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1 , Vol. 29, No. 07 食 品 科 学 专 题 论 述 谢 会 玲, 陈 伟, 彭 池 方, 胥 传 来 ( 江 南 大 学 食 品 学 院, 江 苏 无 锡 ) :β - 内 酰 胺 类 抗 生 素 是 指 化 学 结 构 中 含 有 β - 内 酰 胺 环 的 一 类 抗 生 素, 主 要 包 括 青 霉 素 类 和 头 孢 菌 素 类 由 于 其 使 用 方 法 不 当 或 不 遵 守 休 药 期 规 定 等 原 因 给 人 类 健 康 带 来 严 重 危 害 本 文 介 绍 了 动 物 源 食 品 中 β - 内 酰 胺 类 抗 生 素 的 现 有 残 留 检 测 方 法, 以 及 实 现 多 残 留 快 速 检 测 的 实 验 思 路, 包 括 目 标 抗 体 的 获 得 和 检 测 技 术 的 选 择 :β - 内 酰 胺 类 抗 生 素 ; 头 孢 菌 素 ; 残 留 检 测 ; 目 标 抗 体 Research Progress of Multi-residues Immunoassay of β- lactam Antibiotic in Food of Animal Origin XIE Hui-ling,CHEN Wei,PENG Chi-fang,XU Chuan-lai (School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi , China) Abstract :β- lactam antibiotic is a kind of antibiotics with β- lactam ring in chemical structure, including penicillins and cephalosporins. Because of its abuse, the residues in food have caused serious hazards to people's health. This paper introduced the present residue detection methods of β- lactam antibiotic and the research thinking of multi-residues detection including producing taget antibody and the selection of detection technology. Key words:β- lactam antibiotic;cephalosporins;detection of residues;target antibody 中 图 分 类 号 :S 文 献 标 识 码 :A 文 章 编 号 : (2008) 随 着 人 们 生 活 水 平 的 提 高, 动 物 源 食 品 中 的 药 物 残 留 日 益 受 到 国 际 社 会 的 重 视 FAO/WHO 联 合 组 织 的 食 品 中 兽 药 残 留 立 法 委 员 会 把 兽 药 残 留 定 义 为 : 兽 药 残 留 是 指 动 物 产 品 的 任 何 可 食 部 分 所 含 兽 药 的 母 体 化 合 物 及 其 降 解 物 另 外, 药 物 或 其 降 解 产 物 与 内 源 大 分 子 共 价 结 合 产 物 称 为 结 合 残 留, 动 物 组 织 中 存 在 结 合 残 留 则 表 明 药 物 对 靶 动 物 具 有 潜 在 毒 性 作 用 兽 药 残 留 主 要 有 抗 生 素 类 磺 胺 药 类 呋 喃 药 类 抗 球 虫 药 激 素 药 类 和 驱 虫 药 类 目 前 在 动 物 中 使 用 的 抗 生 素 主 要 有 β - 内 酰 胺 类 四 环 素 类 大 环 内 酯 类 氨 基 糖 苷 类 氯 霉 素 类 等 动 物 性 食 品 中 的 抗 生 素 残 留 对 人 体 健 康 的 影 响, 主 要 表 现 为 过 敏 毒 性 作 用 细 菌 耐 药 性 致 畸 [1] 致 突 变 和 致 癌 作 用 等 多 个 方 面 β - 内 酰 胺 类 抗 生 素 作 为 发 现 最 早 用 量 最 多 的 一 类 抗 生 素, 在 牛 乳 及 动 