2.1.3 试剂与仪器试剂 : ph 7.0 PBS 缓冲液, 恩诺沙星器材 :722 型分光光度计, 离心机, 超净工作台, 恒温培养箱, 全温振荡培养箱,5L 发酵罐 2.2 实验方法菌株的培养

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1 The exploration and practice on the comprehensive experiment in advanced experiment course of microbiology Effect of the physiological states of bacterial population on the result of antibiotic susceptibility test Na Liu, Nana Zhou, Wei Qian, Huaiqiang Zhang* (College of Life Science, Shandong University, Jinan, China, ) * Corresponding author: Tel: ; zhq@sdu.edu.cn Abstract: In this study, the physiological states of Escherichia coli CVCC249 under batch culture are determined by the numerical differential method and nonlinear fitting method. The antibiotic susceptibility of E.coli CVCC249 at different physiological states is accurately characterized with different concentrations of antibiotics based on the concentration-killing curve method. The test studied the effect of physiological states of the bacterial population on the antibacterial agents s killing power. It will help to provide the basis for the clinical use of drugs and the improvement of the method of antibiotic susceptibility test. Keywords: Escherichia coli; numerical differential method; physiological state; CKC method; antibiotic susceptibility 微生物大实验课程综合性实验项目的探索与实践细菌菌群生理状态对抗菌药物敏感性检测实验结果的影响 * 刘娜, 周娜娜, 钱卫, 张怀强 ( 山东大学生命科学学院山东济南 ) * 通讯作者 :Tel: ; zhq@sdu.edu.cn 摘要 : 首先基于数值微分和非线性方程拟合方法, 准确确定了大肠杆菌 E.coli CVCC249 在限制性分批培养下的菌群生理状态进一步通过浓度杀菌曲线 (CKC) 法, 定量表征了处于不同生理状态下的菌群对抗菌药物恩诺沙星敏感性的差异, 进而阐明菌群生理状态对抗菌药物杀菌力的影响研究结果可望为药敏性实验方法的改进和临床抗菌药物的合理使用, 提供理论依据关键词 : 大肠杆菌 ; 数值微分 ; 生理状态 ; 浓度杀菌曲线 (CKC) 法 ; 抗生素敏感性 1 前言当前, 由于抗生素的大量使用, 导致细菌耐药性 / 抗药性问题日趋严重, 从而造成抗生素的治疗效果大为降低 [1-4] 因此, 在临床医学上, 合理科学地使用抗生素, 对避免因抗生素滥用导致细菌抗药性的产生, 起着至关重要性的作用获得稳定而又准确的药敏检测结果, 是合理科学地使用抗生素的重要依据 [5] 一种抗生素对特定细菌杀菌力的测定, 通常会涉及到抗菌药物的浓度被测试菌株的培养条件接种量的大小, 以及菌群的生理状态等多个方面对前三者, 传统的药敏实验方法都对其做了较为严格的限定和规范, 但菌群生理状态对药敏实验结果的影响却常常被忽略本文采用 CKC 法研究处于不同生理状态下的 E.coli CVCC249 群体对抗菌药物敏感性的差异, 以阐明菌群生理状态对抗生素杀菌力的影响, 这对药敏性检测实验方法的改进, 以及临床上抗菌药物的合理使用, 都具有重要意义 [6-9] 2 材料与方法 2.1 实验材料菌株鸡致病性大肠杆菌 E.coli CVCC249, 由中国兽医微生物菌株管理保存中心提供培养基 LB 液体培养基,LB 固体培养基 1024

edu.cn Abstract: In this study, the physiological states of Escherichia coli CVCC249 under batch culture are determined by the numerical differential method and nonlinear fitting method.

