動物傳染病研討會

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1 第 八 章 陸 龜 疱 疹 病 毒 感 染 症 張 益 誠 國 立 台 灣 大 學 獸 醫 學 研 究 所 前 言 疱 疹 病 毒 (Herpesvirus) 除 了 感 染 多 種 高 等 脊 椎 動 物 外, 亦 可 感 染 多 種 低 等 脊 椎 動 物, 包 括 魚 類 (fish) 兩 棲 類 (amphibians) 及 爬 蟲 類 (reptiles) 而 陸 龜 疱 疹 病 毒 感 染 症 (Herpesvirus infection of Tortoises), 是 一 種 以 侵 害 消 化 及 呼 吸 系 統 為 主 的 疾 病, 包 括 引 起 口 炎 (stomatitis) 舌 炎 (glossitis) 胃 炎 (gastritis) 腸 炎 (enteritis) 肝 炎 (hepatitis) 鼻 炎 (rhinitis) 氣 管 炎 (tracheitis) 肺 炎 (pneumonia) 及 腦 膜 腦 炎 (meningoencephalitis)(cooper et al., 1988; Drury et al., 1998;Drury et al., 1999;Hervas et al., 2002;Jacobson et al., 1982;Origgi et al., 2001;Origgi et al., 2004;Soares et al., 2004;Teifke et al., 2000;Une et al., 1999;Une et al., 2000 ) 肉 眼 及 組 織 病 理 學 檢 查, 於 口 腔 可 見 黃 白 色 偽 膜 及 壞 死 性 口 炎 及 包 涵 體 (Pettan-Brewer et al., 1996;Une et al., 1999), 而 包 涵 體 出 現 的 組 織, 包 括 腦 鼻 腔 黏 膜 上 皮 細 胞 肺 臟 肝 臟 脾 臟 腎 上 腺 腎 臟 胰 臟 胃 小 腸 及 大 腸 等 (Hervas et al., 2002;Jacobson et al., 1982;Muro et al., 1998 ;Pettan-Brewer et al., 1996; Une et al., 1999) 依 據 國 外 文 獻 報 告, 具 感 受 性 的 陸 龜 包 括 智 利 陸 龜 (Chilean tortoise, Geochelone Chilensis) 四 爪 陸 龜 (Central Asian tortoise, Testudo horsfieldi) 阿 氏 沙 龜 (Desert tortoise, Gopherus agassizii) 赫 曼 陸 龜 (Hermann's tortoise, Testudo hermanni) 豹 紋 龜 (Leopard tortoise, Geochelone pardalis) 希 臘 陸 龜 ( Marginated tortoise, Testudo marginata ) 偽 地 圖 龜 (Map turtle, Graptemys psedogeographica) 蒙 面 地 圖 龜 (Map turtles, Graptemys barbouri) 餅 乾 龜 (Pancake tortoise, Malacochersus tornieri) 紅 腿 象 龜 (Red-foot tortoise, Geochelone carbonaria) 及 歐 洲 陸 龜 (Spur-thighed tortoise, Testudo gracea) 等 診 斷 方 法 包 括 組 織 病 理 學 電 子 顯 微 鏡 觀 察 病 毒 形 態 聚 合 酶 鏈 反 應 (polymerase chain reaction, PCR ) 免 疫 組 織 化 學 染 色 (immunohistochemistry, IHC) 酵 素 結 合 免 疫 吸 附 法 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 原 位 雜 合 反 應 (in situ hybridization, ISH) 血 清 中 和 試 驗 (serum neutralization, SN) 及 病 毒 分 離 (viral isolation) 等 方 法 近 年 來 由 於 教 育 展 示 需 求 及 民 眾 當 作 寵 物 飼 養, 大 量 陸 龜 由 國 外 被 引 進, 期 間 陸 續 發 生 消 化 道 感 染 而 死 亡 案 例, 經 由 組 織 病 理 學 檢 查, 發 現 壞 死 性 胃 炎 及 