物 组 织 中 残 留 检 出 报 道 最 多 β - 内 酰 胺 类 抗 生 素 是 指 化 学 结 构 中 含 有 β - 内 酰 胺 环 的 一 类 抗 生 素, 主 要 包 括 青 霉 素 类 和 头 孢 菌 素 类, 其 作 用 特 点 是 能 够 抑 制 细 菌 黏 肽 转 肽 酶 的 活 性, 从 而 阻 止 细 菌 细 胞 壁 的 合 成, 呈 现 杀 菌 活 性 在 动 物 生 产 中,β - 内 酰 胺 类 抗 生 素 广 泛 用 于 控 制 奶 牛 的 乳 房 炎, 治 疗 动 物 尿 道 胃 肠 道 和 呼 吸 道 感 染 等 但 由 于 其 使 用 方 法 不 当 或 不 遵 守 休 药 期 规 定 等 原 因, 均 可 造 成 它 在 畜 产 品 中 的 残 留, 给 人 类 健 康 带 来 严 重 危 害, 如 产 生 过 敏 反 应 破 坏 胃 肠 道 菌 群 平 衡 和 增 强 细 菌 耐 药 性 等 其 中 青 霉 素 在 食 品 中 的 残 留 会 对 青 霉 素 过 敏 的 人 产 生 健 康 危 害, 更 为 重 要 的 是, 抗 生 素 被 过 量 食 入 健 康 人 肠 道, 会 破 坏 健 康 人 的 正 常 菌 群 环 境, 导 致 人 体 免 疫 力 的 降 低 为 了 保 障 人 民 食 品 安 全, 适 应 WTO 的 要 求, 增 强 国 内 牛 奶 及 乳 制 品 业 的 国 际 竞 争 力, 必 须 将 牛 乳 中 抗 生 素 残 留 的 检 测 纳 入 常 规 检 测 中 去 2001 年 和 2002 年, 农 业 部 又 先 后 公 布 了 无 公 害 食 品 生 鲜 牛 乳 (NY/T ) 无 公 害 食 品 灭 菌 乳 (NY ) 和 无 公 害 食 品 巴 氏 杀 菌 乳 (NY ) 等 行 业 标 准, 规 定 了 抗 生 素 不 得 检 出, 检 验 方 法 采 用 GB/T 牛 乳 的 检 验 方 法 中 的 TTC ( 氯 化 三 苯 四 氮 唑 ) 法, 但 此 法 的 检 测 限 仅 为 0. 04U/ml, 和 欧 美 国 家 检 测 方 法 差 收 稿 日 期 : 作 者 简 介 : 谢 会 玲 (1979-), 女, 硕 士 研 究 生, 研 究 方 向 为 食 品 安 全 与 检 测 xiehuiling79@163.com

2 专 题 论 述 食 品 科 学 2008, Vol. 29, No 一 个 数 量 级 因 此 开 发 原 料 乳 质 量 现 场 快 速 测 定 技 术, 建 立 常 用 抗 生 素 农 药 残 留 霉 菌 毒 素 的 现 场 快 速 检 测 方 法 及 相 应 的 技 术 标 准 是 非 常 必 要 的 近 年 来, 为 满 足 检 测 需 要 现 已 建 立 了 许 多 残 留 检 测 方 法, 主 要 有 微 生 物 检 测 法 理 化 检 测 法 免 疫 分 析 法 及 其 他 一 些 用 于 免 疫 分 析 法 的 检 测 技 术, 如 SPR 生 物 传 感 器 技 术 微 阵 列 芯 片 技 术 胶 体 金 毛 细 管 电 泳 免 疫 亲 和 色 谱 等 且 免 疫 分 析 法 更 注 重 多 组 分 分 析 物 免 疫 分 析 的 研 究, 并 将 多 残 留 免 疫 分 析 法 与 先 进 的 检 测 技 术 结 合 的 高 通 量, 高 灵 敏 度, 便 携 的 检 测 方 法 1 理 化 检 测 法 理 化 检 测 法 是 利 用 抗 生 素 分 子 中 的 基 团 所 具 有 的 特 殊 反 应 或 性 质 来 测 定 其 含 量, 如 气 相 色 谱 法 高 效 液 相 色 谱 法 比 色 法 荧 光 分 光 光 度 法 等, 能 进 行 定 性 定 量 和 药 物 鉴 定, 敏 感 性 较 高 药 物 残 留 检 测 最 为 常 用 的 理 化 检 测 方 法 是 高 效 液 相 色 谱 法 和 联 用 技 术 常 规 高 效 液 相 色 谱 (HPLC) 往 往 仅 适 宜 于 测 定 比 较 纯 的 产 物, 对 于 具 有 复 杂 组 分 的 生 物 培 养 基 中 的 抗 生 素, 特 别 是 痕 量 的 抗 生 素, 往 往 由 于 高 背 景 干 扰 而 难 于 定 量 分 析 [2] Verdon E 等 曾 报 道 用 柱 前 衍 