58 中国农学通报 0 引言状将蚂蚁腹柄处固定在蜡盘上翻转蚂蚁使其背部接 2004 年曾玲等发现中国广东吴川有了一种能蛰触蜡盘腹部末端斜向上固定好后用一根拨针轻触人的蚂蚁入侵红火蚁 Red imported fire ant, RIFA;

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1 中国农学通报 2009,25(17):57-61 Chinese Agricultural Science Bulletin 多后型红火蚁工蚁和蚁后毒液生物碱成分的比较马伏宁曾鑫年潘达强 (华南农业大学资源环境学院广州 ) 摘要采用毛细管吸取多后型红火蚁(red imported fire ant Solenopsis invicta Burns)工蚁和蚁后的毒液以气质联用分析法 GC MS 比较分析其毒液中的生物碱成分结果表明多后型红火蚁毒液中的生物碱属 2-甲基-6-烷基或烯基哌啶生物碱仅有 6 位取代烃基碳链长短和烯键有无及顺反异构的差异工蚁毒液中的生物碱主要有 4 种分别是 2R-甲基-6R-(4-十三烯基)哌啶 transc13 1 2R-甲基-6R十三烷基哌啶 transc13 2R-甲基-6R- (6-十五烯基)哌啶 trans C15 1 2R-甲基-6R-十五烷基哌啶 trans C15 其占总碱量的比例分别为 15.6% 17.5% 43.8%和 19.1% 而蚁后的生物碱主要有 2 种分别是 2R-甲基-6S-十一烷基哌啶 cisc11 和 2R-甲基-6R-十一烷基哌啶 transc11 其占总碱量的比例分别为 62.6%和 26.6% 工蚁和蚁后毒液生物碱在结构上也存在差异工蚁主要生物碱的链长为 C13 和 C15 二种均为反式结构而蚁后主要生物碱仅有 C11 一种链长且有顺式和反式二种结构关键词入侵红火蚁毒液生物碱火蚁素中图分类号 S3 文献标识码 A 论文编号 Comparison of Venom Alkaloids in Worker Ants and Queen of Solenopsis invicta Burns Ma Funing, Zeng Xinnian, Pan Daqiang (College of Natural Resources and Environment, South China Agricultural University, Guangzhou ) Abstract: The venom of worker ants and queen of polygyne red imported fire ant (RIFA, Solenopsis invicta Burns) were obtained by using self-made microcapillary. The structures of alkaloids were studied by gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS). The results showed that the venom alkaloids detected were 2-meth yl-6-alkyl or alkenyl piperidines according to mass spectral data and related literatures on S. invicta. Four main al kaloids found in venom of worker ants were trans-2-methyl-6-(cis-4-tridecenyl)piperidine (transc13:1), trans-2-methyl-6-n-tridecenyl piperidine (transc13), trans-2-methyl-6-(cis-6-pentadecenyl)piperidine (transc15:1) and trans-2-methyl-6-n- pentadecenyl piperidine (transc15), respectively, which occupied 15.6%, 17.5%, 43.8%, 19.1% of total venom alkaloids. Two main alkaloids found in venom of the queen were cis and trans 2-Methyl-6-n-undecenyl piperidine (C11) which occupied 62.6% and 26.6% of total venom alkaloids, respective ly. The structure difference between main venom alkaloids of worker ants and queen occurred in their conformations and the chain length of 6-alkyl. Only trans C13 and C15 alkaloids in worker ants, while cis and trans C11 alkaloids in queen were found. Key words: Solenopsis invicta; venom, alkaloid, solenopsins 基金项目国家自然科学基金资助项目化学药剂诱发的红火蚁清后行为及机理研究广东省科技计划项目红火蚁入侵与传播的防控新技术系统研究 2007B 第一作者简介马伏宁女 1974 年出生博士研究生主要从事农业昆虫与害虫防治专业研究通信地址广东省广州市五山路华南农业大学资环大楼 617 室 Tel funingma@163.com 通讯作者曾鑫年男 1960 年出生教授通信地址广东省广州市五山路华南农业大学资环大楼 617 室收稿日期修回日期

