从菜鸟到高手-手把手教你qPCR教程II

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1 从 菜 鸟 到 高 手 - 手 把 手 教 你 qpcr 教 程 II --- 定 量 PCR 原 理 常 见 问 题 分 析 和 数 据 统 计 分 析 前 言 由 于 Real-time qpcr 的 众 多 优 点, 现 在 已 经 是 生 命 科 学 领 域 的 一 项 常 规 技 术 越 来 越 多 的 研 究 文 章 中 涉 及 RT-PCR 的 实 验, 也 基 本 上 被 real-time qpcr 所 代 替 由 于 real-time apcr 输 出 的 数 据 不 同 于 常 规 的 PCR 电 泳 检 测, 很 多 没 有 做 过 real-time qpcr 的 研 究 者 常 常 感 到 高 深 莫 测, 不 知 从 何 入 手 ; 甚 至 一 些 做 过 次 实 验 的 研 究 者 也 会 对 数 据 处 理 分 析 感 到 迷 惑, 不 知 所 措 本 文 就 从 real-time qpcr 的 发 展 史 说 起, 包 括 real-time qpcr 的 原 理, 实 验 设 计, 实 际 操 作 ( 以 ABI StepOne 仪 器, 和 北 京 百 泰 克 生 物 技 术 有 限 公 司 的 试 剂 为 例 ), 数 据 分 析, 常 见 问 题 解 答 五 个 方 面, 手 把 手 教 你 从 各 个 方 面 了 解 real-time qpcr, 彻 底 的 从 菜 鸟 到 高 手! 一 Real-time qpcr 发 展 史 Real-time qpcr 就 是 在 PCR 扩 增 过 程 中, 通 过 荧 光 信 号, 对 PCR 进 程 进 行 实 时 检 测 由 于 在 PCR 扩 增 的 指 数 时 期, 模 板 的 Ct 值 和 该 模 板 的 起 始 拷 贝 数 存 在 线 性 关 系, 所 以 成 为 定 量 的 依 据 由 于 常 规 的 PCR 的 缺 点,real-time qpcr 由 于 其 操 作 简 便, 灵 敏 度 高, 重 复 性 好 等 优 点 发 展 非 常 迅 速 设 在 已 经 涉 及 到 生 命 科 学 研 究 的 各 个 领 域, 比 如 基 因 的 差 异 表 达 分 析,SNP 检 测, 等 位 基 因 的 检 测, 药 物 开 发, 临 床 诊 断, 转 基 因 研 究 等 在 Real-time qpcr 技 术 的 发 展 过 程 中, 定 量 PCR 仪 的 发 展 起 了 至 关 重 要 的 作 用 1995 年, 美 国 PE 公 司 ( 已 经 并 入 Invitrogen 公 司 ) 成 功 研 制 了 Taqman 技 术,1996 年 推 出 了 首 台 荧 光 定 量 PCR 检 测 系 统, 通 过 检 测 每 个 循 环 的 荧 光 强 度, 通 过 Ct 值 进 行 数 据 分 析 从 而 荧 光 定 量 PCR 获 得 广 泛 应 用 现 在 的 定 量 PCR 仪 有 ABI , HT StepOnePlus TM StepOne TM PRISM StepOne TM 系 列 ;BIO-RAD 的 CFX96 icycler iq5 MyiQ MJ Research Chromo4 TM Opticon 系 列 ;Stratagene Mx TM 系 列 ;Roche LightCycler 系 列 ;Eppendorf Masercycler ;Corbett Rotor-Gene TM ;Cepheid SmartCycler 和 BIOER 的 LineGene 系 列 以 及 国 内 的 一 些 品 牌 比 如 西 安 天 隆 科 技 公 司 的 TL 系 列 仪 器 二 Real-time qpcr 概 述 1. Real-time qpcr 原 理 实 时 PCR 就 是 在 PCR 扩 增 过 程 中, 通 过 荧 光 信 号, 对 PCR 进 程 进 行 实 时 检 测 一 般 来 讲, 定 量 PCR 仪 包 括 : 实 时 荧 光 定 量 PCR 仪 主 要 由 样 品 载 台 基 因 扩 增 热 循 环 组 件 微 量 荧 光 检 测 光 学 系 统 微 电 路 控 制 系 统 计 算 机 及 应 用 软 件 组 成 其 中 基 因 扩 增 热 循 环 组 件 工 作 原 理 与 传 统 基 因 扩 增 仪 大 致 相 同, 不 同 厂 家 不 同 型 号 的 产 品 分 别 采 用 空 气 加 热 压 缩 机 制 冷 半 导 体 加 热 制 冷 等 工 作 方 式 独 特 是 这 个 微 量 荧 光 检 测 系 统 有 由 荧 光 激 发 光 学 部 件 微 量 荧 光 检 测 部 件 光 路 控 制 系 统 组 成 常 用 的 荧 光 激 发 方 式 有 两 种 : 卤 钨 灯 和 LED; 荧 光 检 测 元 件 常 用 两 种 方 式 :

