临床实验手册

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1 临 床 实 验 室 操 作 手 册 微 生 物 实 验 室 1

2 临 床 实 验 室 手 册 目 录 章 节 标 题 页 码 附 录 1 实 验 室 安 全 : 微 生 物 实 验 室 生 物 安 全 2 抗 酸 杆 菌 3 痰 标 本 4 尿 液 检 验 5 血 培 养 6 体 液 7 脑 脊 液 8 粪 便 标 本 9 混 合 标 本 : 生 殖 道 标 本 10 淋 病 奈 瑟 氏 菌 ( 淋 球 菌 ) 11 混 合 标 本 : 非 生 殖 道 标 本 12 螺 旋 体 培 养 13 粪 便 寄 生 虫 14 真 菌 培 养 15 血 液 检 查 ( 微 生 物 和 寄 生 虫 ) 16 抗 生 素 敏 感 试 验 : 纸 片 法 ( 对 照 ) 17 抗 生 素 敏 感 试 验 : 试 剂 和 纸 片 内 容 18 肉 汤 稀 释 法 敏 感 试 验 19 血 清 抑 菌 试 验 和 定 量 杀 菌 试 验 20 抗 生 素 化 验 21 疾 病 的 报 告 22 培 养 基 23 质 量 保 障 24 细 菌 保 存 2

3 1 实 验 室 安 全 1.1 微 生 物 实 验 室 的 生 物 安 全 性 1.2 科 室 安 全 文 档 (a) 生 物 危 害 防 护 : 实 际 操 作 规 程 见 (PWH Department if Microbiology, Januar,1989, revised March 1994) (b) 实 验 室 安 全 : 原 则 和 措 施 见 (CUHK Safty Advisory Committees & University Laboratory Safety Ofice,1995) 1.3 应 用 : 以 上 的 操 作 规 程 应 用 于 PWH 微 生 物 科 室 的 所 有 部 门 所 用 工 作 人 员 或 访 问 人 员 必 须 遵 守 各 项 规 定 1.4 关 于 新 规 定 或 现 行 规 定 的 修 改 案 任 何 新 规 定 或 现 行 规 定 的 修 改 案 必 须 通 知 负 责 科 室 安 全 的 官 员 及 相 关 人 员, 他 们 将 建 议 科 室 主 任 考 虑 实 施 1.5 生 物 性 危 害 与 各 种 操 作 有 关 的 生 物 危 害 水 平 取 决 于 : a. 处 理 的 传 染 性 物 质 的 本 身 按 照 传 染 性 物 质 对 个 人 和 社 区 和 潜 在 危 险 性 以 及 经 空 气 传 播 的 可 能 性, 其 划 分 成 不 同 等 级 所 采 用 的 等 级 划 分 详 见 " 实 验 室 安 全 "; 原 则 和 措 施 ( 见 CUHK Safty Advisory Committees & University Laboratory Safety Ofice) b. 使 用 的 设 备 和 设 施 处 理 不 同 等 级 的 传 染 性 物 质 的 要 求 在 " 实 验 室 安 全 " 中 已 规 定 这 些 符 合 要 求 的 设 备 都 要 承 担 重 要 临 床 工 作, 科 室 负 责 人 必 须 保 证 中 应 污 染 物 水 平 c. 培 训, 特 别 是 员 工 的 安 全 性 培 训 和 安 全 性 经 验 积 累 所 有 员 工 应 该 接 受 一 定 训 练, 能 安 全 处 理 任 何 实 验 室 可 能 碰 到 的 物 质, 避 免 将 实 验 不 能 处 理 或 规 定 之 外 的 传 染 性 物 质 暴 露 在 实 验 室, 即 使 暴 露 事 故 在 实 验 室, 即 使 暴 露 事 故 发 生 也 要 会 正 确 处 理 传 染 性 物 质 的 分 类 分 类 系 统 1. 生 物 危 害 防 护 :[ 见 1.2 (a)], 其 引 用 了 英 国 的 分 类 系 统, 将 物 质 分 成 A,B 1,B 2 和 C 类,A 类 最 具 危 害 性 2. WHO 和 澳 大 利 亚 及 新 西 兰 使 用 "4 危 性 群 " 分 类, 最 高 的 数 字 代 表 最 高 的 危 害 性 3. 美 国,USDHHS,CDC 和 NIH 将 实 验 室 须 防 护 物 质 分 成 4 个 生 物 安 全 水 平, 最 高 数 字 代 表 危 险 性 最 高 尽 管 使 用 术 语 不 同, 但 这 些 分 类 体 系 差 别 不 大,CUHK 安 全 性 文 件 参 考 以 上 "2" 和 "3" 危 险 群 / 生 物 安 全 水 平 :1-4 a. 危 险 群 / 生 物 安 全 水 平 :1 对 健 康 成 人 无 致 病 性, 对 社 区 无 危 害 性 通 常 一 般 微 生 物 操 作 就 足 够, 不 需 特 殊 安 全 设 备, 工 作 的 附 近 要 有 洗 手 设 施 培 养 基 上 包 含 未 鉴 定 物, 因 此, 妥 善 处 理 对 各 级 安 全 水 平 都 至 着 重 要 b. 危 险 群 / 生 物 安 全 水 平 :2 人 类 疾 病 相 关 物 质, 这 种 物 质 对 实 验 室 工 作 人 员 有 中 度 危 险, 并 具 有 一 定 程 度 社 区 危 险 性 医 院 微 生 物 室 所 涉 及 的 绝 大 多 数 物 质 属 此 安 全 水 平, 生 物 危 害 警 告 应 张 贴, 并 且 限 制 接 近, 应 用 醒 目 标 语, 若 是 能 产 生 空 气 传 播 或 飞 溅 的 I,II 类 物 质 都 就 使 用 相 就 的 操 作 台 实 验 室 就 提 供 类 似 防 护 衣 和 手 套, 眼 罩 尤 其 是 配 戴 隐 形 眼 镜 者, 也 应 提 供 类 似 安 全 水 平 的 洗 手 设 施, 并 且 临 近 工 作 区 也 应 有 高 压 灭 菌 装 置 所 有 废 物 和 反 复 使 用 设 备 的 去 污 染 应 有 特 定 的 程 序 危 险 群 / 生 物 安 全 2 级 传 染 性 物 质 可 参 见 附 表 4.1,4.2,4.4,4.5,4.7, 其 中 分 成 细 菌, 真 菌, 寄 生 虫 和 病 毒, 并 且 列 出 了 相 应 的 预 防 措 施, 这 些 表 格 引 自 澳 大 利 亚 / 新 西 兰 文 档 c. 危 险 群 / 生 物 安 全 水 平 :3 人 类 疾 病 相 关 物 质, 具 有 潜 在 空 气 传 播 性, 能 引 起 严 3

4 重, 致 命 疾 病, 对 实 验 室 工 作 人 员 高 度 危 险, 并 具 有 一 定 程 度 社 区 危 险 性 参 见 附 表 4.3,4.6,4.8, 其 中 分 为 细 菌, 真 菌, 寄 生 虫 和 病 毒, 并 且 给 出 了 相 应 的 预 防 措 施 所 有 含 有 或 怀 疑 含 有 生 物 案 的 标 本 必 须 标 以 " 小 心 污 染 " 标 签, 并 且 同 时 标 于 盛 放 标 本 容 器 和 申 清 单 然 而 作 为 预 防 保 护 还 不 足 够 应 对 所 有 血 液, 体 液, 分 离 的 人 体 组 织 等 有 普 通 防 护 意 识, 它 们 都 应 视 作 传 染 源 在 此 生 物 安 全 级, 实 验 室 应 控 制 对 其 接 近 凡 涉 及 该 类 物 质 都 应 使 用 I 或 II 类 工 作 台 操 作, 也 可 以 遵 循 II 级 操 作 注 意 事 项, 对 所 有 废 物 进 行 去 污 染 处 理, 包 括 工 作 服 和 重 复 使 用 设 备 N.B PWH 目 前 的 设 施 还 不 完 善, 走 廊 缺 乏 一 定 程 度 的 隔 离, 缺 少 自 关 闭 双 扇 门, 实 验 室 负 压 不 具 备, 单 间 气 流 严 格 地 讲, 不 符 合 BSL3 要 求 尽 管 如 此 结 核 分 枝 杆 菌, 多 重 耐 药 菌 的 诊 断 工 作 仍 然 按 照 RG/BSL3 的 要 求 在 进 行 d. 危 险 群 / 生 物 安 全 水 平 :4 对 个 人 的 危 险 如 生 物 安 全 3 级, 但 对 社 区 有 高 度 危 险 性 这 些 传 染 性 物 质 包 括 : 蜱 源 性 脑 炎 病 毒 支 里 半 亚 - 刚 果 牛 血 热 病 毒 Marburg Virus 艾 波 拉 病 毒 Lagsa fever Virus Junin HF Virus Machupo HF Virus Guanaruto HF Virus Herpesvirus simiae (B Virus) ( 参 见 附 表 4.9) 这 些 物 质 在 待 知 情 况 下 不 得 在 任 何 微 生 物 实 验 室 处 理, 但 实 验 室 常 规 工 作 要 求 处 理 一 些 不 明 诊 断 的 标 本, 这 不 可 避 免 a. 狂 犬 病 毒 没 有 列 入 以 上, 尽 管 实 验 室 获 得 性 感 染 曾 有 发 生, 但 在 社 区 中 从 个 室 扩 大 传 播 的 可 能 性 很 小 但 仍 然 要 对 来 自 狂 犬 病 或 怀 疑 的 标 本 拒 收 在 下 述 c,d 中 有 针 对 拒 收 失 败 后 的 措 施 这 种 失 误 可 见 于 以 不 明 原 因 脑 炎 起 病 最 后 确 诊 狂 犬 病 的 病 例 b. 引 起 Creurzfeldt-Jacob, Gerstmann-Sbraussler 和 其 它 海 绵 状 组 织 脑 病 的 物 质 未 例 入 上 表, 但 同 样 应 拒 绝 来 自 已 知 该 病 或 怀 疑 的 标 本 进 入 实 验 室, 因 为 这 类 物 质 通 过 对 热, 射 线 或 化 学 消 毒 有 抵 抗 作 用 c. 如 果 实 验 室 收 到 含 有 或 怀 疑 含 有 生 物 安 全 4 级 物 质 的 标 本, 对 该 标 本 的 任 何 操 作 停 止, 标 本 应 转 移 到 安 全 地 方, 稍 后 再 转 送 指 定 实 验 室 d. 应 立 即 通 知 安 全 负 责 人 员 及 相 关 人 员, 并 由 负 责 人 上 报 权 威 部 门 安 全 人 员 应 起 草 一 份 接 触 过 该 标 本 人 员 名 单, 以 便 预 防, 如 果 可 能, 进 行 必 要 的 随 访 1.6 以 下 预 防 措 施, 所 有 实 验 工 作 人 员 必 须 遵 守 : 工 作 服 a. 所 有 实 验 室 成 员 在 工 作 期 间 必 须 始 终 穿 着 所 提 供 的 工 作 服 离 开 实 验 室 时, 工 作 服 须 挂 在 指 定 地 方, 不 得 在 实 验 室 外 冼 工 作 服 b. 在 处 理 含 有 或 怀 疑 含 有 生 物 安 全 3 级 物 质 的 标 本 时, 必 须 在 工 作 服 外 穿 隔 离 衣 c. 在 生 物 安 全 操 作 台 内 处 理 标 本 和 培 养 基 时, 必 须 戴 手 套 洗 手 池 洗 手 池 须 供 应 洗 洁 剂 和 纸 巾 洗 手 所 有 工 作 人 员 在 离 开 工 作 区 必 须 洗 手, 并 且 要 先 脱 去 工 作 服 和 手 套 食 物, 饮 水, 吸 烟, 化 妆 品 食 物 和 饮 料 不 允 许 带 入 任 何 处 理 标 本 的 房 间. 不 允 许 在 处 理 标 本 的 任 何 地 方 吸 烟. 不 允 许 在 处 理 标 本 的 任 何 地 方 使 用 化 妆 品 伤 口 和 擦 伤 手 上 的 伤 口 和 擦 伤 必 须 覆 盖 保 护 物 个 人 衣 物 个 人 衣 秀 不 允 许 带 入 实 验 室, 并 且 必 须 保 存 在 带 锁 的 柜 子 里 4

5 1.6.7 口 吸 移 液 管 这 是 禁 用 的 要 求 使 用 机 械 移 液 装 置 1.7 常 规 预 防 措 施 应 用 于 所 有 血 液 体 液 组 织 标 本 的 操 作 中 1> 无 论 何 时 都 应 尽 可 能 避 免 使 用 注 射 器, 针 头 或 其 它 锐 器 2> 使 用 过 的 针 头 和 一 次 性 切 割 器 必 须 丢 入 专 门 的 带 有 盖 子 和 桶 内, 以 备 安 全 处 理 防 止 容 器 过 满 盛 装 3> 使 用 过 的 针 头 不 许 重 新 使 用 或 再 用 手 操 作 4> 打 烂 的 玻 璃 必 须 放 入 坚 硬 的 容 器 ( 不 要 用 手 ), 然 后 再 放 入 黑 色 垃 圾 袋, 如 果 是 污 染 的, 使 用 红 色 垃 圾 袋 5> 在 接 触 具 有 潜 在 性 传 染 性 标 本 培 养 基 组 织, 必 戴 保 护 性 手 套, 防 止 皮 肤 直 接 接 触 如 果 手 套 有 可 见 的 污 染, 必 须 先 除 去 污 染, 再 更 换 手 上 有 皮 炎 或 伤 口 的 工 作 人 员 的 需 要 间 接 接 触 传 染 性 物 质 的 人 员 应 戴 保 护 性 手 套 6> 在 处 理 完 标 本 结 束 工 作, 甚 至 在 上 述 规 定 带 手 套 时, 应 常 规 洗 手 7> 当 血 液 血 液 制 品 或 其 它 体 液 污 染 发 生 时, 应 停 止 工 作 洗 手, 戴 一 次 性 手 套 再 清 除 污 染 区 建 议 用 含 有 效 1000ppm 的 次 氯 酸 钠 溶 液 如 果 污 染 区 较 大 用 浸 有 次 氯 酸 钠 溶 液 的 湿 布 覆 盖 10min 去 污 染, 并 标 示 相 应 的 警 告, 丢 弃 废 物 及 手 套 到 生 物 安 全 级 物 理 容 器 注 意 飞 溅 的 水 滴 和 流 淌 会 将 污 染 带 到 主 污 染 区 以 外 8> 所 有 在 实 验 室 使 的 具 有 潜 在 污 染 性 的 物 质 都 去 污 染, 最 好 先 高 压, 再 做 处 理 9> 任 何 可 能 产 生 飞 溅 或 气 雾 的 操 作 都 应 在 生 物 安 全 操 作 台 里 进 行 这 些 操 作 包 括 离 心, 分 离 血 清, 混 合, 超 声, 收 集 组 织 受 精 卵, 以 及 处 理 含 有 浓 集 的 感 染 物 质 标 本 1.8 实 验 室 物 质 处 理 a> 黑 色 塑 料 袋 用 来 收 集 未 污 染 或 经 高 压 过 需 处 理 的 废 物 b> 废 纸 屡 用 来 收 未 污 染 的 废 纸, 用 过 的 纸 巾 等 c> 所 有 可 能 传 染 的 物 质 必 须 高 压 或 焚 化 d> 所 有 丢 弃 的 标 本, 培 养 基 和 实 验 室 废 物 必 须 放 在 专 门 容 器 里 e> 用 白 色 聚 丙 烯 罐 盛 装 2% 新 鲜 配 置 次 氯 酸 液, 以 供 工 作 中 丢 弃 标 本, 污 染 吸 头, 棉 拭 子 临 时 处 理 待 一 天 工 作 结 束 之 后, 再 经 高 压 处 理 f> 红 色 塑 料 袋 用 来 处 理 污 染 的 实 验 室 废 物 它 们 应 封 口 再 由 工 人 拿 去 焚 烧 g> 带 盖, 带 标 签 硬 质 容 器 用 来 盛 装 针 头 的 锐 器 1.9 实 验 室 传 染 性 物 的 消 毒 高 压 a. 所 有 培 养 基 的 传 染 性 物 质 都 要 高 压, 除 非 准 备 焚 烧 的, 高 压 的 最 大 好 处 是 使 传 染 性 物 质 离 开 实 验 室 可 保 证 安 全 b. 用 作 此 目 的 的 高 太 设 备 应 在 医 学 技 师 监 督 下 由 实 验 室 工 人 操 作 c. 高 压 设 备 应 定 期 由 医 院 设 备 组 测 试, 检 修 这 些 测 试 包 括 商 业 使 有 的 芽 胞 试 纸 实 验 多 个 高 压 设 备 应 有 使 用 记 录, 并 自 使 用 之 日 起 由 医 学 技 师 连 续 记 录 任 何 不 符 都 要 向 安 全 人 员 报 告 1.10 去 污 染 四 类 去 污 染 剂 1> 次 氯 酸 溶 液 : 用 白 色 聚 丙 烯 罐 装 新 鲜 配 置 的 含 有 效 氯 1000ppm 的 2% 次 氯 酸 溶 液, 放 在 多 个 工 作 站 2> Printol [ ] 其 50% 的 水 溶 液 用 来 处 理 溅 在 地 板 和 家 具 上 的 污 染 3> 戊 二 醛 : 新 鲜 配 制 成 一 定 浓 度, 主 要 用 于 不 能 使 用 次 氯 酸 钠 的 仪 器 去 污 染, 如 离 心 机 等 4> 75% 乙 醇 : 主 要 用 于 对 清 洁 表 面 的 快 速 去 污 染 1.11 离 心 机 注 意 事 项 : a> 使 离 心 机 用 的 试 管 应 具 是 厚 管 或 塑 料 的, 离 心 前 应 仔 细 检 查 是 否 缺 损 b> 离 心 机 需 放 置 在 合 适 的 位 置, 操 作 都 应 能 看 见 离 心 缸, 以 便 能 正 确 地 将 离 心 架 放 在 转 子 上 5

