<4D F736F F D20ADB9AB7EB74CA5CDAAABA4A7C0CBC5E7A4E8AA6BA846AAF9A4F3B1ECB5DFA4A7C0CBC5E728BDC6BC66A A4BDA76929>

Transcription

1 食 品 微 生 物 之 檢 驗 方 法 - 沙 門 氏 桿 菌 之 檢 驗 Methods of Test for Food Microorganisms - Test of Salmonella 第 一 部 : 沙 門 氏 桿 菌 之 分 離 1. 適 用 範 圍 : 本 方 法 適 用 於 食 品 中 沙 門 氏 桿 菌 之 檢 驗 2. 檢 驗 方 法 : 檢 體 經 增 菌 後, 續 以 選 擇 性 培 養 基 培 養, 配 合 沙 門 氏 桿 菌 型 別 鑑 定 之 方 法 2.1. 工 作 環 境 : 工 作 平 台 須 寬 敞 潔 淨 光 線 良 好, 操 作 平 台 光 度 為 100 呎 燭 光 以 上, 密 閉 室 內 換 氣 良 好, 儘 可 能 沒 有 灰 塵 及 流 動 空 氣 每 15 分 鐘 落 菌 數 不 得 超 過 15 CFU/ 培 養 皿 2.2. 器 具 及 材 料 生 物 安 全 操 作 櫃 (Biological safety cabinet, BSC): 第 二 等 級 (class II)( 含 ) 以 上 者 乾 熱 滅 菌 器 高 壓 滅 菌 釜 冰 箱 : 能 維 持 5±3 者 冷 凍 櫃 : 保 持 30±3 者 培 養 箱 : 能 維 持 內 部 溫 度 溫 差 在 ±1.0 以 內 者 水 浴 : 能 維 持 水 溫 溫 差 在 ±0.2 以 內 者 攪 拌 均 質 器 (Blender) 或 鐵 胃 (Stomacher): 能 適 用 於 無 菌 操 作 者 增 菌 用 容 器 :500 ml 含 蓋 之 可 滅 菌 廣 口 瓶, 或 無 菌 塑 膠 ( 鐵 胃 ) 袋 三 角 瓶 :500 ml 燒 杯 :500 ml 加 熱 板 (Hot plate): 具 有 磁 性 攪 拌 功 能 天 平 : 可 稱 量 到 2000 g 者, 靈 敏 度 為 0.1 g; 可 稱 量 到 120 g 者, 靈 敏 度 為 1 mg 培 養 皿 : 已 滅 菌, 內 徑 約 90 mm, 深 度 約 15 mm, 底 皿 之 內 外 面 應 平 坦, 無 氣 泡 刮 痕 或 其 他 缺 點 吸 管 輔 助 器 (Pipette aid) 或 微 量 分 注 器 吸 管 或 吸 管 尖 : 已 滅 菌,1 ml 吸 管 應 有 0.01 ml 之 刻 度 ;5 及 10 ml 吸 管 應 有 0.1 ml 刻 度 接 種 針 及 接 種 環 ( 直 徑 約 3 mm): 鎳 鉻 合 金, 鉑 銥 或 鉻 線 材 質, 或 可 拋 棄 式 者 試 管 : mm mm mm 及 mm 或 其 它 適 用 者 1

2 旋 渦 混 合 器 (Vortex mixer) 玻 璃 棒 剪 刀 藥 勺 小 刀 及 鑷 子 : 可 滅 菌 燈 箱 : 一 般 日 光 燈 源,30 瓦 ph 試 紙 :ph 值 適 用 範 圍 為 6~ 酸 鹼 度 測 定 儀 (ph meter) 振 盪 器 (Shaker) 無 菌 濾 膜 : 孔 徑 0.45 μm 或 以 下 之 親 水 性 醋 酸 纖 維 膜 杜 蘭 發 酵 管 (Durham fermentation tube): 外 徑 6 50 mm 或 其 他 適 用 者 試 藥 : 碘 碘 化 鉀 煌 綠 (brilliant green) 氯 化 鎂 (MgCl 2 ) 孔 雀 綠 草 酸 鹽 (malachite green oxalate) 氰 化 鉀 (potassium cyanide) 半 乳 糖 醇 (dulcitol) 乳 糖 (lactose) 蔗 糖 (sucrose) 葡 萄 糖 (glucose) 甲 基 紅 (methyl red) 肌 酸 (creatine) 溴 甲 酚 紫 (bromcresol purple) 酚 紅 (phenol red) 氫 氧 化 鈉 氯 化 鈉 - 萘 酚 ( -naphthol) 對 - 二 甲 胺 基 苯 甲 醛 (p-dimethyl aminobenzaldehyde) 氫 氧 化 鉀 甲 醛 溶 液 (36-38%) 95% 乙 醇 硫 酸 月 桂 酸 鈉 (sodium lauryl sulfate) 漂 白 水 ( 約 5.25% 次 氯 酸 鈉 溶 液 ) 無 水 乙 醇 正 戊 醇 (normal amyl alcohol ) 亞 硫 酸 鉀 (potassium sulfite) 鹽 酸 磷 酸 氫 二 鈉 (Na 2 HPO 4 ) 磷 酸 二 氫 鉀 (KH 2 PO 4 ) 磷 酸 氫 二 鉀 (K 2 HPO 4 ) 磷 酸 二 氫 銨 (NH 4 H 2 PO 4 ) 亞 硒 酸 氫 鈉 (NaHSeO 3 ) 硫 酸 銨 [(NH 4 ) 2 SO 4 ] 胱 胺 酸 (L-cystine) 膽 鹽 (bile salts) 膽 鹽 No.3 (bile salts No.3) 碳 酸 鈣 (CaCO 3 ) 硫 代 硫 酸 鈉 (Na 2 S 2 O 3 5H 2 O) 無 水 硫 代 硫 酸 鈉 (Na 2 S 2 O 3 ; anhydrous) 無 水 磷 酸 氫 二 鈉 (Na 2 HPO 4 ; anhydrous) L- 離 胺 酸 (L-lysine) 離 胺 酸 鹽 酸 鹽 (L-lysine hydrochloride) 木 糖 (xylose) 去 氧 膽 酸 鈉 (sodium deoxycholate) 檸 檬 酸 銨 鐵 (ferric ammonium citrate) 水 楊 苷 (salicin) 溴 麝 香 草 藍 (bromthymol blue) 酸 性 復 紅 (acid fuchsin) 無 水 硫 酸 亞 鐵 (FeSO 4 ; anhydrous) 硫 酸 亞 鐵 (FeSO 4 ) 檸 檬 酸 鈉 (Na 3 C 6 H 5 O 7 ) 硫 酸 鎂 (MgSO 4 ) 尿 素 (urea) 丙 二 酸 鈉 (sodium malonate) 中 性 紅 (neutral red) 結 晶 紫 (crystal violet) 丙 酮 酸 鈉 (sodium pyruvate) 亞 硫 酸 鉍 [Bi 2 (SO 3 ) 3 ] Tergitol anionic 7 及 Triton X-100 界 面 活 性 劑 均 採 用 試 藥 級 ; 牛 肉 抽 出 物 (beef extract) 酵 母 抽 出 物 (yeast extract) 蛋 白 腖 (peptone) 月 示 蛋 白 腖 (proteose peptone) 洋 菜 (agar) 植 物 蛋 白 腖 (phytone peptone) 胰 化 酪 蛋 白 腖 (trypticase peptone) 胰 化 酪 蛋 白 大 豆 培 養 液 粉 末 (trypticase soy broth; dehydrated) 胰 化 蛋 2

3 白 培 養 液 粉 末 (tryptose broth; dehydrated) 聚 蛋 白 腖 (polypeptone) 胰 化 蛋 白 腖 (tryptone) 蛋 白 腖 緩 衝 液 粉 末 (buffered peptone water powder) 無 脂 乳 粉 (nonfat dry milk) 小 牛 腦 浸 出 物 (calf brain infusion) 牛 心 浸 出 物 (beef heart infusion) 月 示 蛋 白 腖 No.3 (proteose peptone No.3) 木 瓜 酶 (papain) 及 纖 維 素 酶 (cellulase) 均 採 用 微 生 物 級 試 劑 % 木 瓜 酶 溶 液 : 取 木 瓜 酶 5 g, 溶 於 蒸 餾 水 使 成 100 ml, 以 9500 rpm 離 心 10 分 鐘 後, 經 無 菌 濾 膜 過 濾, 注 入 已 滅 菌 之 三 角 瓶 內 需 新 鮮 配 製 % 纖 維 素 酶 溶 液 : 取 纖 維 素 酶 1 g, 溶 於 蒸 餾 水 使 成 100 ml, 溶 解 後 以 無 菌 濾 膜 過 濾 後, 於 2~5 貯 存, 並 應 於 2 週 內 使 用 % 酚 紅 溶 液 : 取 酚 紅 0.25 g, 溶 於 蒸 餾 水 使 成 100 ml N 氫 氧 化 鈉 溶 液 : 取 氫 氧 化 鈉 40 g, 溶 於 蒸 餾 水 使 成 1000 ml N 鹽 酸 溶 液 : 取 鹽 酸 89 ml, 溶 於 蒸 餾 水 使 成 1000 ml % 煌 綠 溶 液 : 取 煌 綠 1 g, 溶 於 水 使 成 100 ml, 以 無 菌 濾 膜 過 濾 % 煌 綠 溶 液 : 取 煌 綠 0.1 g, 溶 於 蒸 餾 水 使 成 100 ml % 煌 綠 溶 液 : 取 1% 煌 綠 溶 液 2 ml, 加 入 蒸 餾 水 使 成 1000 ml % 溴 甲 酚 紫 溶 液 : 取 溴 甲 酚 紫 0.2 g, 溶 於 蒸 餾 水 使 成 100 ml % 無 菌 生 理 食 鹽 水 (0.85% sterile physiological saline solution): 取 氯 化 鈉 8.5 g, 溶 於 蒸 餾 水 使 成 1000 ml 分 裝 於 試 管, 以 121 滅 菌 15 分 鐘 福 馬 林 化 生 理 食 鹽 水 (Formalinized physiological saline solution): 取 氯 化 鈉 8.5 g, 以 蒸 餾 水 溶 解 使 成 1000 ml, 以 121 滅 菌 15 分 鐘, 冷 卻 至 室 溫, 再 加 甲 醛 溶 液 6 ml 柯 瓦 克 氏 試 劑 (Kovacs reagent): 取 對 - 二 甲 胺 基 苯 甲 醛 5 g, 溶 於 正 戊 醇 75 ml, 再 徐 徐 加 入 鹽 酸 25 ml, 混 合 均 勻 後 應 呈 黃 色, 保 存 於 4 冰 箱 中 歐 普 氏 試 劑 (Voges-Proskauer reagents, VP reagents): 溶 液 A: 取 α- 萘 酚 5 g, 以 無 水 乙 醇 溶 解 使 成 100 ml 溶 液 B: 取 氫 氧 化 鉀 40 g, 以 蒸 餾 水 溶 解 使 成 100mL 甲 基 紅 指 示 劑 (Methyl red indicator): 取 甲 基 紅 0.1 g, 溶 於 3