生 - 离 子 对 高 效 液 相 色 谱 法 测 定 牛 奶 中 的 异 恶 唑 青 霉 素 残 留, 但 前 处 理 步 骤 过 于 复 杂, 操 作 难 于 控 制, 其 准 确 性 和 选 择 性 较 差 Riediker S [3] 和 Ito Y [4] 也 用 LC - MSPMS 测 定 牛 奶 中 的 青 霉 素 含 量, 准 确 性 较 好, 但 灵 敏 度 不 高 [5] 刘 媛 等 建 立 了 反 相 高 效 液 相 色 谱 分 析 鸡 肉 猪 肉 猪 皮 猪 脂 肪 等 动 物 组 织 样 品 中 阿 莫 西 林 残 留 量 的 方 法 对 8 种 动 物 组 织 样 品 采 用 磷 酸 盐 缓 冲 溶 液 提 取 三 氯 乙 酸 沉 淀 蛋 白 固 相 萃 取 净 化 和 富 集 1,2,4- 三 唑 - 氯 化 汞 衍 生 化 研 究 了 样 品 在 C18 柱 上 的 保 留 行 为 和 阿 莫 西 林 的 衍 生 化 条 件 衍 生 物 采 用 高 效 液 相 色 谱 法 分 离, 外 标 法 定 量 分 析, 标 准 曲 线 的 线 性 相 关 系 数 为 , 线 性 范 围 为 8.6~860μg/L 动 物 组 织 样 品 中 阿 莫 西 林 的 加 标 回 收 率 为 70.9%~86.8%, 相 对 标 准 偏 差 为 3.2%~16.4%, 最 低 检 出 限 低 于 10μg/kg 该 分 析 方 法 具 有 良 好 的 重 现 性, 批 内 批 间 定 量 结 果 的 相 对 标 [6] 准 偏 差 均 小 于 10% Beconi-Barker M G 等 报 道 了 HPLC 用 于 牛 奶 中 头 孢 噻 呋 的 残 留 检 测, 牛 奶 通 过 离 心 脱 脂 乙 腈 提 取 药 物 固 相 柱 对 提 取 物 进 行 净 化 化 合 物 通 过 离 子 对 梯 度 HPLC 色 谱 柱 分 离, 在 270nm 处 进 行 紫 外 检 测 对 头 孢 噻 呋 的 检 测 限 是 7.0μg/kg 在 20~200μg/ kg 的 浓 度 范 围 对 头 孢 噻 呋 的 回 收 率 是 84%~88% [7] Keever J 等 将 电 化 学 检 测 器 用 于 检 测 头 孢 菌 素, 由 于 其 固 有 的 高 灵 敏 度, 荧 光 检 测 法 在 多 数 的 LC 分 析 中 要 优 于 紫 外 检 测 法 用 其 测 定 头 孢 噻 呋 的 残 留 量, 不 仅 提 高 了 方 法 的 选 择 性, 而 且 灵 敏 度 可 达 到 1μg/L 2 多 残 留 免 疫 分 析 法 免 疫 分 析 (immunoassay,ia ) 是 以 抗 原 (antigen, Ag) 与 抗 体 (antibody,ab) 的 特 异 性, 可 逆 性 结 合 反 应 为 基 础 的 分 析 技 术 免 疫 反 应 具 有 单 独 任 何 一 种 理 化 分 析 技 术 难 以 达 到 的 选 择 性 和 灵 敏 度, 非 常 适 用 于 复 杂 基 质 中 痕 量 组 分 的 分 离 或 检 测 多 组 分 分 析 物 免 疫 分 析 (multianalyte immunoassay, MIA) 是 指 在 同 一 份 样 品 中, 同 时 测 定 两 种 以 上 的 相 关 分 析 物 的 免 疫 分 析 技 术 通 过 构 建 多 种 抗 原, 筛 选 针 对 一 类 农 药 特 异 的 抗 体, 可 以 实 现 一 次 实 验 同 时 检 测 一 类 农 药 的 残 留 量, 也 可 以 在 抗 体 的 产 生 过 程 中 有 针 对 性 的 筛 选 有 广 泛 交 叉 反 应 的 抗 体, 从 而 实 现 一 次 实 验 同 时 检 测 多 种 甚 至 一 类 农 药 的 残 留 量 小 分 子 药 物, 如 青 霉 素 (penicillins) 链 霉 素 (streptomycin) 等 抗 生 素 在 特 定 的 条 件 下, 如 和 福 氏 佐 剂 混 合 免 疫 动 物 也 可 使 实 验 动 物 产 生 免 疫 应 答, 但 这 种 应 答 反 应 通 常 比 较 弱 在 药 物 免 疫 分 析 中, 通 常 利 用 药 物 分 子 和 载 体 蛋 白 的 结 合 物 合 成 抗 原 免 疫 动 物, 这 样 