仅限研究使用不可用于诊断程序液相色谱与串联质谱结合法 LC-S/S 是一种广泛使用的药物筛查分析工具液相色谱分离是区分样品基质中目标化合物与干扰成分的有效方法可减轻离子抑制效应并分离出同量异位素化合物因此对于已知目标筛选和未知目标筛选中的多种化合物分析而言液相色谱法仍然是确保数据

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升倪
7 years ago
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1 毒理使用 AB SCIEX TripleTOF 4600 LC/S/S 系统建立高分辨率高精度质谱方法进行尿液中毒物的高通量筛选 AB SCIEX PX - SP 高通量液相进样系统及 TripleTOF 4600 LC/S/S 系统作者 :Adrian. Taylor,AB SCIEX 加拿大安大略省 Concord 分部 ; Xiang He Jenny E. osh 及 Hua-fen Liu,AB SCIEX 美国加州 Redwood 市分部概览在典型的药物筛查分析中, 样品制备与液相色谱仪 (LC) 分离通常是耗时最长的环节液相色谱仪分离是将样品基质中的目标化合物与干扰成分有效分离的方法, 不但可减轻离子抑制效应, 而且还可分离出同重化合物因而无论对于已知目标筛查还是未知目标筛查中的各种化合物分析而言, 液相色谱仪仍然是确保高精度且准确的数据质量的重要工具与此同时, 保留时间也可用作选择性的重要依据之一, 以确保正确甄别样品中的药物但是, 高通量要求需要快速完成色谱分析, 缩短运行时间集成型多路复用系统 [PX - 高通量系统 ] 经过精心设计, 可大幅提升与串联质谱 (LC/S/S) 分析结合的液相色谱仪的通量将高分辨率 S 及 S/S 采集与 LC 分离相结合, 可通过精确质量子离子专属性质谱库匹配以及质量误差同位素描述和分子式查找高置信度地实现回溯性的化合物识别 AB SCIEX TripleTOF 4600 LC/S/S 系统是一款混合四极杆 / 飞行时间 (QqTOF) 仪器, 能实现高灵敏度高分辨率和高质量准确度的全扫描 S 及 S/S 谱库采集将 PX - 高通量系统与 TripleTOF 4600 LC/S/S 系统完美整合在一起, 可充分满足高通量筛查的需求, 进样时间间隔低于 50 秒该工作流程通过一次自动运行即能完成定性筛查与确认, 以用于生成报告结果, 同时还可保持良好的精度与准确度介绍在样品上执行药物筛查分析的实验室往往希望从单次实验中即能甄别出尽可能多的化合物此外, 实验室也希望具备可执行回溯性数据分析的能力和灵活性, 以便识别未包括在初始已知目标筛查实验中的化合物近来, 将高分辨率 / 精确质量 S 系统用作药物筛查备选工具的意向不断增强, 主要是因为该系统能够运行简单且通用的方法, 并能够执行回溯性的数据分析 AB SCIEX TripleTOF 4600 系统此项工作的目的是研究 AB SCIEX TripleTOF 4600 系统的处理能力, 该系统可作为尿样药物传统筛查法的替代方案该方法能够在各个周期中综合运用 ()TOF-S 扫描及 () 多子离子扫描在色谱分析过程中, 每个运行周期都会采集一次未知目标 TOF-S 完全扫描结果, 并根据母离子的准确质量测定值来识别化合物和任何未知目标数据采集一样, 这种方法的优势在于可以在日后进行回溯数据分析, 以识别出任何质量的已知或未知化合物加入对目标化合物的子离子扫描, 可保证采集这些化合物的 S/S 数据, 为每一种化合物提供高选择性的特征碎片离子提取离子色谱 (XIC) 这种名为 R HR 的方法与三重四极杆 (Triple Quadrupole) 质谱仪使用的 R 扫描模式类似, 但质量测量的分辨率和精确度更高, 另一个优点在于可通过与 S/S 库的匹配提供更多化合物识别标准结合所有可用的 S 和 S/S 数据, 可更加全面地进行实验计算, 以便判断可能的分子式