2 2.1.3 试剂与仪器试剂 : ph 7.0 PBS 缓冲液, 恩诺沙星器材 :722 型分光光度计, 离心机, 超净工作台, 恒温培养箱, 全温振荡培养箱,5L 发酵罐 2.2 实验方法菌株的培养及休止细胞的制备菌种的活化与转接挑取保藏的大肠杆菌 E.coli CVCC249 菌株接种到固体斜面培养基上,37 活化培养 18 小时将活化好的菌种取适量转接到三角瓶中,37 恒温振荡培养 18 小时休止细胞的制备将三角瓶中的菌液加入到 50mL 离心管中,5000rpm 离心 10min, 弃去上清液, 收集菌体, 用 0.85% 的生理盐水洗涤, 并 5000rpm 离心 5min 最后用 ph 7.0 的 PBS 缓冲液悬浮菌体制成 25mL 菌悬液, 于 4 冰箱中放置 72h 后取出使用前, 对菌液进行稀释后将制备的细胞置于 37 条件下培养 6h 得休止细胞悬滴法测活细胞数 [10] 将制备好的 LB 固体平板培养基在 37 培养箱中放置 48 小时, 使其表面干燥将制备好的平板划为 8 个区, 用无菌吸管吸取 10µL 适当稀释的样品滴种在 LB 固体培养基上, 平稳放置 20 分钟待液体完全渗入培养基中, 将平板倒置于 37 培养箱中培养至长出菌落, 统计形成的菌落数分批培养将约 10 5 休止细胞接种到含 5L 的 LB 培养基的发酵罐中, 以 200r/min 搅拌速度,3mL/min 通气量,37 下进行培养每小时取样 20mL, 用分光光度计在 600nm 波长下测定发酵罐中菌群的浊度, 以其浊度值 (OD 600nm ) 对时间 (t) 作图, 再用 Logistic 方程去拟合之后通过求得瞬时生长速度和瞬时生长加速度, 来区分细菌群体的不同生理状态绘制 CKC 杀菌曲线 [11] 重复上述分批培养, 取不同生理状态细菌 10µL, 经过适当稀释后, 选取每 60µL 含个细菌 ( 远低于自发突变基数, 保证遗传的同质性 ) 的梯度, 按 CKC 法均匀涂布到含有不同浓度恩诺沙星的 LB 平板 ( 平板要放置 24h 以上至平板表面比较干燥 ) 上,37 下倒置培养小时对平板上残留的 CFU 进行计数, 并计算其存活率, 得到不同状态菌群的 CKC 杀菌曲线 3 结果与分析在分批培养过程中, 不同生长阶段的菌群中活细胞 / 死细胞比率各不相同, 而药敏检测实验仅对活菌时才有研究意义, 因此, 通过瞬时生长速度和瞬时生长加速度来表征细菌群体的生理状态, 对测定菌群的药敏性就显得尤为重要本次实验检测了处于休止和减速生长状态下的大肠杆菌 E.coliCVCC249 菌群对抗菌药物敏感性 3.1 分批培养条件下 E.coliCVCC249 菌群生理状态的确定图 1 图 2 和图 3 给出了用发酵罐培养 E.coli CVCC249 生长状况由 Origin 软件进行观测数据平滑后得到的菌群光密度表征的生长曲线呈典型 S 型,Logistic 函数方程可给出很好的拟合 (R 2 = ), 有饱和渐近线生长曲线经过函数方程 y=a 2 +(A 1 -A 2 )/(1+(x/x 0 )^p) 拟合后, 得到的曲线参数为 A 1 = , A 2 = ,x 0 = ,p= 表明, 在前 2.9 个小时内为延迟期, 在 4.45 小时时到达拐点,2.9 小时至 6.81 小时是指数期,6.81 小时之后是稳定生长期 1025

85% 的生理盐水洗涤, 并 5000rpm 离心 5min 最后用 ph 7.0 的 PBS 缓冲液悬浮菌体制成 25

3 图 1. 分批培养条件下以实测光密度值为指标表征的 E.coliCVCC249 生长过程曲线 Figure 1. The growth dynamic curve of E.coli CVCC249 using the observed data of optical density value as index under batch culture 使用 Origin 软件对曲线上不同数据点进行微分, 可得到 E.coli CVCC249 菌群生长的瞬时生长速度和瞬时生长加速度, 如图 2 图 3 所示依据生长曲线以及瞬时生长速度和瞬时生长加速度的极大极小值点和拐点, 对大肠杆菌 E.coli CVCC249 生理状态进行阶段性区分经 Logistic 函数拟合的生长曲线的最大值点相对应的时刻为瞬时生长速率趋于零的点, 而它的拐点对应的时刻为瞬时生长速度峰值的点, 对应于瞬时生长加速度的零值点而瞬时生长速度的拐点则是二阶导数的峰值点根据上述结果不难看出, 在分批培养条件下, 以休止细胞为接种物,37 振荡培养,E.coli CVCC249 的生长从培养起始先后经历了零速加速生长恒速生长减速生长和衰亡等不同生理状态图 2 和图 3 中 A 阶段从开始培养到瞬时生长加速度第一个峰值 ( 瞬时生长速度的第一个拐点 ), 细菌处于加速生长生理状态 ;B 阶段从瞬时生长加速度第一个峰值到瞬时生长速度的峰值 ( 瞬时生长加速度的零值点 ), 细菌处于恒速生长生理状态 ;C 阶段从瞬时生长速度的峰值 ( 瞬时生长加速度的零值点 ) 到瞬时生长速度的第二个拐点 ( 瞬时生长加速度的第二个峰值 ), 细菌处于减速生长生理状态 ;D 阶段从瞬时生长速度的第二个拐点 ( 瞬时生长加速度的第二个峰值 ) 以后, 细菌处于衰亡生理状态 1026

coli CVCC249 菌群生长的瞬时生长速度和瞬时生长加速度, 如图 2 图 3 所示依据生长曲线以及瞬时生长速度和瞬时生长加速度的极大极小值点和拐点, 对大肠杆菌 E.