腸 炎, 病 灶 區 可 見 核 內 包 涵 體 此 為 國 內 首 次 於 陸 龜 發 現 病 毒 性 消 化 道 感 染 而 致 死 的 案 例 因 此 建 立 快 速 準 確 的 診 斷 技 術, 並 研 擬 防 治 方 法, 遏 阻 病 毒 於 陸 龜 族 群 中 散 佈, 乃 是 目 前 重 要 的 課 題 陸 龜 疱 疹 病 毒 之 宿 主 範 圍 根 據 文 獻 報 告 顯 示, 對 疱 疹 病 毒 具 感 受 之 陸 龜 族 群 包 括 智 利 陸 龜 四 爪 陸 龜 阿 氏 沙 龜 赫 曼 陸 龜 豹 紋 龜 希 臘 陸 龜 偽 地 圖 龜 蒙 面 地 圖 龜 餅 乾 龜 紅 腿 象 龜 及 歐 洲 陸 龜 等 皆 有 感 染 之 報 告 其 中, 四 爪 陸 龜 赫 曼 陸 龜 及 歐 洲 陸 龜, 有 較 多 感 染 之 報 告, 推 測 四 爪 陸 龜 赫 曼 陸 龜 及 歐 洲 陸 龜 對 於 陸 龜 疱 疹 病 毒 感 受 性 較 高 (Cooper et al., 1988;Drury et al., 1998; Drury et al., 1999;Hervas et al., 2002;Jacobson et al., 1982;Jacobson et al., 1985;Lange et al., 64

2 1989;Origgi et al., 2001;Origgi et al., 2004;Soares et al., 2004;Une et al., 1999) 陸 龜 疱 疹 病 毒 之 病 毒 特 性 陸 龜 疱 疹 病 毒 屬 於 疱 疹 病 毒 科 (Herpesviridae), 為 DNA 病 毒 目 前 暫 時 歸 於 Alphaherpesvirinae(Une et al., 2000) 病 毒 顆 粒 為 二 十 面 體 (icosahedral), 大 小 約 nm (Drury et al., 1999;Lange et al., 1989), 病 毒 主 要 在 宿 主 細 胞 之 細 胞 核 內 複 製, 具 感 受 性 之 陸 龜 感 染 後, 可 見 核 內 嗜 伊 紅 性 包 涵 體 存 在 病 灶 區 (Murphy et al., 1999) 陸 龜 疱 疹 病 毒 具 有 封 套 (envelope) 與 直 線 型 雙 股 DNA(linear double-stranded DNA) 基 因 組 (genome) 陸 龜 疱 疹 病 毒 之 基 因, 目 前 僅 有 三 段 被 確 認 知, 分 別 為 DNA helicase/primase associated protein (UL5) DNA polymerase ribonucleotide reductase large subunit(ul39), 功 能 分 別 為 促 進 雙 股 DNA 之 氫 鍵 打 開 與 參 與 引 子 (primer) 合 成 參 與 DNA 複 製 (Murakami et al., 2001;Origgi et al., 2004;Soares et al., 2004;Telford et al., 1998) 陸 龜 疱 疹 病 毒 感 染 症 之 傳 播 途 徑 與 流 行 病 學 對 於 陸 龜 疱 疹 病 毒 感 染 症 而 言, 真 正 傳 播 途 徑 至 今 仍 然 未 知, 水 平 傳 播 (horizontal transmission) 可 能 為 主 要 的 途 徑, 包 括 吸 入 接 觸 感 染 動 物 之 唾 液 鼻 分 泌 物 尿 液 與 糞 便 等 ; 有 報 告 顯 示, 病 毒 顆 粒 會 存 在 輸 精 管 上 皮 (ductus deferent epithelium), 因 此, 亦 不 能 排 除 垂 直 傳 播 (vertical transmission) 的 途 徑 陸 龜 疱 疹 病 毒 感 染 具 感 受 性 之 陸 龜, 可 能 不 會 出 現 臨 床 症 狀 與 死 亡, 當 面 臨 運 輸 緊 迫 生 存 環 境 改 變 與 飼 養 密 度 太 高 等 不 適 情 況 下, 導 致 疾 病 爆 發 及 大 量 死 亡 病 例 發 生, 推 測 可 能 具 有 潛 伏 感 染 (latent infection) 的 特 性 (Une et al., 1999) 另 外, 有 報 告 顯 示, 陸 龜 疱 疹 病 毒 較 易 發 生 於 冬 眠 後 ( 春 季 與 夏 季 ), 可 能 與 免 疫 抑 制 有 關 (Muro et al., 1998) 1985 年 報 告, 同 時 進 口 智 利 陸 龜 與 紅 腿 象 龜, 兩 種 共 同 飼 養, 智 利 陸 續 出 現 死 