2 仅限研究使用不可用于诊断程序液相色谱与串联质谱结合法 LC-S/S 是一种广泛使用的药物筛查分析工具液相色谱分离是区分样品基质中目标化合物与干扰成分的有效方法可减轻离子抑制效应并分离出同量异位素化合物因此对于已知目标筛选和未知目标筛选中的多种化合物分析而言液相色谱法仍然是确保数据质量精确性的宝贵工具但是全面的药物筛查法往往需要较长的LC时间运行可通过复用LC系统并同步到单个S的方式缩短运行时间从而提供实现 S效率最大化所需的高通量已经开发出一种用于同步两套LC系统和一部质谱仪的集成式复用系统以便将样品并行注入到两个 LC流中图通过PX -高通量系统实现LC并行运行和S 检测功能的高效利用可提高通用常规筛查分析系统的总通量本文中探讨的例子采用PX -高通量系统满足高速筛查需求但在LC分离度方面有所妥协该例使用C8保护柱 0x.毫米 5毫米提供较低分离度但通过每个目标化合物特征碎片离图. PX -高通量系统配置和应用中使用的模块安排子的高选择性提取离子色谱 XIC 获得专属性 XICof + R(4pairs): 0./64.Da fromsam ple9(std5)of ix_batch_.wiff (UnknownIonSource) ax. 8.e4cps. XICof + R(4pairs): 0./64.Da fromsam ple9(std5)of ix_batch_.wiff (UnknownIonSource).03 ax. 8.e4cps. XICof + R(4pairs): 0./64.Da fromsam ple9(std5)of ix_batch_.wiff (UnknownIonSource) XICof + R(4pairs): 0./64.Da fromsam ple9(std5)of ix_batch_.wiff (UnknownIonSource) ax. 8.e4cps ax. 8.e4cps ject to stream N send sync signal XICof + R(4pairs): 0./64.Da fromsam ple9(std5)of ix_batch_.wiff (UnknownIonSource) ax. 8.e4cps ax. 8.e4cps e4.5e4.0e4.0e XICof + R(4pairs): 0./64.Da fromsam ple9(std5)of ix_batch_.wiff (UnknownIonSource).03.5e4.0e idle acquire from stream acquire from stream wait for sync signal XICof + R(4pairs): 0./64.Da fromsam ple9(std5)of ix_batch_.wiff (UnknownIonSource).5e4.0e ax. 8.e4cps..5e4.0e XICof + R(4pairs): 0./64.Da fromsam ple9(std5)of ix_batch_.wiff (UnknownIonSource).5e4.0e4 0. ax. 8.e4cps..5e4.0e e4.0e imizes S idle time durg LC column equilibration Improves LC/S throughput 图. 设计用于支持到单个S的并行LC流的复用LC系统 asterview 可管理大型化合物清单运行提取离子色谱 XIC 运算包括已知目标和未知目标峰值查找运算和谱库搜索 asterview 能够根据保留时间精确质量同位素特征 S/S库搜索和分子式查找核查结果 asterview 软件可进一步用于协助结构解析元素构成判定和裂化解读从而高置信度地使用获得的S/S数据发现未知化合物图3. 复合运行典型状态下的管道原理图和溶液流路图

