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1 SOOCHOW UNIVERSITY 硕士学位论文 论文题目 富硒产朊假丝酵母的制备及性能研究 研究生姓名指导教师姓名专业名称研究方向论文提交日期 杨波梁中琴卫功元药理学微生物生理 2012 年 5 月

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3 富硒产朊假丝酵母的制备及性能研究 中文摘要 中文摘要 硒 (Se) 是维持人体正常生命活动所必需的元素之一 缺硒可导致多种疾病 的发生, 通过膳食摄取足够的硒将可以对疾病起到很好的预防作用 硒的补充可 以通过摄入无机硒或有机硒而得以实现, 但无机硒的毒性较大限制了它的广泛应 用 富硒酵母富含蛋白质和 B 族维生素, 安全性强 生物利用率高, 同时有很好 的自由基清除功能, 能够提高机体的免疫性能 延缓衰老等优点而成为首选的补 硒产品 富硒酵母的制备通常是在酵母培养过程中将一定浓度的无机硒源物质添加到 培养基中, 伴随着酵母细胞的生长代谢而得到富硒产品 产朊假丝酵母 (Candida utilis) 可用于富硒酵母的制备, 其在富集硒的同时还可以在胞内积累谷胱甘肽 (GSH), 因而受到了广泛的关注 高性能 ( 高有机硒含量和高谷胱甘肽含量 ) 富 硒产朊假丝酵母由于其在补硒的同时还可以提高机体免疫力, 因而将具有更广阔 的市场前景和应用价值 GSH 是细胞内重要的抗氧化分子, 在细胞抵抗自由基和毒性物质引起的损伤中起着重要的作用 近年来, 随着研究的不断深入,GSH 在临床医药 食品加工 化妆品以及畜牧生产中都将具有良好的应用前景 本论文以 GSH 积累株 C. utilis SZU 为出发菌株, 以高性能 ( 高有机硒含 量和高 GSH 含量 ) 富硒产朊假丝酵母的制备及性能为目标展开研究, 具体研究内 容如下 : (1) 在摇瓶和发酵罐水平上分别研究了亚硒酸钠浓度及其添加方式对高性能 富硒产朊假丝酵母制备的影响 结果发现, 亚硒酸钠添加浓度为 15 mg/l 时产朊假 丝酵母具有较好的富硒效果, 但一次性添加对酵母细胞有较大的毒害作用 采用 分批添加亚硒酸钠的方法获得了高性能富硒产朊假丝酵母制备的培养条件 : 发酵 起始添加 10 mmol/l L- 蛋氨酸, 并在发酵过程的 12 h 15 h 分别添加 10 mg/l 和 5 mg/l 亚硒酸钠 在此培养方式下, 产朊假丝酵母胞内 GSH 和有机硒含量分别达到 mg/l 和 1194 μg/g (2) 采用高密度培养的方法制备富硒产朊假丝酵母 补料分批培养在显著提 高酵母细胞生长 GSH 合成的同时, 也明显的增强了产朊假丝酵母的富硒性能 首先, 考察了恒速流加 指数流加及多项式流加三种流加策略对富硒酵母高密度 I

