因子 Ａ ０ ３１７ 衰减 ３０２ 衰减子 １４０ 衰老相关基因 ４ 调控点 ｋ ２７９ 选择同步法 ２８８ 选择性剪接 １３１ 选择素 ９５ 调控序列 １２７ ｑ 调解蛋白质 １４７ 重复 ２１７ 重链 Ｈ １８９ 调节型外排途径 ｘ ｗ ６２ 重叠带 ２６８ ｚ 重组节 ｍ ２７３ 高尔基体 Ｇ ３７ ２３５ 高尔基堆 Ｇ ｋ ２３５ 重组期 ｍ ２７３ 重新结合 ｍ １５６ 高尔基器 Ｇ ２３５ 高异倍性 １４４ 高尔基复合体 Ｇ ｍ ｘ ２３５ 重复序列 １０６ １０７ ｑ 钙调蛋白 ｍ １５２ ２６０ 高度重复序列 １０７ ｑ 钙粘连素 ９５ ９９ 钙离子依赖的外源凝集素功能区 ｍ 高压电子显微镜 ｍ ＨＶＥＭ １３ Ｉ ｍ ９７ 配体 ２５３

243 ４０２ 细胞生物学 配对期 ２７３ 配体门通道 ５３ 核被膜 ３７ 核基质 ｍ ｘ １１８ 配体闸门离子通道 ２５４ 核糖体 ｍ ２２１ 核糖体 ＲＮＡ ＲＮＡ ３０ ２２１ 配体 Ｆ Ｌ ３２０ 致密颗粒 １８７ 核仁基质 ｍ ｘ １２０ 核糖核酸 ＲＮＡ ２８ 起始因子 Ｉ Ｆ ２２４ 起泡 ｚ ３１４ 载体 ５５ 核内异质 ＲＮＡ ＲＮＡ ＲＮＡ １３０ 载体蛋白 ５１ 原丝 ｍ １７３ 原型 ３１７ 原生质 ｍ ２ ２６ 原纤维 ｍ １６０ 原肠胚 ３５７ 核仁组织区 ｚ ＮＯＲ １２０ １３３ 核仁组织者 ｚ １３３ 核仁染色质 ｍ １２０ 核孔复合体 ｍ ｘ １０３ 核纤层蛋白 ｍ １０４ 核糖体结合蛋白 ２２９ 桥粒 ｍ ｍ ６５ 原代细胞 ｍ ２０ 原生质体 ２ 原核细胞 ｋ ３４ ＧＣ 框 ＧＣ ｘ １２６ ＣＡＡＴ 框 ＣＡＡＴ ｘ １２６ 原癌基因 ２８６ 原肌球蛋白 ｍ １５５ ＴＡＴＡ 框 ＴＡＴＡ ｘ １２６ 珠蛋白 ３７７ 原子力显微镜 ｍ ｍ ＡＦＭ 原位杂交组织化学 ｚ ８ 热休克蛋白 ｋ ＨＳＰ ２３０ 真核细胞 ｋ ３４ ｍ ＳＨＨ ２２ Ｉ 原位核酸分子杂交 简称原位杂交 ｚ Ｉ ＳＨ ２２ 通讯连接 ｍｍ ｊ ６４ ６６ 通透酶 ｍ ５１ 原始生殖细胞 ｍ ｍ ＰＧＣ ３２８ 原癌基因相关基因 ３０２ 套索状 １ １３１ 挽救受体 ２４０ 捕获 １５ 核小体核心颗粒 １１１ 核仁 ３７ １２０ 核型 ｋ １１７ 核酸 ２８ 核糖 ２７ 核小体 ｍ １１１ 核心酶 ｚ ｍ １２７ 核纤层 ｍ １０４ 核间隙 １０３ 核型图 ｋ ｍ １１７ 核骨架 ｋ １０８ 通道扩散 ５３ 通道蛋白 ５１ 晚胞内体 ｍ ２４１ 紧密连接 ｊ ６４ 倒置相差显微镜 ｍ １０ 氧化磷酸化 ｘ ２０８ 氨基聚糖 ｍ ＧＡＧ ８７ 氨酰ＲＮＡ ｍ ＲＮＡ １３７ 特异性 ３６６ 缺失 ２１７ 胰岛素受体 ２６２ 胶质原纤维酸性蛋白 ＧＦＡＰ ３４０ 胶原 ７２ 胸腺素β ４ ｍ ４ １５３ β 胸腺嘧啶核苷 ｍ Ｔ ３４５