3 在运行复用软件安装程序后, 用户可方便地在 Analyst 程序的硬件配置对话框中配置和激活复用选项 PX Driver 为用户提供一种简便易用的界面, 便于用户在设置窗格中修改系统配置 ( 图 4), 以及在方法窗格创建或更新复用 LC 方法 ( 图 5) 图 4. PX TF 版.0. 的工作设置界面, 简单仪器配置实验条件样品制备通过向空白尿液加入分析标准物 (Cerilliant)( 第批 ) 来制备尿样, 制成浓度分别为和 0.5ng/mL 的校准品然后分别在第批和第 3 批尿样中制备浓度为 4ng/mL 和 0ng/mL 的尿样将 50uL 每种尿样转移到微量离心管, 加入 0uL 的内部标准物混合物, 然后涡旋随后在 300uL 0% 氢氧化镁水溶液加入 0.% 甲酸, 对样品进行稀释涡旋并用离心机分离, 然后转移到自动采样器小瓶中, 以便注入 LC-S/S 图 5. PX TF Version.0. 的方法工作空间, 易用方法编辑器可简便地加载样例色谱到软件中, 并且定向到质谱仪供数据采集的区域可以突出显示时间计算自动完成, 通量的增加在计量器中显示通过此界面, 还可在状态窗格 ( 图 6) 中监测实时采集情况和系统状态 ( 包括两路 LC 流的压力流速温度流经路径和系统状态 ) 复用软件配置和操作使用组合的复用 LC-S/S 系统, 由一套 AB SCIEX TripleTOF 4600 LC/S/S 系统两套 Shimadzu Promence XR LC 系统一个内置装载样品的四溶剂选择阀的泵和用于流程控制的 3 个开关阀门组成 ( 图 ) 两个色谱通道并非相互独立, 因其共享一个高压装载泵, 这样可以更加灵活地注入和清洗溶剂成分所有硬件模块均受 Analyst TF.6 软件和 PX TF Driver.0 版控制可以精确设定开关阀门的启闭时间, 让每路 LC 流路交替注入, 实现 LC 梯度洗脱通过在 PX TF Driver.0 方法编辑器中围绕目标峰值选择保留时间窗口, 可实现有目标的 S 数据采集图 3 是用于典型 LC-S 分析的一般流程图 6. PX TF 版.0. 的状态工作空间便于系统监测和多方法均衡

4 本快速筛查法使用 C8 保护柱 (0x. 毫米,5 微米 ) 混合 0.% 甲酸的甲醇水溶液以分钟的梯度注入, 采集窗口时长 3 分钟对一批样品的自动复合数据采集非常类似于用 Analyst 软件中的批次编辑器创建和提交批次, 来实现有规律的 LC-S 数据采集在复合数据采集运行过程中, 交错进样时间安排可由 PX TF Driver.0 实时计算完成 LC 组件和质谱仪之间的全部开关阀门和同步工作也可用 PX TF Driver.0 加以控制 Real peak Good library match Sample Library 质谱条件 AB SCIEX TripleTOF 4600 系统与 DuoSpray 源和电喷雾电离 (ESI) 探头配合使用该方法针对每一种化合物采用优化的碰撞能量 (CE), 对 4 种目标化合物进行一次 TOF-S 全扫描和多次闭环 TOF-S/S 产物离子扫描 TOF-S 扫描累计时间为 50 毫秒, TOF-S/S 扫描累计时间为 0 毫秒图 7. 对未知尿样使用 S/S 数据采集来减少假阴性率在对 AB SCIEX TripleTOF 4600 系统进行质量校准时, 可通过 LC 自动采样器在柱上注入 AB SCIEX APCI 校准溶液然后通过对质量药物 LC/S/S 库进行搜索来采集 S/S 频谱结果和讨论利用具有高置信度识别能力的 PX - 高通量 TripleTOF 4600 系统实现快速高分辨率筛查 PX - 高通量系统搭配 PX TF Driver.0 软件并结合 TripleTOF 4600 系统所提供的快速药物筛查备选解决方案的效果已得到建立和研究已开发出一种针对 4 种药物化合物的 LC-S/ S 方法, 进样时间间隔小于 50 秒这种方法可使用多点选择性设置, 以便根据质量误差同位素匹配保留时间 S/S 库搜索和分子式查找完成识别, 从而发挥 TripleTOF 系统的高分辨率及精确质量功能只依赖精确质量和同位素匹配功能, 可能会导致图 7 和图 8 所示的假阴性结论图 7 和图 8 所示的例子说明, 由于受共流出的未知化合物的干扰, 而导致目标化合物的同位素比值不正确这可能导致假阴性结论, 因为已为该化合物采集到 S/S 数据, 且生成了良好的库匹配, 即已成功识别出该化合物由于分离度有限, 在使用快速筛查法时会造成共流出的化合物增加, 从而增加干扰的可能性因此可通过在这些快速筛查工作流程中采集 S/S 数据, 来减少假阴性率图 8. 干扰会导致同位素离子比率变化, 但 S/S 可确认特性以及避免可能的假阴性在 XIC 管理器中定义 XIC 清单和处理选项, 用于有目标的定性筛查和识别在 PeakView 软件中打开数据文件后, 可从 PeakView 工具栏的 XIC 管理器菜单启动 asterview 插件打开的表中有多个数据列, 其值可编辑, 具体包括名称分子式添加 / 修改保留时间宽度等定义 XIC 时必须录入质量录入的方法可以是直接编辑单元格, 让软件根据分子式同位素和提供的添加物计算其数据或也可从电子表格中粘贴数据生成的 XIC 清单可储存起来为将来的处理使用 ( 图 9) 可以在选项对话框中调整多个处理和显示设置这其中包括用于质量误差保留时间同位素匹配库搜索和分子式查找 ( 图 0) 中的强度信噪阈值和置信度设置