有 利 于 在 动 物 体 内 产 生 对 药 物 分 子 的 强 免 疫 应 答 反 应, 从 而 得 到 大 量 的 抗 药 物 分 子 的 特 异 性 抗 体 ; 再 利 用 药 物 分 子 的 半 抗 原 特 性, 通 过 药 物 和 产 生 的 特 异 性 抗 体 间 的 相 互 作 用 实 现 对 药 物 分 子 的 分 析 实 践 中, 当 药 物 分 子 和 蛋 白 载 体 结 合 后, 诱 导 机 体 产 生 的 抗 体 通 常 为 不 均 一 抗 体, 即 抗 体 的 特 异 性 略 有 不 同 ; 和 蛋 白 质 的 结 合 还 可 能 导 致 药 物 分 子 原 有 抗 原 决 定 簇 的 改 变 青 霉 素 在 偏 碱 性 条 件 下 和 蛋 白 质 结 合 形 成 的 青 霉 素 噻 唑 蛋 白 合 成 抗 原, 主 要 含 有 三 个 不 同 的 抗 原 决 定 簇, 其 中 内 酰 胺 环 开 环 后 和 蛋 白 质 以 酰 胺 键 结 合 形 成 的 新 位 点 是 新 形 成 的 抗 原 决 定 簇, 其 特 异 性 是 原 半 抗 原 结 构 所 不 具 有 的 因 此, 在 合 成 人 工 抗 原 时 首 先 要 避 免 内 酰 胺 环 的 断 裂 所 以, 一 个 成 功 的 人 工 抗 原 的 合 成 包 括 半 抗 原 的 选 择 和 载 体 的 选 择 2.1 载 体 的 选 择 实 验 设 计 中 要 考 虑 载 体 对 检 测 系 统 的 影 响, 在 免 疫 过 程 中, 合 成 抗 原 免 疫 动 物, 不 仅 可 以 产 生 抗 半 抗 原 抗 体, 也 会 产 生 大 量 的 抗 载 体 蛋 白 抗 体 因 此, 选 择 载 体 蛋 白 时 应 考 虑 载 体 对 检 测 系 统 的 影 响, 通 常 包 括 两 个 反 应 : 其 一, 选 择 的 载 体 应 和 检 测 系 统 不 发 生 交 叉 反 应 如 免 疫 得 到 的 抗 体 要 用 于 测 定 血 液 中 的 半 抗 原, 由 于 血 液 中 存 在 大 量 的 白 蛋 白, 因 此 不 宜 选 用 牛 血 清 白 蛋 白 (BSA) 等 血 液 蛋 白 作 为 载 体 蛋 白, 而 应 选 择 和 血 液 蛋 白 无 关 的 蛋 白 如 破 伤 风 毒 素 (TT) 等 为 载 体 其 二, 在 进 行 ELISA 等 免 疫 分 析 时, 常 将 包 被 抗 原 用 做 竞 争 抗 原 或 作 为 阳 性 对 照, 此 时 用 于 包 被 的 合 成 抗 原 的 载 体 应 和 免 [8] 疫 原 的 载 体 蛋 白 不 同

3 , Vol. 29, No. 07 食 品 科 学 专 题 论 述 如 果 所 要 检 测 的 是 牛 奶 中 抗 生 素 的 残 留, 为 避 免 检 测 系 统 与 载 体 发 生 交 叉 反 应, 就 应 该 选 择 匙 孔 戚 血 蓝 蛋 白 (KLH) 作 为 免 疫 原 的 偶 联 载 体, 选 择 卵 清 蛋 白 (OVA) 作 为 包 被 抗 原 的 偶 联 载 体 2.2 抗 原 合 成 用 于 制 备 免 疫 结 合 抗 原 的 半 抗 原 称 为 免 疫 半 抗 原 影 响 免 疫 分 析 质 量 的 根 本 因 素 是 抗 体 的 选 择 性 和 亲 和 性, 这 些 性 质 又 决 定 于 免 疫 半 抗 原 的 结 构, 因 此 免 疫 半 抗 原 的 设 计 与 合 成 是 建 立 小 分 子 免 疫 分 析 的 关 键 步 骤 将 半 抗 原 与 载 体 蛋 白 偶 联 的 方 法 常 用 的 有 碳 化 二 亚 胺 (CDI) 法 混 合 酸 酐 法 戊 二 醛 法 生 理 生 化 反 应 等 半 抗 原 或 其 衍 生 物 与 载 体 蛋 白 的 偶 联 形 式 的 不 同, 决 定 着 抗 体 特 异 性 的 特 点 选 择 半 抗 原 或 其 衍 生 物 中 参 加 反 应 的 活 性 基 团 要 考 虑 测 定 对 象 是 单 一 药 物 还 是 某 一 类 药 物, 偶 联 后 要 突 出 其 特 定 的 结 构 或 突 出 这 一 类 药 物 中 共 有 的 特 征 结 构 部 分, 免 疫 动 物 后 制 备 的 抗 体 相 应 被 称 为 化 合 物 特 异 性 抗 体 和 簇 特 异 