244 附录二 汉英名词对照 ４０３ 脂质体 ｍ ４４ ３５２ 脂蛋白脂肪酶 ＬＰＬ ３３９ 基因敲除 ｋ ｋ ２３ ３３１ 基因簇 １ ４２４ 脂筏模型 ｍ ４８ 脂褐质 ２４６ 基质 ｍ ｘ １８７ 基质颗粒 ｍ １８７ 透明质酸 ＨＡ ８９ 透明质酸蛋白 ８６ 基础代谢率 ＢＭＲ ２１３ 奢侈基因 ｘ ３００ 透射电子显微镜 ｍ ｍ １２ 奢侈蛋白 ｘ ３００ 辅助克隆 ３７６ 造血干细胞 ｍ ｍ ＨＳＣ ３２３ ３３６ ３５９ 辅剪切蛋白 １５３ 接合 ｍ １５６ 造血祖细胞 ｍ ３３７ 掺入因子 １５３ 梯状条带 ３１５ 十 一 画 剪切 １３０ 剪切体 ｍ １３０ 球状肌动蛋白 １４７ Ｇ 蛋白二硫异构 ＰＤＩ ２３０ 剪切蛋白 １５３ 着丝粒 ｍ １０７ ２６７ 蛋白质 ３１ 蛋白质工程 ３６３ 减数分裂 ｍ ２６５ 密码子限制学说 蛋白质从头设计 ３６５ ３６８ ３０８ 蛋白原 ｍ ２３９ 蛋白激酶 Ａ ｋ Ａ ２５６ 密度梯度离心法 １８ 液态镶嵌模型 ｍ ｍ ４７ 淀粉 ２８ 蛋白激酶 Ｃ ｋ Ｃ ２６０ Ｇ 蛋白 ＧＴＰ ２５５ 随体 １１５ 淋巴细胞归巢 ｍ ９７ ｍ 烯醇化酶 １９７ 常染色质 ｍ １０９ 弹性蛋白 ８６ 粒溶作用 ２４８ 粗肌丝 ｋｍ ｍ １５５ 假基因 １２５ 停泊蛋白 ｋ ２２９ 粗线期 ２７３ 粗面内质网 ｍ ｍ 偶线期 ｚ ２７３ 第一信使 ｍ ２５３ ｍ ＲＥＲ ３７ ２２７ ２２８ 粘附分子 ｍ ＡＭ ９４ 粘着连接 ｊ １５４ 脱氧胆酸 ｘ ２０５ 脱氧核糖 ｘ ２７ 粘着斑 １５４ 断裂基因 １２５ 断裂蛋白 １５３ ｍ 副中肾管 ｍ ２９９ 基本的表达 ３００ 基因打靶 ３３２ 基因组 ｍ １１６ ２９５ ２９６ 基因敲进 ｋ ｋ ２３ ３３１ 脱氧核糖核酸 ｘ ＤＮＡ ２８ 铰进 １９４ 巢素蛋白 ３２３ ３５９ 十 二 画 普金耶 Ｊ Ｅ Ｐ ｋ ２ ｊ 普通缺失 ｍｍ ２１８ 游离核糖体 ｍ ２２３ 滑面内质网 ｍ ｍ ｍ ＳＥＲ ２２７ ２２８