2 光 电 倍 增 管 和 冷 光 CCD 摄 像 机, 光 单 色 元 件 有 滤 光 片 和 光 栅 在 实 时 PCR 扩 增 过 程 中, 荧 光 信 号 被 收 集, 转 化 为 成 为 扩 增 和 熔 解 曲 线 具 体 数 据 就 是 基 线, 荧 光 阈 值 和 Ct 值 2. Real-time qpcr 的 数 学 原 理 也 就 是 说 为 什 么 Ct 值 跟 初 始 模 板 的 量 成 正 比? 首 先 来 看 一 个 real-time qpcr 中 的 重 要 参 数 ( 具 体 的 后 面 会 讲 到 )Ct 值 (Ct value), 阈 值 (threshold), 和 基 线 (baseline) 一 般 来 讲, 第 3-15 个 循 环 的 荧 光 值 就 是 基 线, 是 由 于 测 量 的 偶 然 误 差 引 起 的 阈 值 一 般 是 基 线 的 标 准 偏 差 的 是 10 倍 在 实 际 操 作 中 也 可 以 手 动 调 节, 位 于 指 数 期 就 可 以 Ct 值 就 是 荧 光 值 达 到 阈 值 时 候 的 PCR 循 环 次 数 所 以 是 一 个 没 有 单 位 的 参 数 C 那 么 为 什 么 说 Ct 值 跟 初 始 模 板 的 量 程 正 比 呢? 我 们 来 看 PCR 的 扩 增 方 程 :

3 从 线 性 方 程 上 看, 斜 率 (slope) 为 -1/lg(1+E), 所 以 E=10-1/slope -1 如 果 从 标 准 曲 线 上 得 到 斜 率 (-3.3), 就 可 以 算 出 扩 增 效 率 (0.99) 一 般 来 讲 PCR 扩 增 效 率 在 90%-110% 都 是 可 以 用 于 数 据 分 析 的 效 率 低 于 100%, 是 由 于 PCR 反 应 中 存 在 抑 制 因 素 ; 而 高 于 100% 可 能 一 些 污 染 非 特 异 性 扩 增 或 者 是 引 物 二 聚 体 造 成 3. Real-time qpcr 的 种 类 根 据 real-time qpcr 的 化 学 发 光 原 理 可 以 分 为 2 大 类 : 一 类 为 探 针 类 包 括 TaqMan 探 针 和 分 子 信 标, 利 用 与 靶 序 列 特 异 杂 交 的 探 针 来 指 示 扩 增 产 物 的 增 加 ; 一 类 为 非 探 针 类, 其 中 包 括 如 SYBR Green I 或 者 特 殊 设 计 的 引 物 ( 如 LUX Primers) 通 过 荧 光 染 料 来 只 是 产 物 的 增 加 3.1 Taqman 探 针 法 Taqman 探 针 是 最 早 用 于 定 量 的 方 法 就 在 PCR 扩 增 时 加 入 一 对 引 物 的 同 时 加 入 一 个 特 异 性 的 荧 光 探 针, 该 探 针 为 一 寡 核 苷 酸 :5 端 标 记 一 个 报 告 荧 光 基 团,3 端 标 记 一 个 淬 灭 荧 光 基 团 探 针 完 整 时, 报 告 基 团 发 射 的 荧 光 信 号 被 淬 灭 基 团 吸 收, 也 就 是 FRET 反 应 ;PCR 扩 增 时,Taq 酶 的 5'-3' 外 切 酶 活 性 将 探 针 酶 切 降 解, 使 报 告 荧 光 基 团 和 淬 灭 荧 光 基 团 分 离, 从 而 荧 光 监 测 系 统 可 接 收 到 荧 光 信 号, 即 每 扩 增 一 条 DNA 链, 就 有 一 个 荧 光 分 子 形 成, 实 现 了 荧 光 信 号 的 累 积 与 PCR 产 物 形 成 完 全 同 步 而 新 型 TaqMan-MGB 探 针 使 该 技 术 既 可 进 行 基 因 定 量 分 析, 又 可 分