亡 的 病 例 然 而, 紅 腿 象 龜 並 無 病 徵 出 現 與 死 亡 病 例 發 生, 推 測 紅 腿 象 龜 可 能 是 保 毒 者 (reservoir), 散 播 病 毒 給 具 感 受 之 智 利 陸 龜 (Jacobson et al., 1985) 1989 年 報 告, 赫 曼 陸 龜 與 四 爪 陸 龜 共 65 頭, 感 染 疱 疹 病 毒 死 亡 病 例, 死 亡 率 約 50%(Lange et al., 1989) 1999 年 報 告, 先 後 分 別 進 口 四 爪 陸 龜 與 餅 乾 龜, 一 些 四 爪 陸 龜 與 餅 乾 龜 陸 續 感 染 疱 疹 病 毒 死 亡 案 例, 推 測 四 爪 陸 龜 與 餅 乾 龜 可 能 於 出 口 前 運 輸 與 混 養 期 間 感 染 病 毒 (Une et al., 1999) 陸 龜 疱 疹 病 毒 感 染 症 之 診 斷 臨 床 症 狀 (clinical signs) 罹 病 陸 龜 常 見 之 臨 床 症 狀 為 口 腔 與 鼻 腔 分 泌 物 流 涎 (sialorrhea) 眼 睛 分 泌 物 眼 瞼 腫 脹 眼 瞼 水 腫 結 膜 炎 角 膜 炎 眼 緣 炎 (blepharitis) 漿 液 黏 液 性 鼻 炎 食 慾 不 振 食 物 逆 流 嘔 吐 脫 水 衰 弱 沈 鬱 昏 睡 伸 頸 呼 吸 困 難 開 口 呼 吸 頸 部 皮 下 水 腫 及 皮 下 潰 瘍 等 症 狀 (Cooper et al., 1988;Drury et al., 1998;Holt et al., 1976;Jacobson et al., 1982; Jacobson et al., 1985;Muro et al., 1998;Origgi et al., 2001;Origgi et al., 2004;Soares et al., 2004;Teifke et al., 2000;Une et al., 1999) 65

3 血 液 學 與 血 清 生 化 學 (hematology and serum biochemistry) 罹 病 陸 龜 會 出 現 正 球 性 正 色 素 性 貧 血 (normocytic-normochromic anemia) 淋 巴 球 增 多 症 (lymphocytosis) 及 異 嗜 球 減 少 症 (heteropenia) 伴 隨 中 毒 變 化 ; 另 外 aspartate aminotransferase (AST) 與 α-globulin 皆 顯 著 上 升 (Muro et al., 1998) 病 理 學 (pathology) 肉 眼 病 理 學 檢 查 可 見 黃 白 色 偽 膜 附 著 於 口 腔 舌 頭 咽 部 與 食 道 黏 膜 咽 部 膿 瘍 氣 管 黏 面 增 厚, 管 腔 內 充 面 乾 酪 樣 物 肺 氣 腫 肝 臟 腫 大 與 灰 色 小 點 分 佈 於 實 質 及 脾 臟 腫 大 等 (Hervas et al., 2002;Jacobson et al., 1985;Muro et al., 1998;Pettan-Brewer et al., 1996;Teifke et al., 2000;Une et al., 1999) 組 織 病 理 學 檢 查 常 見 偽 膜 樣 壞 死 性 口 炎 (diphtheroid-necrotizing stomatitis) 舌 炎 咽 炎 胃 炎 腸 炎 肝 炎 鼻 炎 氣 管 炎 支 氣 管 炎 肺 炎 及 腦 炎, 可 見 核 內 包 涵 體 存 在 於 病 灶 區 另 外, 口 腔 黏 膜 上 皮 顯 著 增 生 水 腫 變 性, 伴 隨 大 量 纖 維 素 異 嗜 球 (hetrophils) 少 量 淋 巴 球 與 巨 細 胞 浸 潤 ; 舌 頭 黏 膜 上 皮 顯 著 增 生 與 空 泡 變 性 ; 鼻 腔 黏 膜 上 皮 變 性 與 增 生, 伴 隨 大 量 異 嗜 球 浸 潤 細 菌 團 塊 與 小 血 栓 形 成 ; 氣 管 黏 膜 上 皮 顯 著 增 生, 管 腔 內 可 見 大 量 異 嗜 球 漿 細 胞 單 核 球 多 核 巨 細 胞 融 合 巨 細 胞 與 壞 死 細 胞 碎 片 ; 腎 臟 間 質 可 見 少 量 淋 巴 球 與 漿 細 胞 浸 潤 ; 真 皮 層 嚴 重 水 腫 大 量 血 栓 存 在 於 動 脈 管 腔 與 管 壁 壞 死, 周 圍 可 見 一 些 淋 巴 球 與 異 嗜 球 浸 潤 ; 肝 細 胞 胃 小 腸 大 腸 及 膀 胱 上 皮 細 胞 呈 現 氣 球 樣 變 性 (balloning degeneration) 等 偶 爾 可 見 (Cooper