6 c> 离 心 桶 和 离 心 架 配 对 使 用, 负 载 后 需 仔 细 平 衡 d> 为 避 免 脱 架 和 试 管 内 溶 液 溅 出, 开 始 采 用 低 转 速, 然 后 逐 渐 升 高 e> 离 心 机 内 缸 应 由 高 级 人 员 定 期 检 索, 内 壁 必 须 用 戊 二 醛 定 期 清 洁, 去 污 染 f> 在 对 含 有 或 怀 疑 含 有 生 物 安 全 操 作 3 级 标 本 离 心 时, 必 须 加 盖 密 封, 密 封 盖 只 有 在 一 级 生 物 安 全 操 作 台 内 才 能 打 开 离 心 时, 试 管 破 裂 a> 如 果 正 在 离 心 时, 发 生 或 怀 疑 发 生 试 管 破 裂, 电 动 机 应 立 即 断 电, 并 在 30min 后 才 能 打 开 离 心 机 盖 b> 如 离 心 后 发 现 破 裂, 应 产 刻 关 闭 机 盖, 保 持 至 少 30min c> 立 即 通 知 安 全 员 d> 戴 厚 手 套, 使 用 镊 子 或 用 镊 子 夹 棉 鉴 清 除 破 碎 玻 璃 碎 片 e> 所 有 破 裂 试 管, 玻 璃 碎 片, 离 心 桶 和 转 子 必 须 放 在 专 门 消 毒 剂 中 去 污 染, 要 求 流 毒 剂 不 具 腐 蚀 性, 对 浸 生 物 安 全 物 质 有 效 然 后, 或 者 浸 泡 至 24 小 时, 或 者 高 压 f> 未 破 裂, 带 盖 的 试 管 也 应 放 在 另 一 含 有 消 毒 剂 的 容 器 中 1 后, 再 对 其 内 容 物 处 理 i> 离 心 缸 必 须 用 戊 二 醛 棉 拭 子 清 洁, 过 夜, 再 重 复 擦 拭, 再 用 水 清 洁 洗 净 并 干 燥 g> 含 有 生 物 安 全 3 级 物 质 的 密 封 离 心 桶 必 须 在 密 封 状 态 下 取 出, 在 一 级 生 物 安 全 操 作 台 内 打 开 如 果 试 管 破 裂, 离 心 桶 密 封 盖 应 松 松 地 盖 上, 对 离 心 桶 高 压 1.12 破 裂 和 溢 出 任 何 重 要 的 破 裂 的 溢 出 都 应 通 知 安 全 人 员 在 处 理 含 有 或 怀 疑 含 有 生 物 案 例 的 溢 出 物, 应 先 得 到 安 全 人 员 的 建 议 病 毒 培 养 基 的 泄 漏 a> 用 浸 有 20% 次 氯 酸 钠 的 纸 巾 覆 盖 溅 洒 出 的 污 染 物 用 容 器 碎 片 b> 覆 盖 10-15min c> 戴 一 次 性 手 套, 清 扫 纸 巾 和 碎 片 于 合 适 的 容 器 ( 如 塑 料 袋, 但 不 包 括 含 有 碎 玻 璃 或 其 它 锐 利 物 体 ), 用 一 片 硬 纸 板 去 清 扫, 不 能 用 刷 子 或 尘 掸, 除 非 它 们 适 于 高 压 手 指 远 离 碎 玻 璃 d> 奖 碎 片 和 使 的 废 物 放 在 实 验 室 废 物 箱 e> 用 常 规 工 作 消 毒 剂 擦 拭 污 染 区 及 其 周 围 可 能 飞 溅 区 1.13 泄 漏 的 标 本 实 验 室 不 泄 漏 的 标 本, 但 要 以 塑 料 密 封 后 退 还 到 病 房 1.14 紫 外 线 消 毒 : 未 固 定 组 织 的 电 子 显 微 镜 检 1.15 传 代 细 胞 在 液 氮 中 的 储 存 应 使 用 带 丝 口 盖 的 安 瓿 盛 装, 但 严 禁 用 玻 璃 安 瓿 在 移 放 安 瓿 和 更 换 液 氧 时, 必 须 戴 手 套 和 口 罩 使 用 过 的 安 瓿 必 须 立 即 丢 入 红 色 垃 圾 袋 1.16 培 养 基, 试 剂 分 装 和 病 人 血 清 应 存 放 -70 C 和 -30 C 冰 箱 操 作 存 放 于 -30 C 或 以 下 温 度 冰 箱 物 质, 应 戴 手 套, 例 如 当 标 本 从 低 温 冰 箱 取 出 或 放 放 时 1.17 生 物 安 全 柜 ( 台 ) 实 验 室 应 配 备 I 级 和 II 级 生 物 安 全 柜, 后 者 用 于 病 毒 实 验 室 级 别 I : 基 本 要 求 : 定 向 流 动 保 护, 要 求 气 流 从 外 流 入 安 全 柜, 并 且 远 离 操 作 者, 指 向 传 染 物 经 HEPA 过 滤 排 后, 紧 好 由 导 管 引 向 室 外, 以 便 清 除 去 污 染 后 的 各 种 蒸 汽 II: 基 本 要 求 : 经 过 滤 气 体 垂 直 流 向, 既 保 护 操 作 者 也 要 保 护 工 作 不 受 污 染 IIA:70% 的 过 滤 气 体 重 新 循 环 至 工 作 区, 废 气 导 向 室 外 经 HEPA 过 滤 和 内 流 经 式 工 作 区 的 气 流 速 度 平 均 0.4m/s 或 略 高 IIB: 流 进 气 体 流 速 平 均 0.5m/s 或 更 好 按 照 不 同 型 别 (IIB 1,IIB 2,IIB 3 ), 气 体 排 出 比 例 从 70% 到 100% 根 据 工 作 选 择 不 同 型 如 有 毒 化 学 物 质 和 放 射 线 同 位 素 不 能 再 循 环 至 工 作 区 III : 基 本 要 求 : 操 作 者 与 传 染 物 安 全 隔 离, 并 且 整 个 操 作 过 程 都 要 提 高 安 全 柜 所 在 的 环 境 也 要 一 定 程 度 隔 离, 以 防 手 套 破 裂 生 物 安 全 柜 的 安 装 安 全 柜 要 发 挥 某 安 全 防 护 功 能 必 须 注 意 安 装 位 置, 废 气 应 通 过 管 道 以 保 护 环 境 不 受 污 6

7 染 如 果 需 购 置 这 类 设 备 应 联 系 CUHK 安 全 办 公 室, 在 种 类, 牌 子, 样 式, 安 装 位 置 和 安 装 以 及 与 其 它 设 施 的 相 邻 关 系 上 获 得 指 导 常 规 检 查 和 安 全 操 作 以 及 工 作 区 的 消 毒 有 一 份 操 作 规 程 详 尽 地 叙 安 全 柜 的 常 规 使 用 也 应 包 括 安 全 柜 发 生 意 外 时 应 采 取 的 行 动 每 一 个 使 用 者 必 须 阅 读 规 程 使 后 签 名 注 意 : 安 全 柜 应 尽 可 能 避 免 使 其 处 于 不 安 全 状 态, 但 有 时 因 为 安 全 柜 的 意 外, 使 用 者 被 迫 这 样 做 此 时, 应 张 贴 注 意 以 警 告 其 它 人 不 得 再 使 用 去 污 染 和 再 认 证 由 受 过 训 练 的 人 员, 配 戴 个 人 防 护 用 具, 来 做 污 染 工 作 要 求 : 安 全 柜 在 密 闭 条 件 下 用 干 燥 多 聚 甲 醛 蒸 汽 醺 蒸, 使 用 浓 度 8500ppm ( 安 全 柜 的 体 积 应 包 括 外 周 供 应 和 废 气 过 滤 设 备 ) 在 温 度 c, 相 对 温 度 不 低 于 60% 环 境 保 持 4h, 甲 醛 蒸 汽, 如 果 允 许, 可 直 接 抽 出 室 外, 若 不 允 许 可 在 安 全 柜 内 用 氨 基 重 碳 盐 吸 收 因 为 空 气 有 限 的 穿 透 力, 在 处 理 潜 在 传 染 性 物 质 时 最 好 使 用 HEPA 过 滤 器, 以 及 高 压 或 焚 化 后 再 丢 弃 再 认 证 这 项 工 作 由 专 门 人 员 进 行, 去 污 染 后 安 全 柜 性 能 再 认 证 定, 及 过 滤 器 的 更 换, 测 试 是 否 有 漏 气, 调 试 空 气 流 速 是 否 合 规 定, 以 及 检 测 过 滤 器 的 性 能 再 认 证 应 至 少 一 年 做 一 次, 或 是 装 置 移 动, 过 滤 器 维 修 后 应 备 有 去 污 染, 维 修 和 再 认 证 的 记 录, 并 且 应 方 便 使 用 者 的 查 阅 附 表 : 表 4.1 生 物 安 全 二 级 细 菌 举 例 放 线 菌 属 不 动 杆 菌 属 放 线 杆 菌 属 气 单 胞 菌 属 Afipia spp 溶 血 性 秘 菌 腊 样 芽 胞 杆 菌 粪 杆 菌 属 巴 字 通 体 属 Bardetella spp Brucella ovis 嗜 工 氧 化 氧 菌 属 弯 曲 菌 属 人 心 杆 菌 属 衣 原 体 属 ( 不 包 括 鹦 鹉 热 衣 原 体 ) 枸 椽 酸 杆 菌 属 梭 状 芽 胞 杆 菌 属 Corgnebacterium matruchotii 微 小 棒 状 杆 菌 溃 疡 棒 状 杆 菌 假 结 核 棒 状 杆 菌 刚 果 嗜 皮 菌 迟 缓 爱 德 华 氏 菌 侵 蚀 爱 肯 菌 肠 杆 菌 属 肠 球 菌 属 黄 杆 菌 属 丹 麦 丝 状 菌 大 肠 埃 希 氏 菌 ( 除 放 线 菌 株 ) 土 拉 热 弗 朗 西 丝 菌 梭 杆 菌 属 嗜 血 杆 菌 属 巨 大 金 氏 属 克 雷 伯 氏 菌 属 军 团 杆 菌 属 产 单 李 斯 菌 属 莫 拉 氏 菌 属 肺 炎 支 原 体 奈 瑟 氏 菌 属 诺 卡 氏 菌 属 巴 斯 特 菌 属 类 志 贺 氏 邻 单 胞 菌 变 形 杆 菌 属 普 罗 维 登 氏 菌 属 假 单 胞 菌 属 ( 除 鼻 疽 假 单 胞 ) 平 衡 红 球 菌 沙 门 氏 菌 属 液 化 沙 雷 氏 菌 粘 质 沙 雷 氏 菌 志 贺 氏 菌 属 金 黄 色 葡 萄 球 菌 念 珠 形 链 杆 菌 链 球 菌 属 弧 菌 属 耶 尔 森 氏 菌 属 ( 除 鼠 疫 耶 尔 森 氏 菌 ) 表 4.2 7

8 微 生 物 需 要 特 别 注 意 的 生 物 二 级 细 菌 及 注 意 事 项 包 重 螺 旋 体 属 肉 毒 梭 状 芽 胞 杆 菌 破 伤 风 梭 状 芽 胞 杆 菌 白 喉 棒 状 杆 菌 澳 大 利 亚 钩 端 螺 旋 体 分 枝 杆 菌 属 ( 除 耐 药 结 核 分 枝 杆 菌 ) 脑 膜 炎 奈 瑟 氏 菌 ( 除 了 B 群 ) 脑 膜 炎 奈 瑟 氏 菌 B 群 伤 寒 沙 门 氏 菌 梅 毒 螺 旋 体 细 密 螺 旋 体 E G,S V V E C,G,V,T V,C C,E,G G,V G,E G,E C: 使 用 空 气 隔 离 安 全 柜 E: 使 用 护 眼 用 具 G: 使 用 手 套 S: 小 心 溅 洒 V: 要 求 接 种 疫 苗 T: 要 求 受 专 门 训 练 表 4.3 微 生 物 生 物 安 全 3 级 细 菌 及 注 意 事 项 炭 疽 芽 胞 杆 菌 布 鲁 菌 属 ( 除 B.ovis) 鹦 鹉 热 衣 原 体 Q 热 立 克 次 体 土 拉 热 弗 朗 西 斯 菌 (A 型 ) 多 重 耐 药 结 核 杆 菌 复 合 体 鼻 疽 假 单 胞 菌 立 克 次 体 属 鼠 疫 耶 尔 森 氏 菌 V - V,T 表 4.4 生 物 安 全 二 级 寄 生 虫 ( 略 ) 表 4.5 生 物 安 全 二 级 真 菌 微 生 物 烟 曲 霉 菌 和 黄 曲 霉 菌 白 色 假 丝 酵 母 菌 新 型 隐 球 菌 絮 状 表 皮 癣 菌 小 孢 子 菌 属 申 克 氏 孢 子 丝 菌 毛 癣 菌 属 注 意 事 项 C G - 表 4.6 生 物 安 全 3 级 真 菌 微 生 物 皮 炎 芽 生 菌 属 Coccidioides immitis 组 织 胞 浆 菌 属 Paracoccidioides brasiliensis 注 意 :Coccidioides immitis 的 芽 胞 特 别 危 险, 不 能 使 用 平 板 培 养 这 个 真 菌 8