4 图 2. 分批培养条件下, 以瞬时生长速度 (dn/dt) 为指标表征的 E.coliCVCC249 生长过程曲线 Figure 2.The growth dynamic curve of E.coli CVCC249 using the instantaneous growth rate (dn/dt) as index under batch culture 图 3. 分批培养条件下, 以瞬时生长加速度 (d 2 N/dt 2 ) 为指标所表征的 E.coliCVCC249 生长过程曲线 Figure 3. The growth dynamic curve of E.coli CVCC249 using the instantaneous growth acceleration (dn 2 /dt 2 ) as index under batch culture 1027

coli CVCC249 using the instantaneous growth rate (dn/dt) as index under batch culture 图 3.

5 3.2 E.coli CVCC249 菌群生理状态对抗生素恩诺沙星敏感性的影响本次实验中, 我们研究小组进行了休止生理状态和减速生长生理状态下细菌的药敏性检测用 CKC 方法显示的细菌在不同浓度的恩诺沙星下存活率的变化, 能反映出遗传同质性的群体中个体药物敏感性的差异图 4 图 5 展示了休止细胞的药敏性检测的结果由图 4 可知, 休止细胞在不同浓度的恩诺沙星作用下, 存活率不同随着恩诺沙星浓度的升高, 休止细胞存活率下降即图形呈典型的 S 型,Logistic 方程可给出很好的拟合 (R 2 = ) 由图 5 可知, 杀菌率是单位浓度药物的杀菌数, 在此次检测休止细胞药敏性的实验中,BC 50 为 0.6µg/mL, 在此浓度下杀菌率达到最大值恩诺沙星浓度从 0 到 0.6µg/mL 杀菌率逐渐增大, 从 0.6µg/mL 之后, 杀菌率逐渐减小菌群内个体间药敏性的差异呈现正态分布 ( 图 5) 图 4. 不同浓度的恩诺沙星下 E.coli CVCC249 休止细胞存活率变化曲线 Figure 4. The survival rate curve of E.coli CVCC249 resting cells in different concentration of enofloxacin 1028

质性的群体中个体药物敏感性的差异图 4 图 5 展示了休止细胞的药敏性检测的结果由图 4 可知, 休止细胞在不同浓度的恩诺沙星作用下, 存活率不同随着恩诺沙星浓度的升高, 休止细胞存活率下降即图形呈典型的 S 型,Logistic 方程

6 图 5. 不同浓度的恩诺沙星下 E.coli CVCC249 休止细胞存活率瞬变率 ( 杀菌率 ) 曲线 Figure 5. The instantaneous rate curve of survival rate of E.coli CVCC249 resting cells in different concentration of enofloxacin 图 6 图 7 展示了减速生长期细菌 (OD 600nm =1.208) 的药敏性检测结果由图 6 可知, 减速生长期细菌在恩诺沙星作用下, 随着恩诺沙星浓度的升高, 存活率下降图形也呈现 S 型, 可用 Logistic 方程拟合 (R 2 = ) 由图可知, 在此次检测减速生长期细菌药敏性的实验中,BC 50 为 0.7µg/mL, 在此浓度下杀菌率 ( 存活率的瞬变率 ) 达到最大值恩诺沙星浓度从 0 到 0.7µg/mL 杀菌率逐渐增大, 从 0.7µg/mL 之后, 杀菌率则逐渐减小, 菌群内个体间药敏性的差异呈现正态分布 ( 图 7) 图 6. 不同浓度的恩诺沙星下减速生长生理状态的 E.coli CVCC249 菌群存活率变化曲线 Figure 6. The E.coli CVCC249 population survival curve at decelerate growth physiological state in different concentration of enofloxacin 1029

208) 的药敏性检测结果由图 6 可知, 减速生长期细菌在恩诺沙星作用下, 随着恩诺沙星浓度的升高, 存活率下降图形也呈现 S 型, 可用 Logistic 方程拟合 (R 2 =0.