4 析 基 因 突 变 (SNP), 有 望 成 为 基 因 诊 断 和 个 体 化 用 药 分 析 的 首 选 技 术 平 台 3.2 分 子 信 标 法 分 子 信 标 : 一 种 在 靶 DNA 不 存 在 时 形 成 茎 环 结 构 的 双 标 记 寡 核 苷 酸 探 针 在 此 发 夹 结 构 中, 位 于 分 子 一 端 的 荧 光 基 团 与 分 子 另 一 端 的 淬 灭 基 团 紧 紧 靠 近 分 子 信 标 的 茎 环 结 构 中, 环 一 般 为 个 核 苷 酸 长, 并 与 目 标 序 列 互 补 ; 茎 一 般 5-7 个 核 苷 酸 长, 并 相 互 配 对 形 成 茎 的 结 构 荧 光 基 团 连 接 在 茎 臂 的 一 端, 而 淬 灭 剂 则 连 接 于 另 一 端 分 子 信 标 必 须 非 常 仔 细 的 设 计, 以 致 于 在 复 性 温 度 下, 模 板 不 存 在 时 形 成 茎 环 结 构, 模 板 存 在 时 则 与 模 板 配 对 与 模 板 配 对 后, 分 子 信 标 的 构 象 改 变 使 得 荧 光 基 团 与 淬 灭 剂 分 开 当 荧 光 基 团 被 激 发 时, 它 发 出 自 身 波 长 的 光 子 3.3 SYBR Green 法 SYBR Green I 是 一 种 结 合 于 小 沟 中 的 双 链 DNA 结 合 染 料, 与 双 链 DNA 结 合 后, 其 荧 光 大 大 增 强 这 一 性 质 使 其 用 于 扩 增 产 物 的 检 测 非 常 理 想 SYBR GreenI 的 最 大 吸 收 波 长 约 为 497nm, 发 射 波 长 最 大 约 为 520nm 在 PCR 反 应 体 系 中, 加 入 过 量 SYBR Green 荧 光 染 料,SYBR Green 荧 光 染 料 特 异 性 地 掺 入 DNA 双 链 后, 发 射 荧 光 信 号, 而 不 掺 入 链 中 的 SYBR Green 染 料 分 子 不 会 发 射 任 何 荧 光 信 号, 从 而 保 证 荧 光 信 号 的 增 加 与 PCR 产 物 的 增 加 完 全 同 步

5 3.4 LUX primers 法 LUX (light upon extention) 引 物 是 利 用 荧 光 标 记 的 引 物 实 现 定 量 的 一 项 新 技 术 目 标 特 异 的 引 物 对 中 的 一 个 引 物 3 端 用 荧 光 报 告 基 团 标 记 在 没 有 单 链 模 板 的 情 况 下, 该 引 物 自 身 配 对, 形 成 发 夹 结 构, 使 荧 光 淬 灭 在 有 目 标 片 断 的 时 候, 引 物 与 模 板 配 对, 发 夹 结 构 打 开, 产 生 特 异 的 荧 光 信 号 4. Real-time qpcr 和 常 规 PCR 的 区 别 实 时 检 测 ( 在 对 数 扩 增 时 期 ) 而 不 是 终 点 检 测 敏 感 性 高 需 要 样 品 少 特 异 性 高 (Taqman) 精 确 定 量 三 Real-time qpcr 实 验 设 计 实 验 设 计 其 实 比 实 验 本 身 更 重 要! 好 的 实 验 设 计 可 以 事 半 功 倍, 节 省 时 间! 尤 其 做 生 物 实 验, 一 定 要 查 询 尽 可 能 完 全 的 相 关 资 料, 整 理 好 思 路, 设 计 好 实 验 路 线 当 然 实 验 过 程 中 出 现 各 种 各 样 的 变 化, 但 有 足 够 多 的 背 景 知 识, 就 可 以 分 析 原 因, 才 有 可 能 创 新 对 于 一 个 real-time qpcr 而 言, 首 先 就 是 实 验 材 料 的 处 理 和 准 备 ; 然 后 引 物 设 计, 这 步 至 关 重 要, 好 的 引 物 是 实 验 本 身 成 功 的 50%; 进 行 实 验 和 数 据 分 析 ( 这 一 部 分 单 独 说 明 ) 1. 实 验 材 料 的 处 理 和 准 备 以 最 基 本 的 基 因 表 达 差 异 分 析 为 例 实 验 材 料 分 为 对 照 组 (CON) 和 处 理 组 (TRT) 组 内 要 有 生 物 重 复, 可 以 数 据 分 析 此 处 理 是 否 有 统 计 意 义 在 材 料 收 集 过 程 中, 尽 量 避 免 RNA 的 降 解 ( 尤 其 对 于 绝 对 定 量 的 样 品 ) 一 般 传 统 的 收 集 材 料 的 方 法 是 样 品 采 集 立 刻 液 氮 速 冻, 然 后 迅