2 58 中国农学通报 0 引言状将蚂蚁腹柄处固定在蜡盘上翻转蚂蚁使其背部接 2004 年曾玲等发现中国广东吴川有了一种能蛰触蜡盘腹部末端斜向上固定好后用一根拨针轻触人的蚂蚁入侵红火蚁 Red imported fire ant, RIFA; So 蚂蚁腹部末端待其伸出蛰针蛰针尖端会分泌出一小 lenopsis invicta Burns 红火蚁工蚁具有很强的攻击滴毒液用自制毛细微管轻触液滴将其吸入重复触其行为能将其腹部未端毒囊内的毒液通过蛰针注入攻腹部末端吸取毒液然后将毒液挤入装有 1 ml 正己烷击对象起防御作用人们被蚁蛰后马上会有如针扎色谱纯的气质样品瓶将样品过 0.45 μm 的有机滤 [1] 的痛楚而且局部会很快发痒红肿有低于 1%的人群膜后进行气质检测会对其微量的毒蛋白产生过敏反应红火蚁的工蚁 1.3 GC-MS [2] 为不育的雌蚁和工蚁一样蚁后腹部末端也有毒囊和气质联用采用安捷伦 6890/5975C-GC/MSD 系统蛰针但蚁后的毒针主要执行的是在产卵过程将毒液气相色谱柱:HP-5 毛细管柱 30 m 0.25 mm 0.25 μm 分泌到卵上起一定的抑菌作用其中的微量信息素对升温程序为 150 保持 1.0 min 4 /min 升温到 240 红火蚁个体之间交流和种群生存起重要作用国外后保持 2 min 进样口温度 250 进样量 1 μl 载气对红火蚁工蚁的毒液成份已有较多的研究发现其为氦气载气流量 1 ml/min 进样分流比 6 1 质谱条 95%的成份是生物碱其余为蛋白质和小分子肽类等件 EI 检测器检测口温度 250 电离能 70 ev 质量物质也有对有翅蚁后毒液的研究但未见对蚁后范围 50~500 amu 参考质谱库为 NIST02 采用面积毒液成分的报道入侵中国红火蚁主要为多后型红火归一化法计算各化学成分在毒液总生物碱中的相对含蚁对其毒液的成分的研究尚未见报道为了对红量火蚁的信息素和亲系识别物质进行研究该文对入侵 2 结果与分析中国的多后型红火蚁工蚁和蚁后毒液生物碱进行了比 2.1 工蚁毒液主要生物碱及其结构 [3] [4] [5] [6] 较分析期望能为入侵红火蚁农业和医学等方面的继按上述 GC-MS 条件对红火蚁工蚁的毒液进行分续研究提供参考析得到六个主要气相色谱峰如图 1(a) 出峰时间分别 1 材料与方法为按 1.1 供试红火蚁气相色谱峰面积计算这 6 种主要生物碱占毒液总物质供试红火蚁采自广东省增城市华南农业大学教学含量的 99%以上在红火蚁的毒液生物碱中 6 位取代实习基地参照 Banks 方法用大塑料桶从田间采回基有一双键的哌啶碱因为其分子量比 6 位取代基为红火蚁蚁群桶口涂爽身粉防止蚂蚁爬出放置 1 夜相同碳原子数正烷烃的小出峰时间也相应要早工待蚁群在桶内建立了新的蚁巢通道后,将自来水缓慢蚁毒液主要生物碱气相色谱图与 MacConnel 等报道滴入桶内,令红火蚁从蚁巢中自动上移浮出用油捞的一致 [4] 不同构型的哌啶碱其顺势构型比反式构将蚁群转入盆口涂有爽身粉的塑料盆(7.0 L)中在室型的先出峰这可能是顺势结构的分子空间阻力小而内(温度 22~28 RH 65%~80% )用人工饲料饲养供导致的 [7] 试验用将蚁群转入人工饲养时检查蚁巢中同时存在对应工蚁毒液 6 个气相色谱的质谱图如图 2 在多个蚁后确认为多后型蚁群 NIST02 库中只有 C13 能检测到对应的图谱相似度为 1.2 毒液采集方法 64% 对分子结构的推测参考 MacConnel 等 [4] 的报毒液采集参考 Blum 的 milk 方法[8] 自制毒液采道这六种生物碱都具有的特征峰为 m/z=98(相对丰集毛细吸管将长 10 cm 直径 0.3 mm 的毛细点样管中度 100%) 对应片断为 C6H12N+ 是 6 位取代烷烃断裂后部放在酒精灯上烧边烧边旋转并拉伸待管拉细后自剩下 2-甲基哌啶环的离子特征峰 C11,C13,C15 的分子动断开用镊子去除尖部融合的玻璃使微管中通特征峰为 M-H + 式 C13 1,C15 1,C17 1 的分子特征峰为 M + 将制好的毛细管粗端插入 1 ml 塑料移液枪枪头尖内式工蚁毒液六种主要哌啶生物碱的分子量和对应的用酒精灯略烧枪头尖使枪头尖融化后封闭与毛细管分子式分别 253(C17H35N) 279(C19H37N) 281(C19H39N) 间的空隙在移液枪枪头另一端加一橡胶吸管头即 307(C21H41N) 309(C21H43N) 335(C23H45N) 哌啶环 2,6 可位取代基的构型参考 Leclercq 等对入侵红火蚁毒液生毒液收集将工蚁或有翅蚁后用小镊子夹住身体中间腹柄处或有翅蚁后的翅从蚁巢中取出在体视显物碱优势构型的报道[9] 将不同哌啶碱与 MTPA-Cl(甲氧基-三氟甲基苯乙酰氯)反应使其转变为非对应异微镜下放入解剖用蜡盘用两根细解剖针针尖呈交叉构体后与标准的已知绝对构型化合物的色谱对比确