4 中文摘要 富硒产朊假丝酵母的制备及性能研究 培养的影响, 以有机硒浓度与 Se 的有机转化率为指标, 确定了最佳的流加方式为多项式流加 在此基础上, 进一步考察了亚硒酸钠的添加浓度及其添加方式对富硒产朊假丝酵母高密度制备的影响 结果表明, 较低浓度亚硒酸钠添加时虽然 Se 的转化率较高但有机硒含量较低, 而较高浓度的亚硒酸钠对酵母细胞的生长 GSH 的合成以及 Se 的有机转化率都具有不利影响, 由此确定了亚硒酸钠的最佳添加浓度为 60 mg/l 考虑到亚硒酸钠的添加方式对酵母细胞的富硒效果也会产生较大的影响, 比较了一次性添加 分批添加和连续流加亚硒酸钠对富硒产朊假丝酵母制备的影响 结果表明, 产朊假丝酵母在连续流加的培养方式下, 胞内 GSH 产量及有机硒含量均达到最高, 分别为 mg/l 与 μg/g (3) 研究了富硒产朊假丝酵母对 SD 大鼠生理特性的影响 添加一定量的富硒酵母在促进 SD 大鼠生长的同时, 显著增强大鼠血清谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px) 过氧化物歧化酶(SOD) 与过氧化氢酶 (CAT) 活力, 提高其抗氧化的能力, 从而减少自由基和脂质过氧化物对细胞膜完整性的破坏 ; 同时, 富硒产朊假丝酵母还能提高 SD 大鼠体内淋巴细胞的转化率, 从而增强了大鼠的免疫性能 关键词 : 产朊假丝酵母 ;L- 蛋氨酸 ; 谷胱甘肽 ; 富硒酵母 ; 抗氧化能力 作 者 : 杨波 指导教师 : 梁中琴 卫功元 II

5 Preparation of selenium-enriched Candida utilis and its biochemical capacities on rats Abstract Preparation of selenium-enriched Candida utilis and its biochemical capacities in rats Abstract Selenium (Se), an essential nutritional trace element, is required in a variety of metabolic functions and numerous health effects. However, its absence in the body of human and animals can lead to many diseases. Supplementation of Se in diet in the form of organic or inorganic Se can prevent Se deficiency. Inorganic selenium is not wildly used because of its greater toxicity. Supplementation with selenized yeast is the most popular approach to prevent Se deficiency because it has high protein and vitamine B content, high security and bioavailability. Meanwhile, selenized yeast can be used to protect cells against damages caused by free radicals, improve the immune performance. Preparation of selenium yeast is usually carried out by adding a certain concentration of inorganic Se source material to the medium during the process of yeast culture, and selenium-enriched products are obtained along with the growth and metabolism of yeast cells. Candida utilis, a kind of industrial yeast, is now used for the preparation of selenium-enriched yeast, because it can accumulate high concentrations of inorganic Se and glutathione (GSH) intracellularly. Se-enriched C. utilis with high performance (high organic Se content and high GSH content) will have a wider market and application prospects owing to its improving the immune system. GSH, an important intracellular antioxidant, plays a key role on protecting cells against damages caused by free radicals and toxic substances. In recent years, GSH is widely used as pharmaceutical, food additives and cosmetic. In this study, C. utilis SZU which could accumulate GSH intracellularly was selected for preparation of selenium-enriched yeast. Aiming at high performance (high organic selenium content and high glutathione content) of the selenium-enriched C. utilis preparation, together with the application of the yeast, the experiments were III

6 Abstract Preparation of selenium-enriched Candida utilis and its biochemical capacities on rats designed and conducted in three aspects as follows: Firstly, the effects of sodium selenite concentration and addition mode on the preparation of selenium-enriched C. utilis with high performance (high organic selenium content and high glutathione content) were investigated in flasks and a 5 L fermentor, respectively. It was found that selenium-enrichment C. utilis could be achieved under sodium selenite concentration of 15 mg/l, but one-shot addition of sodium selenite with high concentration had poisonous effect on yeast cells. Accordingly, the better culture mode for efficient preparation of selenium-enriched C. utilis was obtained with batch addition of sodium selenite as follows: 10 mmol/l L-methione was added at 0 h, together with 10 mg/l and 5 mg/l sodium selenite was added at 12 h and 15 h, respectively. Under this culture mode, GSH of mg/l and organic selenium content of 1194 μg/g was achieved. Secondly, preparation of selenium-enriched C. utilis was conducted under fed-batch fermentations. It was indicated that cell growth, GSH production and selenium-enriched C. utilis performance were improved. The effects of fed-batch fermentation under constant, exponential and polynomial feeding strategies on selenium-enriched yeast were investigated. Aiming at higher organic selenium content and higher Se biotransformation ratio, the polynomial feeding was proven the optimal feeding approach. Based on the results above, the effects of sodium selenite addition concentration and addition mode on selenium-enriched C. utilis preparation were further studied. It was shown that high biotransformation ratio of Se was obtained by adding low concentration of sodium selenite. However, organic selenium content was maintained at a low level. Besides, high concentration of sodium selenite had inhibitory effect on cell growth, GSH production and biotransformation ratio of Se. For these reasons, the optimal addition concentration of sodium selenite was 60 mg/l. Furthermore, the effects of sodium selenite addition mode under one-shot, batch, and continous feeding strategies on preparation of selenium-enriched C. utilis were studied. It was shown that continous feeding of sodium selenite was more suitable for selenium-enriched C. utilis preparation, and the intracellular GSH content (IGC) and the organic Se content reached mg/g and mg/g, respectively, under the optimal IV