6 速 转 移 到 超 低 温 冰 箱 保 存, 但 这 种 方 法 携 带 不 方 便, 由 于 对 于 异 地 取 材 现 在 新 技 术 的 发 展, 也 有 一 些 非 液 氮 类 的 样 品 储 存 液, 比 如 百 泰 克 的 RNAfixer ( Cat. No.RP 引 物 设 计 一 般 real-time PCR 引 物 的 设 计 遵 循 下 面 一 些 原 则 : 扩 增 产 物 长 度 在 bp 引 物 应 用 核 酸 系 列 保 守 区 内 设 计 并 具 有 特 异 性 产 物 不 能 形 成 二 级 结 构 产 物 长 度 一 般 在 15~30 碱 基 之 间 G+C 含 量 在 40%~60% 之 间 碱 基 要 随 机 分 布 引 物 自 身 不 能 有 连 续 4 个 碱 基 的 互 补 引 物 之 间 不 能 有 连 续 4 个 碱 基 的 互 补 引 物 5 端 可 以 修 饰 引 物 3 端 不 可 修 饰 引 物 3 端 要 避 开 密 码 子 的 第 3 位 Taqman 探 针 的 设 计 稍 有 不 同, 一 般 有 公 司 设 计 合 成 遵 循 下 面 一 下 原 则 : 尽 量 靠 在 上 游 引 物 ; 长 度 30-45bp,Tm 比 引 物 高 至 少 5 ; 5 端 不 要 是 G,G 会 有 淬 灭 作 用, 影 响 定 量 3 实 验 操 作 一 般 来 讲, 进 行 real-time qpcr MasterMix 都 是 2 的 浓 缩 液, 只 需 要 加 入 模 板 和 引 物 就 可 以 由 于 real-time qpcr 灵 敏 度 高, 所 以 每 个 样 品 至 少 要 做 3 个 平 行 孔, 以 防 在 后 面 的 数 据 分 析 中, 由 于 Ct 相 差 较 多 或 者 SD 太 大, 无 法 进 行 统 计 分 析 通 常 来 讲, 反 应 体 系 的 引 物 终 浓 度 为 mM; 模 板 如 果 是 总 RNA 一 般 是 10ng-500ng, 如 果 cdna, 通 常 情 况 下 是 1μl 或 者 1μl 的 10 倍 稀 释 液, 要 根 据 目 的 基 因 的 表 达 丰 度 进 行 调 整 当 然 这 些 都 是 经 验 值, 在 操 作 过 程 中, 还 需 要 根 据 所 用 MasterMix, 模 板 和 引 物 的 不 同 就 行 优 化, 达 到 一 个 最 佳 反 应 体 系 在 反 应 体 系 配 置 过 程 中, 有 下 面 几 点 需 要 注 意 : 1. MasterMix 不 要 反 复 冻 融, 如 果 经 常 使 用, 最 好 溶 解 后 放 在 4 度 2. 更 多 的 配 制 Mix 进 行, 减 少 加 样 误 差 最 好 能 在 冰 上 操 作 3. 每 管 或 每 孔 都 要 换 新 枪 头! 不 要 连 续 用 同 一 个 枪 头 加 样! 4. 所 有 成 分 加 完 后, 离 心 去 除 气 泡 5. 每 个 样 品 至 少 3 个 平 行 孔 说 到 反 应 体 系 的 配 制, 不 得 不 说 到 参 比 或 者 校 正 染 料 (reference dye,passive dye) 常 用 的 是 ROX TM 或 者 其 他 染 料, 只 要 不 影 响 检 测 PCR 产 物 的 荧 光 值 就 可 以 参 比 染 料 的 作 用 是 标 准 化 荧 光 定 量 反 应 中 的 非 PCR 震 荡, 校 正 加 样 误 差 或 者 是 孔 与 孔 之 间 的 误 差, 提 供 一 个 稳 定 的 基 线 现 在 很 多 公 司 已 经 把 ROX TM 配 制 在 MasterMix 或 者 Premixture 里 如 果 反 应 曲 线 良 好 或 已 经 优 化 好 反 应 体 系, 也 可 以 不 加 ROX TM 染 料 校 正 比 如 Bio-RAD 的 系 列 仪 器