et al., 1988;Drury et al., 1998;Harper et al., 1982;Hervas et al., 2002; Jacobson et al., 1985;Marschang et al., 1997;Muro et al., 1998;Origgi et al., 2004;Pettan-Brewer et al., 1996;Teifke et al., 2000;Une et al., 1999) 穿 透 式 電 子 顯 微 鏡 (transmission electron microscopy, TEM) 此 法 的 優 點 是 檢 查 病 灶 區 之 病 毒 顆 粒 形 態 與 大 小, 確 定 病 毒 的 種 類, 有 利 於 疾 病 之 確 診 然 而, 無 法 快 速 診 斷 疾 病 耗 時 與 耗 力 為 其 缺 點 目 前 此 技 術 可 用 來 檢 測 新 鮮 組 織 福 馬 林 固 定 與 石 蠟 包 埋 組 織, 是 否 有 病 毒 病 毒 顆 粒 存 在 (Cooper et al., 1988;Drury et al., 1998;Frye et al., 1977;Hervas et al., 2002;Jacobson et al., 1982;Jacobson et al., 1985;Jacobson et al., 1986;Lange et al., 1989;Muro et al., 1998;Pettan-Brewer et al., 1996;Une et al., 1999) 聚 合 酶 鏈 反 應 (polymerase chain reaction, PCR) 此 法 的 優 點 可 以 快 速 敏 感 偵 測 病 原 體 ( 包 括 細 菌 病 毒 寄 生 蟲 與 黴 菌 ) 的 核 酸 鑑 定 特 定 基 因 存 在 與 否 及 偵 測 基 因 是 否 異 常 等 依 據 報 告 顯 示, 由 新 鮮 組 織 福 馬 林 固 定 組 織 與 石 蠟 包 埋 組 織 皆 可 抽 取 陸 龜 疱 疹 病 毒 之 核 酸, 以 PCR 技 術 檢 測, 發 現 核 酸 可 存 在 於 神 經 系 統 ( 大 腦 小 腦 延 腦 與 腦 神 經 ) 消 化 系 統 ( 口 腔 黏 膜 舌 頭 食 道 胃 大 腸 與 肝 臟 ) 呼 吸 系 統 ( 聲 門 咽 頭 氣 管 與 肺 ) 泌 尿 系 統 ( 腎 臟 與 膀 胱 ) 生 殖 系 統 ( 睪 丸 ) 循 環 系 統 ( 心 臟 ) 與 淋 巴 系 統 ( 脾 臟 )(Murakami et al., 2001; Origgi et al., 2004;Une et al., 2000;VanDevanter et al., 1996) 另 外, 亦 可 應 用 於 臨 床 檢 體 ( 口 腔 或 鼻 腔 拭 子 ) 之 檢 測, 共 檢 測 146 個 檢 體, 結 果 顯 示 12 個 (8.2%) 檢 體 呈 現 陽 性 (Soares et al., 2004) 66

4 酵 素 結 合 免 疫 吸 附 法 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 酵 素 結 合 免 疫 吸 附 法 可 用 來 檢 測 抗 體 與 抗 原, 目 前 已 知 可 應 用 此 技 術 檢 測 陸 龜 血 漿 中 是 否 含 有 疱 疹 病 毒 之 特 異 性 抗 體, 此 法 之 特 異 性 與 敏 感 性 分 別 為 98% 與 97%(Origgi et al., 2003) Origgi 等 人, 由 法 國 收 集 175 個 圈 飼 陸 龜 之 血 漿, 應 用 此 法 檢 測, 結 果 有 37 個 (21.1 %) 檢 體 呈 現 陽 性 另 外, 選 取 歐 洲 陸 龜 5 隻, 以 血 清 中 和 試 驗 檢 測 抗 體 皆 呈 陰 性 4 隻 為 實 驗 組 (2 隻 以 肌 肉 內 與 2 隻 以 鼻 腔 內 接 種 美 國 株 與 德 國 株 ) 及 1 隻 為 對 照 組 ( 以 肌 肉 內 與 鼻 腔 內 接 種 PBS), 檢 測 接 種 前 與 接 種 後 之 血 漿 中 抗 體, 結 果 顯 示, 實 驗 組 在 第 4 週 可 測 得 抗 體, 而 在 第 6 週 抗 體 明 顯 上 升,34 至 36 週 期 間 抗 體 仍 然 存 在 ; 對 照 組 1 至 36 週 期 間 抗 體 仍 然 呈 現 陰 性 此 法 之 優 點 包 括 : 在 短 時 間 之 內 可 同 時 檢 測 大 量 血 漿 檢 體 與 診 斷 陸 龜 族 群 是 否 曾 受 疱 疹 病 毒 感 染, 此 外, 特 異 性 