7 Preparation of selenium-enriched Candida utilis and its biochemical capacities on rats Abstract culture conditions. In the end, the effects of selenium-enriched C. utilis on the activities of enzymes related to antioxidant capacity in rats were investigated. It was indicated that supplementation with selenium-enriched C. utlis in diet could promote the growth of SD rats, and also significantly increased the activities of GSH-Px, SOD and CAT, compared to the control. Therefore, selenium-enriched C. utlis could enhance antioxidant capacity of rats and protecting cells against damages caused by free radicals and lipid peroxides. Meanwhile, selenium-enriched C. utlis could enhance the transformation capacity of lymphocyte and improve the immune function in rats. Keywords: Candida utilis; L-methionine; glutathione; Selenium-enriched yeast; Antioxidant capacity Written by: Bo Yang Supervised by: Zhongqin Liang, Gongyuan Wei V

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9 目录 第一章文献综述 硒的特性及生物学效应 硒的营养学价值 硒与疾病诊疗 硒的免疫学效应 富硒酵母 富硒酵母的制备 富硒酵母的应用与价值 谷胱甘肽 谷胱甘肽的功能 谷胱甘肽的应用 富硒酵母的生理学功能 抗氧化 提高免疫力 本论文的研究意义和主要内容 研究意义 主要内容 9 第二章高性能富硒产朊假丝酵母的制备 前言 材料和方法 菌种 培养基 培养方法 分析方法 结果与分析 亚硒酸钠浓度对富硒产朊假丝酵母性能的影响 亚硒酸钠添加方式对产朊假丝酵母富硒能力的影响 13

10 2.3.3 分批培养制备高性能富硒产朊假丝酵母 讨论 L- 蛋氨酸对于提高富硒产朊假丝酵母性能的作用 分批发酵培养改善了富硒产朊假丝酵母的性能 不同培养方式对富硒产朊假丝酵母性能的影响 小结 17 第三章高密度培养制备富硒产朊假丝酵母 前言 材料与方法 菌种 培养基 培养方法 分析方法 结果与分析 分批培养过程与分析 不同流加培养方式对富硒产朊假丝酵母性能的影响 亚硒酸钠浓度对产朊假丝酵母富硒能力的影响 亚硒酸钠添加方式对富硒产朊假丝酵母制备的影响 讨论 分批培养与补料分批培养的比较 多项式流加策略下的优越性 Se 的生物转化对产朊假丝酵母生理特性的影响 小结 30 第四章富硒产朊假丝酵母对 SD 大鼠生理特性的影响 前言 材料与方法 实验动物 实验设计 测定指标与方法 数据处理及统计方法 33

11 4.3 结果与分析 SD 大鼠的生长性能 SD 大鼠的血硒及肝硒水平 SD 大鼠的抗氧化能力 SD 大鼠的淋巴细胞转化率 讨论 Se 对 SD 大鼠抗氧化功能的作用 Se 对 SD 大鼠免疫性能的影响 酵母 GSH 的影响结果 小结 38 结论与展望 39 参考文献 41 攻读硕士学位期间取得的成果 48 致谢 49