3 59 马伏宁等多后型红火蚁工蚁和蚁后毒液生物碱成分的比较图 1 入侵红火蚁工蚁 a 和蚁后 b 毒液 GC 图定了红火蚁工蚁和有翅蚁后毒液的优势构型分别为反 C13 1 和 C13 出峰时间为的比 transc11 早其质式 2R,6R 型和顺势 2R,6S 型谱数据与 transc11 相似为其异构体 cisc11 根据质谱碎 2.2 蚁后毒液生物碱片离子分析出峰时间为14.348和14.934的为顺势C13 1 如图 1(b)所示红火蚁蚁后毒液的气相色谱峰与和 C13 的异构体反式 C13 1 和 C13 顺反异构体的质谱离工蚁的不完全一致出峰时间有 3 个与工蚁的相同为子碎片数据之间差异很小因此蚁后毒液生物碱的质 min 对应的物质为反式的 C11 谱图在此不一一列出

4 60 中国农学通报表 1 工蚁和蚁后毒液主要生物碱成分比较工蚁毒液生物碱蚁后毒液生物碱生物碱保留时间相对含量/% 生物碱保留时间 transc R-甲基-6R-十一烷基哌啶化合物 1.4 cisc R-甲基-6S-十一烷基哌啶 62.5 transc R-甲基-6R-(4-十三烯基)哌啶 15.6 transc R-甲基-6R-十一烷基哌啶 26.6 transc R-甲基-6R-十三烷基哌啶 17.5 cisc13: R-甲基-6S-(4-十三烯基)哌啶 1.2 transc15: R-甲基-6R- (6-十五烯基)哌啶 43.7 cisc R-甲基-6S-十三烷基哌啶 5.8 transc R-甲基-6R-十五烷基哌啶 19.1 transc13: R-甲基-6R-(4-十三烯基)哌啶 1.5 transc17: R-甲基-6R-(8-十七烯基)哌啶 2.5 transc R-甲基-6R-十三烷基哌啶工蚁和蚁后毒液成分的比较化合物相对含量/% 异性可以作为分类辅助特征 [14] 而且具有溶血细胞由表 1 可以看出工蚁毒液中含量最多的是 tran 毒性杀虫抑菌引起组胺释放等特性[8,15-16] 这与工蚁 sc15 1 2R-甲基-6R- (6-十五烯基)哌啶占毒液含量的利用毒液在捕食防御和保卫蚁巢中的功能相关蚁 43.8% 其次是 C15 C13 和 C13 1 分别占到工蚁毒液总生后主要的工作就是产卵其毒液生物碱具有对所产的物碱量的 19.1% 17.5%和 15.6% 蚁后毒液的生物碱卵抑菌和传递信息素作用 Brand 等对有翅处女蚁后以顺势 cisc11 2R-甲基-6S-十一烷基哌啶为主其含的毒液成分分析表明以顺势和反式的 C11 为主 [5] 与测量占蚁后毒液总生物碱量的 62.6% transc11 2R- 甲定红火蚁蚁后的毒液成分一致在红火蚁的毒腺上有基 -6R- 十一烷基哌啶占到蚁后毒液总碱量的杜氏腺的开口其分泌的信息素具有示踪作用 [17] 红 26.6% 其中还含有少量 C13 1 和 C13 的顺反异构体火蚁蚁后毒液中大量的 cisc11 除了具有抑菌作用外在 3 讨论与结论蚁后识别中是否也起作用还有待进一步研究 Lai 等最早确证红火蚁工蚁毒液生物碱的是 MacConnel 对台湾的单蚁后和多蚁后蚁巢工蚁毒液的分析中发现等(1971) 