9 微 生 物 实 验 室 生 物 安 全 2 级 危 险 群 细 菌 污 染 处 理 程 序 ( 手 册 - 实 验 室 安 全 - 附 录 2) 第 一 步 ( 针 对 污 染 所 涉 及 人 员 ) 1. 迅 速 通 知 其 他 人 员 离 开 并 最 后 关 门 2. 脱 掉 所 有 已 污 染 衣 物, 并 将 其 装 入 消 毒 袋 进 行 高 压 灭 菌 3. 通 知 组 长 和 医 院 生 物 安 全 办 公 室 4. 等 待 指 示 第 二 步 ( 消 毒 ) 1. 如 果 污 染 发 生 在 有 负 压 的 房 间, 应 等 30 分 钟 后 开 始 消 毒 2. 如 果 污 染 发 生 在 没 有 负 压 的 房 间, 应 尽 快 消 毒 3. 应 由 有 经 验 的 人 员 进 行 消 毒 处 理, 并 由 生 物 安 全 官 员 确 定 制 造 事 故 者 是 否 参 加 处 理 工 作 4. 进 入 处 理 房 间 前, 工 作 人 员 换 上 防 护 衣 5. 用 含 5% 的 printol 或 含 50,000ppm 氯 的 漂 白 剂 的 纱 布 覆 盖 已 污 染 的 区 域, 然 后 离 开 房 间 分 钟 后, 再 次 着 防 护 衣 进 入 房 间, 将 污 染 溢 出 物 和 用 于 清 洁 的 纱 布 放 入 可 耐 受 高 压 的 双 层 塑 料 袋 内 并 尽 快 高 压 7. 用 含 酚 的 消 毒 剂 擦 拭 事 故 中 例 如 由 于 溅 出 被 污 染 的 地 面 重 复 第 6 和 第 7 步 8. 在 生 物 安 全 办 公 室 准 许 开 放 前, 该 污 染 实 验 区 域 不 得 向 任 何 人 员 开 放 9. 所 有 污 染 仪 器 应 高 压 灭 菌 或 用 2% 的 glutaraldehyde 浸 泡 过 夜 10. 临 床 医 务 人 员 应 对 事 故 受 害 者 和 消 毒 人 员 进 行 医 学 随 访 11. 应 随 时 保 证 微 生 物 室 有 三 套 防 护 衣 ( 放 置 在 培 养 基 室 ) 所 需 物 品 : ⅰ 防 护 衣 和 长 筒 靴 ⅱ2% 的 Glutaraldehyde ⅲ 5% 的 Printol ⅳ 手 套 ⅴ 纱 布 ⅵ 卷 纸 9

10 2. 抗 酸 杆 菌 2.1 概 述 抗 酸 杆 菌 主 要 包 括 分 枝 杆 菌 属, 但 是 一 些 奴 卡 氏 菌, 放 线 菌, 棒 状 杆 菌 和 红 球 菌 有 弱 抗 酸 性 本 室 主 要 是 从 各 种 临 床 标 本 中 分 离 与 鉴 定 分 枝 杆 菌 特 别 是 结 核 分 枝 杆 菌 进 行 本 章 操 作 前, 必 须 严 格 参 看 实 验 室 安 全 手 册 2.2 标 本 类 型 要 求 去 污 染 的 标 本 (1) 呼 吸 道 标 本 (a) 痰 (b) 纤 支 镜 标 本 包 括 气 管 抽 取 液 (c) 胃 灌 洗 液 (2) 尿 液 (3) 大 便 正 常 不 用 去 污 染 的 标 本 (1) 脑 脊 液 (2) 体 液 (a) 胸 水 (b) 腹 膜 液 (c) 腹 水 (d) 心 包 液 (3) 组 织 (a) 胸 膜 活 检 (b) 淋 巴 结 (c) 子 宫 内 膜 活 检 (d) 细 针 抽 取 物 (e) 骨 髓 (4) 脓, 伤 口 拭 子 2.3 病 原 菌 (1) 结 核 分 枝 杆 菌 (2) 鸟 - 胞 内 分 枝 杆 菌 (3) 偶 然 分 枝 杆 菌 (4) 龟 分 枝 杆 菌 10

11 (5) 堪 萨 斯 分 枝 杆 菌 (6) 牛 分 枝 杆 菌 (7) 其 他 如 从 伤 口 分 离 的 溃 疡 分 枝 杆 菌 和 海 分 枝 杆 菌 2.4 常 规 检 查 和 报 告 程 序 显 微 镜 检 查 标 本 制 备 所 有 涂 片 部 分 应 涂 在 玻 片 中 央 2 平 方 厘 米 的 区 域 (1) 晨 痰 : 标 本 4 放 置 过 夜, 取 20 毫 升 离 心,3000 g15 分 钟, 取 沉 淀 涂 片 (2) 脑 脊 液 / 体 液 / 支 气 管 抽 取 液 等 标 本 体 积 应 大 于 2 毫 升 标 本 离 心 3000 g15 分 钟, 取 沉 淀 涂 片 脑 脊 液 涂 在 白 蛋 白 包 被 的 玻 璃 片 上 (3) 大 便 : 将 乳 化 后 约 1 克 的 标 本 倒 入 5 毫 升 的 蒸 馏 水 中, 静 置 几 分 钟, 取 悬 浮 液 涂 片 (4) 痰 : 用 一 半 径 3 毫 米 的 粗 铁 丝 环, 取 含 脓 最 多 的 部 分 涂 片 (5) 组 织 : 用 最 小 体 积 的 平 衡 盐 溶 液 使 其 均 质 化, 涂 片 对 于 细 针 抽 取 物, 如 量 太 少 优 先 做 培 养 (6) 脓 拭 子 : 将 拭 子 放 入 极 少 的 平 衡 盐 溶 液 中 反 复 裹 洗 而 后 直 接 涂 片 染 色 (1) 微 热 固 定 涂 片 (2) 用 金 胺 罗 丹 明 法 ( 见 附 录 1) 筛 选, 如 结 果 为 阳 性 的 标 本, 再 用 Z-N 抗 酸 染 色 法 ( 见 附 录 2) 确 认 检 查 涂 片 并 报 告 结 果 (1) 记 录 所 有 的 涂 片 结 果 对 于 阳 性 结 果, 发 报 告 前 先 电 话 通 知, 报 告 单 上 提 醒 临 床 注 意 可 能 的 交 叉 感 染 危 险 (2) 如 发 现 脑 脊 液 抗 酸 阳 性 应 首 先 咨 询 当 班 的 微 生 物 学 家 11

12 阳 性 结 果 报 告 等 级 ( 放 大 250 倍 ) 近 似 : 每 视 野 1-2 个 杆 菌 每 视 野 3-10 个 杆 菌 每 视 野 超 过 10 个 杆 菌 下 表 是 筛 选 查 找 抗 酸 杆 菌 时 必 须 扫 描 的 视 野 : 放 大 倍 数 * 视 野 数 250 X X X 300 最 终 放 大 倍 数 = 物 镜 放 大 倍 数 目 镜 放 大 倍 数 如 金 胺 罗 丹 明 结 果 阳 性, 但 ZN 阴 性, 仍 报 阴 性 (3) 当 天 出 阴 性 报 告 (4) 保 存 所 有 阳 性 涂 片 并 清 楚 标 记, 保 存 一 年 培 养 去 消 化 前 的 标 本 处 理 (1) 痰 无 (2) 胃 灌 洗 液 / 支 气 管 灌 洗 液 等 体 积 >2 毫 升 (a) 离 心 3000 g 15 分 钟 (b) 将 表 面 悬 浮 部 分 倒 入 5% 的 来 苏 尔 中 (c) 使 用 沉 淀 去 污 染 (3) 尿 (a) 将 尿 液 静 置 放 4 过 夜, 取 下 面 部 分 约 20 毫 升 装 入 离 心 管 (b) 离 心 3000 g 15 分 钟 (c) 将 上 面 液 体 倒 入 5% 的 来 苏 尔 (d) 取 沉 淀 去 污 染 (4) 粪 便 (a) 挑 取 约 1 克 的 标 本 放 入 5 毫 升 蒸 馏 水 中 乳 化, 放 置 数 分 钟, 取 上 面 部 分 入 无 菌 瓶 中 即 为 1 号 悬 浮 液 12

13 (b) 用 蒸 馏 水 1:10 稀 释 1 号 悬 浮 液 即 得 2 号 悬 浮 液 (c) 使 用 1 号 和 2 号 悬 浮 液 去 污 染 (5) 活 检 标 本 和 组 织 (a) 研 磨 后 用 极 少 的 无 菌 平 衡 盐 溶 液 浸 泡 溶 解 (b) 接 种 血 平 板, 观 察 有 无 细 菌 生 长, 如 有 生 长 立 刻 去 消 化 (c) 此 种 标 本 应 保 存 在 -70 (6) 脑 脊 液 (CSF) (a) 离 心 3000 g 15 分 钟 (b) 接 种 血 平 板, 观 察 有 无 细 菌 生 长, 如 有 生 长 立 刻 去 消 化 (c) 此 种 标 本 应 保 存 在 -70 (7) 体 液 : 如 胸 水, 关 节 液, 腹 水 等 (a) 接 种 血 平 板 做 无 菌 检 测, 如 血 平 板 生 长 请 查 阅 血 培 养 / 体 液 台 操 作 和 参 照 以 下 去 污 染 (b) 离 心 3000 g 15 分 钟 取 沉 淀 (c) 剩 余 标 本 保 存 于 -70 (8) 拭 子 (a) 在 极 少 的 平 衡 盐 溶 液 挤 干 拭 子 (b) 接 种 血 平 板 做 无 菌 检 测, 如 血 平 板 生 长, 即 要 求 去 污 染 处 理 去 污 染 以 下 为 本 室 处 理 有 杂 菌 污 染 的 标 本 的 程 序 : (1) 痰 液 : (a) 将 保 护 性 衬 垫 置 于 hood 之 下, 然 后 按 顺 序 排 列 好 标 本 及 离 心 管 (b) 打 开 标 本 容 器 盖 (c) 将 样 本 中 的 大 部 分 粘 液 转 移 至 离 心 管, 不 超 过 5ml 离 心 管 中 的 标 本 量 必 须 不 得 超 过 其 容 量 的 1/5, 并 在 AFB 日 志 上 记 下 标 本 的 数 量 及 质 量 (d) 配 制 净 化 剂 ( 要 求 每 天 新 鲜 配 制 ) 混 合 等 量 的 4%NaOH 和 2.9% 枸 椽 酸 钠 及 适 量 的 NALC 结 晶 于 无 菌 烧 瓶 例 如, 欲 配 制 100ml 的 试 剂 可 用 0.5gNALC 结 晶 物,NaOH 和 枸 椽 酸 钠 各 50ml (e) 将 定 时 器 设 定 为 15 分 钟 (f) 从 第 一 个 标 本 开 始, 各 加 与 标 本 等 量 的, 但 不 超 过 标 本 量 的 NALC- NAOH 溶 液 另 加 10ml 该 溶 液 于 一 试 管 作 为 阴 性 对 照 13

14 (g) 拧 紧 离 心 管 帽 并 在 离 心 机 上 混 匀 直 至 标 本 液 化 ( 每 个 标 本 大 约 离 心 5-20 秒 ) 照 此 完 成 所 有 标 本 (h) 15 分 钟 后, 从 第 一 号 标 本 开 始, 去 掉 盖 子, 并 用 浸 Staphene 的 无 菌 纱 布 消 毒 试 管 口, 不 要 让 消 毒 剂 进 入 试 管, 再 用 无 菌 的 PH6.8PBS 加 至 40ml 处 然 后 拧 紧 盖 子, 颠 倒 试 管 混 匀 注 意 : 加 缓 冲 液 与 净 化 处 理 所 用 的 时 间 应 该 一 样 长, 比 如 用 7 分 钟 时 间 加 NALC- NAOH, 同 样 应 用 7 分 钟 时 间 加 缓 冲 液 (i) 将 离 心 管 置 于 离 心 机 中, 以 4316RPM( 约 3000Xg) 离 心 15 分 钟 (j) 离 心 期 间, 标 记 好 玻 片 以 供 涂 片 用, 并 将 打 印 好 的 标 签 贴 在 培 养 基 上, 并 在 AFB 日 志 上 记 录 其 数 量 和 质 量 (k) 从 离 心 机 中 取 标 本, 将 上 清 液 倒 于 盛 有 消 毒 剂 的 AFB 棕 色 瓶 中 并 用 浸 过 消 毒 剂 的 纱 布 消 毒 管 口 (l) 用 无 菌 吸 管 吸 取 约 ml0.2% 牛 血 清 白 蛋 白 溶 液 加 入 离 心 管 并 轻 轻 混 匀 (m) 用 无 菌 的 巴 氏 吸 管 吸 取 2 滴 沉 淀 物 于 试 管 基 质 表 面, 并 反 复 倾 斜 让 其 扩 散 开 (n) 然 后 取 1-2 滴 沉 淀 物 涂 片, 涂 片 面 积 约 为 1x2cm, 将 玻 片 置 于 孵 箱 内, 在 孵 育 2 小 时 ( 过 夜 也 可 ) (o) 将 标 本 按 顺 序 放 于 水 平 架 上, 并 在 AFB 孵 箱 中 孵 育 (p) 冷 冻 剩 余 的 沉 淀 物 以 供 反 复 培 养, 涂 片 或 再 次 净 化 处 理 (2) 胃 灌 洗 液 标 本 采 集 后 应 尽 快 加 几 滴 10%NA 2 CO 3, 并 用 PH 试 纸 检 测 直 到 PH 值 呈 中 性 粘 液 样 胃 灌 洗 液 : (a) 每 20-50ml 灌 洗 液 加 入 mgNALC 粉 末 (b) 手 动 混 匀 或 用 试 管 如 痰 液 般 混 匀 (c) 以 1900r.p.m(1800xg) 离 心 30 分 钟 (d) 轻 轻 移 去 上 清 液 并 用 2-5ml 的 无 菌 蒸 馏 水 重 悬 沉 淀 物 (e) 加 入 等 量 的 NALC-NAOH 溶 液, 以 下 操 作 同 于 痰 液 标 本 液 体 胃 灌 洗 液 : (a) 离 心 全 部 标 本 30min (b) 移 去 上 清 夜 并 用 2-5ml 无 菌 蒸 馏 水 重 悬 沉 淀 物 如 果 不 止 用 一 个 容 器 离 心, 应 先 集 中 沉 淀 物 (c) 加 入 等 量 NALC-NAOH 溶 液, 以 下 操 作 同 痰 液 标 本 (3). 组 织 标 本 (a) 加 无 菌 0.85% 盐 水 或 0.2% 牛 血 清 白 蛋 白 溶 液 于 无 菌 玻 璃 研 磨 器 内, 研 碎 组 织 若 组 织 含 有 粘 液 ( 如 肺 组 织 ), 应 加 1 pinch NALC (b) 无 菌 技 术 采 集 的 标 本 可 直 接 接 种 于 固 体 培 养 基 (c) 非 无 菌 技 术 采 集 的 标 本, 研 碎 后 置 于 试 管 内, 以 下 操 作 同 痰 液 标 本 14

15 (4) 其 他 体 液 标 本 粘 液 脓 性 物 : (a) 标 本 量 少 于 等 于 10ml 者 处 理 同 痰 液 (b) 大 于 10ml 者 处 理 同 粘 液 状 胃 灌 洗 液 液 体 标 本 : (a) 无 菌 技 术 采 集 的 标 本, 离 心 后 可 将 沉 淀 物 直 接 接 种 培 养 基 (b) 非 无 菌 技 术 采 集 的 标 本, 若 标 本 量 少 于 等 于 5ml, 处 理 同 痰 液 标 本 ; 标 本 量 大 于 5ml 者, 处 理 同 液 体 胃 灌 洗 液 (5) 尿 液 标 本 (a) 标 本 量 超 过 5cc 者 应 先 离 心, 然 后 去 管 底 5ml 和 沉 淀 物 再 处 理 (b) 沉 淀 物 处 理 同 胃 灌 洗 液, 省 去 标 本 碱 中 和 部 分 接 种, 培 养 基 和 孵 育 遵 循 安 全 步 骤, 将 按 和 处 理 后 的 标 本 做 以 下 操 作 : (1) 每 一 标 本 分 两 份, 一 份 接 种 一 个 Bact/Alert MP 瓶, 一 份 接 种 罗 氏 斜 面 (2) 放 Bact/Alert MP 专 用 培 养 箱 37 孵 育 对 于 怀 疑 由 海 分 枝 和 溃 疡 分 枝 引 发 的 皮 肤 活 检 和 表 皮 感 染, 应 再 种 一 套 放 32 孵 育 (3) 每 周 查 看 并 记 录 一 次 罗 氏 培 养 基 结 果 直 至 8 周, 对 于 Bact/Alert MP 瓶, 前 3 周 每 周 两 次 阅 读 生 长 指 数, 而 后 每 周 一 次 直 到 六 周 培 养 污 染 对 于 轻 微 污 染, 可 继 续 保 留 培 养, 如 罗 氏 管 和 Bact/Alert MP 瓶 同 时 严 重 污 染, 丢 掉, 并 迅 速 报 告 临 床 培 养 污 染, 请 重 送! 鉴 定, 体 外 药 敏 和 培 养 报 告 (1) 罗 氏 管 8 周 未 生 长,Bact/Alert MP 瓶 6 周 未 生 长 即 发 阴 性 报 告 : 8 周 培 养 无 分 枝 杆 菌 生 长 (2)A. 对 于 斜 面 阳 性 的 标 本 : (i) 在 培 养 本 中 记 录 生 长 的 菌 落 数 量 阳 性 级 别 : 3+, 密 集 生 长 2+, 中 度 生 长 1+, 稀 疏 生 长 15