與 敏 感 性 高 可 早 期 偵 測 到 感 染 產 生 之 抗 體 ( 感 染 後 4 週 可 測 得 抗 體 ) 及 省 時 與 省 力 因 此, 此 法 可 大 量 廣 泛 篩 檢 圈 飼 私 人 收 容 所 與 野 生 陸 龜 等 族 群 的 疱 疹 病 毒 感 染 與 實 施 流 行 病 學 之 調 查 分 析 (Origgi et al., 2003) 血 清 中 和 試 驗 (serum neutralization, SN) 血 清 中 和 試 驗 主 要 用 以 偵 測 抗 體 以 此 技 術 偵 測 實 驗 感 染 與 野 外 自 然 感 染 之 血 漿, 兩 者 抗 體 力 價 最 高 分 別 為 64 與 724 倍, 結 果 顯 示, 自 然 感 染 病 毒 產 生 中 和 抗 體 力 價 較 高, 可 能 的 原 因 包 括 : 實 驗 組 陸 龜 只 進 行 一 次 接 種 感 染, 而 野 生 陸 龜 族 群 可 能 持 續 接 觸 病 毒 及 接 種 感 染 之 劑 量 較 少, 自 然 感 染 可 能 接 觸 高 劑 量 病 毒, 刺 激 宿 主 產 生 較 高 之 中 和 抗 體 ; 接 種 感 染 之 病 毒 株, 經 過 多 次 的 寄 代, 其 毒 力 可 能 減 弱, 無 法 刺 激 宿 主 產 生 較 高 之 中 和 抗 體 此 法 與 酵 素 結 合 免 疫 吸 附 法 比 較, 雖 然, 可 以 用 來 偵 測 抗 體, 然 而, 其 缺 點 為 無 法 在 短 時 間 之 內 診 斷 ( 必 需 經 過 10 至 14 天 感 作 才 能 判 讀 ) 無 法 同 時 偵 測 大 量 血 漿 檢 體 及 無 法 偵 測 早 期 感 染 產 生 之 抗 體 ( 感 染 後 7 週 才 能 測 得 抗 體 )(Origgi et al., 2001) 免 疫 組 織 化 學 染 色 (immunohistochemistry, IHC) 應 用 免 疫 組 織 化 學 染 色 可 用 來 診 斷 陸 龜 疱 疹 病 毒 感 染 症, 包 括 間 接 免 疫 過 氧 化 氫 酶 法 (indirect immunoperoxidase, IIP) 與 直 接 免 疫 過 氧 化 氫 酶 法 (direct immunoperoxidase, DIP) 其 中, 間 接 免 疫 過 氧 化 氫 酶 法 主 要 用 以 檢 測 抗 體 ( 血 漿 ) 與 抗 原 ( 活 體 生 檢 福 馬 林 固 定 與 石 蠟 包 埋 等 組 織 ), 此 法 的 優 點 包 括 : 可 快 速 檢 測 血 漿 檢 體 中 是 否 含 有 陸 龜 疱 疹 病 毒 之 特 異 性 抗 體 ( 以 感 染 陸 龜 疱 疹 病 毒 之 細 胞 株 當 抗 原, 來 檢 測 血 漿 中 之 抗 體 ) 檢 測 活 體 生 檢 福 馬 林 固 定 與 石 蠟 包 埋 等 組 織 是 否 含 有 陸 龜 疱 疹 病 毒 之 抗 原 ; 而 直 接 免 疫 過 氧 化 氫 酶 法 主 要 用 來 檢 測 抗 原, 此 法 的 優 點 為 可 快 速 檢 測 感 染 細 胞 株 福 馬 林 固 定 與 石 蠟 包 埋 等 組 織 是 否 含 有 陸 龜 疱 疹 病 毒 之 抗 原 雖 然 間 接 免 疫 過 氧 化 氫 酶 法 酵 素 結 合 免 疫 吸 附 法 與 血 清 中 和 試 驗 皆 可 檢 測 抗 體 然 而, 與 酵 素 結 合 免 疫 吸 附 法 比 較, 其 缺 點 為 費 力, 因 為 進 行 實 驗 前 必 需 先 行 準 備 已 感 染 陸 龜 疱 疹 病 毒 之 細 胞 株 (terrapene heart cell, TH-1) 福 馬 林 固 定 與 石 蠟 包 埋 等 組 織 ; 與 血 清 中 和 試 驗 比 較, 此 法 於 較 短 時 間 可 快 速 診 斷 血 漿 中 是 否 含 有 陸 龜 疱 疹 病 毒 之 特 異 性 抗 體 因 此, 間 接 免 疫 過 氧 化 氫 酶 法 與 直 接 免 疫 過 氧 化 氫 酶 法 可 用 來 確 診 陸 龜 疱 疹 病 毒 感 染 症 (Origgi et al., 2003) 病 毒 分 離 (viral isolation) Marschang 等 人 報 告 由 歐 洲 陸 龜 及 赫 曼 陸 龜 出 現 口 炎 與 鼻 炎 死 亡 病 例, 採 集 周 邊 血 液 白 67