其利用气相色谱和质谱(CI)分析并合成和不论生长温度季节和采集地区红火蚁的单蚁后蚁巢鉴定了红火蚁(S. saevissima Forel (Wilson 1951))毒液中工蚁毒液的 C13 C13 1 和 C15 C15 1 的比例要比多蚁 [4] 的五种主要生物碱 S. saevissima 中的红色火蚁后来被定名为红火蚁(S. invicta Buren, 1972) 黑色火蚁为后蚁巢中的高而多蚁后蚁巢中工蚁毒液不饱和哌啶碱的比例要大于单蚁后蚁巢的[18] 黑火蚁(S. richteri Buren, 1972)[10] 黑火蚁工蚁毒液生近来的研究表明火蚁素 solenopsins 对细胞膜物碱仅含微量 C15 可与红火蚁区别开这 5 种生物 Na -K+-ATPase 有抑制作用从而导致突触后神经传导碱都是反式结构分别被称为火蚁素 A solenopsin A 阻断[19] 异火蚁素 A IsosolenopsinA cisc11 对 3 种神经 C11) 火蚁素 B solenopsin B C13) 脱氢火蚁素 B dehy- 氮氧合成酶(NOS)具有选择性抑制作用[20] 火蚁素能选 drosolenopsin B C13 1) 火蚁素 C solenopsin C C15), 脱择性抑制 PI3K 磷脂酰基肌醇 3 激酶因此对肿瘤细氢火蚁素 C dehydrosolenopsin C C15 1) 这 5 种哌啶碱胞生长和血管生成也有控制作用[21] 在国外专利数据占总碱量的比例分别为 1.25% 15.1% 17.6% 44.2% 库中有用红火蚁毒液生物碱制成口服药剂来治疗动 21.8% MacConnel 对工蚁毒液加氢后检测到物如猫狗的寄生虫如虱子跳蚤 [22] 也有专利提出火 C19H39N + 和 C21H43N + 的强度增加了而 C19H37N 和蚁素具有治疗神经系统疾病如阿耳茨海默氏病及提高 C21H41N 的离子峰则检测不到说明 C19H37N 和 C21H41N 体能的功能 [23] 生物碱在自然界广泛存在其中许多是 C19H39N + 和 C21H43N + 的烃类同系物其对毒液生物具有抗癌抗菌和抗 HIV 的作用 [24] 按相生相克的理碱臭氧氧化后得到的唯一挥发物为壬醛从而确定六论在一定的浓度范围内可以将有毒的物质进行利位取代基双键的位置陈立等 2009 重新分析了红用此文参考国外相关研究在国内首次报道入侵中火蚁工蚁毒液的化学组成所得工蚁毒液主要哌啶碱国的多后型红火蚁工蚁和蚁后毒液主要成分哌啶生物质谱图与此研究结果完全一致碱的差异红火蚁毒液生物碱在医学和农业等方面的 [11] [12-13] 但除了已知的 7 对哌啶碱正反式 C11,C13 1,C13,C15 1,C15,C17 1,C17 外他 + 活性和功能值得进行深入研究和开发们还报道了微量的哌啶环Δ 和Δ 为烯键的哌啶碱 1,2 1,6 参考文献推测其为毒液主要哌啶碱的生物合成途径的前体化合物国外研究表明火蚁工蚁的毒液生物碱具有种的特 [1] 曾玲, 陆永跃, 陈忠南, 等. 红火蚁监测与防治. 广州: 广东科技出版社,