16 (ii) 在 生 物 安 全 柜 中, 取 阳 性 培 养 物 涂 片, 固 定,Z-N 染 色 (iii) 将 罗 氏 斜 面 上 菌 落 转 钟 在 1/4 麦 康 凯 平 板 和 1/4 血 平 板 (iv) 如 果 培 养 显 示 典 型 的 分 枝 杆 菌 形 态, 且 MAC 或 BA 平 板 1 周 未 长,Z-N 抗 酸 染 色 阳 性, 则 报 告 为 : 培 养 : 分 离 到 分 枝 杆 菌 ; 正 在 进 一 步 鉴 定 (ⅴ) 如 一 周 后 MAC 平 板 生 长, 且 证 实 为 抗 酸 杆 菌, 即 报 告 : 培 养 : 分 离 到 分 枝 杆 菌 ; 正 在 进 一 步 鉴 定 (vi) 如 一 周 后 血 平 板 生 长, 染 色 为 抗 酸 杆 菌, 要 进 一 步 鉴 定 诺 卡 菌 红 球 菌 和 其 他 分 枝 杆 菌 并 做 药 敏 B. 对 于 Bact/Alert MP 瓶 培 养 阳 性 者 : (i) (ii) 如 生 长 指 数 >1, 取 瓶 中 1 毫 升 肉 汤 1900r.p.m(1800xg) 离 心 1 分 钟, 取 沉 淀 涂 片 Z-N 染 色 如 为 抗 酸 杆 菌, 即 报 告 培 养 : 分 离 到 分 枝 杆 菌 ; 正 在 进 一 步 鉴 定 (2) 结 核 分 枝 杆 菌 的 鉴 定 和 药 敏 (i) MB/Bact 鉴 定 方 法 : 鉴 定 试 剂 : 硝 基 苯 (PNB) 作 用 : 抑 制 结 核 杆 菌 复 合 群 生 长 接 种 步 骤 : a. 准 备 两 瓶 MB/Bact 培 养 瓶, 用 70% 酒 精 消 毒 瓶 盖 后 自 然 风 干, 加 0.5ml 的 MAS 溶 解 液 到 MB/BacT 处 理 瓶 内 b. 一 瓶 标 识 PNB; 另 一 瓶 标 识 GC(growth control) 在 瓶 子 上 写 上 体 检 编 号 和 病 历 号 c. 加 入 0.5ml 的 PNB 浓 缩 溶 液 到 标 识 PNB 的 MB/BacT 处 理 瓶 内, 让 最 后 浓 度 到 500ug/ml d. 加 0.5ml 已 灭 菌 的 水 到 标 识 GC 的 MB/BacT 处 理 瓶 内 e. 把 阳 性 的 MB/BacT 瓶 子 震 荡 打 散 菌 落, 在 各 取 0.5ml 细 菌 悬 浮 液 分 别 打 到 PNB 和 MB/BacT 处 理 瓶 内 f. 把 以 上 接 种 好 的 MB/BacT 处 理 瓶 放 入 MB/BacT 侦 测 (2) 判 读 标 准 : a. 以 下 的 标 准 我 们 认 为 是 被 PNB 抑 制 (susceptible): GC 处 理 平 呈 阳 性 反 应 而 两 天 后 有 加 PNB 的 处 理 瓶 所 呈 现 Positivity index( 生 长 指 数 ) 小 于 0.4 b. 以 下 的 标 准 我 们 认 为 是 对 PNB 抵 抗 (resistant): GC 处 理 瓶 呈 阳 性 反 应 且 PNB 处 理 瓶 同 时 也 呈 阳 性 反 应 或 Positity index( 生 长 指 数 ) 大 于 0.4, 或 两 天 后 也 呈 阳 性 反 应 (Positity index=1) 16

17 附 表 1: 金 胺 染 色 法 试 剂 : (1) 金 胺 - 石 炭 酸 A 金 胺 -O 0.1g 溶 解 于 90-95% 的 乙 醇 B 石 炭 酸 晶 体 3g 溶 解 于 87ml 的 蒸 馏 水 中 混 和 A 与 B (2) 盐 酸 酒 精 将 0.5ml 盐 酸 溶 解 于 100ml70% 的 乙 醇 (3) 高 锰 酸 钾 高 锰 酸 钾 0.5g 溶 解 于 100ml 的 蒸 馏 水 操 作 步 骤 : 固 定 前 按 下 列 步 骤 操 作 : 1 加 热 固 定 涂 片 2 加 金 胺 - 石 炭 酸 染 色 15 分 钟, 自 来 水 冲 洗 3 用 盐 酸 酒 精 脱 色 4 分 钟, 自 来 水 冲 洗 4 加 高 锰 酸 钾 染 色 30 秒, 自 来 水 冲 洗 5 待 干 镜 检 : 在 250 倍 荧 光 显 微 镜 下 可 查 见 典 型 的 有 微 弱 荧 光 的 杆 菌 17

18 附 表 2: 萋 - 尼 染 色 法 试 剂 : 碱 性 复 红 12g 溶 解 于 42g 石 炭 酸 ( 将 混 合 物 在 沸 水 浴 中 直 到 完 全 溶 解 ) 冷 却 后 加 入 95% 乙 醇 84ml, 用 蒸 馏 水 稀 释 至 1000ml 操 作 步 骤 : 固 定 前 按 下 列 步 骤 操 作 : 1 加 热 固 定 涂 片 2 将 染 色 液 完 全 覆 盖 涂 片 3 于 涂 片 下 方 用 酒 精 灯 缓 慢 加 热 至 出 现 蒸 汽 后 5 分 钟 ( 避 免 煮 沸 或 煮 干 ) 4 用 自 来 水 冲 洗 5 用 盐 酸 酒 精 脱 色 至 几 乎 无 红 色 6 用 自 来 水 冲 洗 7 用 稀 释 的 孔 雀 绿 染 液 复 染 30 秒 8 自 来 水 冲 洗, 晾 干 镜 检 : 在 1000 倍 光 学 显 微 镜 下 可 查 见 典 型 的 细 长 略 带 弯 曲, 有 时 堆 积 成 团 的 杆 菌 18

19 3. 痰 液 细 菌 学 检 查 3.1 目 的 对 来 自 上 呼 吸 道 及 下 呼 吸 道 ( 本 节 第 二 部 分 ) 标 本 中 的 病 原 或 潜 在 病 原 菌 进 行 分 离 鉴 定 和 抗 生 素 敏 感 实 验 第 一 部 分 下 呼 吸 道 感 染 中 的 细 菌 3.2 分 离 的 意 义 下 呼 吸 道 标 本 中 潜 在 病 原 菌 的 存 在 可 表 明 有 来 自 上 呼 吸 道 的 污 染 以 下 几 点 将 有 助 于 解 释 : a) 标 本 收 集 方 法 : 如 吐 出 的 痰 液 通 常 都 会 被 上 呼 吸 道 的 微 生 物 污 染 b) 化 脓 性 感 染 的 证 据 : 如 标 本 中 大 量 分 裂 的 中 性 粒 细 胞 表 明 存 在 感 染, 但 对 于 中 性 粒 细 胞 缺 乏 的 患 者 该 现 象 就 不 存 在 c) 病 人 的 临 床 状 况 : 病 人 处 于 亚 临 床 状 态 插 管 机 械 供 氧 免 疫 力 低 下 3.3 下 呼 吸 道 病 原 菌 一 般 病 原 菌 (1) 肺 炎 链 球 菌 (2) 流 感 嗜 血 杆 菌 (3) 卡 它 布 兰 汉 球 菌 潜 在 病 原 菌 当 其 大 量 存 在 或 优 势 性 生 长 时 (1) 铜 绿 假 单 胞 杆 菌 和 其 它 假 单 胞 菌 (2) 克 雷 伯 菌 属, 其 它 肠 菌 (3) 金 黄 色 葡 萄 球 菌 (4) 念 珠 菌 属 (5) 巴 斯 德 菌 属 (6) 化 脓 性 链 球 菌 (A 群 链 球 菌 ) 和 β- 溶 血 性 链 球 菌 在 兰 斯 非 尔 德 分 类 中 的 C 群 和 G 群 或 新 生 儿 的 B 群 (7) 嗜 血 杆 菌 属 (8) 脑 膜 炎 奈 瑟 菌 (9) 除 了 以 上 微 生 物, 其 它 微 生 物 由 于 某 些 原 因 也 可 能 会 明 显 存 在 如 有 怀 疑, 请 咨 询 当 值 微 生 物 学 家 研 究 病 原 菌 的 特 殊 方 式 ( 见 下 3.8 节 ) (1) 肺 炎 军 团 菌 或 其 它 军 团 菌 属 (2) 肺 炎 支 原 体 (3) 卡 氏 肺 囊 虫 病 (4) 诺 卡 菌 属 / 红 球 菌 属 (5) 真 菌 (6) 分 支 杆 菌 属, 包 括 结 核 分 支 杆 菌, 见 手 册 第 1 部 分 (7) 寄 生 虫 3.4 下 呼 吸 道 标 本 标 本 类 型 19

20 (1) 痰 液 (SPT) / 气 管 吸 出 液 (TA) (2) 纤 支 镜 标 本 包 括 支 气 管 吸 出 液 (BAsp), 支 气 管 肺 泡 洗 液 (BAL) 和 支 气 管 刷 液 (3) 气 管 内 管 (ETT) (4) 鼻 咽 部 吸 出 液 痰 / 气 管 吸 出 液 : 显 微 镜 检 以 裸 眼 观 察 标 本, 报 告 其 是 否 : (1) 唾 液 ( 清 亮 起 泡 沫 和 水 样 )[ 拒 收 : 见 下 ] (2) 粘 液 样 ( 清 亮 且 有 粘 性 ) (3) 粘 液 脓 性 (4) 化 脓 性 ( 不 透 明 的 黄 色 或 绿 色 ) (5) 带 血 的 痰 液 / 气 管 吸 出 液 : 标 本 的 准 备 和 检 查 对 痰 标 本 的 操 作 必 须 在 一 个 防 护 安 全 的 操 作 台 上 进 行 痰 : 显 微 镜 检 取 样 本 中 化 脓 的 部 分, 准 备 一 张 涂 片, 革 兰 染 色 后 检 查 白 细 胞 上 皮 细 胞 和 微 生 物 (1) 每 低 倍 视 野 (LPF) 下 的 白 细 胞 和 上 皮 细 胞 数 量 [LPF 为 100 倍 放 大 率 ] > 大 量 中 量 <10 + 少 量 无 -- 无 白 细 胞 或 无 上 皮 细 胞 (2) 报 告 存 在 的 微 生 物 的 形 态 类 型, 包 括 酵 母 菌 / 真 菌 (3) 除 非 标 本 有 化 脓 或 带 血, 否 则 不 要 将 每 低 倍 视 野 小 于 10 个 上 皮 细 胞 的 标 本 用 于 培 养 另 对 任 何 标 本 而 言, 过 多 的 上 皮 细 胞 都 不 可 用 于 培 养, 以 206 号 评 语 在 标 本 接 受 当 日 发 出 报 告 标 本 每 低 倍 视 野 (100 倍 ) 大 于 10 个 上 皮 细 胞, 可 能 是 唾 液, 如 有 临 床 指 征, 请 复 查 痰 : 以 溶 痰 素 混 匀 (1) 每 个 工 作 日, 准 备 一 瓶 新 鲜 的 溶 痰 素 溶 液, 将 1 瓶 溶 痰 素 浓 缩 液 (100ml) 加 入 90ml 无 菌 蒸 馏 水 中 混 匀 (2) 以 无 菌 吸 管 将 痰 标 本 中 的 唾 液 吸 出, 弃 入 盛 有 5% 来 苏 尔 液 的 广 口 废 液 瓶 (3) 剩 余 的 痰 中 加 入 等 体 积 的 溶 痰 素 液, 盖 紧, 在 安 全 的 操 作 台 上 旋 涡 混 匀 (4) 混 合 物 静 置 15 分 钟 后, 再 次 旋 涡 混 匀, 以 该 混 合 物 作 为 培 养 的 接 种 物 培 养 介 质 和 孵 育 条 件 A 常 规 培 养 在 混 匀 后, 样 本 的 接 种 使 用 1ul 的 标 准 环, 接 种 于 : (1) 血 琼 脂 (BA BA) 平 板 (2) 巧 克 力 血 琼 脂 (CBA) 平 板 分 别 在 BA 和 CBA 平 板 的 接 种 线 上 家 一 个 Optochin 圆 纸 片 (5ug) 和 一 个 杆 菌 肽 圆 纸 片 (10 单 位 )[ 在 Jan 上 修 正 ] 两 种 平 板 均 在 5%CO2,37 环 境 中 孵 育 18 到 24 小 时 B 菌 类 研 究 如 有 必 要, 接 种 两 个 Sabourand s 琼 脂 斜 面 [ 一 个 含 有 50 mg/l 氯 霉 素 及 25ug/ml 的 庆 大 霉 素, 另 一 个 不 含 ], 并 将 两 个 斜 面 置 于 30 孵 育 14 天, 参 见 手 册 中 的 真 菌 培 养 基 部 分 20

21 痰 : 培 养 基 的 检 查 和 鉴 别 经 过 一 夜 的 孵 育 后, 检 查 BA 和 CBA 平 板, 区 别 一 般 的 或 潜 在 的 病 原 菌 如 有 以 下 情 况, 请 再 孵 育 24 小 时 : (a) 过 夜 孵 育 后 无 菌 生 长 (b) 在 革 兰 染 色 涂 片 下 见 到 的 主 要 形 态 类 型 未 被 分 离 参 见 报 告 部 分 第 11 页 3.5 除 痰 以 外 的 下 呼 吸 道 标 本 气 管 内 标 本 : 处 理 以 小 量 体 积 溶 痰 素 液 洗 出 内 容 物 并 将 之 分 别 接 种 于 BA CBA 平 板 各 一 个 支 气 管 吸 出 液, 洗 液, 刷 液 : 准 备 这 些 样 本 都 以 侵 袭 性 的 操 作 获 得 在 操 作 前, 请 与 微 生 物 学 家 讨 论 当 样 本 体 积 大 于 2ml 时, 应 在 3000*g 离 心 10 分 钟, 弃 去 上 清 夜, 以 最 小 体 积 的 溶 痰 素 复 溶 沉 淀 物 如 样 本 体 积 较 少, 可 以 用 溶 痰 素 直 接 处 理 显 微 镜 检 : 革 兰 染 色 的 涂 片 记 录 每 低 倍 视 野 (*100 倍 ) 下 的 白 细 胞 数 量 > 大 量 中 量 <10 + 少 量 无 -- 无 白 细 胞 培 养 基 用 于 常 规 研 究, 用 1ul 标 准 环 接 种 于 BA CBA 平 板, 于 37 孵 育 如 果 AFB 实 验 室 还 不 曾 肯 定 标 本 中 的 样 本, 请 将 沉 淀 物 寄 到 AFB 研 究 免 疫 低 下 /SLE 病 人 标 本, 或 微 生 物 学 家 认 为 有 特 殊 要 求 的 标 本, 除 了 做 常 规 培 养 和 AFB 研 究 以 外, 还 应 做 卡 氏 肺 囊 虫 病, 军 团 菌 属, 支 原 体 和 真 菌 检 查 3.6 所 有 的 下 呼 吸 道 (LRT) 标 本 : 区 别 一 般 / 潜 在 病 原 菌 的 关 键 性 实 验 (1) 肺 炎 链 球 菌 Optochin susceptibility 胆 汁 溶 解 该 微 生 物 可 以 产 生 粘 液 性 菌 落, 该 形 式 与 严 重 的 疾 病 有 关 (2) 嗜 血 杆 菌 属 Ⅹ 和 Ⅴ 因 子 ; 噗 啉 实 验 ( 见 附 录 A) (3) 卡 它 莫 拉 菌 属 氧 化 酶, 硝 酸 盐 还 原 奈 瑟 菌 属 快 速 NH,DNA 酶 (4)β- 溶 血 性 链 球 菌 抗 生 素 敏 感 实 验 分 类 ( 乳 胶, 兰 斯 非 尔 德 ) 如 果 抗 生 素 耐 药, 分 为 A 群, 以 API 链 球 菌 证 实 (5) 金 黄 色 葡 萄 球 菌 凝 固 酶 ( 试 管 法 ) (6) 肠 杆 菌 科 MB12E/API 仅 克 雷 伯 菌 属 的 粘 液 形 式 与 严 重 的 感 染 有 关, 包 括 Friedländer s 肺 炎 (7) 假 单 胞 菌 种 和 氧 化 酶,O/F, 运 动 性 不 动 杆 菌 属 API20NE 患 有 支 气 管 扩 张 或 胆 囊 纤 维 化 的 病 人 常 带 有 粘 液 性 铜 绿 假 单 胞 杆 菌 感 染 开 始 常 生 长 缓 慢, 经 24 小 时 孵 育 后 菌 落 与 流 感 嗜 血 菌 相 似 注 :Burkolderia ( 以 前 称 为 假 单 胞 菌 )Pseudomallei 可 在 越 南 病 人 或 东 南 亚 病 人 身 上 找 到 21