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13 富硒产朊假丝酵母的制备及性能研究 第一章文献综述 第一章文献综述 1.1 硒的特性及生物学效应硒是哺乳动物包括人类行使正常生理功能所必需的一种微量元素 [1] 硒主要是以硒蛋白的形式如硫氧蛋白还原酶 脱碘酶 脱氢酶等在人和动物体内发挥多方面的生物学效应 [2-3] 硒的营养学价值 硒对动物的营养学价值 1957 年,Schwarz 首次证实硒是动物必需的营养元素 [4] 缺硒会导致畜禽引发多种疾病, 如肌肉变性症 大肠杆菌病 猪桑葚心 免疫功能降低以及繁殖力下降等, 而补硒可明显降低畜禽相关疾病的发生率 随着对硒研究的日益深入, 特别是其生物学功能的广泛研究, 硒对动物的营养学价值在生产上的应用也越来越广泛 首先, 硒对动物的生长具有刺激作用 硒能促进甲状腺分泌甲状腺素 (T 3 ), 而 T 3 能参与生长激素的合成, 同时促进动物自身蛋白质的合成, 从而提高了动物的生长性能 这在动物生产上已证实, 如柳清潭报道, 饲料中添加硒可明显提高肥牛的生长性能 [5] 其次, 硒能提高动物机体的抗氧化性能 饲料中添加硒明显提高了动物机体内 GSH-Px 的活性, 使得机体清除自由基及过氧化物的能力显著地得到了增强, 从而提高了动物的氧化应激水平 最后, 硒改善了动物的免疫效应, 增强了对疾病的抵抗力 Awaden 研究表明, 饲料中添加有机硒后犊牛后代存活率及抵抗寒冷的能力得到了明显的改善 [6] 此外, 硒还可以提高动物的繁殖性能, 降低后代的死亡率, 抑制前列腺素的生成, 同时明显降低肌肉的滴水损失, 提高动物肌肉的营养价值 因此, 硒对动物具有非常重要的营养学价值 硒对人类的营养学价值 70 年代中期, 我国研究人员发现硒对克山病的预防有效, 并对硒的研究从毒性开始向其营养作用转变, 并确认硒是人体所必需的微量元素 [7] 研究表明, 长期食用硒缺乏食物会因硒营养不足而导致相关疾病的发生, 而从膳食中摄取足够的硒可以降低疾病的发生率 人体摄取硒的方式主要来源于饮食, 通常是蛋白质含量丰富的食物, 如鱼 蛋和肉类等, 而植物性食物硒含量较低 [8-10] 当前补硒的最 1