4 95% 乙 醇 300 ml, 再 加 蒸 餾 水 使 成 500 ml 碘 - 碘 化 鉀 溶 液 : 取 碘 化 鉀 5 g, 溶 於 無 菌 水 5 ml, 加 入 碘 6 g, 攪 拌 至 溶 解, 再 加 無 菌 水 稀 釋 至 20 ml, 避 光 儲 存 本 操 作 務 必 在 抽 氣 櫃 內 進 行 含 0.1% 硫 酸 月 桂 酸 鈉 氯 水 溶 液 : 取 硫 酸 月 桂 酸 鈉 1 g, 溶 於 蒸 餾 水 992 ml, 再 加 入 漂 白 水 8 ml, 臨 用 前 配 製 % 氰 化 鉀 溶 液 : 取 氰 化 鉀 0.5 g, 溶 於 無 菌 蒸 餾 水 使 成 100 ml 氰 化 鉀 為 劇 毒 物 質, 本 操 作 務 必 在 抽 氣 櫃 內 進 行 氯 化 鎂 溶 液 : 取 氯 化 鎂 400 g, 溶 於 蒸 餾 水 使 成 1000 ml 孔 雀 綠 草 酸 鹽 溶 液 : 取 孔 雀 綠 草 酸 鹽 0.4 g, 溶 於 蒸 餾 水 使 成 100 ml 血 清 沙 門 氏 桿 菌 多 價 本 體 (O) 抗 血 清 [Salmonella polyvalent somatic (O) antiserum] 沙 門 氏 桿 菌 多 價 鞭 毛 (H) 抗 血 清 [Salmonella polyvalent flagellar (H) antiserum] 沙 門 氏 桿 菌 單 價 本 體 族 群 (O) 抗 血 清 [Salmonella somatic group (O) antiserum], 包 括 A B C 1 C 2 C 3 D 1 D 2 E 1 E 2 E 3 E 4 F G H I 及 Vi 培 養 基 乳 糖 培 養 液 (Lactose broth) 牛 肉 抽 出 物 (beef extract) 3 g 蛋 白 腖 (peptone)...5 g 乳 糖 (lactose).5 g 蒸 餾 水 ml 加 熱 溶 解 後, 以 121 滅 菌 15 分 鐘, 最 終 ph 值 為 6.9 ± 無 脂 乳 粉 溶 液 (Nonfat dry milk, Reconstituted) 無 脂 乳 粉 (nonfat dry milk)..100 g 蒸 餾 水 ml 加 熱 溶 解 後, 以 121 滅 菌 15 分 鐘 蛋 白 腖 緩 衝 液 (Buffered peptone water) 蛋 白 腖 (peptone) 10 g 氯 化 鈉 g 磷 酸 氫 二 鈉 (Na 2 HPO 4 ).3.5 g 磷 酸 二 氫 鉀 (KH 2 PO 4 ) g 蒸 餾 水 ml 加 熱 溶 解 後, 以 121 滅 菌 15 分 鐘, 最 終 ph 值 為 7.2±0.2 4

5 亞 硒 酸 胱 胺 酸 培 養 液 (Selenite cystine broth, SC) 聚 蛋 白 腖 (polypeptone)...5 g 或 胰 化 蛋 白 腖 (tryptone) 乳 糖 (lactose)...4 g 磷 酸 氫 二 鈉 (Na 2 HPO 4 )..10 g 亞 硒 酸 氫 鈉 (NaHSeO 3 )...4 g 胱 胺 酸 (L-cystine) g 蒸 餾 水 ml 加 熱 溶 解 後, 取 10 ml 或 225 ml, 分 別 注 入 試 管 或 三 角 瓶 內 後, 再 於 沸 騰 水 浴 上 蒸 氣 加 熱 10 分 鐘 ( 加 熱 時 應 經 常 搖 動, 但 不 可 高 壓 殺 菌 ), 最 終 ph 值 為 7.0±0.2 配 製 後 應 當 天 使 用 四 硫 代 硫 酸 鹽 培 養 液 (Tetrathionate broth, TT) TT 基 礎 培 養 液 (TT broth base) 聚 蛋 白 腖 (polypeptone)...5 g 膽 鹽 (bile salts).1 g 碳 酸 鈣 (CaCO 3 )..10 g 硫 代 硫 酸 鈉 (Na 2 S 2 O 3 5H 2 O)...30 g 蒸 餾 水.1000 ml 將 基 礎 培 養 液 加 熱 沸 騰, 最 終 ph 值 為 8.4±0.2 冷 卻 至 45 以 下, 分 取 10 ml, 注 入 試 管 中, 儲 藏 於 冰 箱 備 用 使 用 前 加 入 碘 - 碘 化 鉀 溶 液 0.2 ml 及 0.1% 煌 綠 溶 液 0.1 ml Rappaport - Vassiliadis 培 養 液 (RV) RV 基 礎 培 養 液 ( RV broth base) 胰 化 蛋 白 腖 (tryptone)..5 g 氯 化 鈉 g 磷 酸 二 氫 鉀 (KH 2 PO 4 ) g 蒸 餾 水 ml 量 取 RV 基 礎 培 養 液 1000 ml 氯 化 鎂 溶 液 100 ml 及 孔 雀 綠 草 酸 鹽 溶 液 10 ml, 混 合 均 勻, 分 取 10 ml, 注 入 試 管, 以 115 滅 菌 15 分 鐘, 最 終 ph 值 為 5.5±0.2 RV 基 礎 培 養 液 必 須 於 配 製 當 天 與 氯 化 鎂 溶 液 及 孔 雀 綠 草 酸 鹽 溶 液 混 合 成 為 RV 培 養 液 氯 化 鎂 溶 液 儲 存 於 棕 色 瓶 中, 於 室 溫 下 可 保 存 1 年 ; 孔 雀 綠 草 酸 鹽 溶 液 儲 存 於 棕 色 瓶 中, 於 室 溫 下 可 保 存 6 個 月 配 製 完 成 之 RV 培 養 液 儲 存 於 冰 箱 中 勿 超 過 1 個 月 不 建 議 使 用 市 售 乾 燥 培 養 基 配 製 本 培 養 液 木 糖 離 胺 酸 去 氧 膽 酸 鹽 培 養 基 (Xylose lysine deoxycholate 5

6 agar, XLD) 酵 母 抽 出 物 (yeast extract)...3 g L- 離 胺 酸 (L-lysine)..5 g 木 糖 (xylose) g 乳 糖 (lactose).7.5 g 蔗 糖 (sucrose) 7.5 g 去 氧 膽 酸 鈉 (sodium deoxycholate)..2.5 g 檸 檬 酸 銨 鐵 (ferric ammonium citrate).0.8 g 硫 代 硫 酸 鈉 (Na 2 S 2 O 3 5H 2 O).6.8 g 氯 化 鈉 g 洋 菜 (agar).15 g 酚 紅 (phenol red) 0.08 g 蒸 餾 水 1000 ml 攪 拌 加 熱 至 沸 騰 溶 解, 注 意 不 可 加 熱 過 度 於 50 水 浴 中 冷 卻, 最 終 ph 值 為 7.4±0.2 每 培 養 皿 注 入 約 20 ml, 凝 固 後 打 開 皿 蓋 約 1/2~1/4, 使 培 養 基 表 面 乾 燥 配 製 後 勿 儲 存 超 過 一 天 海 克 頓 腸 內 菌 培 養 基 (Hektoen enteric agar, HE) 蛋 白 腖 (peptone) 12 g 酵 母 抽 出 物 (yeast extract)...3 g 膽 鹽 No.3 (bile salts No.3)..9 g 乳 糖 (lactose)..12 g 蔗 糖 (sucrose).12 g 水 楊 苷 (salicin).2 g 氯 化 鈉 g 硫 代 硫 酸 鈉 (Na 2 S 2 O 3 5H 2 O).5 g 檸 檬 酸 銨 鐵 (ferric ammonium citrate)..1.5 g 溴 麝 香 草 藍 (bromthymol blue) g 酸 性 復 紅 (acid fuchsin).0.1 g 洋 菜 (agar)...14 g 蒸 餾 水 ml 攪 拌 加 熱 至 沸 騰 溶 解, 沸 騰 勿 超 過 1 分 鐘 於 50 水 浴 中 冷 卻, 最 終 ph 值 為 7.5±0.2 每 培 養 皿 注 入 約 20 ml, 打 開 皿 蓋 約 1/2~1/4, 靜 置 約 2 小 時, 使 培 養 基 表 面 乾 燥 配 製 後 勿 儲 存 超 過 一 天 亞 硫 酸 鉍 培 養 基 (Bismuth sulfite agar, BS) 聚 蛋 白 腖 (polypeptone) 或 蛋 白 腖 (peptone)..10 g 6

7 牛 肉 抽 出 物 (beef extract) 5 g 葡 萄 糖 (glucose)...5 g 無 水 磷 酸 氫 二 鈉 (Na 2 HPO 4 ; anhydrous).4 g 無 水 硫 酸 亞 鐵 (FeSO 4 ; anhydrous) g 亞 硫 酸 鉍 [Bi 2 (SO 3 ) 3 ]...8 g 煌 綠 (brilliant green) g 洋 菜 (agar)...20 g 蒸 餾 水.1000 ml 攪 拌 加 熱 至 沸 騰 溶 解 約 1 分 鐘, 不 須 高 壓 滅 菌 冷 卻 至 45~ 50, 最 終 ph 值 為 7.7±0.2 每 培 養 皿 注 入 約 20 ml, 打 開 皿 蓋 約 1/2~1/4, 靜 置 約 2 小 時, 使 培 養 基 表 面 乾 燥 培 養 基 注 入 培 養 皿 前, 應 搖 動 混 合, 使 絮 狀 沈 澱 物 分 散 均 勻, 搖 動 時 應 避 免 產 生 氣 泡 培 養 基 以 當 天 使 用 最 佳, 最 多 不 得 超 過 48 小 時, 且 應 貯 存 於 暗 處 三 糖 鐵 培 養 基 (Triple sugar iron agar, TSI) 牛 肉 抽 出 物 (beef extract)...3 g 酵 母 抽 出 物 (yeast extract)..3 g 蛋 白 腖 (peptone)...15 g 月 示 蛋 白 腖 (proteose peptone)...5 g 葡 萄 糖 (glucose)...1 g 乳 糖 (lactose)...10 g 蔗 糖 (sucrose)...10 g 硫 酸 亞 鐵 (FeSO 4 ) g 氯 化 鈉...5 g 硫 代 硫 酸 鈉 (Na 2 S 2 O 3 5H 2 O) g 酚 紅 (phenol red) g 洋 菜 (agar)...12 g 蒸 餾 水 ml 加 熱 溶 解 後, 分 取 約 5 ml, 注 入 試 管, 以 121 滅 菌 15 分 鐘, 最 終 ph 值 為 7.4±0.2 滅 菌 後 作 成 斜 面 培 養 基, 斜 面 長 度 約 4~5 cm, 斜 面 底 部 之 深 度 約 2~3 cm 胰 化 蛋 白 腖 培 養 液 (Tryptone broth) 胰 化 蛋 白 腖 (tryptone) g 蒸 餾 水 ml 加 熱 溶 解 後, 分 取 約 5 ml, 注 入 試 管 內, 以 121 滅 菌 15 分 鐘, 最 終 ph 值 為 6.9± 胰 化 酪 蛋 白 大 豆 培 養 液 (Trypticase soy broth) 7

8 植 物 蛋 白 腖 (phytone peptone).3 g 胰 化 酪 蛋 白 腖 (trypticase peptone) 17 g 磷 酸 氫 二 鉀 (K 2 HPO 4 ) g 氯 化 鈉 g 葡 萄 糖 (glucose) 2.5 g 蒸 餾 水.1000 ml 加 熱 溶 解 後, 取 225 ml, 倒 入 500 ml 三 角 錐 瓶, 以 121 滅 菌 15 分 鐘 最 終 ph 值 為 7.3± 胰 化 酪 蛋 白 大 豆 胰 化 蛋 白 培 養 液 (Trypticase soy- tryptose broth) 胰 化 酪 蛋 白 大 豆 培 養 液 粉 末 (trypticase soy broth; dehydrated)..15 g 胰 化 蛋 白 培 養 液 粉 末 (tryptose broth; dehydrated) 13.5 g 酵 母 抽 出 物 (yeast extract)...3 g 蒸 餾 水.1000 ml 加 熱 溶 解 後, 分 取 約 5 ml, 注 入 試 管 內, 以 121 滅 菌 15 分 鐘, 最 終 ph 值 為 7.2± 含 亞 硫 酸 鉀 胰 化 酪 蛋 白 大 豆 培 養 液 (Trypticase soy broth containing potassium sulfite) 亞 硫 酸 鉀 (potassium sulfite)....5 g 胰 化 酪 蛋 白 大 豆 培 養 液 ml 加 熱 溶 解 後, 以 121 滅 菌 15 分 鐘, 備 用 MR-VP 培 養 液 (MR-VP broth) 蛋 白 腖 緩 衝 液 粉 末...7 g (buffered peptone-water powder) 葡 萄 糖 (glucose)...5 g 磷 酸 氫 二 鉀 (K 2 HPO 4 )..5 g 蒸 餾 水 ml 溶 解 後, 分 取 約 5 ml, 注 入 試 管 中, 以 121 滅 菌 12~15 分 鐘, 最 終 ph 值 為 6.9± 辛 蒙 斯 檸 檬 酸 鹽 培 養 基 (Simmons citrate agar) 氯 化 鈉 g 檸 檬 酸 鈉 (Na 3 C 6 H 5 O 7 ).2 g 磷 酸 氫 二 鉀 (K 2 HPO 4 )..1 g 磷 酸 二 氫 銨 (NH 4 H 2 PO 4 )..1 g 硫 酸 鎂 (MgSO 4 ).0.2 g 8