5 血 球 結 膜 咽 部 與 鼻 腔 等 拭 子 及 舌 頭 小 腸 大 腸 氣 管 肺 臟 脾 臟 心 臟 及 腦 等 臟 器, 成 功 分 離 出 疱 疹 病 毒 (Marschang et al., 1997) 另 外, 從 一 些 呼 吸 與 消 化 道 病 變 之 陸 龜 族 群 分 離 病 毒, 以 病 毒 中 和 試 驗 檢 測 均 呈 陽 性 將 病 毒 株 不 活 化, 製 成 疫 苗 並 且 免 疫 57 隻 陸 龜 (26 隻 赫 曼 陸 龜 25 隻 歐 洲 陸 龜 與 6 隻 希 臘 陸 龜 ), 每 隻 陸 龜 各 疫 苗 3 次, 進 行 效 力 評 估 分 別 採 集 第 與 369 天 之 血 液, 以 血 清 中 和 試 驗 檢 測, 結 果 顯 示, 經 疫 苗 免 疫 之 陸 龜, 其 中 和 抗 體 無 顯 著 上 升 (Marschang et al., 2001) Drury 等 人 報 告 一 隻 七 十 歲 齡 歐 洲 陸 龜 罹 患 壞 死 性 口 炎, 進 行 安 樂 死 後, 採 集 舌 頭 肝 臟 氣 管 肺 臟 及 脾 臟 製 成 乳 劑, 接 種 於 TH-1, 接 種 後 第 五 天 出 現 細 胞 病 變 效 應 (cytopathic effect, CPE) 包 括 圓 形 化 或 成 葡 萄 串 樣 聚 集, 取 細 胞 液 接 種 未 感 染 之 TH-1 細 胞 株, 持 續 寄 代 至 第 三 代 仍 然 出 現 類 似 細 胞 病 變 效 應, 並 收 集 細 胞, 進 行 負 染 色, 結 果 可 見 病 毒 顆 粒 存 在 (Drury et al., 1999) 此 法 的 優 點 為 分 離 病 毒 株 後, 可 發 展 單 株 抗 體 疫 苗 應 用 分 子 生 物 學 技 術 增 幅 核 酸, 進 行 序 列 分 析 比 對 及 親 緣 關 係 鑑 定 ; 其 缺 點 為 無 法 快 速 診 斷 疾 病, 因 為 接 種 TH-1 細 胞 株, 大 約 第 五 天 才 會 出 現 細 胞 病 變 效 應 原 位 雜 合 反 應 (in situ hybridization, ISH) 本 法 主 要 針 對 陸 龜 疱 疹 病 毒 UL5 gene(helicase gene), 設 計 一 標 定 有 Digoxigenin(DIG) 之 DNA 核 酸 探 針 (DNA probe), 使 其 與 病 材 中 疱 疹 病 毒 核 酸 特 異 片 段 結 合, 再 結 合 免 疫 酵 素 染 色 法, 以 顏 色 標 示 病 毒 核 酸 所 在 位 置 而 診 斷 此 疾 病 依 據 報 告 指 出, 陸 龜 疱 疹 病 毒 分 布 之 組 織 臟 器 包 括 : 舌 頭 ( 黏 膜 上 皮 細 胞 腺 體 上 皮 細 胞 與 血 管 內 皮 細 胞 ) 腸 管 ( 肌 層 之 神 經 叢 與 血 管 內 皮 細 胞 ) 肝 臟 ( 肝 細 胞 ) 氣 管 ( 黏 膜 上 皮 細 胞 ) 鼻 腔 ( 黏 膜 上 皮 細 胞 ) 肺 臟 ( 肺 泡 上 皮 細 胞 ) 大 腦 ( 神 經 元 與 神 經 膠 質 細 胞 ) 腎 臟 ( 腎 小 管 上 皮 細 胞 ) 與 皮 膚 ( 血 管 內 皮 細 胞 ) 由 上 述 結 果 顯 示, 此 病 毒 以 侵 犯 消 化 呼 道 中 樞 神 經 泌 尿 與 被 皮 等 系 統 為 主 (Teifke et al., 2000) 此 法 適 用 於 福 馬 林 固 定 與 與 石 蠟 包 埋 等 組 織, 但 由 於 步 驟 較 為 繁 雜 及 費 時 ( 約 一 至 二 天 ), 所 以 不 適 用 於 快 速 診 斷 疾 病 與 實 驗 耗 材 費 較 貴 為 其 缺 點 其 優 點 為 經 由 核 酸 標 定, 可 確 定 病 原 分 佈 與 存 在 的 位 置, 適 用 於 致 病 機 轉 之 探 討 與 研 究 陸 龜 疱 疹 病 毒 感 染 症 之 預 防 與 控 制 對 於 陸 龜 疱 疹 病 毒 感 染 症, 至 今 仍 然 無 有 效 的 疫 苗 免 疫, 以 保 護 陸 龜 免 於 感 染 減 少 生 存 環 境 緊 迫 降 低 飼 養 密 度 不 同 品 種 之 陸 龜 避 免 混 養 及 國 外 進 口 之 陸 龜 必 需 施 行 隔 離 與 檢 疫 (12 至 18 個 月 ) 另 外, 建 立 快 速 特 異 性 與 敏 感 性 高 之 診 斷 技 術, 篩 檢 進 口 野 生 私 人 收 容 所 與 圈 飼 之 陸 龜, 發 現 感 染 病 例 應 進 行 隔 離 飼 養, 並 投 予 抗 疱 疹 病 毒 藥 物 治 療 (aciclovir ganciclovir 或 acyclovir), 可 避 免 疾 病 之 擴 散 與 爆 發, 造 成 大 量 陸 龜 死 亡 68