245 ４０４ 细胞生物学 募集结构域 ｍ ３１８ ｍ ＣＡＲＤ 硫代鸟嘌呤 Ｔ ３５５ 硫胺素焦磷酸酶 ｍ ３０５ 硫酸乙酰肝素 ８７ 硫酸皮肤素 ｍ ＤＳ ８９ 硫酸角质素 ｋ ＫＳ ８９ 硫酸软骨素 ＣＳ ８９ 琥珀酰 ＣＡ Ｓ ＣＡ １９９ 琥珀酸 ２００ 琥珀酸脱氢酶 ２００ 琥珀酸硫激酶 ｋ １９９ 葡萄球菌核酸酶 ３６６ 葡萄糖的磷酸化 １９５ Ｓ期外的 ＤＮＡ 合成 ＤＮＡ ２７８ 联会 ２７３ 联偶 １５ 联会复合体 ｍ ｍ ｘ ＳＣ ２７２ 裂殖酵母 ｚ ｍ ｍ ２８５ 超二倍体 １４４ 超高压电子显微镜 ｍ １４ 超薄切片机 ｍ ｍ １２ 超螺线管 １１２ 强直构象 ｍ １５６ 嵌合动物 ｍ ｍ ３６２ 紫杉醇 ｘ １６５ 最终反应产物 ＦＲＰ １５ 遗传性视网膜母细胞瘤 ｍ ２８７ 遗传程序 ｍ ３５８ 短暂扩充细胞 ｍ ３ ４１ 编码链 １２６ 编程性细胞死亡 ｍｍ ＰＣＤ ３０９ 脾集落形成单位 ｍ ＣＦＵ Ｓ ３３７ 锌指型结构域 ｚ ｍ １４１ 集束蛋白 １５３ 十 三 画 Ｔ４溶菌酶 Ｔ４ ｚ ｍ ３６６ 塞尔托利前体细胞 ３３２ 溶酶体 ｍ ３８ ２４３ 缝隙连接 ６６ ｊ 摇摆 ｗ １３８ 摆动假说 ｗ １３８ 酪氨酸蛋白激酶受体 Ｒ ｋ ２５４ 酪氨酸蛋白激酶 Ｐ ｋ ２５４ 路易斯寡糖 Ｓ Ｌｗ ９８ 嗅球 ３４０ 嗜热水生菌 ｍ ２３ ｑ 嗜盐菌 ｍ ｍ ２１２ 嗜酸细胞 ３３８ 暗视野显微镜 ｋ ｍ １０ 睫状神经营养因子 ＣＮＴＦ ３５５ 嵴内间隙或嵴内腔 １８６ 微丝 ｍ ｍ ＭＦ １４６ 微体 ｍ ３８ ２４９ 微带 ｍ ｍ １１３ 微管 ｍ ＭＴ １４６ １５９ 微穗 ｍ ｋ １５４ 微绒毛 ｍ ６９ １５４ 微粒体 ｍ ｍ ２２８ 微管蛋白 １５９ 微管结合区 ｍ ｍ ＭＢＤ １７６ 微管马达蛋白 ｍ １６９ 微管连接蛋白 ｘ １６７ 微管结合蛋白 ｍ ＭＡＰ １５０ １６１ 微管组织中心 ｍ ｚ ＭＴＯＣ １６２ 腱蛋白 内动囊 ８６ 舒尔策 Ｍ ｘｓ ｚ ２ 微管结合结构域 ｍ ｍ １６１ 释放 １５６ 微管蛋白ＧＴＰ帽 ＧＴＰ １６３

246 附录二 汉英名词对照 ４０５ 简单扩散 ｍ ５２ 缢环 １５６ 膜的通透性 ｍ ５２ 膜流 ｍｍ ｗ ６２ ２５０ 腺苷酸环化酶 Ａ ２５８ 解偶联剂 ２１２ 膜联蛋白 Ａ ｘ ２６１ 解螺旋酶 １２８ 詹纳斯绿 Ｂ Ｊ Ｂ １８４ 羰基氰对三氟甲氧基苯肼 ＦＣＣＰ ２１２ 凝溶胶蛋白 １５３ 锚定连接 ｊ ６５ 锚定蛋白 ｋ １５４ 激光扫描共焦显微镜 ｍ ＬＳＣＭ １１ 十 四 画 寡聚体 ｍ １６２ 寡霉素 ｍ ２１２ 寡霉素敏感蛋白质 ｍ ２１０ ＯＳＣＰ 慢周期性 ｗ ３４１ 端着丝粒染色体 ｍ ｍ １１５ 端粒 ｍ １０８ 谱系分化 ３５８ 谱系定型细胞 ｍｍ ３５８ 谱系祖细胞 ３５８ 精原干细胞 ｍ ｍ ３３２ 精氨酸 Ｌ Ｌ ２６０ 碱基对 １１６ １８９ 聚乙二醇 ＰＥＧ ３４４ 聚合因子 ｚ １５２ ｍ 聚合期 ｚ １５２ ｍ 聚合酶链反应 ＰＣＲ ｍ ２２ ３６５ 聚纤蛋白 １７６ 酶 ｚ １５ ｍ 酶细胞化学技术 ｚ ｍ ｍ １５ 酸性的突出结构域 ｍ ｊ 十五画以上 激动型 Ｇ 蛋白 ｍ ２５６ Ｇ 激活蛋白 ２５８ 糖原 ２８ 糖脂 ４１ 癌基因 ２８５ 增强子 １２６ 横向分化 ３２２ 横桥 １５５ 醋酸铀 １３ 整体 ９５ 整合素 ６５ 整合素家族 ｍ ９５ 磷钨酸 ＰＴＡ １３ 磷脂 ４１ 磷脂酰丝胺酸 ３１３ 磷酸二羟丙酮 Ｄ ｘ ＤＨＡＰ １９６ 磷酸二羟丙酮的异构反应 ｍ ｚ ｘ １９６ 磷酸二酯键 ２８ 磷酸二酯酶 ２５８ 磷酸己糖异构酶 ｘ ｍ １９５ 磷酸丙糖异构酶 ｍ １９６ ３６７ １６１ 磷酸甘油酸变位酶 ｍ １９７ 颗粒 １８４ 颗粒内质网 ｍ ｍ 磷酸甘油酸激酶 ｋ ＰＧＫ １９６ ＧＥＲ ２２８ 颗粒成分 ｍ １２０ 稳定期 １６２ 磷酸果糖激酶１ ｋ ＰＦＫ１ １９５ 管家基因 ｋ ３００ 管家蛋白 ｋ ３００ 膜间隙 ｍｍ １８７ 磷酸钙共沉淀法 ｍ ３５１ 磷酸烯醇式丙酮酸 ＰＥＰ １９７