9 溴 麝 香 草 藍 (bromthymol blue) g 洋 菜 (agar)...15 g 蒸 餾 水 ml 加 熱 溶 解 後, 分 取 約 5 ml, 注 入 試 管 中, 以 121 滅 菌 15 分 鐘, 最 終 ph 值 為 6.8±0.2 滅 菌 後 作 成 斜 面 培 養 基, 此 斜 面 長 度 約 4~5 cm, 斜 面 底 部 深 度 約 2~3 cm 尿 素 培 養 液 (Urea broth) 尿 素 (urea)...20 g 酵 母 抽 出 物 (yeast extract).0.1 g 磷 酸 氫 二 鉀 (K 2 HPO 4 ) g 磷 酸 氫 二 鈉 (Na 2 HPO 4 )..9.5 g 酚 紅 (phenol red) g 蒸 餾 水 ml 溶 解 後, 以 無 菌 濾 膜 過 濾, 分 取 1.5~3.0 ml 濾 液, 注 入 已 滅 菌 之 試 管 中, 最 終 ph 值 為 6.8± 尿 素 培 養 液 (Urea broth) (rapid) 尿 素 (urea)...20 g 酵 母 抽 出 物 (yeast extract).0.1 g 磷 酸 氫 二 鈉 (Na 2 HPO 4 ) g 磷 酸 二 氫 鉀 (KH 2 PO 4 ) g 酚 紅 (phenol red) g 蒸 餾 水 ml 溶 解 後, 以 無 菌 濾 膜 過 濾, 分 取 1.5~3.0 ml 濾 液, 注 入 已 滅 菌 之 試 管 中, 最 終 ph 值 為 6.8± 丙 二 酸 鹽 培 養 液 (Malonate broth) 酵 母 抽 出 物 (yeast extract) 1 g 硫 酸 銨 [(NH 4 ) 2 SO 4 ]...2 g 磷 酸 氫 二 鉀 (K 2 HPO 4 ) 0.6 g 磷 酸 二 氫 鉀 (KH 2 PO 4 ) 0.4 g 氯 化 鈉... 2 g 丙 二 酸 鈉 (sodium malonate).3 g 葡 萄 糖 (glucose) g 溴 麝 香 草 藍 (bromthymol blue) g 蒸 餾 水 ml 加 熱 溶 解 後, 分 取 約 3 ml, 注 入 試 管 中, 以 121 滅 菌 15 分 鐘, 最 終 ph 值 為 6.7± 離 胺 酸 鐵 培 養 基 (Lysine iron agar, LIA) 9

10 蛋 白 腖 (peptone)...5 g 酵 母 抽 出 物 (yeast extract)...3 g 葡 萄 糖 (glucose) 1 g 離 胺 酸 鹽 酸 鹽 (L-lysine hydrochloride)..10 g 檸 檬 酸 銨 鐵 (ferric ammonium citrate) g 無 水 硫 代 硫 酸 鈉 (Na 2 S 2 O 3 ; anhydrous) g 溴 甲 酚 紫 (bromcresol purple) g 洋 菜 (agar)...15 g 蒸 餾 水 ml 加 熱 溶 解 後, 分 取 約 4 ml, 注 入 試 管 中, 以 121 滅 菌 12 分 鐘, 最 終 ph 值 為 6.7±0.2 滅 菌 後 作 成 斜 面 培 養 基, 此 斜 面 長 度 約 2.5 cm, 斜 面 底 部 之 深 度 約 4 cm 離 胺 酸 脫 羧 酶 培 養 液 (Lysine decarboxylase broth) 蛋 白 腖 (peptone) 5 g 酵 母 抽 出 物 (yeast extract).3 g 葡 萄 糖 (glucose).1 g 離 胺 酸 (L-lysine) 5 g 溴 甲 酚 紫 (bromcresol purple) g 蒸 餾 水 ml 加 熱 溶 解 後, 分 取 約 5 ml, 注 入 附 有 螺 旋 蓋 試 管 中, 以 121 滅 菌 15 分 鐘, 最 終 ph 值 為 6.5~ 氰 化 鉀 培 養 液 [Potassium cyanide (KCN) broth] 聚 蛋 白 腖 (polypeptone).3 g 氯 化 鈉... 5 g 磷 酸 二 氫 鉀 (KH 2 PO 4 ) g 磷 酸 氫 二 鈉 (Na 2 HPO 4 ) 5.64 g 蒸 餾 水 ml 加 熱 溶 解 後, 以 121 滅 菌 15 分 鐘, 最 終 ph 值 為 7.6±0.2 冷 卻 後 於 抽 氣 櫃 內 以 吸 管 輔 助 器 配 合 無 菌 操 作, 加 入 0.5% 氰 化 鉀 溶 液 15 ml, 混 合 均 勻, 分 取 1~1.5 ml, 注 入 已 滅 菌 之 試 管, 貯 存 於 冰 箱 備 用, 貯 存 期 限 不 超 過 兩 週 酚 紅 碳 水 化 合 物 培 養 液 (Phenol red carbohydrate broth) 月 示 蛋 白 腖 No.3 (proteose peptone No.3)...10 g 氯 化 鈉...5 g 牛 肉 抽 出 物 (beef extract)...1 g 酚 紅 (phenol red) g ( 或 0.25% 酚 紅 溶 液 7.2 ml) 10

11 蒸 餾 水 ml 取 半 乳 糖 醇 5 g, 溶 解 於 上 述 之 培 養 液 後, 分 取 約 2.5 ml, 注 入 裝 有 發 酵 管 之 試 管 內, 以 118 滅 菌 10 分 鐘, 最 終 ph 值 為 7.4±0.2 含 乳 糖 或 蔗 糖 10 g 之 酚 紅 碳 水 化 合 物 培 養 液 配 製 方 法 亦 同 紫 色 碳 水 化 合 物 培 養 液 (Purple carbohydrate broth) 月 示 蛋 白 腖 No.3 (proteose peptone No.3).10 g 牛 肉 抽 出 物 (beef extract)..1 g 氯 化 鈉... 5 g 溴 甲 酚 紫 (bromcresol purple) g 蒸 餾 水 ml 操 作 步 驟 與 相 同, 最 終 ph 值 為 6.8± 麥 康 奇 培 養 基 (MacConkey agar) 月 示 蛋 白 腖 (proteose peptone)...3 g 蛋 白 腖 (peptone)...17 g 乳 糖 (lactose)...10 g 膽 鹽 No.3 (bile salts No.3) g 氯 化 鈉...5 g 中 性 紅 (neutral red) g 結 晶 紫 (crystal violet) g 洋 菜 (agar) g 蒸 餾 水 ml 加 熱 溶 解 後, 分 裝 於 試 管 或 三 角 瓶 內, 以 121 滅 菌 15 分 鐘, 最 終 ph 值 為 7.1± 營 養 培 養 液 (Nutrient broth) 牛 肉 抽 出 物 (beef extract)...3 g 蛋 白 腖 (peptone)...5 g 蒸 餾 水 ml 加 熱 溶 解 後, 分 取 約 10 ml, 注 入 試 管, 以 121 滅 菌 15 分 鐘, 最 終 ph 值 為 6.8± 腦 心 浸 出 物 培 養 液 (Brain heart infusion broth, BHI) 小 牛 腦 浸 出 物 (calf brain infusion) g 牛 心 浸 出 物 (beef heart infusion) g 月 示 蛋 白 腖 (proteose peptone)...10 g 氯 化 鈉...5 g 磷 酸 氫 二 鈉 (Na 2 HPO 4 ) g 葡 萄 糖 (glucose)...2 g 11

12 蒸 餾 水.1000 ml 加 熱 溶 解 後, 分 裝 於 試 管 中, 以 121 滅 菌 15 分 鐘, 最 終 ph 值 為 7.4± 含 硫 酸 亞 鐵 胰 化 酪 蛋 白 大 豆 培 養 液 (Trypticase soy broth containing ferrous sulfate) 硫 酸 亞 鐵 (FeSO 4 ).35 mg 胰 化 酪 蛋 白 大 豆 培 養 液 ml 加 熱 溶 解 後 以 121 滅 菌 15 分 鐘, 最 終 ph 值 為 7.3± 預 增 菌 培 養 液 (Universal preenrichment broth) 胰 化 蛋 白 腖 (tryptone)...5 g 月 示 蛋 白 腖 (proteose peptone) g 磷 酸 二 氫 鉀 (KH 2 PO 4 ).15 g 磷 酸 氫 二 鈉 (Na 2 HPO 4 )...7 g 氯 化 鈉... 5 g 葡 萄 糖 (glucose).0.5 g 硫 酸 鎂 (MgSO 4 ) g 檸 檬 酸 銨 鐵 (ferric ammonium citrate) g 丙 酮 酸 鈉 (sodium pyruvate) g 蒸 餾 水 ml 加 熱 溶 解 後, 分 裝 於 試 管 中, 以 121 滅 菌 15 分 鐘, 最 終 ph 值 為 6.3± 檢 液 之 調 製 與 增 菌 培 養 脫 水 蛋 黃 蛋 白 及 全 蛋, 液 狀 乳 ( 脫 脂 乳 含 2% 脂 肪 乳, 全 脂 乳 及 白 脫 乳 ), 粉 末 配 方 混 合 物 ( 蛋 糕 餅 乾 甜 甜 圈 及 麵 包 ), 嬰 兒 配 方 食 品 (infant formula) 及 其 他 含 蛋 之 口 服 或 管 灌 食 品 : 冷 凍 檢 體 分 析 前 不 須 解 凍 如 冷 凍 檢 體 須 回 溫 方 可 切 割 取 樣 時, 儘 速 解 凍 以 免 傷 及 沙 門 氏 桿 菌 或 造 成 競 爭 性 微 生 物 之 增 殖 樣 品 可 置 於 45 以 下 水 浴 中, 持 續 搖 動, 解 凍 時 間 不 超 過 15 分 鐘, 或 在 2~5, 解 凍 時 間 不 超 過 18 小 時 在 無 菌 操 作 下 稱 取 檢 體 25 g, 置 於 已 滅 菌 含 蓋 廣 口 瓶 內 檢 體 為 非 粉 末 類, 則 加 乳 糖 培 養 液 225 ml 檢 體 為 粉 末 狀, 則 先 加 乳 糖 培 養 液 15 ml, 以 已 滅 菌 玻 璃 棒 攪 拌 均 勻, 再 依 續 加 入 乳 糖 培 養 液 及 190 ml, 使 總 添 加 量 為 225 ml 攪 拌 均 勻 後, 將 瓶 蓋 旋 緊 並 在 室 溫 放 置 60±5 分 鐘 必 要 時, 以 1N 氫 氧 化 鈉 溶 液 或 1N 鹽 酸 溶 液 將 ph 值 調 至 6.8±0.2 將 瓶 蓋 略 旋 鬆, 於 35 培 養 24±2 小 時 後 供 作 檢 液 蛋 品 12