7 通 常 来 讲,real-time qpcr 的 反 应 程 序 不 需 要 想 常 规 的 PCR 那 样, 要 变 性 退 火 延 伸 3 步 由 于 其 产 物 长 度 在 bp 之 间, 所 以 只 需 要 变 性 和 退 火 就 可 以 了 SYBR Green 等 染 料 法, 最 好 在 PCR 扩 增 程 序 结 束 后, 加 一 个 溶 解 程 序, 来 形 成 溶 解 曲 线, 判 断 PCR 产 物 的 特 异 性 扩 增 而 溶 解 程 序, 仪 器 都 有 默 认 设 置, 或 稍 有 不 同, 但 都 是 一 个 在 产 物 进 行 溶 解 时 候, 进 行 荧 光 信 号 的 收 集 各 个 仪 器 的 设 置 基 本 类 似, 首 先 设 计 plate, 再 设 置 反 应 程 序, 请 具 体 参 考 仪 器 的 说 明 书 四 Real-time qpcr 数 据 分 析 1. Real-time qpcr 常 见 参 数 基 线 (baseline) 通 常 是 3-15 个 循 环 的 荧 光 信 号 同 一 次 反 应 中 针 对 不 同 的 基 因 需 单 独 设 置 基 线 阈 值 (threshold) 自 动 设 置 是 3-15 个 循 环 的 荧 光 信 号 的 标 准 偏 差 的 10 倍 手 动 设 置 : 置 于 指 数 扩 增 期, 刚 好 可 以 清 楚 地 看 到 荧 光 信 号 明 显 增 强 同 一 次 反 应 中 针 对 不 同 的 基 因 可 单 独 设 置 阈 值, 但 对 于 同 一 个 基 因 扩 增 一 定 要 用 同 一 个 阈 值 Ct 值 : 与 起 始 浓 度 的 对 数 成 线 性 关 系 分 析 定 量 时 候 一 般 取 Ct:15-35 太 大 或 者 太 小 都 会 导 致 定 量 的 不 准 确 Rn(Normalized reporter) 是 荧 光 报 告 基 团 的 荧 光 发 射 强 度 与 参 比 染 料 的 荧 光 发 射 强 度 的 比 值 Rn: Rn 是 Rn 扣 除 基 线 后 得 到 的 标 准 化 结 果 ( Rn = Rn 基 线 ) 2. 影 响 Ct 值 的 关 键 因 素 模 板 浓 度 模 板 浓 度 是 决 定 Ct 的 最 主 要 因 素 控 制 在 一 个 合 适 范 围 内, 使 Ct 在 之 间 反 应 液 成 分 的 影 响 任 何 分 子 的 荧 光 发 射 都 受 环 境 因 素 影 响 ---- 比 如 溶 液 的 ph 值 和 盐 浓 度 PCR 反 应 的 效 率 PCR 反 应 的 效 率 也 会 影 响 CT 值 在 PCR 扩 增 效 率 低 的 条 件 下 进 行 连 续 梯 度 稀 释 扩 增, 与 PCR 扩 增 效 率 高 的 条 件 下 相 比, 可 能 会 所 产 生 斜 率 不 同 的 标 准 曲 线 PCR 效 率 取 决 于 实 验 反 应 混 合 液 性 能 和 样 品 质 量 一 般 说 来, 反 应 效 率 在 % 之 间 都 是 可 以 接 受 的 3. 如 何 评 估 实 时 定 量 PCR 反 应 的 效 果 PCR 扩 增 效 率 : 为 了 正 确 地 评 估 PCR 扩 增 效 率, 至 少 需 要 做 3 次 平 行 重 复, 至 少 做 5 个 数 量 级 倍 数 (5 logs) 连 续 梯 度 稀 释 模 板 浓 度 R 2 值 : 另 一 个 评 估 PCR 效 率 的 关 键 参 数 是 相 关 系 数 R 2, 它 是 说 明 两 个 数 值 之 间 相 关 程 度 的 统 计 学 术 语 如 果 R 2 等 于 1, 那 么 你 可 以 用 Y 值 (Ct) 来 准 确 预 测 X 值 ( 量 ) 如 果 R 2 等 于 0, 你 就 不 能 通 过 Y 值 来 预 测 X 值 R 2 值 大 于 0.99 时, 两 个 数 值 之 间 相 关 的 可 信 度 很 好