性 抗 体 为 获 得 对 头 孢 类 抗 生 素 具 有 群 选 性 的 簇 特 异 性 抗 体, 选 择 合 成 头 孢 类 抗 生 素 的 母 核 结 构 7- 氨 基 头 孢 烷 酸 (7-ACA) 作 为 半 抗 原, 并 采 用 戊 二 醛 法, 以 半 抗 原 小 分 子 侧 链 上 的 氨 基 为 连 接 臂 与 载 体 蛋 白 相 连, 突 出 其 母 核 结 构 且 戊 二 醛 作 为 交 联 剂 同 时 可 以 起 到 连 接 臂 的 作 用, 可 以 更 好 地 保 持 母 核 结 构 的 立 体 空 间 结 构 2.3 检 测 技 术 免 疫 分 析 法 由 于 其 特 有 的 高 选 择 性 低 检 测 限 和 对 多 种 物 质 的 适 用 性, 免 疫 分 析 成 为 临 床 生 物 医 药 环 境 化 学 以 及 兽 药 残 留 分 析 中 一 种 有 力 的 分 析 手 段 目 前 用 于 药 物 残 留 分 析 的 免 疫 分 析 (IAS) 方 法 主 要 分 为 两 大 类 : 一 是 相 对 独 立 的 分 析 方 法, 即 免 疫 测 定 法 (IAS), 如 RIA ELISA 固 相 免 疫 传 感 器 (solid phase immunosensor) 等 ; 二 是 将 免 疫 技 术 与 常 规 理 化 分 析 技 术 联 用, 如 利 用 免 疫 分 析 的 高 选 择 性 作 为 理 化 测 定 中 的 净 化 手 段, 典 型 的 方 式 为 免 疫 亲 和 色 谱 (IAC) 胶 体 金 免 疫 分 析 法 毛 细 管 电 泳 免 疫 分 析 法 另 外 还 有 人 用 将 免 疫 分 析 法 与 微 滤 孔 芯 片 SPR 生 物 传 感 器 技 术 联 合 用 于 残 留 检 测 相 对 独 立 的 免 疫 分 析 方 法 有 关 ELISA 法 检 测 β- 内 酰 胺 类 抗 生 素 残 留 的 研 究 报 道 较 多, 其 中 又 以 间 接 竞 争 ELISA 法 为 主 Usleber 等 使 用 直 接 竞 争 ELISA 方 法 检 测 牛 奶 中 邻 氯 青 霉 素 和 双 氯 青 霉 素 残 留, 最 小 检 测 限 分 别 为 10ng/ml 和 30ng/ml [9] Strasser 等 采 用 戊 二 醛 法, 通 过 氨 苄 青 霉 素 的 氨 基 与 牛 血 清 白 蛋 白 偶 联, 免 疫 兔 子 制 备 出 具 有 较 高 簇 特 异 性 的 多 克 隆 抗 体, 并 采 用 直 接 竞 争 ELISA 法 检 测 牛 奶 中 青 霉 素 类 抗 生 素 残 留, 检 测 范 围 为 2~32ng/ml Sam Sonova [10] 等 用 间 接 竞 争 ELISA 检 测 牛 奶 中 氨 苄 青 霉 素 残 留, 最 小 检 测 限 为 5.0ng/ml Cliquet 等 采 用 戊 二 醛, 青 霉 素 化 反 应 等 不 同 的 免 疫 原 合 成 方 法, 免 疫 小 鼠, 筛 选 出 3 株 单 克 隆 抗 体, 获 得 了 对 多 种 青 霉 素 有 交 叉 反 应 的 单 克 隆 抗 体, 采 用 间 接 竞 争 ELISA 法 可 同 时 检 测 到 氨 苄 青 霉 素 青 霉 素 G 羟 氨 青 霉 素 苯 唑 青 霉 素 双 氯 青 霉 素, 检 测 灵 敏 度 都 在 欧 盟 最 大 残 留 量 (MRL) 限 度 内 [11] Shirazid 等 使 用 同 样 的 方 法 检 测 牛 奶 和 畜 产 品 中 β - 内 酰 胺 类 抗 生 素 残 留, 最 低 检 测 限 度 为 2. 5~5ng/ml Rose [11] 等 用 筛 选 出 的 2 株 抗 头 孢 噻 呋 单 抗 建 立 了 检 测 头 孢 噻 呋 的 间 接 竞 争 ELISA 方 法, 两 个 克 隆 株 的 检 测 限 分 别 是 [12] 32μg/kg 和 0.3μg/kg 陆 彦 等 通 过 碳 化 二 亚 胺 (EDC) 法 将 氨 苄 青 霉 素 上 的 - COOH 与 血 蓝 蛋 白 (KLH ) 偶 联, 突 出 其 侧 链, 免 疫 小 鼠 后 制 备 抗 氨 苄 青 霉 素 单 克 隆 抗 体, 以 间 接 竞 争 ELISA 法 为 原 理, 检 测 牛 奶 中 