13 帶 殼 蛋 : 先 以 刷 子 清 洗 蛋 表 面 並 瀝 乾 浸 於 含 0.1% 硫 酸 月 桂 酸 鈉 之 氯 水 溶 液 約 30 分 鐘 以 無 菌 操 作 取 出 蛋 黃 及 蛋 白, 混 合 均 勻 後 稱 取 25 g, 置 於 已 滅 菌 廣 口 瓶 內 加 含 硫 酸 亞 鐵 胰 化 酪 蛋 白 大 豆 培 養 液 225 ml, 混 合 均 勻, 在 室 溫 靜 置 60±5 分 鐘 先 以 ph 試 紙 測 其 ph 值, 必 要 時, 以 無 菌 之 1N 氫 氧 化 鈉 溶 液 或 1N 鹽 酸 溶 液 將 ph 值 調 至 6.8±0.2 於 35 培 養 24±2 小 時 後, 供 作 檢 液 全 蛋 液 ( 均 質 化 者 ): 以 無 菌 操 作 稱 取 檢 體 25 g, 置 於 已 滅 菌 廣 口 瓶 內 加 含 硫 酸 亞 鐵 胰 化 酪 蛋 白 大 豆 培 養 液 225 ml, 混 合 均 勻 後, 續 依 節 步 驟 進 行 檢 液 之 調 製 水 煮 蛋 ( 雞 蛋 鴨 蛋 及 其 他 ): 蛋 殼 完 整 者, 依 節 步 驟 處 理, 再 以 無 菌 操 作 取 出 蛋 黃 及 蛋 白, 混 合 均 勻 後 稱 取 25 g, 置 於 已 滅 菌 廣 口 瓶 內, 加 胰 化 酪 蛋 白 大 豆 培 養 液 225 ml, 振 盪 均 勻 後, 續 依 節 步 驟 進 行 檢 液 之 調 製 脫 脂 乳 粉 即 溶 脫 脂 乳 粉 : 以 無 菌 操 作 稱 取 檢 體 25 g, 徐 徐 加 至 盛 有 0.002% 煌 綠 溶 液 225 ml 之 廣 口 瓶 中, 使 其 佈 滿 於 表 面 必 要 時, 檢 體 量 可 倍 增, 並 依 上 述 步 驟 加 至 盛 有 等 比 例 0.002% 煌 綠 溶 液 之 廣 口 瓶 中 勿 混 合 或 調 整 ph 值, 靜 置 60±5 分 鐘 後, 將 瓶 蓋 旋 鬆, 於 35 培 養 24±2 小 時, 供 作 檢 液 非 即 溶 脫 脂 乳 粉 : 依 節 步 驟 進 行 檢 液 之 調 製, 但 不 建 議 倍 增 檢 體 量 全 脂 乳 粉 : 依 步 驟 進 行 檢 液 之 調 製, 但 不 建 議 倍 增 檢 體 量 酪 蛋 白 乳 酸 酪 蛋 白 (Lactic casein): 以 無 菌 操 作 稱 取 檢 體 25 g, 徐 徐 加 至 盛 有 預 增 菌 培 養 液 225 ml 之 廣 口 瓶 中, 使 其 佈 滿 於 表 面 必 要 時, 檢 體 量 可 倍 增, 並 依 上 述 步 驟 加 至 盛 有 等 比 例 預 增 菌 培 養 液 之 廣 口 瓶 中 勿 混 合 或 調 整 ph 值, 靜 置 60±5 分 鐘 後, 將 瓶 蓋 旋 鬆, 於 35 培 養 24±2 小 時, 供 作 檢 液 酶 凝 酪 蛋 白 (Rennet casein): 以 無 菌 操 作 稱 取 檢 體 25 g, 徐 徐 加 至 盛 有 乳 糖 培 養 液 225 ml 之 廣 口 瓶 中, 使 其 佈 滿 於 表 面 必 要 時, 檢 體 量 可 倍 增, 並 依 上 述 步 驟 加 至 盛 有 等 比 例 乳 糖 培 養 液 之 廣 口 瓶 中 勿 混 合 或 調 整 ph 值, 靜 置 60±5 分 鐘 後, 將 瓶 蓋 旋 鬆, 於 35 培 養 24±2 小 時, 供 作 檢 液 酪 蛋 白 鈉 (Sodium caseinate): 以 無 菌 操 作 稱 取 檢 體 25 g, 置 於 已 滅 菌 均 質 杯 內, 加 乳 糖 培 養 液 225 ml, 混 合 均 勻 必 要 時, 檢 體 量 可 倍 增, 並 依 上 述 步 驟 加 至 盛 有 等 比 例 乳 糖 培 養 液 之 13

14 廣 口 瓶 中, 混 合 均 勻 將 瓶 蓋 旋 緊, 於 室 溫 靜 置 60±5 分 鐘 後, 混 勻 並 測 ph 值 必 要 時, 調 整 ph 值 至 6.8±0.2 將 瓶 蓋 略 旋 鬆, 於 35 培 養 24±2 小 時 後, 供 作 檢 液 黃 豆 粉 : 依 步 驟 進 行 檢 液 之 調 製, 但 不 建 議 倍 增 檢 體 量 含 蛋 製 品 ( 麵 條 蛋 捲 通 心 麵 義 大 利 麵 條 ) 乾 酪 生 麵 糰 沙 拉 ( 含 火 腿 蛋 雞 肉 鮪 魚 火 雞 肉 ) 生 鮮 冷 凍 或 乾 燥 水 果 及 蔬 菜 堅 果 核 仁 甲 殼 類 ( 蝦 螃 蟹 小 龍 蝦 龍 蝦 ) 及 魚 類 : 檢 驗 分 析 前, 冷 凍 檢 體 最 好 不 要 解 凍 需 回 溫 再 切 取 檢 體 時, 可 在 45 以 下 之 水 浴, 持 續 搖 動, 解 凍 不 超 過 15 分 鐘, 或 在 2~5, 解 凍 時 間 不 超 過 18 小 時 以 無 菌 操 作 稱 取 檢 體 25 g, 置 入 已 滅 菌 之 均 質 杯 內 加 乳 糖 培 養 液 225 ml, 均 質 2 分 鐘 將 已 均 質 化 之 檢 體 與 培 養 液 混 合 物 倒 入 已 滅 菌 廣 口 瓶 內, 將 瓶 蓋 旋 緊, 於 室 溫 靜 置 60±5 分 鐘 後, 混 勻 並 調 整 ph 值 至 6.8±0.2 將 瓶 蓋 略 旋 鬆, 於 35 培 養 24±2 小 時 後, 供 作 檢 液 乾 酵 母 : 以 無 菌 操 作 稱 取 檢 體 25 g, 置 於 已 滅 菌 含 蓋 廣 口 瓶 內 加 胰 化 酪 蛋 白 大 豆 培 養 液 225 ml 混 合 均 勻, 將 瓶 蓋 旋 緊, 在 室 溫 靜 置 60±5 分 鐘 後, 混 勻 並 調 整 ph 值 至 6.8±0.2 將 瓶 蓋 略 旋 鬆, 於 35 培 養 24±2 小 時 後, 供 作 檢 液 糖 霜 及 甜 點 加 覆 料 (Frosting and topping mixes): 以 無 菌 操 作 稱 取 檢 體 25 g, 置 於 已 滅 菌 含 蓋 之 廣 口 瓶 內 加 營 養 培 養 液 225 ml, 混 合 均 勻 將 瓶 蓋 旋 緊, 於 室 溫 靜 置 60±5 分 鐘 後, 混 勻 並 調 整 ph 值 至 6.8±0.2 將 瓶 蓋 略 旋 鬆, 於 35 培 養 24±2 小 時 後 供 作 檢 液 香 辛 料 黑 胡 椒 白 胡 椒 芹 菜 片 及 種 子 辣 椒 粉 小 茴 香 紅 椒 香 芹 碎 片 迷 迭 香 芝 麻 麝 香 草 及 蔬 菜 片 等 : 以 無 菌 操 作 稱 取 檢 體 25 g, 置 於 已 滅 菌 含 蓋 之 廣 口 瓶 內, 加 胰 化 酪 蛋 白 大 豆 培 養 液 225 ml, 混 合 均 勻 將 瓶 蓋 旋 緊, 於 室 溫 靜 置 60±5 分 鐘 調 整 ph 值 至 6.8±0.2 將 瓶 蓋 略 旋 鬆, 於 35 培 養 24±2 小 時 後, 供 作 檢 液 洋 蔥 片 洋 蔥 粉 大 蒜 片 : 以 無 菌 操 作 稱 取 檢 體 25 g, 置 於 已 滅 菌 含 蓋 之 廣 口 瓶 內 加 含 亞 硫 酸 鉀 胰 化 酪 蛋 白 大 豆 培 養 液 225 ml 後, 依 節 步 驟 調 製 檢 液 眾 香 子 肉 桂 丁 香 及 牛 至 草 香 辛 料 : 眾 香 子 肉 桂 及 牛 至 草 香 辛 料 以 檢 體 與 胰 化 酪 蛋 白 大 豆 培 養 液 為 1:100 的 比 例 丁 香 以 1:1000, 其 它 葉 狀 調 味 料 則 至 少 以 1:10 的 比 例 予 以 混 合, 續 依 節 步 驟 製 備 檢 液 14

15 糖 果 及 糖 衣 ( 包 括 巧 克 力 ): 以 無 菌 操 作 稱 取 檢 體 25 g, 置 入 已 滅 菌 均 質 杯 內, 加 無 脂 乳 粉 培 養 液 225 ml, 均 質 2 分 鐘 將 此 溶 液 倒 入 已 滅 菌 含 蓋 廣 口 瓶 內, 將 瓶 蓋 旋 緊 後 於 室 溫 靜 置 60±5 分 鐘 必 要 時, 調 整 ph 值 至 6.8±0.2 後, 加 1% 煌 綠 溶 液 0.45 ml, 混 合 均 勻, 並 將 瓶 蓋 旋 鬆 後, 於 35 培 養 24±2 小 時 後, 供 作 檢 液 椰 子 : 以 無 菌 操 作 稱 取 檢 體 25 g, 置 入 已 滅 菌 之 含 蓋 廣 口 瓶 內 加 乳 糖 培 養 液 225 ml, 將 瓶 蓋 旋 緊 並 混 合 均 勻, 於 室 溫 靜 置 60±5 分 鐘 後, 混 勻 並 測 ph 值 必 要 時, 將 ph 值 調 至 6.8±0.2 加 業 經 蒸 氣 加 熱 15 分 鐘 之 Tergitol anionic ml, 混 合 均 勻 或 加 經 蒸 氣 加 熱 15 分 鐘 之 Triton X 至 3 滴 將 瓶 蓋 旋 鬆, 於 35 培 養 24±2 小 時 後, 供 作 檢 液 食 品 染 料 及 食 品 著 色 劑 : 當 染 料 之 ph 值 6.0 時, 使 用 節 之 方 法 製 備 檢 液 染 料 之 ph 值 <6.0 時, 以 無 菌 操 作 稱 取 檢 體 25 g, 置 入 已 滅 菌 含 蓋 廣 口 瓶, 加 不 含 煌 綠 之 TT 培 養 液 225 ml 將 瓶 蓋 旋 緊, 混 合 均 勻, 於 室 溫 靜 置 60±5 分 鐘, 調 整 ph 值 至 6.8±0.2 加 0.1% 煌 綠 溶 液 2.25 ml, 混 合 均 勻 將 瓶 蓋 旋 鬆, 於 35 培 養 24±2 小 時 後, 依 直 接 劃 線 於 選 擇 性 培 養 基 明 膠 : 以 無 菌 操 作 稱 取 檢 體 25 g, 置 入 無 菌 含 蓋 廣 口 瓶 內 加 乳 糖 培 養 液 225 ml 及 5% 木 瓜 酶 溶 液 5 ml, 混 合 均 勻 將 瓶 蓋 旋 緊, 於 室 溫 靜 置 60±5 分 鐘 混 合 均 勻, 以 試 紙 測 ph 值 必 要 時, 將 ph 值 調 至 6.8±0.2 將 瓶 蓋 旋 鬆, 於 35 培 養 24±2 小 時 後, 供 作 檢 液 肉 肉 類 代 用 品 ( 如 素 雞 等 ) 肉 類 副 產 品 動 物 成 分 ( 如 膠 原 蛋 白 等 ) 魚 粉 肉 粉 及 骨 粉 : 以 無 菌 操 作 稱 取 檢 體 25 g, 置 入 已 滅 菌 之 均 質 杯 內 加 乳 糖 培 養 液 225 ml, 均 質 2 分 鐘 將 已 均 質 化 之 檢 體 與 培 養 液 混 合 物 倒 入 已 滅 菌 廣 口 瓶 內, 將 瓶 蓋 旋 緊, 於 室 溫 靜 置 60±5 分 鐘 檢 體 為 粉 狀 或 磨 碎 狀 不 需 均 質 時, 加 乳 糖 培 養 液 並 充 分 混 合 均 勻 後, 將 瓶 蓋 旋 緊, 於 室 溫 靜 置 60±5 分 鐘 以 試 紙 測 ph 值, 必 要 時, 將 ph 值 調 至 6.8±0.2 加 以 蒸 氣 加 熱 15 分 鐘 之 Tergitol Anionic 7 或 Triton X-100, 儘 量 減 少 用 量, 加 至 會 產 生 泡 沫 即 可, 最 多 加 至 2.25 ml, 實 際 用 量 視 檢 體 成 分 而 定 粉 狀 肝 臟 及 腎 臟 類 製 品 等, 不 需 加 界 面 活 性 劑 將 瓶 蓋 旋 鬆, 於 35 培 養 24±2 小 時 後, 供 作 檢 液 蛙 腿 : 將 15 對 蛙 腿 或 分 別 來 自 15 對 之 蛙 腿 15 隻 ( 平 均 每 支 重 量 在 25 g 以 上 時 ) 置 於 無 菌 塑 膠 袋 內, 上 覆 乳 糖 培 養 液, 檢 體 與 培 養 液 之 比 例 為 1:9 (g/ml) 混 合 均 勻, 於 室 溫 靜 置 60±5 分 鐘 後 15