8 精 确 度 : 标 准 偏 差 (standard deviation, 偏 差 的 平 方 根 ) 是 最 常 用 的 精 确 度 计 量 方 法 如 果 许 多 数 据 点 都 靠 近 平 均 值, 那 么 标 准 偏 差 就 小 ; 如 果 许 多 数 据 点 都 远 离 平 均 值, 则 标 准 偏 差 就 大 实 际 上, 足 够 多 重 复 次 数 产 生 的 数 据 组 会 形 成 大 致 的 正 态 分 布 这 经 常 可 通 过 经 典 的 中 心 极 限 理 论 来 证 明, 独 立 同 分 布 随 机 变 量 在 无 限 多 时 趋 向 于 正 态 分 布 如 果 PCR 反 应 效 率 是 100%, 那 么 2 倍 稀 释 点 之 间 的 平 均 Ct 间 隔 应 该 恰 为 1 个 Ct 值 要 以 99.7% 的 几 率 分 辨 2 倍 稀 释 浓 度, 标 准 偏 差 就 必 须 小 于 等 于 标 准 偏 差 越 大, 分 辨 2 倍 稀 释 的 能 力 就 越 低 为 了 能 够 在 95% 以 上 的 情 况 下 分 辨 出 2 倍 稀 释, 标 准 偏 差 必 须 小 于 等 于 灵 敏 度 : 无 论 Ct 绝 对 值 是 多 少, 任 何 能 够 有 效 扩 增 和 检 测 起 始 模 板 拷 贝 数 为 1 的 系 统 都 达 到 了 灵 敏 度 的 极 限 PCR 效 率 是 决 定 反 应 灵 敏 度 的 关 键 因 素 在 检 测 极 低 拷 贝 数 时 的 另 一 个 重 要 的 考 虑 因 素 是, 低 拷 贝 时 的 模 板 数 量 不 能 按 普 通 情 况 来 预 期 相 反, 它 会 遵 循 泊 松 分 布, 即 进 行 大 量 的 平 行 重 复, 平 均 应 该 含 有 一 个 拷 贝 的 起 始 模 板, 实 际 上 约 37% 不 含 有 拷 贝, 仅 有 约 37% 含 有 1 个 拷 贝, 约 18% 实 际 上 含 有 两 个 拷 贝 因 此, 为 了 更 可 靠 地 检 测 低 拷 贝, 必 须 做 大 量 的 平 行 重 复 实 验 来 提 供 统 计 显 著 性, 并 克 服 泊 松 分 布 的 限 制 评 价 荧 光 PCR 结 果 的 标 准 因 素 建 议 指 标 效 率 精 密 度 5 个 数 量 级 梯 度 稀 释 至 少 3 个 重 复 Slope ~ -3.3 R 2 > 0.99 标 准 差 < 0.25 (0.5 或 者 1 个 Ct 之 内 ) 灵 敏 度 增 加 低 浓 度 样 本 的 重 复 数 统 计 分 析 除 了 这 些 因 素, 还 必 须 评 估 和 验 证 合 适 的 实 验 对 照 ( 如 无 模 板 对 照, 无 反 转 录 酶 对 照 等 ) 以 及 模 板 质 量 3. Real-time qpcr 定 量 方 法 可 以 分 为 绝 对 定 量 和 相 对 定 量 绝 对 定 量 是 用 一 系 列 已 知 浓 度 的 标 准 品 制 作 标 准 曲 线, 在 相 同 的 条 件 下 目 的 基 因 测 得 的 荧 光 信 号 量 同 标 准 曲 线 进 行 比 较, 从 而 得 到 目 的 基 因 的 量 该 标 准 品 可 以 是 纯 化 的 质 粒 DNA, 体 外 转 录 的 RNA, 或 者 是 体 外 合 成 的 ssdna 相 对 定 量 可 以 分 为 比 较 Ct 法 和 其 他 一 些 相 对 方 法 比 较 Ct 指 的 是 通 过 与 内 参 基 因 Ct 值 之 间 的 相 差 来 计 算 基 因 表 达 差 异, 也 称 之 是 2 - Ct