14 第一章文献综述 富硒产朊假丝酵母的制备及性能研究 佳途径是富硒酵母补硒, 富硒酵母由于本身富含蛋白质和 B 族维生素 食用安全性强以及生物利用率高等优点而成为首选的补硒食品 [11] 硒被人体吸收利用后, 会对人体产生许多重要的营养学价值 其中硒最重要的功能之一就是抗氧化作用, 硒是 GSH-Px 活性部位的重要组成部分, 机体内硒含量的增加可明显提高 GSH-Px 等抗氧化物酶的活性, 使得机体清除活性氧自由基及抑制脂质过氧化的能力增强, 从而来保护细胞免受损伤 而且硒也是碘化甲状腺氨酸脱碘酶 (TDIs) 活性部位组成部分, 该酶可将 T4 脱碘转变为 T3,T3 能促进腺垂体细胞分泌生长激素, 并能促进肌肉蛋白的合成与周转, 从而促进机体的生长 硒以硒蛋白的形式还可参与血红素代谢, 稳定核酸等生物大分子的作用 [12] 同时, 硒还具有调节维生素的吸收与消耗以及参与辅酶的合成等作用 [13] 此外, 硒能够改善机体的免疫力, 延缓衰老, 降低癌症的发病率等重要的营养学价值 硒与疾病诊疗硒是机体生命活动必须的微量元素, 随着研究的深入, 硒在机体正常生理活动中扮演者越来越重要的作用, 硒缺乏能够严重影响人体健康, 并能引发多种疾病, 如免疫力下降, 消化系统紊乱, 白内障, 克山病, 大骨节病, 各种癌症, 溶血性贫血, 心血管疾病以及脂肪肝等多种人类疾病 [14] 硒与癌症诊疗 1949 年 Cloyton 等报道了饲料中加入亚硒酸钠能有效地抑制二甲基氨基苯所导致的大鼠结肠癌作用 [15] 目前, 硒对癌症的抑制作用已经得到充分证实 [16-18] 硒能够调节癌基因与抗癌基因的表达, 抑制癌基因 DNA 的合成, 改变癌细胞的恶性表型特征, 同时诱导癌细胞发生凋亡 而且硒能够提高解毒酶系统如 GSH 转移酶和酸性磷酸酯酶的活性, 降低致癌物羟化酶的活性, 抑制致癌物代谢酶基因的表达, 使致癌原逐步丧失其致癌活性从而保护机体免受致癌物的损伤 [19] 相关研究表明, 硒与癌症间存在明显的负相关性, 补硒可以降低一些癌症发病率, 其机理有如下几个方面 :(1) 抑制恶性肿瘤细胞的生长, 对恶性肿瘤细胞具有直接杀伤作用 [19] (2) 抗氧化及清除自由基作用 许多致癌物质的致癌效应与自由基引起细胞突变有关, 机体在代谢过程中会产生大量的自由基, 导致脂质过氧化反应, 使膜的结构和功能遭到破坏有利于癌变 硒是 GSH-Px 活性成分的重要组成部分, GSH-Px 能清除自由基, 催化有毒氧化物的分解, 从而保护细胞免受损伤 [20] (3) 抑制新血管的生成 [21] 硒主要通过干预肿瘤血管调控因子的活性, 阻断肿瘤新生 2

15 富硒产朊假丝酵母的制备及性能研究 第一章文献综述 血管生成的比较理想的靶部位以及降低血管的通透性来抑制与癌相关的新血管的生成 (4) 降低致癌中间代谢产物生成酶的活性 硒能降低致癌中间代谢产物的酶活性以及癌细胞的增值速度, 并能调节蛋白激酶系统从而抑制癌细胞蛋白质的磷酸化 [20] (5) 调节机体免疫功能 硒在加强淋巴细胞的细胞毒作用的同时还可提高其转化率, 并能激活巨噬细胞的吞噬功能, 从而达到有效清除肿瘤细胞的作用 [22] 硒与心血管疾病诊疗硒可保护心脏, 维持心血管系统正常的结构和功能 [23], 预防动脉粥样硬化与冠心病的出现, 并能维持正常的血压水平 缺硒能明显增加心脏病的发病率和死亡率 补硒可有效的预防多种心血管疾病的发生, 其作用机理表现在以下几个方面 :(1) 硒对人体红细胞的流动性有保护作用, 能增加红细胞膜的流动性, 降低过氧化氢诱导的氧化溶血作用, 并能促进损伤心肌的修复和再生 [24] (2) 硒参与清除过氧化氢和脂质过氧化物, 清除自由基, 从而起到保护心肌细胞膜的正常功能 (3) 硒可以在一定程度上能够降低血小板的聚集性及血液的粘滞性, 减弱胆固醇的沉积, 从而抑制心血管疾病的发生 [25] (4) 硒能调节血脂代谢, 阻止脂肪肝的形成, 对高脂血症有一定的预防作用 [26] 因此, 硒能够降低多种心血管疾病的发病率 硒与其他疾病诊疗克山病和大骨节病是过去常见的地方性缺硒疾病 克山病患者血中的 GSH-Px 的活性低下, 并伴有急剧心肌坏死的现象 [27], 补硒能预防克山病的发生 大骨节病患者的软骨变形坏死, 同时伴有严重的肌肉萎缩, 然而该病情与硒水平呈显著负相关 硒还具有明显的保护肝脏, 抑制甲 乙型肝炎的作用 此外, 硒在维持男性生育功能 抵抗 HIV 病毒和延缓人体的衰老过程等方面也具有重要作用 [28-30] 最新研究发现, 硒与人体的肌肉疾病及情绪的变化也存在着密切的联系 [31-32] 硒的免疫学效应硒是影响机体免疫功能的重要因素之一, 可以从多方面影响机体的免疫功能 研究者发现硒的摄入量如果低于最适量, 可损害机体免疫系统的发育与功能, 补硒可提高机体的免疫力 [33] 硒与免疫能力之间的关系主要体现在以下几个方面: (1) 硒与非特异性免疫 非特异性免疫的效应细胞包括巨噬细胞 单核细胞和中性粒细胞等 吞噬细胞具有溶解和杀伤体内感染的病原微生物的作用 硒缺乏可 3