16 , 以 試 紙 測 試 ph 值, 必 要 時, 將 ph 值 調 至 6.8±0.2 於 35 培 養 24±2 小 時 後, 供 作 檢 液 兔 檢 體 : 將 兔 檢 體 置 入 無 菌 塑 膠 袋 內, 上 覆 乳 糖 培 養 液, 檢 體 與 培 養 液 之 比 例 為 1:9 混 合 均 勻, 於 室 溫 靜 置 60±5 分 鐘 後, 以 試 紙 測 試 ph 值, 必 要 時, 將 ph 值 調 至 6.8±0.2 於 35 培 養 24±2 小 時 後, 供 作 檢 液 關 華 豆 膠 (Guar gum): 取 乳 糖 培 養 液 225 ml 及 已 除 菌 之 1% 纖 維 素 酶 溶 液 2.25 ml 至 已 滅 菌 含 蓋 之 廣 口 瓶 中 在 以 磁 鐵 攪 拌 混 勻 之 過 程 中, 迅 速 加 入 檢 體 25 g, 充 分 攪 拌 後, 將 瓶 蓋 旋 緊, 於 室 溫 靜 置 60±5 分 鐘 後 ( 無 需 調 整 ph 值 ), 將 瓶 蓋 旋 鬆, 於 35 培 養 24±2 小 時 後, 供 作 檢 液 柳 橙 汁 ( 已 滅 菌 及 未 滅 菌 ) 未 過 濾 之 蘋 果 汁 ( 已 滅 菌 及 未 滅 菌 ) 已 過 濾 之 蘋 果 汁 ( 已 滅 菌 ): 以 無 菌 操 作 量 取 檢 體 25 ml, 置 於 已 滅 菌 且 盛 有 預 增 菌 培 養 液 225 ml 之 含 蓋 廣 口 瓶 中, 混 合 均 勻 將 瓶 蓋 旋 緊, 於 室 溫 靜 置 60±5 分 鐘 ( 無 需 調 整 ph 值 ), 續 將 廣 口 瓶 之 蓋 子 旋 鬆, 於 35 培 養 24±2 小 時 後, 供 作 檢 液 網 紋 甜 瓜 (Cantaloupe): 檢 驗 分 析 前, 冷 凍 檢 體 最 好 不 要 解 凍 需 回 溫 再 切 取 檢 體 時, 可 在 45 以 下 之 水 浴, 持 續 搖 動, 解 凍 不 超 過 15 分 鐘, 或 在 2~5, 解 凍 時 間 不 超 過 18 小 時 檢 體 為 塊 狀 或 丁 狀 時, 以 無 菌 操 作 稱 取 檢 體 25 g, 置 於 已 滅 菌 之 均 質 杯 內 加 預 增 菌 培 養 液 225 ml, 均 質 2 分 鐘 將 已 均 質 化 之 檢 體 與 培 養 液 混 合 物 倒 入 已 滅 菌 廣 口 瓶 內, 將 瓶 蓋 旋 緊, 於 室 溫 靜 置 60±5 分 鐘 ( 無 需 調 整 ph 值 ), 續 將 廣 口 瓶 之 蓋 子 略 旋 鬆, 於 35 培 養 24±2 小 時 後, 供 作 檢 液 檢 體 為 完 整 網 紋 甜 瓜 時, 將 檢 體 置 於 無 菌 塑 膠 袋 內, 加 足 夠 之 預 增 菌 培 養 液, 使 檢 體 浮 起 添 加 培 養 液 之 體 積 可 能 為 檢 體 重 量 之 1.5 倍, 例 如 檢 體 1500 g 可 能 需 要 培 養 液 約 2250 ml 必 要 時, 再 加 更 多 培 養 液 將 盛 有 檢 體 及 培 養 液 之 塑 膠 袋 置 於 適 當 之 容 器 內, 將 袋 口 摺 下 以 防 止 污 染, 但 不 密 封 於 室 溫 靜 置 60±5 分 鐘 後 ( 無 需 調 整 ph 值 ), 於 35 培 養 24±2 小 時, 供 作 檢 液 芒 果 (Mango): 檢 驗 分 析 前, 冷 凍 檢 體 最 好 不 要 解 凍 需 回 溫 再 切 取 檢 體 時, 可 在 45 以 下 之 水 浴, 持 續 搖 動, 解 凍 不 超 過 15 分 鐘, 或 在 2~5, 解 凍 時 間 不 超 過 18 小 時 檢 體 為 塊 狀 或 丁 狀 時, 以 無 菌 操 作 稱 取 檢 體 25 g, 置 於 已 滅 菌 之 均 質 杯 內 加 蛋 白 腖 緩 衝 液 225 ml, 均 質 2 分 鐘 將 已 均 質 化 之 檢 體 與 培 養 液 混 合 物 倒 入 已 滅 菌 廣 口 瓶 內, 將 瓶 蓋 旋 緊, 於 室 溫 靜 置 60±5 分 鐘 16

17 後, 混 勻 並 調 整 ph 值 至 6.8±0.2 將 瓶 蓋 略 旋 鬆, 並 於 35 培 養 24±2 小 時 後, 供 作 檢 液 檢 體 為 完 整 芒 果 時, 將 檢 體 置 於 無 菌 塑 膠 袋 內, 加 足 夠 之 蛋 白 腖 緩 衝 液, 使 檢 體 浮 起 添 加 培 養 液 之 體 積 可 能 為 檢 體 重 量 之 1.5 倍, 例 如 檢 體 500 g 可 能 需 要 培 養 液 約 750 ml 必 要 時, 再 加 更 多 培 養 液 將 盛 有 檢 體 及 培 養 液 之 塑 膠 袋 置 於 適 當 之 容 器 內, 將 袋 口 摺 下 以 防 止 污 染, 但 不 密 封, 於 室 溫 靜 置 60±5 分 鐘 必 要 時, 調 整 ph 值 至 6.8±0.2 於 35 培 養 24±2 小 時 後, 供 作 檢 液 蕃 茄 (Tomato): 檢 體 為 塊 狀 或 丁 狀 時, 以 無 菌 操 作 稱 取 檢 體 25 g, 置 於 已 滅 菌 之 均 質 杯 內 加 蛋 白 腖 緩 衝 液 225 ml, 均 質 2 分 鐘 將 已 均 質 化 之 檢 體 與 培 養 液 混 合 物 倒 入 已 滅 菌 廣 口 瓶 內, 將 瓶 蓋 旋 緊, 於 室 溫 靜 置 60±5 分 鐘 後, 混 勻 並 調 整 ph 值 至 6.8±0.2 將 瓶 蓋 略 旋 鬆, 並 於 35 培 養 24±2 小 時 後, 供 作 檢 液 檢 體 為 完 整 蕃 茄 時, 將 檢 體 置 於 無 菌 塑 膠 袋 內, 加 足 夠 之 預 增 菌 培 養 液, 使 檢 體 浮 起 加 培 養 液 之 體 積 可 能 為 檢 體 重 量 之 1.5 倍, 例 如 檢 體 300 g 可 能 需 要 培 養 液 約 450 ml 必 要 時, 再 加 更 多 培 養 液 將 盛 有 檢 體 及 培 養 液 之 塑 膠 袋 置 於 適 當 之 容 器 內, 將 袋 口 摺 下 以 防 止 污 染, 但 不 密 封 於 室 溫 靜 置 60±5 分 鐘 後 ( 無 需 調 整 ph 值 ), 於 35 培 養 24±2 小 時, 供 作 檢 液 塗 抺 物 (Swab) 檢 體 : 以 無 菌 操 作 折 斷 塗 抹 物 木 柄 或 以 無 菌 剪 刀 或 其 他 無 菌 器 具 將 塗 抹 棒 之 頭 部 置 於 無 菌 含 蓋 試 管 內, 加 蛋 白 腖 緩 衝 液 5 ml, 將 試 管 蓋 旋 緊, 於 10 秒 內 來 回 叩 擊 手 心 使 其 劇 烈 振 盪 ( 振 盪 幅 度 需 達 15 公 分 ) 50 次, 或 以 旋 渦 混 合 器 充 分 振 盪 至 塗 抹 物 頭 部 之 棉 絮 鬆 開 取 溶 出 液 1 ml, 置 於 已 盛 裝 蛋 白 腖 緩 衝 液 9 ml 之 已 滅 菌 含 蓋 之 試 管 內, 於 35 培 養 24±2 小 時 後, 供 作 檢 液 或 以 無 菌 操 作 折 斷 塗 抹 物 木 柄 或 以 無 菌 剪 刀 或 其 他 無 菌 器 具 將 塗 抹 物 之 頭 部 置 於 已 盛 裝 蛋 白 腖 緩 衝 液 10 ml 之 已 滅 菌 含 蓋 試 管 內, 於 35 培 養 24±2 小 時 後, 供 作 檢 液 其 他 檢 體 : 以 無 菌 操 作 稱 取 檢 體 25 g, 置 於 已 滅 菌 均 質 杯 內, 加 蛋 白 腖 緩 衝 液 225 ml, 均 質 攪 拌 2 分 鐘 將 已 均 質 化 之 檢 體 與 培 養 液 混 合 物 倒 入 已 滅 菌 含 蓋 之 廣 口 瓶 內 將 瓶 蓋 旋 緊, 於 室 溫 靜 置 60±5 分 鐘 後 混 合 均 勻 當 檢 體 中 細 菌 因 長 期 冰 凍 或 其 他 原 因 受 損, 則 可 使 用 乳 糖 培 養 液 代 替 蛋 白 腖 緩 衝 液 必 要 時, 調 整 ph 值 至 6.8±0.2 將 瓶 蓋 旋 鬆 於 35 培 養 24±2 小 時 後, 供 作 檢 液 2.4. 選 擇 性 增 菌 培 養 與 分 離 檢 液 接 種 至 選 擇 性 增 菌 培 養 液 : 將 2.3. 節 檢 液 混 合 均 勻, 依 下 列 17