22 皱 纹 形 菌 落 形 式 氧 化 酶, 运 动 性,API20NE 在 处 理 该 微 生 物 时 应 使 用 生 物 安 全 性 操 作 台 (8) 巴 斯 德 菌 属 氧 化 酶 ( W+), 粘 液 性 不 在 MAC 上 生 长,API (9) 念 珠 菌 属 germ 管 3.7 所 有 下 呼 吸 道 标 本 : 敏 感 性 实 验 请 参 见 17 部 分, 抗 生 素 板 敏 感 性 实 验 对 嗜 血 杆 菌 属, 应 于 厌 氧 环 境 中 接 种 所 有 易 感 性 实 验 板 建 立 易 感 性 实 验 必 须 有 对 照 微 生 物, 并 每 天 记 录 抑 菌 区 直 径 3.8 下 呼 吸 道 标 本 : 特 殊 研 究 军 团 菌 种 的 培 养 基 进 行 该 实 验 通 常 是 应 临 床 医 生 或 微 生 物 学 家 的 要 求 所 有 对 培 养 基 或 标 本 的 操 作 均 在 安 全 操 作 台 上 进 行 (1) 以 溶 痰 素 处 理 痰 液 ( 见 3.3) (2) 将 1 份 带 血 标 本 与 9 份 HCL-KCL 缓 冲 液 ( 见 注 解 ) 在 一 般 容 器 中 混 匀 (3) 将 混 合 物 静 置 7 分 钟, 中 间 摇 晃 一 次 (4) 将 其 于 2500rpm 离 心 20 分 钟 (5) 将 沉 淀 物 接 种 于 BCYE( 选 择 性 和 非 选 择 性,Oxoid) 37,5%CO2 孵 育 10 天 注 :HCL-KCL 缓 冲 液 M HCL 3.9ml M KCL 25ml 3. 混 合 并 以 1M KOH 调 整 ph 值 到 军 团 菌 的 培 养 基 检 查 和 鉴 别 在 所 有 平 板 孵 育 过 夜 后, 第 5 天, 第 10 天 检 查 a. 找 寻 圆 形, 完 整, 微 凸, 发 亮, 光 滑 的 菌 落 b. 选 择 可 疑 菌 落, 接 种 到 : (i) 血 琼 脂 平 板 (BA) (ii)bcye 平 板 c. 如 果 BA 上 有 生 长, 则 该 菌 落 并 非 军 团 菌 种 d. 如 果 只 在 BCYE 上 生 长, 做 一 个 涂 片, 并 于 革 兰 染 色 后 用 0.1% 碱 性 品 红 复 染 如 果 发 现 长 而 尖 细 的 多 形 性 革 兰 阴 性 小 杆 菌, 则 可 立 即 报 告 致 病 微 生 物 e. 用 免 疫 荧 光 法 进 行 鉴 别 要 使 用 FITC- 标 记 的 特 异 性 抗 血 清, 以 区 别 军 团 菌 不 同 的 血 清 型 f. 培 养 基 的 皂 化 过 程 要 用 到 气 象 色 谱 / 分 光 光 谱 分 析, 它 可 以 对 脂 肪 酸 支 链 上 所 结 合 的 基 团 做 一 个 指 纹 肺 炎 支 原 体 标 本 处 理 对 拭 子 而 言, 并 无 特 殊 的 运 送 条 件, 但 一 般 的 下 呼 吸 道 标 本 都 可 用 于 检 查 注 : 支 原 体 可 在 -70 保 存, 但 却 不 耐 干 (1) 在 接 种 到 支 原 体 琼 脂 板 (Oxoid) 前 按 重 量 1:10,1:100 稀 释 样 本 ( 减 少 抑 制 物 的 影 响 ) 两 种 稀 释 物 均 同 样 保 存 并 孵 育 生 长 媒 介 :Oxoid 支 原 体 琼 脂 增 加 G (M 琼 脂 ) 22

23 Oxoid 支 原 体 肉 汤 增 加 G (M 肉 汤 ) (2) 平 板 及 两 种 稀 释 液 均 于 需 氧 环 境 37 孵 育 21 天 在 第 2,5,10,14 和 21 天 检 查 注 : 在 口 腔 中 的 其 它 支 原 体 ( 唾 液 支 原 体, M.orale,M.buccale, M.faucium) 生 长 得 更 需 厌 氧, 并 且 是 Arinine dihydrolase (+), 葡 萄 糖 (--); 而 肺 炎 支 原 体 是 Arinine dihydrolase (--), 葡 萄 糖 (+) (3) 在 平 板 显 微 镜 下 检 查 M. 琼 脂 平 板 是 为 了 观 察 中 心 嵌 入 琼 脂 的 菌 落 的 油 煎 蛋 或 桑 葚 样 外 形 在 M. 肉 汤 中 的 生 长, 为 轻 雾 状, 而 不 同 于 浑 浊, 苯 酚 红 指 示 剂 变 为 黄 色 是 因 为 葡 萄 糖 的 发 酵 (4) 血 红 素 吸 附 实 验 (i) 本 实 验 要 求 M 琼 脂 上 分 离 菌 落 : 如 有 必 要 做 次 培 养 (ii) 用 0.3% 以 上 生 理 盐 水 洗 过 的 人 O 型 红 细 胞 浸 漫 平 板 (iii) 于 37 孵 育 分 钟 (iv) 倒 出 红 细 胞 悬 液, 以 生 理 盐 水 轻 轻 洗 涤 琼 脂 表 面, 仅 一 次 (v) 在 显 微 镜 下 检 查 血 红 素 吸 附 和 玫 瑰 花 结 形 状 (5) 溶 血 实 验 (i) 实 验 要 求 在 M 琼 脂 平 板 上 分 离 菌 落 (ii) 在 菌 落 上 倒 一 薄 层 盐 琼 脂 (1% 琼 脂 含 有 ph 的 磷 酸 盐 缓 冲 液 和 5% 人 O 型 红 细 胞 ), 并 使 之 固 定 (iii) 在 需 氧 环 境 下,37 孵 育 平 板 过 夜 (iv) 显 微 镜 下 检 查 菌 落 周 围 的 溶 血 (6) 对 琼 脂 上 生 长 的 支 原 体 做 次 培 养 : 切 下 一 小 块 含 菌 落 较 多 的 M 琼 脂, 将 之 倒 置 在 平 板 表 面 上 接 种, 轻 轻 移 动 这 块 琼 脂, 以 接 种 更 宽 的 区 域 ; 要 想 做 M 肉 汤 的 次 培 养, 可 切 一 块 琼 脂 放 入 液 体 中 (7) 支 原 体 培 养 基 的 保 存 : 在 M 肉 汤 中 生 长, 于 -70 保 持 卡 氏 肺 囊 虫 病 样 本 处 理 (1) 加 入 同 体 积 溶 痰 素 旋 涡 混 匀 标 本 ; 在 37 至 少 孵 育 30 分 钟 (2) 1500rpm 离 心 5 分 钟, 弃 去 上 层, 以 10-15ml 溶 痰 素 复 溶 沉 淀 物 (3) 重 复 一 次 混 匀 及 离 心 (4) 以 2ml 生 理 盐 水 或 溶 痰 素 复 溶 沉 淀 物 (5) 以 沉 淀 做 3 Cytospin 涂 片, 热 固 定 (6) 第 一 步 只 染 一 张 涂 片, 留 2 张 用 于 重 染 或 其 它 染 色 操 作 试 剂 A. 硫 酸 盐 试 剂 (1) 将 一 个 干 净 的 Coplin 广 口 瓶 置 入 一 个 盛 有 冷 自 来 水 ( 不 低 于 10 ) 的 盆 中 (2) 加 45ml 冰 醋 酸 进 Coplin 广 口 瓶 (3) 以 玻 璃 移 液 管 缓 慢 加 入 15ml 浓 硫 酸 : 避 免 溅 出 (4) 轻 轻 以 玻 棒 混 匀 (5) 室 温 储 存, 稳 定 1 星 期 B 甲 苯 胺 蓝 O 染 色 (1) 在 60ml 蒸 馏 水 中 溶 解 0.26g 甲 苯 胺 蓝 O( 染 料 含 量 85%) 23

24 (2) 加 入 2ml 浓 HCL (3) 加 入 140ml 无 水 乙 醇 (4) 室 温 储 存, 稳 定 1 年 染 色 过 程 修 改 的 甲 苯 胺 蓝 O 染 色 (Gossey et al. J.Clin.Microbiol1985;22:803) (1) 以 玻 棒 立 即 混 匀 硫 酸 盐 试 剂 ( 在 加 玻 片 前 ) (2) 将 玻 片 放 入 硫 酸 盐 试 剂 浸 10 分 钟 (3) 以 冷 自 来 水 轻 洗 玻 片 10 分 钟, 滴 干 剩 余 水 (4) 将 玻 片 放 入 甲 苯 胺 蓝 染 液 浸 5 分 钟 (5) 将 玻 片 先 后 浸 入 并 拿 出 75%,95% 乙 醇, 每 浸 一 次 约 10 秒 (6) 将 玻 片 浸 入 并 拿 出 无 水 乙 醇 (7) 将 玻 片 浸 入 并 拿 出 二 甲 苯 约 10 秒 钟, 直 到 洗 净 (8) 放 于 DPV 架 中 间 晾 干 (9) 阳 性 对 照 片 ( 放 于 痰 工 作 台 上 ) 必 须 与 病 人 标 本 一 起 染 色 并 检 查 (10) 所 有 标 本 片 都 陪 独 立 检 查, 而 阳 性 片 应 指 出 致 病 菌 (11) 与 当 值 微 生 物 学 家 讨 论 并 报 告 诺 卡 菌 属 / 红 球 菌 属 在 镜 下 直 接 见 到 革 兰 阳 性 或 多 变 的 丝 状 分 枝 形 态 可 以 怀 疑 其 存 在 培 养 基 : 溶 痰 素 处 理 能 得 到 满 意 结 果, 不 论 细 菌 学 的 介 质 ( 如 BA) 或 真 菌 学 的 介 质 ( 如 萨 布 罗 右 旋 糖 琼 脂 ) 都 可 使 用 为 了 选 择 药 剂, 庆 大 霉 素 和 氯 霉 素 通 常 都 有 耐 药 性 30 需 氧 孵 育 是 最 佳 的, 应 持 续 10 天 ( 要 鉴 定, 见 ASM 临 床 微 生 物 手 册 ) 曲 霉 菌 在 显 微 镜 下 可 以 看 见 其 菌 丝 分 隔, 并 分 为 两 支 在 霉 菌 介 质 上, 其 生 长 迅 速 ( 见 B), 参 见 真 菌 培 养 基 鉴 定 工 作 台 标 本 的 寄 生 虫 检 查 准 备 一 个 湿 载 玻 片, 并 以 显 微 镜 检 查 3.9 下 呼 吸 道 标 本 : 报 告 (1) 对 任 何 纤 支 镜 标 本 (BAL,Basp,brushing ) 必 须 通 知 病 房 其 革 兰 染 色 结 果 : 在 标 本 接 收 当 日 出 结 果 (2) 记 录 那 些 不 能 用 于 培 养 的 不 合 格 痰 标 本 ( 见 和 3.5.3), 这 些 也 可 在 一 天 内 报 告, 因 为 加 入 了 第 206 号 评 语, 要 求 重 去 样 本 (3) 记 录 一 般 病 原 菌 及 其 敏 感 性 实 验 (4) 对 于 潜 在 病 原 菌, 仅 在 其 大 量 存 在 或 优 势 生 长 或 口 部 共 生 物 不 存 在 时 才 予 以 记 录 不 用 报 告 敏 感 性 实 验 结 果, 但 应 在 报 告 时 加 上 231 代 码, 如 分 离 出 需 氧 革 兰 阴 性 杆 菌, 还 应 再 加 上 第 232 号 代 码 如 治 疗 已 证 实, 请 与 微 生 物 学 家 讨 论 * 例 外 从 ITU 和 6AB 病 房 分 离 的 均 应 报 告 ST (5) 对 于 正 常 菌 群 失 调 或 有 以 下 临 床 表 现 的 病 人, 所 有 的 一 班 潜 在 病 原 菌, 即 使 仅 少 量 存 在, 都 应 报 告 : (a) 白 血 病 (b) 皮 质 类 固 醇 或 细 胞 毒 素 治 疗 期 (c) 胆 囊 纤 维 化 ( 在 香 港 少 见 ) 24

25 (d) 骨 髓 移 植 病 人 (6) 当 菌 分 离 后, 报 告 口 腔 共 生 物 应 报 告 的 微 生 物 不 论 何 时, 只 要 存 在 就 应 报 告 的 : (1) 所 有 的 丝 状 真 菌 ( 于 95 年 修 正 ) (2) β 溶 血 性 链 球 菌 (A 群 ) (3) 肺 炎 链 球 菌 (4) 流 感 嗜 血 杆 菌 当 大 量 存 在 或 优 势 生 长 时 报 告 (1) β 溶 血 性 链 球 菌 ( 除 A 群 外 ) (2) 念 珠 菌 (3) 需 氧 革 兰 阴 性 杆 菌 (4) 副 流 感 嗜 血 杆 菌 或 嗜 血 杆 菌 属 (5) 巴 斯 德 菌 属 ( 与 大 肠 杆 菌 相 似 且 通 常 是 粘 液 样 的 ) (6) 铜 绿 假 单 胞 杆 菌 (7) 金 黄 色 葡 萄 球 菌 (8) 记 住, 其 它 的 微 生 物 偶 尔 也 会 很 明 显, 当 你 不 确 定 时, 请 咨 询 微 生 物 学 家 * 对 于 有 以 下 临 床 表 现 的 病 人, 上 面 的 微 生 物 即 使 仅 少 量 存 在 也 应 予 以 报 告 : (a) 白 血 病 (b) 类 固 醇 或 细 胞 毒 素 治 疗 (c) 胆 囊 纤 维 化 ( 香 港 少 见 ) (d) 骨 髓 移 植 痰 标 本 中 的 共 生 菌 群 主 要 包 括 : (1) α 和 非 溶 血 性 链 球 菌 (2) 奈 瑟 菌 属 (3) 类 白 喉 菌 初 步 报 告 除 非 因 为 继 续 研 究, 否 则 报 告 不 应 被 拖 延 那 些 要 进 一 步 研 究 的, 应 在 常 规 研 究 完 成 后 立 即 发 出 初 步 报 告 单, 指 出 哪 些 工 作 还 未 完 成, 如 : 对 不 常 见 的 微 生 物 的 鉴 定 还 待 定 3.10 第 二 部 分 上 呼 吸 道 样 本 (URTI) 检 查 上 呼 吸 道 样 本 时, 下 面 几 点 需 注 意 : A. 大 多 数 咽 炎 都 有 一 个 滤 过 性 病 因 学, 并 且 目 前 细 菌 性 咽 炎 已 不 常 见, 但 化 脓 性 链 球 菌 依 然 是 主 要 寻 找 的 病 原 菌 B. 白 喉 和 百 日 咳 因 为 社 区 内 的 免 疫 预 防 针 广 泛 使 用 一 少 件, 但 对 于 分 离 和 鉴 定 这 些 病 原 菌 的 实 验 室 程 序 仍 应 备 用 并 注 意 C. 淋 病 奈 瑟 菌 可 从 个 别 人 的 喉 拭 子 中 检 出, 这 些 病 人 有 以 下 危 险 : 感 染 可 引 起 咽 炎, 或 无 症 状 D. 当 临 床 诊 断 指 出 有 溃 疡 性 损 伤 或 怀 疑 有 放 线 菌 病 时, 其 喉 部 嘴 口 腔 或 牙 龈 的 拭 子 均 应 按 深 部 伤 口 拭 子 的 方 式 处 理 ( 见 11.2 部 分 ) 标 本 类 型 (1) 喉 拭 子 (TS) [= 咽 拭 子 ] (2) 口 腔 拭 子 (OS) 25