氨 苄 青 霉 素, [13] 检 测 灵 敏 度 为 0.4ng/ml 张 建 群 等 采 用 戊 二 醛 法 和 物 理 方 法, 合 成 免 疫 原 和 包 被 原, 并 对 ELISA 方 法 进 行 [14] 了 优 化, 其 检 测 极 限 为 4.17ng/ml 另 外, 吴 建 祥 用 与 细 胞 色 素 C 交 联 的 氨 苄 青 霉 素 (Amp-Cy) 免 疫 的 BALB/ c 鼠 脾 细 胞 与 SP2/0 鼠 骨 髓 瘤 细 胞 融 合, 经 筛 选 克 隆, 获 得 3 株 能 稳 定 传 代 并 分 泌 抗 青 霉 素 的 单 克 隆 抗 体 的 杂 交 瘤 细 胞 (1C1,2C11K 和 2G7), 间 接 竞 争 酶 联 免 疫 吸 附 试 验 (C I-EL ISA ) 显 示,3 株 单 克 隆 抗 体 对 青 霉 素 类 和 先 锋 霉 素 类 抗 生 素 有 特 异 性 反 应, 而 对 链 霉 素 卡 那 霉 素 氯 霉 素 土 霉 素 四 环 素 新 霉 素 其 他 抗 生 素 没 有 交 叉 反 应, 可 用 于 青 霉 素 类 抗 生 素 残 留 的 检 测 与 其 他 分 析 技 术 联 用 SPR 生 物 传 感 器 技 术 也 是 残 留 检 测 研 究 的 一 个 方 向 SPR 生 物 传 感 器 技 术 是 一 种 用 表 面 等 离 子 体 共 振 [16] (SPR) 技 术 为 基 础 的 生 物 传 感 器 检 测 技 术 Dillon 等 使 用 表 面 等 离 子 共 振 (SPR) 免 疫 传 感 器 检 测 牛 奶 中 头 孢 氨 苄 残 留 首 先 将 头 孢 氨 苄 -BSA 联 接 到 传 感 膜 表 面 的 葡 聚 糖 凝 胶 上, 然 后 通 过 微 射 流 取 样 操 纵 系 统 将 待 测 样 品 连 续 注 射 通 过 传 感 膜 表 面, 抗 原 抗 体 特 异 性 结 合 后, 传 感 膜 表 面 复 合 物 浓 度 发 生 变 化, 再 利 用 SPR 检 测 器 把 抗 原 抗 体 反 应 的 情 况 实 时 反 应 在 传 感 图 上, 检 测 范 围 在 0.24~3.9μg/ml GAUDIN V [17] 等 采 用 SPR 生 物 传 感 器 技 术 检 测 经 过 酶 解 和 酸 解 开 环 的 青 霉 素 类 抗 生 素, 氨 苄 青 霉 素 的 检 测 限 分 别 为 33μg/L 和 12.5μg/L, 且 与 头 孢 类 抗 [18] 生 素 没 有 交 叉 反 应 Giuseppe 等 采 用 SPR 生 物 传 感 器 检 测 牛 奶 中 残 留 抗 生 素 β- 内 酰 胺 通 过 离 心 等 前 处 理 避 免 基 质 干 扰 所 检 测 苄 青 霉 素 可 以 达 到 欧 盟 所 规 定 的 最 大 残 [19] 留 限 量 (MRL) 标 准 (4μg/kg) 另 外, Knecht B G 等 将 微 阵 列 芯 片 技 术 与 免 疫 分 析 法 相 结 合 用 于 奶 中 抗 生 素 的 检 测, 采 用 间 接 竞 争 ELISA 模 式 进 行 多 残 留 免 疫 分 析, 结 合 PASA 系 统 进 行 十 种 抗 生 素 的 检 测, 所 有 液 体 样 品

4 专 题 论 述 食 品 科 学 2008, Vol. 29, No 处 理 都 是 自 动 完 成, 每 个 分 析 物 所 需 时 间 不 超 过 5min, 其 中 头 孢 类 抗 生 素 检 测 限 可 达 到 0.12μg/L PASA 系 统 被 认 为 是 第 一 个 可 用 于 大 量 抗 生 素 同 时 检 测 的 免 疫 化 学 生 物 传 感 器 平 台 ] [20] Okerman 等 也 曾 用 固 相 荧 光 免 疫 法 测 定 奶 及 牛 和 猪 肾 组 织 中 头 孢 噻 呋 残 留 头 孢 噻 呋 可 以 被 定 性 的 检 测 1000μg/kg, 此 水 平 相 当 于 或 低 于 肾 组 织 中 头 孢 噻 呋 的 最 大 残 留 限 量 (MRLs) 还 有 人 建 立 了 一 种 flow-through 免 疫 体 系, 是 适 用 于 牛 奶 中 头 孢 菌 素 残 留 检 测 的 自 动 完 整 的 体 系, 此 方 法 的 检 测 限 