18 操 作 : 檢 體 為 關 華 豆 膠 : 各 吸 取 檢 液 1 ml 至 SC 及 TT 培 養 液 各 10 ml 中, 混 合 均 勻 檢 體 為 其 他 食 品 : 吸 取 檢 液 0.1 ml 至 RV 培 養 液 10 ml 中, 另 吸 取 檢 液 1 ml 至 TT 培 養 液 10 ml 中, 混 合 均 勻 選 擇 性 增 菌 培 養 : 檢 體 為 高 度 污 染 食 品 : 將 RV 培 養 液 置 於 42 水 浴 培 養 24±2 小 時 另 將 TT 培 養 液 置 於 43 水 浴 培 養 24±2 小 時 檢 體 為 低 度 污 染 食 品 ( 關 華 豆 膠 除 外 ): 將 RV 培 養 液 置 於 42 水 浴 培 養 24±2 小 時 另 將 TT 培 養 液 置 於 35 培 養 24±2 小 時 檢 體 為 關 華 豆 膠 : 將 SC 及 TT 培 養 液 置 於 35 培 養 24±2 小 時 分 離 培 養 : 分 別 自 節 之 RV SC 及 TT 增 菌 培 養 液 中 取 一 接 種 環 量, 在 HE XLD 及 BS 培 養 基 表 面 作 劃 線 後, 於 35 培 養 24±2 小 時, 觀 察 所 形 成 菌 落 型 態 在 各 培 養 基 中, 典 型 沙 門 氏 桿 菌 菌 落 之 性 狀 如 下 : HE 培 養 基 : 呈 藍 綠 或 藍 色 菌 落, 有 ( 或 無 ) 黑 色 中 心 很 多 典 型 菌 落 有 大 而 具 光 澤 之 黑 色 中 心 或 黑 色 菌 落 部 分 非 典 型 菌 落 會 形 成 黃 色 菌 落, 有 ( 或 無 ) 黑 色 中 心 XLD 培 養 基 : 呈 粉 紅 色 菌 落, 有 ( 或 無 ) 黑 色 中 心 很 多 典 型 菌 落 有 大 而 具 光 澤 黑 色 中 心 或 呈 黑 色 菌 落 部 分 非 典 型 菌 落 會 形 成 黃 色 菌 落, 有 ( 或 無 ) 黑 色 中 心 BS 培 養 基 : 典 型 菌 落 為 褐 色 灰 色 或 黑 色, 有 時 會 產 生 金 屬 光 澤 菌 落 周 圍 之 培 養 基 顏 色, 起 初 為 褐 色, 隨 著 培 養 時 間 加 長 而 轉 為 黑 色 並 產 生 光 環 效 應 部 份 非 典 型 菌 落 會 形 成 綠 色 菌 落, 周 圍 培 養 基 色 澤 稍 微 變 深 或 不 變 色 於 BS 培 養 基 上 未 發 現 典 型 菌 落, 須 再 於 35 培 養 24±2 小 時 自 HE BS 及 XLD 培 養 基 中 各 挑 2 個 或 2 個 以 上 之 典 型 菌 落, 無 典 型 菌 落 時, 挑 取 2 個 或 2 個 以 上 之 非 典 型 菌 落, 每 一 菌 落 同 時 接 種 於 TSI 及 LIA 斜 面 培 養 基, 並 同 時 進 行 斜 面 劃 線 及 穿 刺 接 種 以 無 菌 接 種 針 輕 觸 菌 落 的 中 心 並 接 種 於 TSI 斜 面 及 底 部, 穿 刺 於 LIA 底 部 兩 次 並 於 斜 面 劃 線 離 胺 酸 脫 羧 反 應 為 專 性 厭 氧 性 (strictly anaerobic), 故 LIA 培 養 基 斜 面 底 部 之 深 度 約 4 cm 將 已 接 種 菌 之 TSI 及 LIA 斜 面 培 養 基 於 35 培 養 24±2 小 時, 培 養 時, 將 試 管 蓋 旋 鬆 典 型 沙 門 氏 桿 菌 在 TSI 培 養 基 斜 面 呈 紅 色 反 應 ( 鹼 性 ), 底 部 呈 黃 色 ( 或 無 色 ) 反 應 ( 酸 性 ), 有 培 養 基 顏 色 變 黑 或 無 硫 化 氫 產 生 ; 在 LIA 培 養 基 之 底 部 呈 紫 色 反 應 ( 鹼 性 ), 大 多 18

19 數 沙 門 氏 桿 菌 在 LIA 培 養 基 會 產 生 硫 化 氫 而 呈 黑 色 凡 是 在 LIA 斜 面 培 養 基 底 部 產 生 鹼 性 的 菌 株 須 保 留 作 生 化 及 血 清 學 試 驗 ; 在 LIA 培 養 基 底 部 產 生 酸 性 且 在 TSI 斜 面 培 養 基 產 生 鹼 性 斜 面 及 酸 性 底 部 者 亦 須 保 留 菌 株 作 生 化 及 血 清 學 試 驗 在 LIA 斜 面 培 養 基 底 部 產 生 酸 性 且 在 TSI 斜 面 培 養 基 產 生 酸 性 斜 面 及 酸 性 底 部 之 菌 株 則 可 以 丟 棄 如 TSI 斜 面 培 養 基 上 菌 株 呈 非 沙 門 氏 桿 菌 典 型 反 應, 則 重 複 節 之 步 驟, 鉤 取 更 多 可 疑 菌 落 接 種 於 TSI 及 LIA 培 養 基 針 對 以 下 疑 似 沙 門 氏 桿 菌 菌 株, 進 行 生 化 及 血 清 學 試 驗 SC 或 RV 增 菌 培 養 液 經 由 劃 線 培 養 及 穿 刺 培 養 步 驟, 於 TSI 斜 面 培 養 基 中 呈 現 疑 似 沙 門 氏 桿 菌 反 應 之 菌 株, 至 少 取 3 株 ; 以 及 TT 增 菌 培 養 液 經 由 劃 線 培 養 及 穿 刺 培 養 步 驟, 於 TSI 斜 面 培 養 基 中 呈 現 疑 似 沙 門 氏 桿 菌 反 應 之 菌 株, 至 少 取 3 株 當 TSI 斜 面 培 養 基 中 呈 現 疑 似 沙 門 氏 桿 菌 反 應 之 3 株 菌 株, 並 非 來 自 同 一 組 分 離 培 養 基 時, 則 必 須 再 檢 測 其 它 於 TSI 斜 面 培 養 基 中 呈 現 疑 似 沙 門 氏 桿 菌 反 應 之 菌 株 每 25 g 檢 體 至 少 須 檢 測 於 TSI 斜 面 培 養 基 呈 現 疑 似 沙 門 氏 桿 菌 反 應 之 菌 株 6 株 2.5. 鑑 定 試 驗 混 合 菌 株 (Mixed culture) 之 純 化 : 將 TSI 斜 面 培 養 基 上 未 純 化 菌 株 劃 線 培 養 於 麥 康 奇 HE 或 XLD 培 養 基, 於 35 培 養 24±2 小 時 觀 察 是 否 有 疑 似 沙 門 氏 桿 菌 菌 落 : 麥 康 奇 培 養 基 : 典 型 菌 落 為 透 明 無 色, 有 時 會 有 黑 色 中 心 HE 培 養 基 : 如 節 XLD 培 養 基 : 如 節 至 少 接 種 2 株 疑 似 沙 門 氏 桿 菌 菌 落 於 TSI 及 LIA 斜 面 培 養 基, 步 驟 如 節 及 節 純 菌 株 (Pure culture) 尿 素 酶 試 驗 ( 傳 統 方 法 ): 以 無 菌 接 種 針 挑 取 TSI 斜 面 培 養 基 上 可 疑 菌 株, 接 種 於 尿 素 培 養 液 內, 於 35 培 養 24±2 小 時 由 於 未 接 種 之 尿 素 培 養 液 偶 爾 會 轉 變 為 紫 紅 色, 故 試 驗 時 應 包 括 未 接 種 之 培 養 液 作 為 對 照 用 培 養 液 由 橘 紅 色 轉 變 為 紫 紅 色 者 為 正 反 應, 顏 色 不 變 者 為 負 反 應, 沙 門 氏 桿 菌 為 負 反 應 尿 素 酶 試 驗 ( 快 速 法 ): 自 含 可 疑 菌 株 之 TSI 斜 面 培 養 基 上 鉤 取 二 接 種 環 量 菌 種 至 供 快 速 測 試 用 之 尿 素 培 養 液 內, 於 37±0.5 水 浴 培 養 2 小 時 培 養 液 由 橘 紅 色 轉 變 為 紫 紅 色 者 19

20 為 正 反 應, 顏 色 不 變 者 為 負 反 應, 沙 門 氏 桿 菌 為 負 反 應 尿 素 酶 試 驗 為 負 反 應 者, 應 自 其 TSI 培 養 基 中 鉤 菌, 作 以 下 之 血 清 及 生 化 試 驗 本 體 抗 血 清 試 驗 (Serological somatic test) 多 價 本 體 (O) 抗 血 清 試 驗 [Polyvalent somatic (O) test] 將 玻 片 或 塑 膠 培 養 皿 劃 出 約 1 2 cm 之 二 區 自 經 培 養 24~48 小 時 之 TSI 培 養 基 斜 面 鉤 取 一 接 種 環 菌 量 至 0.85% 生 理 食 鹽 水 2 ml, 混 合 均 勻 分 別 取 菌 株 懸 浮 液 各 1 滴, 滴 入 玻 片 上 二 區 部 位 滴 1 滴 生 理 食 鹽 水 在 玻 片 之 一 區, 滴 1 滴 多 價 本 體 抗 血 清 在 玻 片 另 一 區 以 無 菌 接 種 環 或 接 種 針 將 玻 片 上 菌 液 與 0.85% 生 理 食 鹽 水 ( 或 本 體 抗 血 清 ) 混 合 均 勻 將 玻 片 前 後 搖 動 約 1 分 鐘 後 在 光 源 上 觀 察 結 果 : 正 反 應 : 菌 液 與 本 體 抗 血 清 產 生 凝 集, 且 菌 液 與 0.85% 生 理 食 鹽 水 無 凝 集 者 負 反 應 : 菌 液 與 本 體 抗 血 清, 以 及 菌 液 與 0.85% 生 理 食 鹽 水 均 無 凝 集 者 非 特 異 型 反 應 : 兩 者 均 產 生 凝 集 單 價 本 體 族 群 (O) 抗 血 清 試 驗 [Monovalent somatic(o)group test] 如 節, 取 菌 株 懸 浮 液, 利 用 單 價 本 體 族 群 (O) 抗 血 清 ( 包 括 Vi 抗 血 清 ) 進 行 試 驗 正 反 應 者 應 產 生 凝 集 現 象, 負 反 應 者 則 無 將 與 Vi 抗 血 清 凝 集 之 菌 株, 配 製 成 濃 稠 菌 株 懸 浮 液, 於 沸 水 中 加 熱 20~30 分 鐘 後, 冷 卻 將 經 加 熱 冷 卻 處 理 之 濃 稠 菌 株 懸 浮 液 再 與 本 體 族 群 抗 血 清 C 1 D Vi 作 用 菌 株 懸 浮 液 於 加 熱 處 理 前 與 Vi 抗 血 清 呈 凝 集 反 應, 且 加 熱 後 不 與 Vi 抗 血 清 呈 凝 集 但 與 族 群 抗 血 清 D 凝 集 者 可 能 為 Salmonella typhi; 加 熱 前 與 Vi 抗 血 清 呈 凝 集, 且 加 熱 後 不 與 Vi 抗 血 清 呈 凝 集 但 與 族 群 抗 血 清 C 1 凝 集 者 可 能 為 Salmonella paratyphi C ; 經 加 熱 處 理 之 菌 株 懸 浮 液 仍 與 Vi 抗 血 清 呈 凝 集 反 應, 而 不 與 其 它 單 價 本 體 族 群 抗 血 清 凝 集 之 菌 株 可 能 不 是 沙 門 氏 桿 菌 能 與 任 何 單 價 本 體 族 群 抗 血 清 凝 集 之 菌 株 為 單 價 本 體 族 群 (O) 抗 血 清 正 反 應 ; 不 能 與 任 何 單 價 本 體 族 群 (O) 抗 血 清 凝 集 者 為 單 價 本 體 族 群 (O) 抗 血 清 負 反 應 多 價 鞭 毛 (H) 血 清 試 驗 [Serological polyvalent flagellar (H) test] 將 尿 素 酶 負 反 應 之 可 疑 沙 門 氏 桿 菌 菌 株 自 TSI 斜 面 培 養 基 中 接 種 至 BHI 培 養 液 中, 於 35 培 養 4~6 小 時, 或 於 胰 化 酪 蛋 白 大 豆 胰 化 蛋 白 月 示 培 養 液 中 培 養 24±2 小 時 取 上 述 培 養 液 5 ml, 加 20