247 ４０６ 细胞生物学 ３ 磷酸甘油酸 ３ Ｐ １９６ 磷酸甘油醛 ３ Ｇ ３ ＧＡＰ １９６ 螺线管 １１１ 螺旋 环 螺旋结构域 ｘ ｘ ３ 磷酸甘油醛氧化反应 ｘ ３ １９６ ＨＬＨ １４２ ｘ ｘｍ α螺旋 转角 α螺旋 结构域 １４２ ３ 磷酸甘油醛脱氢酶 ３ １９６ 螺旋化螺旋 １４１ 镜口率 ｍ ７ ６ 磷酸 甘露糖 Ｍ ６ Ｐ ２４１ ６ 磷酸果糖 ６ Ｆ ６ Ｐ １９５ 魏尔肖 Ｒ Ｖ ｗ １ 翻译 １２３ １３５ ６ 磷酸果糖的磷酸化 ６ １９５ 翻译调控 ３０１ 翻转酶 ２２３ ６ 磷酸葡萄糖 ６ Ｇ ６ Ｐ １９５ 镶嵌蛋白 ｍ ４５ ６ 磷酸葡萄糖的异构反应 ｍ ｚ ６ １９５ α １ 抗胰蛋白酶 α １ ＡＡＴ ３６７ α 辅肌动蛋白 α １５３ 融合基因 ３６１ 醛缩酶 １９６ α 酮戊二酸 α ｋ １９９ α螺旋 转角 α ｘ ｘｍ １４２ 螺旋 α α ｘ ３２ 戴帽 １３１ 鞭毛 ６９ １６６ 囊胚内细胞团 ｍ ＩＣＭ ３２１ 髓样结构 ｍ ２４６ 踏车行为 ｍ １６５ 踏车模型 ｍ ｍ １４９ 踝蛋白 １５４ 其 他 ３２ β折叠 β ３２６ β 连环蛋白 β γ 微管蛋白环形复合体 γ ｍ ｘ γｔｒｃ １６５ π螺旋 π ｘ ３２