26 (3) 嘴 拭 子 (MS) (4) 牙 龈 拭 子 (GS) (5) 舌 拭 子 (TONS) (6) 鼻 拭 子 (NS) (7) 鼻 咽 部 拭 子 (NPS) (8) 经 鼻 的 拭 子 (PNS) 一 般 病 原 菌 (1) 化 脓 性 链 球 菌 =β - 溶 血 性 链 球 菌 A 群 (2) β- 溶 血 性 链 球 菌 或 C 群 和 D 群 潜 在 病 原 菌 (1) 嗜 血 菌 属 (2) 肺 炎 链 球 菌 (3) 金 黄 色 葡 萄 球 菌 (4) 铜 绿 假 单 胞 菌 属 (5) 肠 杆 菌 属 (6) 厌 氧 菌 包 括 放 线 菌 (7) 白 色 念 珠 菌 (8) 溶 血 性 秘 菌 属 (9) 扁 桃 体 炎 中 的 mileri 链 球 菌 属 ( 扁 桃 体 周 的 脓 肿. 溃 疡 ) 少 见 但 却 重 要 的 病 原 菌 (1) 白 喉 棒 状 杆 菌 (2) 白 日 咳 棒 状 杆 菌, 副 百 日 咳 棒 状 杆 菌 (3) 脑 膜 炎 奈 瑟 菌 (4) 淋 菌 奈 瑟 菌 上 呼 道 标 本 : 常 规 研 究 和 报 告 显 微 镜 检 a. 对 TS.NS.NPS.PNS 不 用 显 微 镜 检 b. 对 OS.MS.GS.TONS, 须 行 革 兰 氏 染 色 ; 且 任 何 酵 母 菌 或 mycelia 的 存 在 都 在 报 告 c. 对 于 怀 凝 患 有 文 森 特 氏 咽 峡 炎 的 病 人, 其 革 兰 染 色 后 的 涂 片 应 以 稀 释 石 炭 酸 品 红 液 复 染 2 分 钟 以 用 于 寻 找 大 量 的 革 兰 阴 性 梭 状 杆 菌,vincentil 博 代 杆 菌 ( 螺 旋 体 ) 和 脓 细 胞, 当 临 床 诊 断 指 示 在 溃 疡 性 损 伤 存 在 或 怀 疑 患 有 放 线 菌 病 时, 应 对 TS.MS.OS. 或 GS 标 本 片. 革 兰 染 色 并 检 查 上 呼 吸 道 标 本 的 培 养 基 (1) 将 TS.NS.NPS 接 种 于 BA, 于 5%CO 2, 37 孵 育 小 时 (2) 将 OS.MS.GS 和 TONS 接 种 于 BA 和 萨 布 罗 琼 脂 (SAB), 于 5%CO 2,37 孵 育,BA 孵 小 时,SAB 孵 48 小 时 (3) 如 临 床 诊 断 证 实 有 溃 疡 损 伤 存 在 或 怀 疑 患 有 放 线 菌 病 时, 应 将 TS.MS.OS 或 GS 附 加 接 种 于 K1 平 板 厌 氧 菌 孵 育 ( 见 手 册 中 厌 氧 菌 部 分 ) 培 养 基 的 检 查 和 微 生 物 的 鉴 定 参 见 的 鉴 别 方 法 和 的 敏 感 性 试 验 (1) 孵 育 48 小 时 后, 在 SAB 平 板 上 检 查 念 球 菌 属, 进 行 Germ 试 管 试 验 (2) 孵 育 48 小 时 后, 检 查 K1 平 板 对 怀 疑 为 需 氧 型 的 菌 落 作 次 培 养, 而 厌 的 26

27 要 以 厌 氧 条 件 以 证 明, 以 AN-IDENT 和 GLU 鉴 别 对 于 怀 疑 患 有 放 线 菌 病 的, 孵 育 K1 平 板 到 10 天 ( 见 部 分 ) 报 告 (1) 以 ST 报 告 一 般 病 原 菌 ( ) (2) 仅 当 潜 在 病 原 菌 大 量 存 在 或 伏 势 性 生 长, 正 常 口 腔 共 生 物 消 失 时 才 进 行 报 告 不 要 报 告 ST, 但 要 报 告 评 洛 第 231 号 : 如 果 治 疗 证 实, 请 与 微 生 物 学 家 讨 论 * 例 外 : 对 所 有 从 ITU 和 6AB 病 房 分 离 的 者 报 告 ST (3) 对 新 生 儿 而 言,TS 和 NS 培 养 基 上 都 可 以 生 长 B 群 链 球 菌, 肠 球 菌 属 或 其 它 在 生 产 时 获 得 的 微 生 物, 如 果 分 离 菌 群 的 显 著 性 不 能 确 定, 请 咨 询 当 值 的 微 生 物 学 家 特 殊 研 究 和 报 告 程 序 这 些 研 究 通 常 在 与 当 值 微 生 物 学 家 对 讨 论 后 进 行, 这 将 有 助 于 其 鉴 定 过 程 所 有 对 标 本 或 培 养 基 的 操 作 都 应 在 安 全 的 操 作 台 上 进 行 白 喉 棒 状 杆 菌 (1) 接 种 TS( 如 有 NS 也 接 种 在 下 例 : (a) 血 琼 脂 (BA) (b) 吕 弗 勒 氏 血 清 斜 面 (c) Hoyles 介 质 (d) Tinsdale 琼 脂 5%CO2,37C 孵 育 过 夜, 如 无 期 望 的 菌 落 发 现, 再 孵 育 24 小 时 (2) 从 Loffer s 血 清 斜 面 上 取 材 涂 片,Albert S 染 色 ( 附 录 D), 如 找 到 具 有 异 性 颗 粒 的 多 形 性 小 杆 证 明 白 喉 杆 菌 的 存 在 (3) 检 查 平 板 的 : (a) 灰 色 菌 落,+/- 溶 血 在 BA 板 上 (b) 在 Hoyle1 s 介 质 检 验 黑 色 / 棕 色 菌 落 (c) 在 Tinsdale 琼 脂 上 检 查 周 边 有 灰 色 棕 色 铅 线 的 菌 落 (4) 如 果 在 Loeffer s 斜 面 上 怀 疑 有 白 喉 棒 状 杆 菌 存 在, 而 在 其 它 介 质 中 并 无 证 据, 先 择 性 的 营 养 肉 汤, 加 入 血 液 / 铜 / 亚 碲 酸 盐 (BCT) 也 同 样 用 作 指 示 从 Loeffer s 斜 面 取 材 接 种 BCT 肉 汤, 孵 4-6 小 时, 然 后 在 BA.Hoyle s 和 tinsdale 介 质 作 次 培 养 (5) 可 疑 微 生 物 可 以 采 用 API Coryne 和 用 Elek 平 板 的 产 毒 试 验 ( 附 录 B) (6) 敏 感 性 试 验 : 参 见 抗 生 素 试 验 和 手 册 中 的 报 告 方 法 百 日 咳 博 代 杆 菌, 副 百 日 咳 博 代 杆 菌 当 您 细 考 虑 后, 对 百 日 咳 博 代 杆 菌 的 检 测 就 着 于 进 行 了 (1) 排 米 地 亚 试 验 准 备 了 新 鲜 的 Bordet-Gengon(BG) 平 板 和 运 输 用 的 炭 介 质 (2) 同 时 安 排 取 一 个 经 鼻 拭 子 (PNS) 并 在 特 殊 的 运 输 介 质 中 运 送 或 者 将 新 鲜 平 板 送 至 病 房 直 接 接 种 鼻 拭 子 (3) PNS 必 须 在 送 到 实 验 室 后 立 即 接 种 BG 平 板 并 于 5%CO 2,37, 潮 湿 容 器 中 孵 育 (4) 将 PNS 放 回 炭 琼 脂 运 送 介 质, 并 同 上 孵 育 (5) 48 小 时 后 检 查 BG 平 板 上 的 珍 珠 菌 落, 如 为 阴 性, 每 天 复 查 一 次, 直 至 孵 满 5 天 并 从 运 输 介 质 取 材, 在 BG 上 做 次 培 养, 如 (3) 孵 育 (6) 可 疑 菌 的 鉴 别 27

28 球 菌 (a) 革 兰 染 色 : 革 兰 阴 性 球 菌 (b) 氧 化 酶 实 验 (+) 百 日 咳 博 代 杆 菌 (--) 副 百 日 咳 博 代 杆 菌 (c) 特 异 性 抗 血 清 凝 聚 实 验 脑 膜 炎 奈 瑟 菌 淋 病 奈 瑟 菌 如 果 要 求 对 致 病 的 奈 瑟 菌 属 做 TS 培 养,NYC 介 质 应 使 用 以 抑 制 α- 溶 血 性 链 在 接 种 PNS 的 CBA 平 板 上, 可 以 再 次 发 现 脑 膜 炎 奈 瑟 菌 血 红 素 生 物 合 成 的 基 本 过 程 : 6- 氨 基 乙 酰 丙 酸 噗 啉 实 验 ] 胆 色 素 原 噗 啉 原 噗 啉 Ⅸ 血 红 素 底 物 2mM 6- 氨 基 乙 酰 丙 酸 HCL 0.8mM 硫 酸 镁 in 0.1mM 磷 酸 盐 缓 冲 液 ph6.9 实 验 将 一 环 细 菌 溶 于 底 物 中, 孵 4 小 时, 判 读 在 Wood s 光 ( 大 约 波 长 360nm) 时, 有 红 色 荧 光 产 生 或 加 入 等 体 积 Kovac s 试 剂, 摇 匀 在 下 层 水 相 中 的 红 色 = 胆 红 素 原 存 在 = 不 依 赖 Ⅹ 因 子 在 上 层 相 的 红 色 = 吲 哚 阳 性 针 对 白 喉 棒 状 杆 菌 的 产 毒 素 实 验 (Elek Elek) (1) 在 Loeffler s 斜 面 上 接 种 阴 性 和 阴 性 对 照 菌 株 (2) 从 米 地 亚 实 验 室 取 得 Elek 平 板 和 一 张 以 抗 毒 素 饱 和 的 纸 条 28

29 (Whatman 第 3 号 纸, 1*6cm, 每 毫 升 白 喉 抗 毒 素 浸 泡 了 IU) (3) 以 菌 环 取 样 并 垂 直 于 饱 和 的 纸 条 在 平 板 中 部 划 一 条 直 线, 同 样 接 种 阳 性 和 阴 性 对 照 ( 如 图 ) (4) 需 氧,37 孵 育 (5) 分 别 于 24,48,72 小 时 观 察 沉 淀 线 白 喉 棒 状 杆 菌 异 嗜 性 颗 粒 的 Albert 染 色 浅 绿 色 (Albert-Laybourn 方 法 ) 试 剂 Albert s 染 液 甲 苯 胺 兰 1.5g 孔 雀 绿 2.0g 冰 醋 酸 10ml 95% 乙 醇 20ml 加 蒸 馏 水 至 1000ml 在 乙 醇 中 溶 解 染 料, 加 水 和 乙 酸 稳 定 ( 静 置 )1 天 后, 过 滤 过 程 Albert s 染 液 3-5 分 钟 水 洗 Lugol s 碘 1 分 钟 水 洗 晾 干 异 嗜 性 ( 嗜 多 色 性 ) 颗 粒 被 染 成 青 黑 色, 胞 质 为 绿 色, 其 它 细 胞 器 为 29

30 4. 尿 细 菌 学 检 查 4.1 概 述 标 本 类 型 (1) 清 洁 中 段 尿 (MSU) (2) 袋 装 尿 (BU) (3) 尿 插 管 采 集 尿 (CSU) (4) 耻 骨 上 部 膀 胱 穿 刺 尿 (SPU) (5) 输 尿 管 尿 / 肾 造 口 术 中 采 集 尿 (6) 商 品 化 浸 片 采 尿 容 器 标 本 容 器 (1) 门 诊 病 人 和 院 内 急 诊 病 人 用 硼 酸 无 菌 管 采 样 ( 硼 酸 浓 度 =1.8%w/v) (2) 住 院 病 人 或 尿 量 太 少 的 标 本 用 普 通 无 菌 管 (3) 蘸 片 4.2 培 养 标 准 除 以 下 情 况 外, 所 有 尿 标 本 都 必 须 做 培 养 和 涂 片 检 查 尿 标 本 应 在 采 集 后 1 小 时 内 得 到 处 理 或 接 种 前 保 存 在 4 (1) 过 夜 的 普 通 无 菌 管 采 集 尿 MSU/CSU/BU 标 本 必 须 当 天 采 集 当 天 送 检 过 夜 的 普 通 无 菌 管 采 集 尿 拒 收 并 备 注 过 夜 标 本 : 不 适 合 培 养 对 过 夜 的 SPU/ 输 尿 管 尿 / 输 尿 管 尿 / 肾 造 口 术 后 采 集 尿, 仍 要 涂 片 和 培 养, 但 报 告 中 应 备 注 : 过 夜 标 本, 结 果 可 能 不 可 靠 仅 供 参 考 (2) 硼 酸 无 菌 管 采 集 尿 尿 量 必 须 不 少 于 15 毫 升, 且 4 存 放 不 超 过 48 小 时 (a) 如 超 过 48 小 时 - 拒 收 MSU/CSU/BU 标 本 并 备 注 : 硼 酸 尿 液 超 过 48 小 时, 不 适 合 培 养 对 SPU/ 输 尿 管 尿 / 输 尿 管 尿 / 肾 造 口 术 后 采 集 尿, 仍 要 涂 片 和 培 养, 但 报 告 中 备 注 : 硼 酸 尿 液 超 过 48 小 时, 结 果 可 能 不 可 靠 仅 供 参 考 30

31 (b) 如 采 集 的 尿 量 少 于 15 毫 升, 做 涂 片 检 查 如 发 现 白 细 胞 2+ 或 更 多, 使 用 标 准 环 接 种, 报 告 上 备 注 尿 量 不 足, 培 养 结 果 可 能 不 可 靠 如 镜 下 白 细 胞 <2+, 报 告 上 备 注 : 尿 量 不 够, 标 本 不 适 合 培 养 对 SPU/ 输 尿 管 尿 / 输 尿 管 尿 / 肾 造 口 术 后 采 集 尿, 涂 片 和 培 养, 但 报 告 中 备 注 : 尿 量 不 足, 培 养 结 果 可 能 不 可 靠 (3) 非 无 菌 管 采 集 的 标 本 对 MSU/CSU/BU, 只 做 白 细 胞 镜 检 报 告 上 备 注 : 请 用 无 菌 管 采 集 尿 对 SPU/ 输 尿 管 尿 / 输 尿 管 尿 / 肾 造 口 术 后 采 集 尿, 仍 要 涂 片 和 培 养, 但 报 告 中 备 注 : 标 本 未 用 无 菌 管 装, 培 养 结 果 可 能 不 可 靠 (4) 对 真 菌 培 养, 如 标 本 少 于 15 毫 升 对 MSU/CSU/BU, 只 做 镜 检 尽 可 能 当 天 出 报 告, 并 备 注 : 尿 量 不 足 不 适 合 做 真 菌 培 养 : 请 至 少 采 集 15 毫 升 尿 液 但 对 于 新 生 儿 或 婴 儿, 需 经 微 生 物 学 家 决 定 做 培 养 或 需 要 更 多 的 尿 液, 如 做 培 养 为 真 菌 阴 性, 则 报 告 上 备 注 : 尿 量 不 足 : 培 养 结 果 可 能 不 可 靠 对 SPU/ 输 尿 管 尿 / 输 尿 管 尿 / 肾 造 口 术 后 采 集 尿, 仍 要 涂 片 和 培 养, 但 报 告 中 备 注 : 尿 量 不 足, 培 养 结 果 可 能 不 可 靠 (5) 收 到 的 玻 片 浸 于 尿 中 拒 绝 接 受, 并 备 注 : 收 到 的 玻 片 仍 浸 于 尿 中 : 不 适 合 培 养, 请 重 取 标 本 如 对 4.2 节 中 有 关 如 何 正 确 处 理 各 种 特 定 类 型 的 尿 标 本 有 所 疑 问, 请 咨 询 值 班 微 生 物 医 师 4.3 培 养 基 及 孵 育 环 境 常 规 培 养 用 适 于 标 本 类 型 ( 见 4.4) 的 适 当 方 法 接 种 下 述 培 养 基 : (1) 兔 血 琼 脂 平 板 需 氧 普 通 培 养 18 24h (2) 如 果 显 微 镜 下 见 到 酵 母 菌 ( 见 4.5) 或 要 求 查 念 珠 菌, 则 选 择 沙 保 琼 脂 培 养 31