21 入 福 馬 林 化 生 理 食 鹽 水 2.5 ml, 混 合 均 勻 將 多 價 鞭 毛 抗 血 清 0.5 ml 置 於 試 管 ( mm 或 mm) 內, 添 加 上 述 福 馬 林 化 菌 株 培 養 液 0.5 ml 以 福 馬 林 化 生 理 食 鹽 水 0.5 ml 與 福 馬 林 化 菌 株 培 養 液 0.5 ml 混 合, 作 為 對 照 組 將 上 述 混 合 液 放 入 水 浴 (48 ~50 ) 培 養, 每 隔 15 分 鐘 觀 察 一 次 至 1 小 時 後, 判 讀 最 後 結 果 正 反 應 為 測 試 組 呈 凝 集 而 對 照 組 無 凝 集 ; 負 反 應 為 測 試 組 及 對 照 組 均 無 凝 集 ; 非 特 異 型 反 應 為 測 試 組 及 對 照 組 均 有 凝 集 生 化 試 驗 : 自 尿 素 酶 負 反 應 之 TSI 培 養 基 鉤 菌, 作 以 下 試 驗 離 胺 酸 脫 羧 酶 試 驗 (Lysine decarboxylase test) 於 LIA 培 養 基 之 試 驗 結 果 符 合 典 型 沙 門 氏 桿 菌 之 反 應 者, 不 需 重 複 此 試 驗 鉤 菌 接 種 於 離 胺 酸 脫 羧 酶 培 養 液, 旋 緊 試 管 蓋 後, 於 35 培 養 48±2 小 時, 每 隔 24 小 時 觀 察 一 次 培 養 液 維 持 紫 色 者 為 正 反 應, 由 紫 色 變 為 黃 色 者 為 負 反 應, 沙 門 氏 桿 菌 應 為 正 反 應 培 養 液 變 為 非 紫 非 黃 色 時, 則 加 數 滴 0.2% 溴 甲 酚 紫 溶 液 後 再 行 觀 察 半 乳 糖 醇 利 用 試 驗 (Dulcitol utilization test) 鉤 菌 接 種 於 酚 紅 半 乳 糖 醇 培 養 液 或 紫 色 半 乳 糖 醇 培 養 液 並 將 試 管 旋 鬆, 於 35 培 養 24 小 時 後 開 始 觀 察, 直 至 48±2 小 時 培 養 液 變 為 黃 色 並 ( 或 ) 產 生 氣 體 者 為 正 反 應, 否 則 為 負 反 應, 大 部 分 沙 門 氏 桿 菌 為 正 反 應 胰 化 蛋 白 腖 培 養 液 (Tryptone broth): 鉤 菌 接 種 於 胰 化 蛋 白 腖 培 養 液, 於 35 培 養 24±2 小 時 後, 進 行 下 列 試 驗 : 氰 化 鉀 試 驗 (KCN test): 鉤 菌 接 種 於 氰 化 鉀 培 養 液 中, 以 橡 皮 塞 封 緊 試 管 口, 於 35 培 養 24 小 時 後 開 始 觀 察 直 至 48±2 小 時 培 養 液 由 清 澈 變 為 混 濁 者 為 正 反 應, 否 則 為 負 反 應 大 部 分 沙 門 氏 桿 菌 為 負 反 應 氰 化 鉀 為 劇 毒 物 質, 操 作 時 須 小 心 丙 二 酸 鹽 試 驗 (Malonate test): 鉤 菌 接 種 於 丙 二 酸 鹽 培 養 液, 於 35 培 養 24 小 時 後 開 始 觀 察 直 至 48±2 小 時 培 養 液 由 綠 色 變 為 藍 色 者 為 正 反 應, 維 持 綠 色 者 為 負 反 應, 大 部 分 沙 門 氏 桿 菌 為 負 反 應 吲 哚 試 驗 (Indole test): 取 胰 化 蛋 白 腖 培 養 液 5 ml 置 入 空 試 管, 加 柯 瓦 克 氏 試 劑 0.2~0.3 ml, 上 層 呈 深 紅 色 或 紫 色 者 為 正 反 應 大 部 分 沙 門 氏 桿 菌 為 負 反 應 將 中 間 色 如 橘 色 或 粉 紅 色 者 記 錄 為 ± 沙 門 氏 桿 菌 之 鞭 毛 抗 血 清 試 驗 : 如 尚 未 進 行 鞭 毛 抗 血 清 試 驗 者 可 在 此 補 作 21

22 將 吲 哚 試 驗 為 正 反 應, 鞭 毛 抗 血 清 試 驗 為 負 反 應, 或 氰 化 鉀 試 驗 為 正 反 應, 離 胺 酸 脫 羧 酶 試 驗 為 負 反 應 之 菌 株 判 定 為 非 沙 門 氏 桿 菌 其 它 生 化 反 應 : 菌 株 與 表 一 中 試 驗 1 至 10 反 應 結 果 相 符 者 為 沙 門 氏 桿 菌 ; 菌 株 具 鞭 毛 抗 血 清 凝 集 反 應, 但 與 沙 門 氏 桿 菌 生 化 反 應 不 符 者, 需 依 節 先 行 純 化, 再 自 節 重 新 測 試 菌 株 與 表 一 所 列 試 驗 1 至 10 之 沙 門 氏 桿 菌 典 型 反 應 結 果 不 符 者, 繼 續 進 行 下 列 生 化 反 應 : 乳 糖 發 酵 試 驗 (Lactose fermentation test): 將 菌 株 接 種 於 酚 紅 乳 糖 培 養 液 或 紫 色 乳 糖 培 養 液, 於 35 培 養 24 小 時 後 開 始 觀 察 直 至 48±2 小 時, 產 酸 ( 顏 色 變 黃 ) 並 有 氣 體 產 生 者 為 正 反 應 ; 只 有 產 酸 者 亦 視 為 正 反 應 大 部 份 的 沙 門 氏 桿 菌 為 負 反 應 將 乳 糖 試 驗 為 正 反 應 之 非 沙 門 氏 桿 菌 菌 株 丟 棄, 惟 在 TSI 培 養 基 上 呈 酸 性 反 應, 並 在 LIA 培 養 基 上 呈 正 反 應, 或 丙 二 酸 鹽 培 養 基 上 呈 正 反 應 之 菌 株 保 留, 進 行 下 列 試 驗, 以 判 定 是 否 為 S. arizonae 蔗 糖 發 酵 試 驗 (Sucrose fermentation test): 將 菌 株 接 種 於 酚 紅 蔗 糖 培 養 液 或 紫 色 蔗 糖 培 養 液, 再 依 節 之 步 驟 培 養 及 觀 察 將 正 反 應 之 菌 株 丟 棄 ; 惟 在 TSI 培 養 基 上 呈 酸 性 反 應, 且 在 LIA 培 養 基 上 呈 正 反 應 之 菌 株 則 保 留 MR-VP 試 驗 : 鉤 菌 接 種 於 MR-VP 培 養 液, 於 35 培 養 48±2 小 時 歐 普 氏 試 驗 (VP test): 取 培 養 48 小 時 菌 液 1 ml 至 另 一 試 管 中 ( 剩 餘 之 MR-VP 培 養 液 於 35 再 培 養 48±2 小 時 ), 加 入 歐 普 氏 試 劑 之 溶 液 A 約 0.6 ml 振 搖 均 勻 再 加 歐 普 氏 試 劑 之 溶 液 B 約 0.2 ml, 振 搖 均 勻, 加 入 少 許 肌 酸 以 加 速 反 應 4 小 時 後 觀 察 結 果, 呈 現 粉 紅 至 鮮 紅 色 者 為 正 反 應, 大 部 份 沙 門 氏 桿 菌 為 負 反 應 甲 基 紅 試 驗 (MR test): 取 已 培 養 96 小 時 菌 液 5 ml 至 試 管 中, 加 入 甲 基 紅 指 示 劑 5 至 6 滴, 立 即 觀 察 反 應 結 果, 培 養 液 呈 紅 色 者 為 正 反 應, 呈 黃 色 者 為 負 反 應 大 部 份 沙 門 氏 桿 菌 為 正 反 應 將 氰 化 鉀 試 驗 呈 正 反 應, 歐 普 氏 試 驗 呈 正 反 應, 甲 基 紅 試 驗 呈 負 反 應 之 非 沙 門 氏 桿 菌 丟 棄 檸 檬 酸 鹽 利 用 試 驗 (Citrate utilization test): 鉤 菌 接 種 於 辛 蒙 斯 檸 檬 酸 鹽 培 養 基, 須 在 斜 面 上 作 劃 線 及 穿 刺 培 養, 於 35 培 養 96 ± 2 小 時 斜 面 上 有 菌 體 生 長 且 培 養 基 顏 色 由 綠 色 變 為 藍 22

23 色 者 為 正 反 應, 大 部 份 沙 門 氏 桿 菌 為 正 反 應 2.6. 判 定 : 沙 門 氏 桿 菌 陽 性 者, 應 符 合 表 一 所 列 之 結 果 與 表 二 之 結 果 相 同 者, 則 被 歸 類 為 非 沙 門 氏 桿 菌 菌 株 不 是 以 上 二 類 者, 則 須 進 行 其 他 試 驗 ( 註 ) 註 : 可 依 參 考 文 獻 (Ewing, W.H Edwards and Ewing's Identification of Enterobacteriacae, 4th ed. Elsevier, New York.) 進 行 其 他 試 驗 23

24 表 一 沙 門 氏 桿 菌 之 生 化 及 血 清 反 應 試 驗 或 基 質 正 反 應 (+) 負 反 應 (-) 沙 門 氏 桿 a 菌 之 反 應 1. 葡 萄 糖 (TSI) 黃 色 底 部 紅 色 底 部 + 2. 離 胺 酸 脫 羧 酶 試 驗 (LIA) 紫 色 底 部 黃 色 底 部 + 3. 硫 化 氫 (TSI 和 LIA) 變 黑 無 變 黑 + 4. 尿 素 酶 試 驗 紫 紅 色 顏 色 不 變 - 5. 離 胺 酸 脫 羧 酶 培 養 液 紫 色 黃 色 + 6. 酚 紅 ( 或 紫 色 ) 半 乳 糖 醇 培 養 液 7. 氰 化 鉀 培 養 液 黃 色, 產 氣 混 濁 ( 生 長 ) 顏 色 不 變 不 產 氣 澄 清 ( 不 生 長 ) 8. 丙 二 酸 鹽 培 養 液 藍 色 顏 色 不 變 - c 9. 吲 哚 試 驗 表 面 呈 深 紅 色 或 紫 色 表 面 呈 黃 色 多 價 本 體 及 鞭 毛 血 清 試 驗 凝 集 無 凝 集 酚 紅 ( 或 紫 色 ) 乳 糖 及 蔗 糖 不 產 氣 黃 色, 產 氣 - 培 養 液 顏 色 不 變 c 不 產 氣 12. 酚 紅 ( 或 紫 色 ) 蔗 糖 培 養 液 黃 色, 產 氣 - 顏 色 不 變 13. 歐 普 氏 試 驗 粉 紅 或 紅 色 顏 色 不 變 甲 基 紅 試 驗 紅 色 黃 色 辛 蒙 斯 檸 檬 酸 鹽 培 養 基 生 長, 藍 色 不 生 長 顏 色 不 變 V a. + 表 示 90% 以 上 在 1~2 天 內 均 為 正 反 應, - 表 示 90% 以 上 在 1~2 天 內 均 為 負 反 應 ; V 表 示 不 一 定 b. 大 部 分 的 S. arizonae 為 負 反 應 c. 大 部 分 的 S. arizonae 為 正 反 應 + b - 24

25 表 二 非 沙 門 氏 桿 菌 菌 株 之 判 定 標 準 試 驗 或 基 質 結 果 1. 尿 素 酶 正 反 應 ( 紫 紅 色 紅 色 ) 2. 吲 哚 試 驗 及 正 反 應 ( 表 面 呈 深 紅 色 或 紫 色 ) 多 價 鞭 毛 抗 血 清 試 驗 負 反 應 ( 無 凝 集 ) 3. 離 胺 酸 脫 羧 酶 及 負 反 應 ( 黃 色 ) 氰 化 鉀 培 養 液 正 反 應 ( 混 濁 ) 4. 酚 紅 ( 或 紫 色 ) 乳 糖 培 養 液 正 反 應 ( 黃 色, 產 氣 ) a,b 5. 酚 紅 ( 或 紫 色 ) 蔗 糖 培 養 液 正 反 應 ( 黃 色, 產 氣 ) b 6. 氰 化 鉀 培 養 液 正 反 應 ( 混 濁 ) 歐 普 試 驗 及 正 反 應 ( 粉 紅 至 紅 色 ) 甲 基 紅 試 驗 負 反 應 ( 黃 色 ) a. 測 試 丙 二 酸 鹽 試 驗 為 陽 性 之 菌 株 需 再 試 驗 是 否 為 S. arizonae b. 如 LIA 為 正 反 應 之 菌 株 不 應 丟 棄, 應 繼 續 測 試 看 是 否 為 沙 門 氏 桿 菌 2.7. 如 使 用 經 確 效 認 可 之 市 售 培 養 基 生 化 檢 測 套 組 或 生 化 試 驗 鑑 定 系 統, 其 檢 驗 結 果 有 爭 議 時, 以 本 檢 驗 方 法 為 準 菌 株 經 商 業 生 化 套 組 鑑 定 為 疑 似 沙 門 氏 桿 菌, 仍 須 進 行 本 體 族 群 (O) 抗 血 清 試 驗 及 鞭 毛 血 清 試 驗, 如 二 者 均 為 正 反 應, 則 判 定 為 沙 門 氏 桿 菌 陽 性 25