248 408 细胞生物学 主要参考文献 1 汪仁, 薛绍白, 柳惠图 细胞生物学 第二版 北京 : 北京师范大学出版社, 韩贻仁 分子细胞生物学 北京 : 高等教育出版社, 贲长恩, 牛建昭 分子细胞学与疾病 北京 : 人民卫生出版社, 来茂德 医学分子生物学 北京 : 人民卫生出版社, 陈竺, 王亚新 分子生物学与疾病 上海 : 百家出版社, 凌诒萍 细胞生物学 北京 : 人民卫生出版社, 宋今丹 医学细胞分子生物学 北京 : 卫生出版社, 翟中和, 王喜忠, 丁明孝 细胞生物学, 高等教育出版社, 杨抚华胡以平 医学细胞生物学 北京 : 科学出版社, 罗深秋 医用细胞生物学 北京 : 军事医学科学出版社, 裴雪涛 干细胞生物学 北京 : 科学出版社, 左 医学生物学 北京 : 人民卫生出版社, 彭黎明 王曾礼主编 细胞凋亡的基础与临床 北京 : 人民卫生出版社, 张遒蘅 医学分子生物学 北京医科大学出版社, 汪仁, 薛绍白, 柳惠图. 细胞生物学. 北京师范大学出版社, 周爱儒 生物化学 第五版 人民卫生出版社, G H 弗里德 G J 黑德莫诺斯 ( 美 ) 生物学 科学出版社, 闫桂琴 生命科学技术概论 北京 : 科学技术出版社, 邓耀祖, 屈伸 医学细胞分子生物学 北京 : 科学出版社, 谭恩光 医学细胞生物学 广州 : 广东高等教育出版社, 徐永华 动物细胞工程 北京 : 化学工业出版社, 赵宗江 组织细胞分子学实验原理与方法 北京 : 中国中医药出版社, 冯伯森, 王秋雨, 胡玉兴 动物细胞工程原理与实践 北京 : 科学出版社, 卢圣栋 生物技术与疾病诊断 北京 : 化学工业出版社, 王大成 蛋白质工程 北京 : 化学工业出版社, 沈关心, 周汝麟 现代免疫学实验技术 武汉 : 湖北科学技术出版社, 冯作化 医学分子生物学 北京 : 人民卫生出版社, 陈大元 克隆技术及其应用 中国科学院院刊, 韩贻仁 分子细胞生物学 第二版, 北京 : 科学出版社, 朱至清 植物细胞工程 北京 : 化学工业出版社, 31 成军 细胞外基质的分子生物学与临床疾病 北京 : 北京医科大学出版社, J 萨姆布鲁克 E F 弗里奇 T 曼尼阿蒂斯著 金冬雁黎孟枫等译 分子克隆实验指南 北京 : 科学出版社,1999

249 ４０８ 细胞生物学 ３３ Ｈ Ｍ Ｃ Ｂ ４ Ｎｗ Ｙ ｋ Ｓ Ａｍ Ｂ ｋ Ｌ ２０００ ３４ １１Ａ Ｂ Ｍ Ｂ Ｔ ３ ＥＧ Ｐ Ｉ １９９５ ３５ Ａ Ｅ Ｂ Ｐ Ｉ １９９８ Ｐ Ｇ Ｉ １９９５ １６３ ２１９ ３６ Ｐ Ｐ Ｂ Ｒ ＣＲＣ ３７ Ｊ Ｘ Ｎ Ｚ Ｒ Ｌ Ｓ Ｚ Ｅ ｍ ｍ Ｃ Ｒ １９９８ ８ ２３１ ２４０ ３８ Ｋ ｍ ２ ＮｗＹ ｋ Ｖ Ｈ ｍ ２ ０ ０ ２ ２ ４ ３ ２ ７ ８ Ｇ Ｃ ３９ Ｃ Ｌ Ｙ ＰＤ Ｆ ｍ ｍ ｍ ｍ Ｄ Ｄ ２０００ １８ ２１３ ２３４ ４０ Ｍ Ａ Ｇ Ｏ Ｂ Ｒ Ｔ ｍ Ｍ ｘｂ ２００１ ２０ ５ ６ ３３７ ３４５

250 彩图 １ 荧光共聚焦显微镜下的凋亡细胞形态 白血病细胞 彩图 ２ 荧光显微镜下的凋亡细胞形态 淋巴瘤细胞 彩图 ３ 前期两个中心向两极移动 引自 Ｍ Ｂ Ｃ ４ ２００２

251 彩图 ４ 左 前中期 右 中期染色体排列在赤道面上 引自 Ｍ Ｂ Ｃ ４ ２００２ 彩图 ５ 中期 右图显示与染色体连接的微管 引自 Ｍ Ｂ Ｃ ４ ２００２ 彩图 ６ 后期姊妹染色体单体分离 引自 Ｍ Ｂ Ｃ ４ ２ ０ ０ ２ 彩图 ７ 细胞有丝分裂末期 引自 Ｍ Ｂ Ｃ ４ ２００２