32 基, 普 通 培 养 48h 特 例 : 疑 为 伤 寒 或 副 伤 寒 ( 即 肠 热 症 ) 的 病 例 : (1) 1500rpm 离 心 尿 标 本 15min (2) 将 离 心 后 的 沉 淀 接 种 于 富 含 亚 硒 酸 盐 --F 的 肉 汤, 37 孵 育 18 24h (3) 次 代 培 养 时 将 富 含 亚 硒 酸 盐 的 肉 汤 转 种 至 脱 氧 胆 酸 盐 枸 橼 酸 盐 琼 脂 (DC) 平 板, 按 手 册 中 的 第 8 节 所 述 孵 育 及 检 查 真 菌 ( 非 念 珠 菌 ) 的 培 养 要 求 (1) 将 尿 标 本 转 至 1 支 或 多 支 灭 菌 50ml 离 心 管 中 (2) 2000rpm 离 心 15min (3) 必 要 时, 倒 去 上 清 液, 并 混 匀 沉 淀 物 (4) 接 种 0.1ml 离 心 后 的 沉 淀 于 沙 保 琼 脂 斜 面 (5) 30 孵 育, 两 天 检 查 一 次 两 周 后 弃 去 阴 性 培 养 物 (6) 鉴 定 所 有 分 离 出 的 真 菌 对 于 骨 髓 移 植 病 人 (BMT): 进 行 细 菌 和 真 菌 培 养, 并 鉴 定 所 有 分 离 出 的 微 生 物, 必 要 时 咨 询 值 班 微 生 物 医 师 4.4 接 种 方 法 : (1) 用 吸 水 纸 法 接 种 MSU CSU 或 袋 装 尿 (2) 用 标 准 环 法 接 种 SPU 和 输 尿 管 / 肾 造 口 术 尿 标 本 (3) 蘸 片 通 常 先 接 种 以 尿 标 本, 再 送 往 实 验 室 (4) 如 果 显 微 镜 下 发 现 白 细 胞 ++ 或 更 多, 重 新 用 标 准 环 法 接 种 MSU 或 带 装 尿 吸 水 纸 法 : (1) 将 一 张 无 菌 吸 水 纸 条 (MAST, 底 部 6*12mm 大 小 ) 浸 入 混 匀 的 尿 标 本 中 (2) 通 过 接 触 标 本 容 器 内 壁 去 除 多 余 液 体 (3) 将 纸 条 底 端 一 边 压 于 血 平 板 的 1/8 面 积 上 标 准 环 法 ( 见 下 图 ): (1) 将 标 准 1µ1 铂 环 浸 于 混 匀 尿 中, 缓 慢 垂 直 取 出 而 得 到 边 缘 扁 平 的 一 铂 环 量 尿 如 果 取 出 的 尿 呈 凸 起 或 凹 陷 状, 则 将 环 放 回 尿 中 重 取 (2) 将 环 触 于 血 平 板 中 部 (3) 迅 速 直 线 推 动 环 至 平 板 一 边, 再 距 平 板 中 心 1cm 沿 同 样 路 线 折 回 (4) 快 速 地 从 一 边 滑 动 到 另 一 边, 均 匀 接 种 平 板 的 上 2/3 部 分 应 避 免 耽 搁, 以 免 液 体 干 燥 而 不 能 均 匀 接 种 (5) 最 后, 用 未 烧 灼 的 接 种 环 末 梢 在 平 板 上 剩 下 的 1/3 部 分 呈 之 字 形 接 种, 勿 接 触 已 接 种 部 分 图. 标 准 环 接 种 法 32

33 4.4.3 蘸 片 : (1) 如 果 在 标 本 采 集 的 当 天 收 到 蘸 片, 孵 育 18 24h, 然 后 进 行 培 养 检 查 (2) 如 果 在 采 集 后 18 24h 收 到 蘸 片, 且 此 间 未 经 冷 冻, 则 继 续 培 养 观 察 如 果 蘸 片 已 被 冷 藏 过, 按 上 述 (1) 法 孵 育 4.5 尿 显 微 镜 检 查 : (1) 所 有 尿 标 本 作 培 养 后 都 直 接 准 备 湿 片 (2) 只 有 当 申 请 单 上 写 有 下 述 一 项 或 多 项 诊 断 时 作 尿 沉 渣 检 查 : 血 尿 管 型 肾 盂 肾 炎 肾 小 球 肾 炎 心 内 膜 炎 (3) 如 果 离 心 尿 显 微 镜 检 查 结 果 阴 性, 但 收 到 的 尿 标 本 不 足 10ml, 则 以 湿 片 法 检 查 报 告, 并 如 下 评 述 ; 请 送 至 少 10ml 尿 以 便 做 尿 沉 渣 检 查 直 接 湿 片 的 准 备 : (1) 混 合 尿 标 本 (2) 用 装 有 灭 菌 吸 头 的 微 量 加 样 器 取 20l 尿, 打 在 干 净 的 玻 上, 盖 上 盖 玻 片, 避 免 产 生 气 泡. (3) 查 玻 片 上 有 无 脓 细 胞 ( 白 细 胞 ) 红 细 胞 和 管 型, 同 时 报 告 有 无 酵 母 菌 寄 生 虫 精 子 和 结 晶. (4) 用 低 倍 镜 扫 描 全 部 涂 片 区, 并 选 择 一 个 代 表 性 区 域 以 40 倍 镜 计 数. (5) 如 下 下 表 述 红 细 胞 和 白 细 胞 的 量. < 1 个 细 胞 /HPF 个 细 胞 /HPF 个 细 胞 /HPF ++ >20 个 细 胞 /HPF +++ 大 量 上 皮 细 胞 查 见 (7) 如 果 看 见 管 型, 则 查 尿 沉 渣 33

34 4.5.2 尿 沉 渣 (1) 将 约 10ml 混 好 的 尿 倒 入 刻 度 离 心 管 中, 以 2000rpm 离 心 5 min 弃 去 9ml 上 清 液, 并 摇 匀 剩 余 液 体, 这 样, 标 本 被 浓 缩 了 10 倍 (2) 在 洁 净 的 玻 片 上 滴 加 一 滴 悬 液, 盖 上 盖 玻 片, 避 免 产 生 气 泡. (3) 检 查 湿 片, 计 数 并 如 下 报 管 型 : 离 心 后 的 10 倍 浓 缩 尿 -ve 管 型 / 低 倍 视 野 培 养 检 查 吸 水 纸 法 对 血 平 板 上 压 印 过 的 部 分 进 行 菌 落 计 数, 按 下 表 报 告 每 ml 菌 落 形 成 单 位 (cfu) 的 数 量. 杆 菌 菌 落 记 数 Cfu/ml 如 下 报 告 生 长 量 球 菌 0 0 <10 3 未 生 长 < 10,000 cfu/ml , ,000 cfu/ml >25 >30 >10 5 > 100,000 cfu/ml 如 果 出 现 一 种 以 上 的 菌 落, 分 开 计 数, 并 报 告 各 自 每 ml cfu 的 量 酵 母 菌 落 毋 需 计 数 : 出 现 任 意 一 个 这 样 的 菌 落 都 被 认 为 可 能 有 意 义 标 准 环 法 计 数 血 平 板 的 菌 落 数, 并 乘 以 稀 释 倍 数 1000, 从 而 计 算 出 每 ml cfu 的 量 如 果 出 现 一 种 以 上 菌 落, 分 开 计 数, 并 报 告 各 自 每 ml cfu 的 量. 据 下 表 报 告 : 菌 落 记 数 Cfu/ml 如 下 报 告 生 长 量 非 MSU/BU MSU/BU 0 未 生 长 未 生 长 未 生 长 1 10 <10-- 轻 度 生 长 < cfu/ml 中 度 生 长 cfu/ml >100 >10 重 度 生 长 > cfu/ml 蘸 片 请 参 考 制 造 商 的 建 议. 4.7 鉴 定 和 敏 感 试 验 34

35 根 据 下 表, 必 要 时 进 行 鉴 定 ( 见 下 ) 和 敏 感 试 验 ( 请 参 考 敏 感 试 验 部 分 ): 尿 标 本 类 型 菌 落 类 型 的 数 菌 落 记 数 WBC( 显 微 镜 采 取 措 施 量 cfu/ml 检 查 ) SPU 输 尿 管 / 1 或 2 +++,++ ID+ST 肾 造 口 术 尿 或 +/ 或 ++ ID+ST 1 +/- MBF# MSU/CSU/BU 1 < 或 ++ ID+ST +/- IG 1 或 或 更 多 ID+ST 2 <10 4 IG 3 3 MBF 1:ID+ST = 对 分 离 出 的 微 生 物 进 行 鉴 定 和 敏 感 试 验 2:MBF = 报 告 为 分 离 出 混 合 菌 丛 : 若 临 床 症 状 可 疑, 请 重 送 3:IG = 非 显 著 生 长 不 作 进 一 步 试 验 据 或 中 的 图 表 报 告 生 长 量 # = 如 果 标 本 为 膀 胱 穿 刺 尿 输 尿 管 或 肾 造 口 术 尿 或 来 自 器 官 移 植 病 人, 则 需 通 知 值 班 微 生 物 医 师 据 目 前 抗 菌 药 报 告 规 定 报 告 敏 感 试 验 结 果 革 兰 阴 性 杆 菌 做 氧 化 酶 试 验 如 果 氧 化 酶 试 验 阳 性, 必 要 时 用 API 20NE 鉴 定 如 果 氧 化 酶 试 验 阴 性, 必 要 时 用 Microbact 12E 或 API20E 鉴 定 革 兰 阳 性 球 菌 告 敏 (1) 对 葡 萄 球 菌, 进 行 凝 固 酶 试 验, 如 果 凝 固 酶 阴 性, 则 测 试 其 对 新 生 霉 素 的 敏 感 新 生 霉 素 耐 药 凝 固 酶 阴 性 葡 萄 球 菌, 则 报 告 为 腐 生 葡 萄 球 菌, 同 时 报 感 试 验 的 结 果 如 凝 固 酶 阴 性 葡 萄 球 菌 对 新 生 霉 素 敏 感, 则 报 告 为 凝 固 酶 阴 性 葡 萄 球 菌, 而 不 报 告 敏 感 试 验 的 结 果 (2) 对 链 球 菌, 检 测 其 在 40% 胆 盐 七 叶 苷 和 6.5% 环 境 下 的 生 长 能 力 : 在 两 种 培 养 基 上 皆 生 长, 则 报 告 为 肠 球 菌 (3) 对 β-- 溶 血 性 链 球 菌, 进 行 血 清 学 分 型 (4) 非 肠 球 菌 非 溶 血 性 链 球 菌, 毋 需 进 一 步 的 鉴 定, 而 报 告 为 非 肠 球 菌 性 链 球 菌 35

36 4.7.3 酵 母 菌 (1) 针 对 白 色 念 珠 菌, 做 芽 管 形 成 试 验 (2) 请 参 考 本 手 册 中 真 菌 培 养 部 分 内 容 真 菌 鉴 定 所 有 分 离 到 的 真 菌 ( 请 参 考 本 手 册 的 真 菌 培 养 部 分 ) 4.8 乳 糜 尿 定 义 : 乳 糜 : 即 消 化 后 的 脂 肪, 来 自 小 肠, 经 由 淋 巴 管 入 血, 为 一 种 碱 性 奶 状 液 体. 乳 糜 尿 : 尿 中 含 乳 糜. 这 可 能 发 生 在 一 些 丝 虫 感 染 患 者 由 于 淋 巴 管 和 尿 道 间 形 成 瘘 道 或 泌 尿 系 统 淋 巴 管 膨 胀 破 裂 时 发 生 试 剂 : 含 70% 乙 醇 溶 液 的 饱 和 苏 丹 III 溶 液 ( 苏 丹 III 在 乙 醇 中 的 溶 解 度 为 0.15%) 步 骤 : (1) 所 有 所 有 器 材 须 无 油 污 (2) 关 掉 附 近 本 生 灯 或 熄 灭 其 它 火 焰 每 3 份 混 匀 尿 加 一 份 乙 醚 (3) 振 摇 1min 后 静 置 10min (4) 用 吸 管 吸 出 上 部 乙 醚 层, 并 转 到 玻 璃 制 的 佩 里 特 细 菌 培 养 皿 中 (5) 让 乙 醚 挥 发 (6) 向 标 本 中 加 入 1ml 苏 丹 试 剂 ( 或 油 红 O 染 料 ) 并 混 匀 (7) 显 微 镜 下 检 查 有 无 被 染 成 橘 红 色 的 圆 形 脂 肪 小 滴 5. 血 培 养 原 理 bact/alert 微 生 物 鉴 定 系 统 可 以 自 动 孵 育 搅 动 血 液 培 养 瓶, 连 续 监 测 样 品 中 需 氧 / 厌 氧 菌 36

37 的 培 养 基 变 化, 样 品 包 括 含 有 可 疑 细 菌 或 真 菌 的 病 员 血 标 本 它 有 一 套 感 光 系 统, 可 以 通 过 从 光 线 反 射 测 定 样 品 种 的 二 氧 化 碳 含 量 当 微 生 物 生 长 产 生 二 氧 化 碳 时, 培 养 瓶 底 的 敏 感 材 料 从 绿 色 变 为 黄 色, 这 种 变 化 可 用 感 光 系 统 测 定 出 来 当 出 现 以 下 几 种 情 况 时, 样 品 被 检 出 阳 性 : 二 氧 化 碳 含 量 呈 加 速 增 长 ; 高 二 氧 化 碳 起 始 浓 度 ; 高 过 正 常 的 二 氧 化 碳 产 率 标 本 BacT/Alert 需 氧 菌 培 养 瓶 厌 氧 菌 培 养 瓶 Pedi-BacT 需 氧 培 养 瓶 理 论 上, 需 要 5-10ml( 至 少 4ml) 血 加 入 到 成 人 或 儿 童 血 培 养 瓶 中, 仔 细 防 止 污 染 安 全 要 求 A 要 全 面 执 行 保 护 措 施 处 理 每 一 份 血 标 本, 都 要 把 它 假 定 为 血 液 传 染 病 阳 性 ( 例 如 :HIV HBV HCV) 小 心 对 待 所 有 用 过 的 针 头 和 注 射 器 需 立 即 放 回 回 收 盒 中 仔 细 操 作, 避 免 被 针 头 划 伤 B 有 些 血 培 养 物 可 能 含 有 需 要 特 别 小 心 的 细 菌, 如 布 鲁 氏 菌 特 别 要 注 意 的 : 凡 是 能 产 生 细 菌 气 溶 胶 的 操 作, 都 必 须 在 生 物 安 全 柜 中 进 行 ( 第 1 2 类 ) 如 怀 疑 3 4 类 菌 生 长, 也 应 按 相 应 的 实 验 室 操 作 规 范 进 行 C 清 洁 溢 出 物 需 用 5,000ppm 的 盐 酸 溶 液 血 培 养 物 的 处 理 将 需 氧 培 养 瓶 中 的 液 体 排 出 并 消 毒 在 瓶 盖 上 标 明 排 出 物 的 参 数 培 养 瓶 放 入 35 孵 箱 孵 育, 并 连 续 监 测 其 状 态 的 改 变 如 果 出 现 5.5 显 示 的 情 况, 则 抛 弃 培 养 瓶 加 长 时 间 培 养 和 特 殊 培 养 可 疑 心 内 膜 炎 培 养 检 测 21 天 可 疑 真 菌 感 染 真 菌 感 染 需 在 培 养 的 第 二 天 将 培 养 物 转 种 将 2 到 3 滴 血 培 养 分 别 液 滴 在 两 个 沙 氏 琼 脂 斜 面 上, 将 培 养 物 滴 在 斜 面 顶 端, 使 其 自 由 流 动 到 底 部 两 管 斜 面 分 别 在 孵 育 14 天, 在 孵 育 过 程 中 每 天 检 查 可 疑 布 鲁 氏 菌 感 染 BacT/Alert 培 养 瓶 孚 育 7 天, 需 在 第 二 天 和 第 七 天 转 种 Castaneda 瓶, 再 不 密 封 瓶 口 的 情 况 下 放 入 二 氧 化 碳 孵 箱 孵 育 8 周 每 隔 2 到 3 天 检 查 Castaneda 瓶 表 面 以 及 琼 脂 斜 面 的 生 长 情 况 如 果 没 有 生 长, 将 瓶 子 倾 斜 让 液 体 再 次 浸 泡 斜 面, 继 续 培 养 注 意 : 对 于 长 时 间 培 养,7 天 内 必 须 给 出 阶 段 性 报 告! 可 疑 阳 性 培 养 物 处 理 A 当 培 养 物 被 鉴 定 为 可 疑 阳 性, 用 无 菌 注 射 器 取 1ml 培 养 肉 汤, 制 作 涂 片, 进 行 革 兰 染 色 B 血 培 养 肉 汤 需 用 以 下 平 板 转 种 血 琼 脂 BA 巧 克 力 血 琼 脂 CBA 加 入 维 生 素 K1 的 血 琼 脂 BAK1 麦 康 凯 琼 脂 Mac 所 有 平 板 在 35 孵 育, 其 中 BA CBA 和 Mac 在 5% 二 氧 化 碳 条 件 维 生 素 K1 在 厌 氧 柜, 时 间 为 48 小 时 18 到 24 小 时 内,BA CBA Mac 平 板 要 检 查 生 长 情 况, 如 果 未 生 长 继 37