26 第 二 部 : 沙 門 氏 桿 菌 之 real-time PCR 檢 測 1. 適 用 範 圍 : 本 方 法 適 用 於 沙 門 氏 桿 菌 之 鑑 別 2. 檢 驗 方 法 : 檢 體 之 增 菌 液 或 經 分 離 純 化 後 之 菌 株, 經 DNA 萃 取 後, 以 即 時 聚 合 酶 鏈 反 應 (real-time polymerase chain reaction, real-time PCR) 進 行 鑑 別 之 方 法 2.1. 工 作 環 境 : 工 作 平 台 需 寬 敞 潔 淨 光 線 良 好 檢 體 前 處 理 檢 體 DNA 抽 取 real-time PCR 試 劑 配 製 及 real-time PCR 等 檢 驗 過 程 皆 需 有 區 隔 空 間, 避 免 交 叉 污 染 Real-time PCR 試 劑 之 配 製 應 於 生 物 安 全 操 作 櫃 內 進 行 ( 註 1) 2.2. 裝 置 即 時 聚 合 酶 鏈 反 應 器 :Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System, 或 同 級 品 高 壓 滅 菌 釜 生 物 安 全 操 作 櫃 (Biological safety cabinet, BSC): 第 二 等 級 (class II) ( 含 ) 以 上 者 加 熱 振 盪 器 : 具 溫 控 及 振 盪 功 能 微 量 冷 凍 離 心 機 (Micro refrigerated centrifuge): 可 達 g, 並 具 4 溫 控 功 能 離 心 機 : 供 各 式 微 量 離 心 管 離 心 用 分 光 光 度 計 : 具 波 長 260 nm 280 nm 冷 凍 設 備 : 具 冷 藏 及 凍 結 (-20 C) 功 能 旋 渦 混 合 器 (Vortex mixer) 酸 鹼 度 測 定 儀 (ph meter) 天 平 : 最 大 稱 重 量 為 2000 g, 靈 敏 度 為 0.1 g; 最 大 稱 重 量 為 100 g, 靈 敏 度 為 1 mg 註 1: 本 方 法 所 使 用 或 提 及 之 產 品 品 牌 不 代 表 為 同 類 產 品 中 最 好 者 ; 反 之, 未 使 用 或 未 提 及 之 產 品 品 牌 亦 不 代 表 為 同 類 產 品 中 較 差 者 2.3. 試 藥 DNA 抽 取 用 : 適 用 於 革 蘭 氏 陰 性 細 菌 DNA 抽 取 之 市 售 套 組 ( 註 2) Real-time PCR 用 鑑 別 試 驗 用 引 子 及 探 針 26

27 沙 門 氏 桿 菌 鑑 別 基 因 ( 標 的 基 因..invA) 引 子 F:5 - CAA CGT TTC CTG CGG TAC TGT -3 引 子 R:5 - CCC GAA CGT GGC GAT AAT T - 3 探 針 P: 5 -(FAM)- CTC TTT CGT CTG GCA TTA TCG ATC AGT ACC A -(BHQ1)-3 PCR 增 幅 產 物 大 小 116 bp 註 2: 合 成 之 引 子 及 探 針, 拆 封 後, 以 無 菌 去 離 子 水 稀 釋 成 適 當 濃 度, 分 裝 後 置 於 -20 貯 存 備 用, 另 探 針 需 避 光 保 存, 探 針 5 端 採 用 6-carboxy-fluorescein (FAM) 標 記,3 端 採 用 Black Hole Quencher-1 (BHQ1) 標 記 TaqMan Fast Reagents Starter Kit ( 適 用 於 Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System) 本 試 劑 內 含 real-time PCR 所 需 去 氧 核 糖 核 苷 三 磷 酸 聚 合 酶 等, 使 用 時 添 加 引 子 探 針 及 待 測 檢 體 DNA 對 照 用 物 質 : 沙 門 氏 桿 菌 標 準 菌 株 或 其 DNA ( 註 3) 2.4. 器 具 及 材 料 微 量 吸 管 (Micropipette):2µL 10 µl 20 µl 100µL 200 µl 及 1000 µl 吸 管 尖 頭 (Pipette tip): 可 滅 菌 10 µl 20 µl 200 µl 及 1000 µl 離 心 管 :200 µl 600 µl 1.5 ml 及 2 ml Real-time PCR 反 應 管 :100 µl Real-time PCR 反 應 盤 : 具 96 個 反 應 孔, 適 用 於 Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System 玻 璃 或 塑 膠 瓶 :50 ml 100 ml 250 ml 500 ml 1000 ml 及 2000 ml 註 3: 使 用 之 塑 膠 或 玻 璃 器 皿 均 為 無 DNase 污 染 2.5. Real-time PCR 溶 液 ( 註 4) Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System 鑑 別 試 驗 用 5 µm 引 子 F µl 5 µm 引 子 R µl 10 µm 探 針 µl TaqMan Fast Reagents Starter Kit µl 27

28 檢 體 DNA 溶 液 µl 無 菌 去 離 子 水 µl 總 體 積 µl 註 4:Real-time PCR 溶 液 應 置 於 冰 浴 中 配 製 2.6. 檢 體 DNA 溶 液 之 製 備 檢 體 增 菌 液 之 DNA 溶 液 製 備 自 第 一 部 節 節 增 菌 液 中 吸 取 菌 液 1 ml 或 分 離 菌 株, 取 一 接 種 環 量, 加 入 無 菌 去 離 子 水 1 ml, 置 入 已 滅 菌 之 1.5 ml 離 心 管 中, 以 g 離 心 3 分 鐘, 去 除 上 清 液 直 接 煮 沸 法 將 沉 澱 物 加 入 無 菌 去 離 子 水 1 ml, 振 盪 混 合 均 勻, 以 g 離 心 3 分 鐘, 去 除 上 清 液, 重 複 操 作 一 次 續 將 沉 澱 物 加 入 無 菌 去 離 子 水 1 ml, 振 盪 混 合 均 勻, 置 入 加 熱 振 盪 器 中 煮 沸 10 分 鐘, 取 出 離 心 管, 作 為 檢 體 DNA 原 液, 置 於 -20 冷 凍 保 存 抽 取 DNA 法 採 用 適 用 於 革 蘭 氏 陰 性 細 菌 DNA 抽 取 之 市 售 套 組, 依 套 組 操 作 說 明 步 驟 抽 取 DNA 抽 取 之 DNA 溶 液 收 集 至 已 滅 菌 之 1.5 ml 離 心 管, 作 為 檢 體 DNA 原 液, 置 於 -20 冷 凍 保 存 分 離 菌 株 之 DNA 溶 液 製 備 取 一 接 種 環 之 分 離 菌 株, 置 入 含 有 無 菌 去 離 子 水 1 ml 之 已 滅 菌 1.5 ml 離 心 管 中, 振 盪 混 合 均 勻, 煮 沸 10 分 鐘, 取 出 離 心 管, 待 冷 卻 後 以 g 離 心 3 分 鐘, 吸 取 上 清 液 至 另 一 已 滅 菌 1.5 ml 離 心 管, 作 為 檢 體 DNA 原 液, 置 於 -20 冷 凍 保 存 亦 可 依 節 進 行 檢 體 DNA 原 液 之 製 備 DNA 濃 度 測 定 及 純 度 判 斷 取 適 量 之 檢 體 DNA 原 液, 以 無 菌 去 離 子 水 做 適 當 倍 數 之 稀 釋, 分 別 測 定 260 nm 及 280 nm 之 吸 光 值 (O.D.) 以 波 長 260 nm 吸 光 值 乘 50 ng/µl 及 稀 釋 倍 數, 即 為 檢 體 DNA 原 液 濃 度 DNA 溶 液 純 度 則 以 O.D. 260 /O.D. 280 比 值 作 判 斷, 其 比 值 應 介 於 1.7 ~2.0 ( 註 5) 2.7. 鑑 別 試 驗 28

29 Real-time PCR 操 作 步 驟 以 無 菌 去 離 子 水 適 當 稀 釋 檢 體 DNA 原 液 引 子 及 探 針 備 用 取 已 滅 菌 之 1.5 ml 離 心 管, 依 照 2.5. 節 配 製 real-time PCR 溶 液, 依 序 加 入 TaqMan Fast Reagents Starter Kit 稀 釋 過 之 引 子 及 探 針, 混 合 均 勻 後, 分 裝 20 µl 入 real-time PCR 反 應 盤 的 反 應 孔 中, 各 別 加 入 檢 體 DNA 溶 液 5 µl, 再 將 real-time PCR 反 應 盤 置 於 離 心 機 中, 以 200 g 瞬 間 離 心, 移 入 real-time PCR 反 應 器, 依 下 列 條 件 進 行 反 應 同 時 另 製 作 正 反 應 及 負 反 應 對 照 組 沙 門 氏 桿 菌 菌 屬 鑑 別 基 因 反 應 條 件 步 驟 溫 度 時 間 1. 熱 活 化 95 C 20 sec 2. 最 初 變 性 95 C 15 sec 3. 黏 接 延 展 60 C 30 sec 步 驟 2 至 步 驟 3, 共 進 行 40 個 循 環 反 應 Real-time PCR 螢 光 分 析 檢 體 DNA 經 real-time PCR 反 應 後, 直 接 從 real-time PCR 反 應 器 上 之 螢 幕 觀 察 探 針 所 產 生 之 螢 光 增 幅 曲 線, 即 可 判 讀 反 應 結 果 同 時 另 測 試 正 反 應 及 負 反 應 對 照 組 確 認 檢 體 DNA 之 real-time PCR 增 幅 產 物 螢 光 分 析 圖 與 正 反 應 對 照 組 螢 光 分 析 圖 進 行 相 互 比 對, 當 檢 體 DNA 與 正 反 應 對 照 組 之 real-time PCR 螢 光 分 析 圖 均 出 現 經 由 探 針 所 產 生 之 螢 光 增 幅 曲 線, 即 確 認 該 real-time PCR 增 幅 產 物 為 沙 門 氏 桿 菌 之 DNA 片 段, 可 確 認 該 檢 體 中 含 有 沙 門 氏 桿 菌 之 基 因 註 5: 本 Real-time PCR 反 應 條 件 係 採 Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System 設 定 之, 當 使 用 其 他 機 型 時, 應 自 行 探 討 反 應 條 件 附 註 : 第 二 部 沙 門 氏 桿 菌 之 real-time PCR 檢 測 可 視 需 要 執 行 29

30 檢 驗 流 程 圖 檢 體 25 g 加 入 增 菌 液 225 ml 35, 培 養 24±2 小 時 檢 液 0.1 ml 加 入 RV broth 10 ml ( 註 1) 42, 水 浴 24±2 小 時 檢 液 1 ml 加 入 TT broth 10 ml ( 註 2) 分 別 接 至 XLD BS 及 HE agar 35, 培 養 24±2 小 時 鈎 取 至 少 2 個 可 疑 菌 落, 接 種 於 TSI 及 LIA 斜 面 培 養 基 ( 註 3) 43, 水 浴 24±2 小 時 35, 培 養 24±2 小 時 自 TSI 及 LIA 斜 面 培 養 基 鈎 取 至 少 3 個 可 疑 菌 落 沙 門 氏 桿 菌 之 real-time PCR ( 註 4) 鑑 別 生 化 試 驗 或 市 售 生 化 檢 測 套 組 鑑 定 系 統 確 認 血 清 學 試 驗 依 試 驗 結 果 判 定 沙 門 氏 桿 菌 及 其 型 別 註 1: 檢 體 為 關 華 豆 膠, 使 用 SC 培 養 液 註 2:TT broth 在 使 用 前 需 先 加 入 碘 - 碘 化 鉀 溶 液 0.2 ml 及 0.1% 煌 綠 溶 液 0.1 ml 註 3: 檢 體 為 低 度 污 染 食 品 ( 關 華 豆 膠 除 外 ), 將 TT 培 養 液 置 於 35 培 養 24±2 小 時 ; 檢 體 為 關 華 豆 膠, 將 SC 及 TT 培 養 液 置 於 35 培 養 24±2 小 時 註 4: 可 依 檢 體 含 菌 量 情 況 自 行 探 討 接 續 real-time PCR 之 步 驟 及 增 菌 時 間, 以 達 快 速 鑑 別 目 的 30