6 圖 一 : 胃 黏 膜 可 見 黃 白 色 偽 膜 附 著 ( 箭 頭 ) 圖 二 : 胃 黏 膜 上 皮 細 胞 壞 死 ( 箭 頭 ) H&E 染 色 圖 三 : 胃 上 皮 細 胞 核 可 見 嗜 酸 性 核 包 涵 體 ( 箭 頭 ) H&E 染 色 圖 四 : 以 穿 透 式 電 子 顯 微 鏡 檢 查 胃 上 皮 細 胞 核 與 細 胞 質 內 皆 可 見 疱 疹 病 毒 顆 粒 ( 箭 頭 ) Bar = 200 nm 參 考 文 獻 1. Cooper JE, Gschmeissner S, Bone RD. Herpes-like virus particles in necrotic stomatitis of tortoises. Vet Rec 123: 544, Drury SE, Gough RE, Kay AV, McArthur SD. Detection and isolation of a herpesvirus from a spur-thighed tortoise (Testudo graeca) in the UK. Vet Rec 145: , Drury SE, Gough RE, McArthur S, Jessop M. Detection of herpesvirus-like and papillomavirus-like particles associated with diseases of tortoises. Vet Rec 143: 639, Hervas J, Sanchez-Cordon PJ, Chacon De Lara F, Carrasco L, Gomez-Villamandos JC. Hepatitis associated with herpes viral infection in the tortoise (Testudo horsfieldii). J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health 49: , Jacobson ER, Clubb S, Gaskin JM, Gardiner C. Herpesvirus-like infection in Argentine tortoises. J Am Vet Med Assoc 187: , Jacobson ER, Gaskin JM, Wahlquist H. Herpesvirus-like infection in map turtles. J Am Vet Med Assoc 181: , Lange H, Herbst W, Wiechert JM, Schliesser T. [Electron microscopic detection of herpesviruses in a mass death of Greek tortoises (Testudo hermanni) and four-toed turtles 69

7 (Agrionemys horsfieldii)]. Tierarztl Prax 17: , Marschang RE, Gravendyck M, Kaleta EF. Herpesviruses in tortoises: investigations into virus isolation and the treatment of viral stomatitis in Testudo hermanni and T. graeca. Zentralbl Veterinarmed B 44: , Marschang RE, Milde K, Bellavista M. Virus isolation and vaccination of Mediterranean tortoises against a chelonid herpesvirus in a chronically infected population in Italy. Dtsch Tierarztl Wochenschr 108: , Murakami M, Matsuba C, Une Y, Nomura Y, Fujitani H. Development of species-specific PCR techniques for the detection of tortoise herpesvirus. J Vet Diagn Invest 13: , Muro J, Ramis A, Pastor J, Velarde R, Tarres J, Lavin S. Chronic rhinitis associated with herpesviral infection in captive spur-thighed tortoises from Spain. J Wildl Dis 34: , Murphy FA, Gibbs EPJ, Horzinek MC, Studdert MJ. Veterinary Virology, 3 rd ed, Origgi FC, Klein PA, Mathes K, Blahak S, Marschang RE, Tucker SJ, Jacobson ER. Enzyme-linked immunosorbent assay for detecting herpesvirus exposure in Mediterranean tortoises (spur-thighed tortoise [Testudo graeca] and Hermann's tortoise [Testudo hermanni]). J Clin Microbiol 39: , Origgi FC, Klein PA, Tucker SJ, Jacobson ER. Application of immunoperoxidase-based techniques to detect herpesvirus infection in tortoises. J Vet Diagn Invest 15: , Origgi FC, Romero CH, Bloom DC, Klein PA, Gaskin JM, Tucker SJ, Jacobson ER. Experimental transmission of a herpesvirus in Greek tortoises (Testudo graeca). Vet Pathol 41: 50-61, Pettan-Brewer KCB, Drew ML, Ramsay E, Mohr FC, Lowenstine LJ. Herpesvirus particles associated with oral and respiratory lesions in a California desert tortoise (Gopherus agassizii). J Wildl Dis 32: , Soares JF, Chalker VJ, Erles K, Holtby S, Waters M, McArthur S. Prevalence of Mycoplasma agassizii and Chelonian herpesvirus in captive tortoises (Testudo sp.) in the United Kingdom. J Zoo Wildl Med 35: 25-33, Teifke JP, Lohr CV, Marschang RE, Osterrieder N, Posthaus H. Detection of chelonid herpesvirus DNA by nonradioactive in situ hybridization in tissues from tortoises suffering from stomatitis-rhinitis complex in Europe and North America. Vet Pathol 37: , Telford EA, Watson MS, Perry J, Cullinane AA, Davison AJ. The DNA sequence of equine herpesvirus-4. J Gen Virol 79: , Une Y, Murakami M, Uemura K, Fujitani H, Ishibashi T, Nomura Y. Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of herpesvirus in tortoises. J Vet Med Sci 62: , Une Y, Uemura K, Nakano Y, Kamiie J, Ishibashi T, Nomura Y. Herpesvirus infection in tortoises (Malacochersus tornieri and Testudo horsfiedii). Vet Pathol 36: , VanDevanter DR, Warrener P, Bennett L, Schultz ER, Coulter S, Garber RL, Rose TM. Detection and analysis of diverse herpesviral species by consensus primer PCR. J Clin Microbiol 34: ,

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