5 图 9. 带 asterview 插件的 PeakView 软件 ; 下面的窗口是加载用于目标药物筛查和识别的 XIC 表在 asterview 中显示结果处理完成后, 显示结果显示了保留时间中发现的质量误差 ( 单位 ppm 或 mda), 库搜索结果以及分子式结果在上面的 XIC 中, 用绿色突出显示设定的强度阈值, 用红绿灯图 ( 图 4) 来直观显示化合物识别中的置信度数据可以根据命中强度 ( 图 5) 来定制显示出的被提取的化合物例如可以将软件设置为仅显示亮起五盏绿灯的化合物图 0. 化合物识别中的置信度设置起动数据处理, 只需点击表格右下方的 Show XIC 按钮 asterview 可自动计算 XIC, 执行化合物识别工作, 并显示结果图和 3 显示的示例数据显示了为每一个目标被分析物自动生成的 XIC, 并将其与用户设定的阈值相比较高分辨率和精确质量 LC-S/S 色谱包含样品中出现的经得起所使用的电离技术和极性检验所有分子的综合信息可生成窄 XIC, 以选择性地筛查目标化合物通过 S 和 S/S 模式进行高速采集时, 根据受检测的质量,AB SCIEX TripleTOF 4600 系统可提供高达 35,000 的高分辨率 ( 图 ), 以及稳定的 ~ ppm 质量准确度

6 表. asterview 生成的结果表, 详细显示了根据注射筛查法中的 48 秒快速进样生成的 S 和 S/S 数据, 从 00ng/mL 尿样中识别出的化合物图. 选择的药物化合物在各种质量下的分辨率和质量准确度图 3. 利用停留时间质量误差同位素模式在 0ng/mL 尿样中检测并识别出 4 种药物, 并用 S/S 库比对结果和分子式发现结果对其加以确认这样在筛查复杂样本 ( 图 ) 中的大量目标药物化合物时, 可生成窄 XIC, 既满足选择性要求, 又能提升信噪比图 3 和表显示了利用检测到的分子离子同位素模式停留时间精确质量及 S/S 图谱搜索与精确质量 S/S 药物库比对得到的信息, 从添加的尿样中识别出的 4 种药物化合物为便于比对, 让药物化合物的精确质量 TOF-S/S 产物离子的扫描结果与相匹配的库图谱互为镜像图 3 的右下方窗口显示了库与含哌替啶的尿样的图谱比对的一个例子样品图谱为上方的蓝色线, 库图谱为灰色线图. 使用窄的窗口提取离子色谱 (XIC) 来提升选择性和信噪比