16 第一章文献综述 富硒产朊假丝酵母的制备及性能研究 明显抑制吞噬细胞的活性, 而补硒能提高吞噬细胞吞噬和杀菌的活力 (2) 硒与细胞免疫 特异性细胞免疫的主要效应细胞是 T 淋巴细胞 抗体依赖 (K) 淋巴细胞及自然杀伤 (NK) 细胞等 硒能增强 T 淋巴细胞介导的肿瘤特异性免疫, 有利于细胞毒性 T 淋巴细胞的诱导, 并明显加强其细胞毒活性 [34] 同时硒还可以增强淋巴细胞内信号传递, 维护淋巴细胞膜的完整性, 并增强 NK 细胞的杀伤力, 从而提高细胞免疫的应答水平 (3) 硒与体液免疫 硒能促进免疫球蛋白的分泌, 增加 γ- 干扰素的活性, 增强免疫球蛋白与靶抗原结合的能力 总之, 硒对机体的免疫效应具有重要的影响, 特别是对病毒性感染的免疫应答具有显著的提高作用 [35] 缺硒可影响免疫系统的各方面, 补硒可显著地改善机体的非特异性免疫 细胞免疫 体液免疫, 从而增强机体的免疫功能 1.2 富硒酵母富硒酵母就是在酵母培养过程中将无机硒添加到培养基中, 通过酵母自身的代谢活动, 使硒与酵母体内的蛋白质等大分子结合转化为有机硒 [36], 从而消除了无机硒对人体的毒害作用, 使硒能更安全 更高效地被人体吸收利用 国外研究的富硒酵母硒含量为 μg/g, 绝大多数为有机硒, 主要以硒蛋氨酸的形式存在, 少部分形成硒酸酯多糖 [37] 富硒酵母的制备富硒酵母的制备方法有普通发酵法和高密度发酵法 在富硒酵母的制备过程中, 培养基成分 培养时间 溶氧 温度 ph 无机硒浓度及添加方式等都是影响酵母富集硒的重要因素 首先, 培养基成分对酵母富硒的影响 培养基成分在影响富硒酵母生长的同时, 还影响酵母的富硒性能 还原糖是酵母细胞生长代谢不可或缺的营养物质, 其含量的高低会对酵母细胞产物的合成及硒的转化产生重要的影响 因为较高的糖量会产生底物抑制效应, 使得酵母细胞不能充分利用还原糖而发生克拉勃脱效应 [38] 因此在发酵培养时, 应将还原糖稀释至最适浓度 其次, 发酵培养时间对酵母富硒的影响 在富硒酵母的发酵过程中, 发酵时间过长和过短会都会对酵母细胞产生不利的影响 李明春等研究了培养时间对酿酒酵母 NK2 和 NK4 菌株积累硒的影响, 结果表明随着培养时间的延长, 菌体含硒量及菌体浓度逐渐下降, 成本反而增加 [39] 因此, 正式发酵前需确定最佳的培养时间 4

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