9 3.1 绝 对 定 量 Y=-3.432X ;R2= 0.995, E=95%, 所 以 可 以 进 行 数 据 分 析 如 果 未 知 样 品 的 代 入 方 程 : 所 以 : Ct=25, 25=-3.432X , X=2.8 Copies=10^ DDCt 定 量 3.3 其 他 定 量 方 法 Marisa L. Wong and Juan F. Medrano: BioTechniques July 2005

10 五 Real-Time qpcr 常 见 问 题 分 析 1. 无 Ct 值 出 现 检 测 荧 光 信 号 的 步 骤 有 误 : 一 般 SYBR Green 法 采 用 60 采 集,Taqman 法 则 一 般 在 退 火 结 束 时 或 延 伸 结 束 采 集 信 号 引 物 或 探 针 降 解 : 可 通 过 PAGE 检 测 其 完 整 性 模 板 量 不 足 : 对 未 知 浓 度 的 样 品 应 从 系 列 稀 释 样 本 的 最 高 浓 度 做 起 模 板 降 解 : 避 免 样 品 制 备 中 杂 质 的 引 入 及 反 复 冻 融 的 情 况 2. Ct 值 出 现 过 晚 (Ct>35) 扩 增 效 率 低 : 反 应 条 件 不 够 优 化 设 计 更 好 的 引 物 或 探 针 ; 改 用 三 步 法 进 行 反 应 ; 适 当 降 低 退 火 温 度 ; 增 加 镁 离 子 浓 度 等 PCR 各 种 反 应 成 分 的 降 解 或 加 样 量 的 不 足 PCR 产 物 太 长 : 一 般 采 用 bp 的 产 物 长 度 基 因 表 达 量 低

11 3. 标 准 曲 线 线 性 关 系 不 佳 加 样 存 在 误 差 : 使 得 标 准 品 不 呈 梯 度 标 准 品 出 现 降 解 : 应 避 免 标 准 品 反 复 冻 融, 或 重 新 制 备 并 稀 释 标 准 品 引 物 或 探 针 不 佳 : 重 新 设 计 更 好 的 引 物 和 探 针 4. NTC 有 信 号 模 板 中 存 在 抑 制 物, 或 模 板 浓 度 过 高 体 系 中 有 污 染 引 物 二 聚 体, 结 合 熔 解 曲 线 分 析 5. 熔 解 曲 线 不 止 一 个 主 峰 引 物 设 计 不 够 优 化 : 应 避 免 引 物 二 聚 体 和 发 夹 结 构 的 出 现 引 物 浓 度 不 佳 : 适 当 降 低 引 物 的 浓 度, 并 注 意 上 下 游 引 物 的 浓 度 配 比 镁 离 子 浓 度 过 高 : 适 当 降 低 镁 离 子 浓 度, 或 选 择 更 合 适 的 mix 试 剂 盒 模 板 有 基 因 组 的 污 染 :RNA 提 取 过 程 中 避 免 基 因 组 DNA 的 引 入, 或 通 过 引 物 设 计 避 免 非 特 异 扩 增 6. 扩 增 效 率 低