可 达 1μg/L 低 于 欧 盟 规 [21] 定 的 牛 奶 中 头 孢 菌 素 100μg/kg 的 限 量 将 免 疫 技 术 与 常 规 理 化 分 析 技 术 联 用, 如 Dietvich [22] 等 采 用 戊 二 醛 方 法 将 氨 苄 青 霉 素 与 匙 孔 戚 血 蓝 蛋 白 (KLH) 偶 联, 筛 选 出 两 株 单 克 隆 抗 体, 检 测 限 分 别 为 11.7ng/ml 和 16.6ng/ml, 制 成 免 疫 亲 和 色 谱 柱 吸 附 容 量 分 别 为 6.6μg/ml 和 5.4μg/ml, 羟 胺 苄 青 霉 素 氨 苄 青 霉 素 等 的 回 收 率 为 67%~100% 3 胶 体 金 技 术 在 上 述 与 免 疫 方 法 联 用 的 各 项 检 测 技 术 中, 胶 体 金 快 速 诊 断 技 术 凭 借 其 方 便 快 捷 灵 敏 高 效 稳 定 性 强 等 特 点, 在 医 疗 诊 断 领 域 和 兽 药 残 留 检 测 领 域 中 迅 速 推 广 基 本 原 理 是 以 胶 体 金 作 为 示 踪 标 志 物 应 用 于 抗 原 抗 体 反 应 的 一 种 新 型 的 免 疫 标 记 技 术 胶 体 金 (colloidal gold) 是 由 氯 金 酸 ( HAuCl4 ) 在 还 原 剂 如 白 磷 抗 坏 血 酸 枸 橼 酸 钠 鞣 酸 等 作 用 下, 聚 合 成 为 特 定 大 小 的 金 颗 粒, 并 由 于 静 电 作 用 成 为 一 种 稳 定 的 胶 体 状 态 胶 体 金 在 弱 碱 环 境 下 带 负 电 荷, 可 与 蛋 白 质 分 子 的 正 电 荷 基 团 形 成 牢 固 的 结 合, 由 于 这 种 结 合 是 静 电 结 合, 所 以 不 影 响 蛋 白 质 的 生 物 特 性, 从 而 可 以 做 为 示 踪 标 记 物 应 用 于 生 物 行 业 各 领 域 中 目 前 医 学 检 验 中 应 用 的 胶 体 金 快 速 诊 断 技 术 主 要 有 两 种 : 胶 体 金 快 速 免 疫 层 析 法 (colloidal gold enhanced immunochromatography assay, GICA) 和 快 速 斑 点 免 疫 金 渗 滤 法 (dotimmunogold filt ration assay, DIGFA) 这 两 种 方 法 的 基 本 原 理 都 是 以 微 孔 滤 膜 为 载 体, 包 被 已 知 抗 原 或 抗 体, 加 入 待 检 标 本 后, 经 滤 膜 的 毛 细 管 作 用 或 渗 滤 作 用 使 标 本 中 的 抗 原 或 抗 体 与 膜 上 包 被 的 抗 体 或 抗 原 结 合, 再 用 胶 体 金 结 合 物 标 记 而 达 到 检 测 目 的 不 同 的 是 前 者 是 通 过 垂 直 穿 透 固 定 有 配 体 的 硝 酸 纤 维 素 膜 而 进 行 的, 后 者 反 应 液 体 是 层 析 作 用 的 横 向 流 动 胶 体 金 技 术 利 用 金 颗 粒 可 催 化 银 离 子 还 原 成 金 属 银 这 一 原 理, 采 用 银 显 影 剂 增 强 金 颗 粒 的 可 见 性, 大 大 提 高 测 定 灵 敏 度, 实 验 结 果 表 明 可 达 到 ELISA 的 灵 敏 度 水 平 胶 体 金 技 术 和 ELISA 试 剂 盒 作 为 灵 敏 度 高 便 携 快 速 检 测 方 法 的 首 选, 试 剂 盒 用 于 成 批 量 的 样 品 检 测, 胶 体 金 试 纸 条 用 于 少 量 单 个 样 品 的 检 测, 从 而 互 为 补 充 4 结 语 目 前, 抗 生 素 残 留 分 析 方 法 主 要 有 微 生 物 检 测 法 理 化 检 测 法 和 免 疫 检 测 法 等, 微 生 物 方 法 虽 然 灵 敏 度 准 确 度 差, 但 由 于 其 简 便 易 操 作 至 今 仍 然 被 大 量 采 用 ; 理 化 检 测 法 由 于 高 的 灵 敏 度 和 检 测 限, 作 为 确 证 方 法 必 不 可 少, 但 因 为 其 需 要 昂 贵 的 仪 器 和 专 业 的 操 作 人 员 且 前 处 理 复 杂 也 难 以 普 及 ; 其 中 免 疫 检 测 法 具 有 简 便 快 速 准 确 灵 敏 等 特 点 而 倍 