5 马伏宁等 : 多后型红火蚁工蚁和蚁后毒液生物碱成分的比较 61 [2] Hoffman D.R., Smith A.M., Schmidt M., et al. Allergens in Hymenoptera venom. XXII. Comparison of venoms from two species of imported fire ants, Solenopsis invicta and richteri. J Allergy Clin Immunol, 1990, 85(6): [3] Vander Meer, R. K., Morel, L.. Ant queens deposit pheromones and antimicrobialagentson eggs. Naturwissenschajqen, 1995, 82: [4] MacConnell, J.G., Blum, M.S., Fales, H.M.. Chemistry of fire ant venom. Tetrahedron, 1971, 27 (6): [5] Brand, J.M., Blum, M.S., Fales, H.M., et al. Fire ant venoms: comparativeanalysesof alkaloidalcomponents. Toxicon, 1972,10 (3): [6] 邵敬国, 罗礼智, 陈浩涛, 等. 应用多元 PCR 技术对我国红火蚁社会型的鉴定. 昆虫学报, 2008,51(5): [7] Banks, W.A., Lofgren, C.S., Jouvenaz, D.P., et al. Techniques for collecting, rearing, and handling imported fire ants. USDA SEA AATS-S-21, 1981, 4: 1-9. [8] Blum, M.S., Walder, J.R., Callahan, P. S.. Chemical, insecticidal, and antibiotic properties of fire ant venom. Science, 1958, 128 (3319): [9] Leclercq, S., Thirionet, I., Broeders, F., et al. Absolute configuration of the solenopsins, venom alkaloids of the fire ants. Tetrahedron, 1994, 50: [10] Buren, W.F.. Revisionary studies on the taxonomy of the imported fire ants. J GeorgiaEntomolSoc, 1972, 7: [11] Brand, J.M., Blum, M.S., Ross, H.H.. Biochemical evolution in fire ant venoms. InsectBiochemistry, 1973b, 3(1): [12] Chen, L., Fadamiro, H. Y..Re-investigation of venom chemistry of Solenopsis fire ants. I. Identification of novel alkaloids in Solenopsis richteritoxicon, 2009, 53(5): [13] Chen, L., Fadamiro, H. Y.. Re-investigation of venom chemistry of Solenopsis fire ants. II. Identification of novel alkaloids in Solenopsis invic tatoxicon, 2009, 53(5): [14] MacConnell, J.G., Blum, M.S., Buren, W.F., et al. Fire ant venoms: chemotaxonomic correlations with alkaloidal compositions. Toxicon, 1976, 14 (1): [15] Jouvenaz, D.P., Blum, M.S., MacConnell, J.G.. Antibacterial activity of venom alkaloids from the imported fire ant, Solenopsis invicta Buren. AntimicrobialAgents andchemotherapy, 1972, 2(4): [16] Lind, N. K.. Mechanism of action of fire ant (solenopsis) venom.i. Lyticreleaseof histaminefrommastcells. Toxicon, 1982, 20(5): [17] Vander Meer, R. K., Williams, F. D., Lofgren, C. S.. Hydrocarbon components of trial pheromone of the red imported fire ant. Solenopsis invic ta. Tetrahedronletters, 1981, 22(18): [18] Lai L. C., Huang R. N. Wu W. J.. Venom alkaloids of monogyne and polygyne forms of the red imported fire ant, Solenopsis invicta, in Taiwan. InsectesSociaux, 2008, 8: 1-7. [19] Koch, R.B., Desaiah, D. Effect of piperidines and fire ant venom on ATPase activites from brain homogenate and characterization of Na +-K + ATPase inhibition. Biochemical pharmacology, 1977, 26: [20] Yi, G. B., McClendon, D., Desaiah, D., et al. Fire ant venom alkaloid, isosolenopsin A, a potent and selective inhibitor of neuronal nitric oxidesynthase. Int. J. Toxicol, 2003, 22: [21] Arbiser, J. L., Kau, T., Konar, M., et al. Solenopsin, the alkaloidal component of the fire ant (Solenopsis invicta), is a naturally occurring inhibitor of phosphatidylinositol-3-kinase signaling and angiogenesis. Blood, 2007, 109(2): [22] Chalmer, R. V. Method of treating parasitic infestation of animals[eb/ OL] [23] Dorsey, D., Kindy, M. S.. Compositions and methods relating to solenopsins and their use in treating neurological disorders and enhancing physical preformance[eb/ol]. WO html, [24] 方起程. 天然药物化学研究. 北京 : 中国协和医科大学出版社, 2006: 284.

8. 9. A: 10. A: 10 11. 12. 13. 14. 15. A: 30~50 10~30 10 16.

1. A: (Red imported fire ant, RIFA) Solenopsis invicta 2. Parana 3. 2.2 4. 5. A: 6. A: 12 1 1975 ~ 1984 1998 2001 7. 8. 9. A: 10. A: 10 11. 12. 13. 14. 15. A: 30~50 10~30 10 16. 30 17. 18. A: 10 19. A:

58 中国农学通报 0 引言 状将蚂蚁腹柄处固定在蜡盘上 翻转蚂蚁使其背部接 2004 年 曾玲等发现中国广东吴川有了一种能蛰 触蜡盘 腹部末端斜向上 固定好后用一根拨针轻触 人的蚂蚁 入侵红火蚁 Red imported fire ant, RIFA;

58 中国农学通报 0 引言状将蚂蚁腹柄处固定在蜡盘上翻转蚂蚁使其背部接 2004 年曾玲等发现中国广东吴川有了一种能蛰触蜡盘腹部末端斜向上固定好后用一根拨针轻触人的蚂蚁入侵红火蚁 Red imported fire ant, RIFA;