12 反 应 试 剂 中 部 分 成 分 特 别 是 荧 光 染 料 降 解 反 应 条 件 不 够 优 化 : 可 适 当 降 低 退 火 温 度 或 改 为 三 步 扩 增 法 反 应 体 系 中 有 PCR 反 应 抑 制 物 : 一 般 是 加 入 模 板 时 所 引 入, 应 先 把 模 板 适 度 稀 释, 再 加 入 反 应 体 系 中, 减 少 抑 制 物 的 影 响 7. 扩 增 曲 线 异 常 仪 器 参 数 设 置 错 误 模 板 过 高 六 Real-Time qpcr 的 数 据 统 计 分 析 有 过 qpcr 实 验 经 验 的 研 究 者 可 能 很 快 就 能 熟 悉 其 不 同 于 PCR 的 结 果 Ct 值, 以 及 数 据 的 常 用 运 算 方 法 比 较 Ct 方 法 (2 - Ct ) 那 么 这 个 数 据 到 底 有 没 有 统 计 意 义 呢? 这 个 该 如 何 分 析? 我 们 来 逐 渐 了 解 相 对 定 量 qpcr 的 数 据 统 计 分 析 首 先 在 数 据 分 析 之 前, 要 确 保 数 据 的 准 确 性, 也 就 是 实 验 过 程 的 各 个 部 门 都 要 严 格 操 作, 也 就 是 MIQE 标 准 ( 具 体 可 见 Bustin SA et al Clin Chem 55, ) 这 些 都 做 到 了, 那 么 就 可 以 来 分 析 Ct 数 据 了 统 计 分 析, 至 少 有 3 个 数 据 才 可 以 那 就 是 在 设 计 实 验 中, 每 组 至 少 要 有 3 个 生 物 学 重 复 ( 也 就 是 3 个 不 同 的 样 本 ) 这 个 和 qpcr 的 3 个 PCR replicate 是 完 全 不 同 的 概 念 ( 这 儿 是 同 一 个 样 本 的 3 个 重 复 ) 下 面 我 们 就 以 一 个 处 理 分 析 的 实 验 来 做 说 明 如 何 来 数 据 统 计 分 析 1 个 处 理 组 和 1 个 对 照 组, 每 组 有 3 个 样 本 ( 也 就 是 生 物 学 重 复 ), 来 检 测 某 目 的 基 因 (target, 设 定 内 参 基 因 为 reference), 在 这 个 处 理 中, 目 的 基 因 的 表 达 是 否 受 到 抑 制? 同 时 这 个 抑 制 作 用 是 否 有 统 计 学 意 义

13 不 管 是 哪 个 qpcr 仪, 都 可 以 做 此 检 测, 数 据 也 都 可 以 用 excel 表 归 纳 如 下 ( 也 就 是 下 表 的 前 6 列 内 容 ): Group Sample Ct target Ct mean of Ct reference Ct mean of T R 2 - Ct 2 - Ct CON sample sample sample TRT sample sample sample 首 先 每 个 样 品 的 目 的 基 因 和 内 参 基 因 的 3 个 PCR replicate 要 求 出 平 均 值 ( 上 表 中 的 第 4 和 第 6 列 内 容 ), 这 个 仅 仅 是 技 术 重 复, 也 就 是 确 定 这 个 数 据 是 可 靠 的 然 后 求 出 在 每 个 样 品 的 目 的 基 因 的 变 化 量 也 就 是 ( 目 的 基 因 的 量 和 其 对 应 的 内 参 基 因 的 量 相 比, 也 就 是 2 - Ct, 及 上 表 中 的 第 7 列 中 的 数 据 ) 然 后 再 平 均 对 照 组 中 的 3 个 2 - Ct ( 上 表 第 七 列 数 据 的 前 3 个 ), 在 此 例 子 中 数 据 为 , 然 后 所 有 2 - Ct 的 都 和 相 比 即 可 到 2 - Ct ( 上 表 第 八 列 数 据 ), 也 就 是 倍 数 变 化 (fold change 或 者 relative expression) 下 面 就 可 以 对 2 - Ct 或 者 2 - Ct 或 者 就 行 统 计 分 析,Ct 的 2 种 形 式 都 可 以 进 行 统 计 分 析, 唯 独 不 能 对 Ct 进 行 统 计 分 析 具 体 统 计 分 析 的 方 法, 任 何 统 计 分 析 软 件 都 可 以 用 比 如 SPSS, GraphPad 等 这 里 展 示 一 下 GraphPad 分 析 的 柱 状 图 结 果

14 参 考 资 料 1. Qiagen AB 荧 光 定 量 PCR 技 术 讲 座 和 生 物 通 丁 香 园 螺 旋 网 等 相 关 资 料 2. Analyzing real-time PCR data by the comparative C T method. Thomas D Schmittgen and Kenneth J Livak 2008, Nature Protocols: Vol3: Real-time PCR for mrna Quantitation Marisa L. Wong and Juan F. Medrano 2005, BioTechniques, Vol39: The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-time PCR Experiments. Bustin SA et al 2009 Clin Chem, 55, 北 京 信 诺 金 达 生 物 科 技 有 限 公 司 地 址 : 北 京 海 淀 区 东 北 旺 南 路 一 号 院 北 321 电 话 : 传 真 :

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