7 图 7. 不同浓度的恩诺沙星下减速生长生理状态的 E.coli CVCC249 菌群存活率的瞬变率变化曲线 Figure 7. The instantaneous rate curve of survival rate of E.coli CVCC249 population at slow growth physiological state in different concentration of enofloxacin 比较 E.coli CVCC249 在休止细胞时期和减速生长时期的恩诺沙星敏感性时发现, 在恩诺沙星作用下, 随着药物浓度的提高, 生理上最敏感的细菌先被低浓度药物杀死, 大多数在 BC 50 被杀死, 一直到最后最不敏感的细菌被杀死休止细胞药敏性检测实验中 BC 50 为 0.6µg/mL, 减速生长时期的细菌药敏性检测实验中 BC 50 为 0.7µg/mL 由此可得知, 减速生长生理状态菌群对恩诺沙星的敏感性略低于休止细胞 4 讨论对在限制性分批培养条件下的菌群增殖过程, 通常均沿用经典的 Logistic 方程对实测试验数据进行直接拟合, 并仅就拟合曲线的形状将菌群生长过程表观性地划分为延迟期指数生长期稳定期, 以及衰亡期 4 个阶段在当前的研究中, 基于瞬时生长速率和瞬时生长加速度的动态变化, 将细菌菌群的生长阶段区分为零速生长加速生长期恒速生长期减速生长期, 以及衰亡期 5 个阶段 [12], 这一新的区分生长阶段的方法可精确给出各区段的临界点, 有利于准确表征菌群生长的动力学行为和菌群的生理状态, 对细胞生物学生理学遗传学生物工程学, 以及医学微生物等方面的研究具有重要意义药敏参数的定量测定, 不仅受抗菌药物的种类抗菌药物的浓度和作用时间菌株的培养条件接种量大小等方面的制约, 同时也受菌群生理状态的影响本研究就减速期生长状态的 E.coli CVCC249 菌群对抗生素恩诺沙星的敏感性进行检测与表征, 并将其与用静止状态的细胞检测结果进行了对比分析, 比较其差异性有关减速生长期和休止状态的菌群对其它抗生素的敏感性, 以及其它生理状态的菌群对特定抗生素的敏感性的差异, 有待于进行进一步的研究由于恩诺沙星抑制 DNA 旋转酶活性, 进而阻止了 DNA 双链解旋后的复制转录和修复或许是由于从 DNA 合成源头开始抑制, 菌群的异质性和敏感性差异不是很大但由于减速生长时期的细菌有一定的复制的 DNA 的储备, 可以进行转录翻译等, 对恩诺沙星的敏感性要略低于休止细胞, 但差异却不是特别明显 5 References [1] Amyes SG. The rise in bacterial resistance is partly because there have been no new classes of antibiotics since the 1960s[J]. BMJ, 2000, 320:

coli CVCC249 在休止细胞时期和减速生长时期的恩诺沙星敏感性时发现, 在恩诺沙星作用下, 随着药物浓度的提高, 生理上最敏感的细菌先被低浓度药物杀死, 大多数在 BC 50 被杀死, 一直到最后最不敏感的细菌被杀死休止细胞药敏

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Science, 1998, 279: 996-7. [5] Zhang HQ, Zhao Y, He XL, Gao PJ. A novel approach for assessing the susceptibility of Escherichia coli to antibiotics[j]. Sci China Life Sci, 2010, 53(11):1346-1355.

说明为了反映教运行的基本状态, 为校和院制定相关政策和进行教建设与改革提供据依据, 校从程资源 ( 开类别开量规模 ) 教师结构程考核等维度, 对 2015 年春季期教运行基

说明为了反映教运行的基本状态, 为校和院制定相关政策和进行教建设与改革提供据依据, 校从程资源 ( 开类别开量规模 ) 教师结构程考核等维度, 对 2015 年春季期教运行基内部资料东北师范大教运行基本状态据报告 2015 年春季期教务处 2015 年 10 月 27 日说明为了反映教运行的基本状态, 为校和院制定相关政策和进行教建设与改革提供据依据, 校从程资源 ( 开类别开量规模 ) 教师结构程考核等维度,

2.1.3 试 剂 与 仪 器 试 剂 : ph 7.0 PBS 缓 冲 液, 恩 诺 沙 星 器 材 :722 型 分 光 光 度 计, 离 心 机, 超 净 工 作 台, 恒 温 培 养 箱, 全 温 振 荡 培 养 箱,5L 发 酵 罐 2.2 实 验 方 法 菌 株 的 培 养

2.1.3 试剂与仪器试剂 : ph 7.0 PBS 缓冲液, 恩诺沙星器材 :722 型分光光度计, 离心机, 超净工作台, 恒温培养箱, 全温振荡培养箱,5L 发酵罐 2.2 实验方法菌株的培养