7 仅限研究使用不可用于诊断程序图6显示了在离子色谱的提取过程中自动完成的库搜索和分子式查找器的详细结果两项结果均以S和S/S的结果为只显示了突出显示的XIC 基础分子式查找器利用分子离子加合物同位素模式的高分辨率精确质量信息和碎片离子信息来实证性地计算可能的分子显示了S和S/S图谱式但这只能通过结合所有可用的S和S/S数据才能实现显示了库搜索和分子式查找的详情数据核查功能用五个红绿灯代表RT误差质量误差同位素匹配库搜索和分子式查找来直观显示识别中的置信度图4. 数据核查 XIC用绿色突出显示当XIC超出用户设定的强度阈值时会按照在选择组合为阳性结果等于或大于框图5 中选择的标准的指定用绿色图6. 同时运用S和S/S信息自动生成库搜索结果和分子式查找器结果突出显示可显示超过设定阈值的识别标准 asterview 具有灵活的报告功能通过同时使用高分辨率和精确质量S和S/S信息来显示化合物的识别情况可使用可定制的报告模版生成文字 csv文本或pdf报告图7 图5. 识别待核查的成分图7. asterview 的灵活报告功能

8 我的样品中含有多少? asterview 还能够定量比较样品, 突出显示因达到或超过目标浓度而被识别出的化合物未知样品可通过使用 XIC 表格下方的下拉菜单来选择然后选择对照液可以是溶剂标准物, 也可以是加有各种相关浓度 ( 比如截止水平 ) 的目标化合物的基质样品随后设定阈值, 以便于比较性筛查 ( 样品比和对照液 ) 阈值表示如果未知样品中出现的所有化合物的浓度均高于对照样品, 就在 XIC 表中突出显示所有的化合物阈值 0.5 表示将突出显示与对照样品相比信号达到 50% 的全部化合物图 8 所示的是如何通过与截止浓度水平的标准物比较, 迅速发现含有高于截止浓度的药物的样品结论本文说明, 通过复用 LC 系统并将其同步到单个 S, 就有可能实现现代实验室所需的高通量, 以便分析不断增多的样品数量, 同时保持或缩短周转时间上述特性可通过自动调节程序同步运行的功能实现通过简便地输入时间或突出显示样品色谱的被分析物保留区域, 就能自动更新质谱仪的采集周期 PX - 高通量系统可实现进样间隔小于 50 秒的快速筛查, 使用多点选择性法 (multiple pots of selectivity) 筛查目标化合物, 确保对样本中成分高置信度识别图 8. 比较性筛查该 XIC 系提取用于来自浓度为 0ng/mL 药物标准物 ( 右方色谱 ) 的安非他命未知化合物中的对应峰值突出显示 ( 左方色谱图 ), 且因未知化合物中的安非他命浓度已经超过 0ng/mL( 阈值 ) 而被提取当浓度超过 0ng/mL 的截止水平时, 还可以高置信度地识别未知样品中的 DA 仅用于研究不用于诊断程序 03 年 AB SCIEX 公司版权所有本文提及的商标均为 AB Sciex Pte. Ltd. 或其各自所有者的财产 AB SCIEX 经许可后方能使用出版编号 : 文档编号 :RUO-KT A AB SCIEX 中国公司北京分公司地址 : 北京市朝阳区酒仙桥中路 4 号院号楼 5 层电话 : 传真 : 上海分公司及亚太区应用支持中心地址 : 上海市田林路 888 号科技绿洲一号楼 0 室电话 : 传真 : 全国免费垂询电话 : , 网址 : 微博 :@ABSCIEX 广州分公司地址 : 广州市体育西路 09 号高盛大厦 5C 电话 : 传真 :

(Microsoft Word - CAN_Peakview XIC Manager \324\332\316\264\326\252\316\357\311\270\262\351\326\320\265\304\323\246\323\ )

$(Microsoft Word - CAN_Peakview XIC Manager \324\332\316\264\326\252\316\357\311\270\262\351\326\320\265\304\323\246\323\ )$ TripleTOF 5600 和 PeakView 及 XIC 管理者软件联用, 让未知物筛查和确证更简单更快捷更方便拥有准确质量数的高分辨 MS/MS 二级质谱图为您带来更多的未知物信息 André Schreiber and David Cox AB SCIEX, Concord, Ontario, Canada 概述本文主要讲述利用 AB Sciex 公司 TripleTOF 5600