受 研 究 学 者 们 的 关 注 且 根 据 抗 体 产 生 的 机 理 可 以 设 计 合 成 针 对 一 类 药 物 的 单 克 隆 抗 体 或 多 克 隆 抗 体, 从 而 可 以 实 现 同 时 进 行 一 类 药 物 的 检 测, 实 现 现 代 检 测 的 高 通 量 要 求 胶 体 金 在 测 定 牛 乳 肉 类 组 织 血 清 及 尿 液 中 抗 生 素 残 留 时 不 需 要 特 别 的 前 处 理, 具 有 易 于 使 用, 不 需 昂 贵 设 备 等 特 点, 检 测 结 果 与 GC-MS 分 析 有 良 好 的 相 关 性 与 传 统 方 法 相 比, 如 以 纸 片 法 TTC 法 等 为 主 的 MIT 法, 灵 敏 度 高 5~10 倍 ; 且 检 测 灵 敏 度 较 高, 可 以 满 足 检 测 限 量 标 准, 因 此 正 越 来 越 多 的 受 到 研 究 者 的 青 睐 近 年 来, 应 用 免 疫 化 学 和 酶 联 免 疫 用 于 检 测 β - 内 酰 胺 抗 生 素 残 留 已 成 为 一 种 趋 势, 而 且 目 前 还 有 将 HPLC 方 法 与 免 疫 化 学 筛 选 试 剂 盒 结 合 用 于 检 测 β - 内 酰 胺 类 抗 生 素 的 残 留 的 趋 势 另 外, 还 有 将 SPR 生 物 传 感 器 技 术 微 阵 列 芯 片 的 PASA 系 统 等 技 术 用 于 奶 中 抗 生 素 残 留 检 测 因 此, 设 计 合 成 能 够 产 生 具 有 簇 特 异 性 抗 体 的 免 疫 原, 并 将 免 疫 分 析 方 法 与 先 进 的 检 测 技 术 联 用 实 现 快 速 便 携 高 灵 敏 度 高 通 量 的 检 测 是 动 物 源 食 品 中 药 物 残 留 检 测 的 研 究 目 标 参 考 文 献 : [1] 韩 剑 众. 肉 品 品 质 及 其 控 制 [M]. 中 国 农 业 科 学 技 术 出 版 社, 2005: 248. [2] VERDON E, COUEDOR P. Determination of isoxazoly lpenicillins residues in milk by ion-pair high-performance liquid chromatography after percolumn derivatization[j]. Journal of Chromatography B, 1998, 705: [3] RIEDIKER S, HSTADLER R H. Simultaneous determination of five β-lactam antibiotic in bovine milk using liquid chromatography coupled with electrospray ionization tandem mass spectrometry[j]. Anal Chem, 2001, 73: [4] ITO Y, GOTO T, OKA H, et al. Application of ion-exchange cartridge clean-up in food analysis VI. Determination of six penicillins in bovine tissues by liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry [J]. J Chromatogr A, 2004, 1042: [5] 刘 媛, 丁 岚, 谢 孟 峡, 等. 动 物 组 织 中 阿 莫 西 林 残 留 的 液 相 色 谱 分 析 方 法 研 究 [J]. 色 谱, 2003, 21(6): [6] BECONI-BARKER M G. Determination of ceftiofur and its desfuroylceftiofur-related metabolites in swine by high-performance liquid chromatography[j]. J Chromatography B Biomed Appl, 1995, 673

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