38 续 孚 24 小 时 C 如 果 革 兰 染 色 发 现 血 培 养 基 有 菌 生 长, 立 即 通 知 主 管 医 生, 并 进 行 直 接 药 敏 试 验 * 用 1 滴 血 培 养 物 作 为 接 种 物 用 接 种 环 加 它 涂 在 药 物 敏 感 试 验 用 的 琼 脂 平 板 上 * 注 意 : 1 尸 检 样 品 不 做 直 接 敏 感 试 验 2 对 于 同 一 天 从 同 一 个 病 人 身 体 上 采 取 的 样 本, 除 了 革 兰 染 色 发 现 多 种 细 菌 形 态 以 外, 都 只 做 一 份 药 敏 试 验 3 血 培 养 显 示 出 革 兰 阴 性 和 革 兰 阳 性 菌 混 合 的 情 况 不 能 进 行 直 接 药 敏 试 验 D 直 接 进 行 鉴 定 试 验 的 细 菌 包 括 : 葡 萄 球 菌 试 管 法 测 凝 固 酶 各 种 链 状 革 兰 阳 性 球 菌 optochin 纸 片 + 新 青 二 纸 片 (1 微 克 ) 厌 氧 菌 甲 硝 唑 特 别 注 意 : 血 培 养 出 现 革 兰 阳 性 菌 应 立 即 通 知 主 管 实 验 员 E 对 于 可 疑 革 兰 阴 性 菌 生 长 的 培 养 瓶 和 转 种 平 板, 应 考 虑 它 的 特 殊 生 长 条 件 : 例 如 一 些 军 团 菌 支 原 体 弯 曲 杆 菌 分 支 杆 菌, 鸟 分 支 杆 菌 / 胞 内 分 支 杆 菌 等 转 种 物 的 检 查 A 所 有 的 培 养 物 在 孵 育 小 时 内 应 检 查 没 有 生 长 的 培 养 基 要 继 续 孵 育 24 小 时 B 应 该 对 所 用 不 同 的 单 个 菌 落 进 行 革 兰 染 色 和 进 一 步 的 生 化 鉴 定 纯 培 养 也 必 须 检 查 所 有 单 个 菌 落 C 检 查 单 个 菌 落 的 方 法 有 : 革 兰 阴 性 杆 菌 :1 乳 糖 发 酵 API20E 2 溶 血 性 乳 糖 发 酵 菌 氧 化 酶,API20E 3 非 乳 糖 发 酵 菌 氧 化 酶 ; 如 氧 化 酶 阴 性 进 行 沙 门 氏 菌 血 清 试 验 API20E O/F 试 验 4 非 乳 糖 发 酵 产 绿 色 素 菌 氧 化 酶 ;O/F;42 孚 育 ;API20NE 革 兰 阳 性 球 菌 :1 葡 萄 球 菌 ( 触 酶 阳 性 ) 试 管 法 测 凝 固 酶 ; 鸟 氨 酸 脱 羧 酶 2 链 球 菌 ( 触 酶 阴 性 ) API STREP (β 溶 血 链 球 菌 ) (optochin 阴 性 ) 3 肺 炎 链 球 菌 ( 触 酶 阳 性 ) 胆 盐 溶 解 试 验 (optochin 阳 性 ) D 应 该 对 每 种 菌 落 进 行 抗 生 素 敏 感 试 验 对 于 同 一 个 病 人 一 天 之 内 的 标 本, 如 只 有 一 种 菌 生 长 只 做 一 份 敏 感 试 验 E 如 果 在 纯 培 养 平 板 上 发 现 两 种 或 两 种 以 上 的 菌 落, 每 种 都 要 单 独 鉴 定 F 如 果 血 培 养 物 涂 片 染 色 呈 阳 性 而 转 种 物 呈 阴 性, 考 虑 一 下 情 况 : 38

39 1 革 兰 阴 性 杆 菌 用 军 团 菌 或 弯 曲 杆 菌 的 特 殊 培 养 基 再 次 转 种 2 链 球 菌 营 养 琼 脂 培 养 基 接 种, 半 胱 氨 酸 或 吡 哆 醛 平 板 接 种 结 果 记 录 A 每 一 个 培 养 瓶 后 面 的 标 签 应 仔 细 填 写 其 内 容 包 括 : 主 管 检 验 师 ; 实 验 室 编 号 ; 阳 性 结 果 出 现 日 期 ; 革 兰 染 色 结 果 ; 分 离 的 单 个 菌 落 特 征 ; 鉴 定 试 验 结 果 ; 单 个 菌 落 最 后 鉴 定 报 告 ; 直 接 敏 感 试 验 ( 结 果 ) B 最 终 敏 感 试 验 结 果 应 填 入 到 NCCLS 数 据 表 中 C 鉴 定 结 果 和 抗 菌 素 敏 感 试 验 结 果 应 该 在 工 作 完 成 以 后 立 即 输 入 电 脑 D 所 有 血 培 养 ( 阴 性 / 阳 性 ) 都 要 有 电 脑 生 成 的 工 作 报 表 结 果 报 告 A 阴 性 结 果 : 报 告 培 养 6 天 后 未 见 生 长 对 于 可 疑 心 内 膜 炎, 需 附 加 一 份 21 天 内 未 见 生 长 B 阳 性 结 果 : 培 养 瓶 出 现 阳 性 时 应 给 出 初 步 报 告, 其 中 应 包 括 革 兰 染 色 结 果 分 离 鉴 定 结 果 和 相 应 的 敏 感 试 验 结 果 同 时 给 出 ( 例 外 情 况 见 C 部 分 ) 如 果 出 现 两 种 菌, 和 主 管 检 验 师 讨 论 后 出 报 告 C 在 以 下 情 况 中, 报 告 不 需 要 附 加 敏 感 试 验 结 果 ( 医 生 直 接 要 求 的 情 况 除 外 ) 凝 固 酶 阴 性 葡 萄 球 菌 杆 菌 属 细 菌 类 白 喉 杆 菌 注 意 1 虽 然 一 般 情 况 下, 这 些 细 菌 是 不 致 病 的 人 体 皮 肤 正 常 菌 群, 但 对 于 危 重 病 人 要 考 虑 他 们 的 致 病 性 : 白 血 病 患 者 ; 移 植 手 术 后 的 患 者 ;ICU 病 员 ; 早 产 儿 2 应 注 意 某 些 突 变 链 球 菌 和 李 斯 特 菌 可 能 出 现 类 白 喉 杆 菌 的 形 态, 而 对 于 危 重 病 人,JK 弯 曲 杆 菌 可 能 导 致 严 重 感 染 如 果 临 床 提 示 该 病 员 处 于 危 险 期, 要 用 触 酶 试 验 鉴 定 类 白 喉 杆 菌, 25 孵 育,API CORYNE 试 剂 条 鉴 定 4 分 离 的 杆 菌, 应 该 鉴 定 其 动 力, 以 排 出 炭 疽 芽 孢 杆 菌 附 录 BacT/Albert 使 用 说 明 1 日 常 使 用 程 序 : a 替 换 培 养 瓶 标 签 以 备 下 次 使 用 收 集 PWH 数 据 表, 填 入 使 用 了 的 标 签 号 b 在 监 视 器 屏 幕 上 选 择 培 养 箱 温 度 这 一 栏, 找 到 并 记 录 培 养 瓶 准 确 温 度 如 果 培 养 瓶 的 温 度 和 你 设 定 的 温 度 出 现 0.5 以 上 的 偏 差, 需 进 行 校 正 2 处 理 阳 性 培 养 瓶 3 准 备 输 入 新 样 品 清 空 需 氧 培 养 瓶, 标 记 清 空 的 培 养 瓶 以 显 示 其 清 空 时 的 状 态 4 对 培 养 瓶 输 入 相 应 的 数 据 5 装 入 培 养 瓶 39

40 6 打 印 阴 性 报 告, 清 空 阴 性 试 剂 瓶 7 在 未 加 样 时 立 即 关 闭 系 统, 以 便 进 行 清 理 程 序 关 于 BacT/Albert 的 全 部 细 节, 请 参 阅 BacT/Albert 使 用 手 册 40

41 6 体 液 6.1 标 本 类 型 (1) 关 节 液 (2) 腹 水 (3) 胸 水 (4) 其 他 液 ( 如 : 心 包 积 液, 阴 囊 水 肿 液 ) (5) 骨 髓 (6)CAPD( 连 续 抢 救 的 腹 膜 透 析 液 ) 6.2 细 胞 数 体 液 细 胞 数 由 血 液 实 验 室 完 成 6.3 镜 检 标 本 类 型 1-4 应 1000g 离 心 15 分 钟, 沉 淀 用 革 兰 染 色 和 培 养 骨 髓 不 用 离 心 如 果 申 请 急 诊 镜 检, 革 兰 涂 片 结 果 应 电 话 通 知 相 应 的 病 房 6.4 培 养 所 有 培 养 应 接 种 于 血 平 板 (BA) 5%CO 2 孵 育 巧 克 力 平 板 (CBA) 补 充 VitK 1 的 血 平 板 厌 氧 孵 育 48hr Thioglycollate 肉 汤 37 孵 育 6.5 特 殊 培 养 如 果 申 请 下 列 特 殊 培 养 之 一, 或 如 果 临 床 提 示, 或 如 果 值 班 微 生 物 学 家 要 求 做 如 下 : (1) 淋 病 特 殊 培 养 加 NTC 平 皿 (2)TB 特 殊 培 养 送 一 部 分 液 体 到 结 核 实 验 室 (3) 真 菌 感 染 特 殊 培 养 见 真 菌 培 养, 手 册 14 部 分 (4) 布 鲁 军 病 特 殊 培 养 见 血 培 养, 手 册 15 部 分 6.6 值 班 微 生 物 学 家 注 意 值 班 微 生 物 学 家 必 须 注 意 阳 性 镜 检 或 培 养 结 果 6.7 培 养 检 查 需 要 培 养 应 在 小 时 后 检 查, 若 无 生 长, 平 板 应 再 孵 育 24 小 时, 将 肉 汤 转 至 BA, CBA 或 K 1 平 皿 上 这 些 应 如 6.4 所 述 孵 育 所 有 分 离 菌 应 做 革 兰 染 色, 微 生 物 纯 培 养 应 用 相 应 的 实 验 鉴 定 至 种 的 水 平 6.8 抗 生 素 敏 感 实 验 对 所 有 分 离 株 均 应 做 ( 详 见 手 册 17 部 分 ) 6.9 结 果 的 记 录 和 报 告 在 收 到 标 本 的 当 天 应 有 一 初 步 报 告, 给 出 镜 检 发 现 最 后 报 告 将 包 括 镜 检 ( 革 兰 ) WBC 半 定 量 (,+,++,+++) 微 生 物 半 定 量 估 计, 革 兰 染 色, 形 态 培 养 分 离 株 的 鉴 定 和 相 应 敏 试 结 果 但 下 列 微 生 物 无 敏 试 报 告 除 非 另 外 指 示 : Co( ) 葡 41

42 芽 孢 杆 菌 属 类 白 喉 6.10 分 离 菌 的 贮 存 所 有 体 液 分 离 菌 必 须 贮 存, 参 见 手 册 中 细 菌 的 贮 存 6.11CAPD 液 标 本 Bactec 660 NR6A 需 氧 瓶 NR7A 厌 氧 瓶 每 瓶 接 种 5mlCAPD 液 操 作 请 参 看 手 册 中 血 培 养 部 分 Bactec 瓶 处 理 同 血 培 养 阳 性 培 养 革 兰 染 色 结 果 应 尽 快 电 话 通 知 肾 病 室 CAPD 液 中 所 有 革 兰 阳 性 菌 必 须 做 万 古 霉 素 敏 试 值 班 微 生 物 师 应 知 道 任 何 泰 能 或 万 古 霉 素 耐 药 菌 株 报 告 请 参 见 手 册 中 血 培 养 部 分 注 意 泰 能 应 报 告, 如 果 Imp=R 对 所 有 革 兰 阳 性 菌 菌 株 贮 存 所 有 CAPD 液 菌 株 应 保 存, 详 见 手 册 中 细 菌 保 存 7 脑 脊 液 7.1 标 本 CSF-L 经 腰 椎 穿 刺 标 本 CSF-V 经 脑 室 导 管 取 得 标 本 7.2 肉 眼 检 查 镜 检 菌, 须 记 录 CSF 的 外 观, 如 下 : 清 亮 和 无 色 ; 血 性 混 浊 ; 黄 色 脑 脊 液 7.3 镜 检 细 胞 计 数, 记 录 WBC,RBC/mm 3 若 标 本 明 显 红 色, 不 须 计 数 和 分 类, 直 接 革 兰 氏 染 色 和 培 养 7.4 离 心 取 一 部 分 CSF 于 无 菌 离 心 管,1000 g 离 心 15min, 观 察 黄 色 脑 脊 液 的 上 清 液 7.5 革 兰 氏 染 色 用 离 心 沉 渣 做 革 兰 氏 染 色, 使 用 干 净, 新 载 片 涂 片 必 须 仔 细 检 查 至 少 5min, 搜 寻 整 个 染 色 区, 然 后 才 能 丢 弃 7.6 分 类 计 数 若 WBC>10/mm 3, 须 进 行 分 类, 可 以 使 用 计 数 池 计 数 分 类 100 细 胞 若 细 胞 分 类 拿 不 准, 使 溶 解 染 液 ( 见 附 录 2) 如 下 操 作 : 加 6 滴 CSF 到 4 滴 染 液, 然 后 再 分 类 WBC 7.7 培 养 CSF 沉 渣 的 培 养 需 要 使 用 下 面 培 养 基 : BA,CBA, 硫 羟 乙 酸 盐 肉 汤 若 革 兰 氏 染 色 证 实 革 半 氏 阴 性 杆 菌, 加 做 Mac 平 板 培 养 接 种 平 板 要 37 C,5%CO 2 过 液 培 养 24h, 若 无 可 见 生 长, 再 培 养 24h, 硫 羟 乙 酸 盐 肉 汤 须 在 BA 和 CBA 上 次 培 养 42