38 暨南大学学报 ( 自然科学与医学版 ) 第 35 卷 cludedneuronnecrosis,vacuolizationandkaryopyknosisetc.,buttheseweremuchslighterintpotreat mentgroup.thelosof

Size: px

Start display at page:

Download "38 暨南大学学报 ( 自然科学与医学版 ) 第 35 卷 cludedneuronnecrosis,vacuolizationandkaryopyknosisetc.,buttheseweremuchslighterintpotreat mentgroup.thelosof"

璜栾
7 years ago
Views:

1 第 35 卷第 1 期暨南大学学报 ( 自然科学与医学版 ) Vol.35 No 年 2 月 JournalofJinanUniversity(NaturalScience&MedicineEdition) Feb TPO 对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的保护作用陈美苑 1, 刘青 1,2, 曾志 3, 周卓妍 1, 蔡岳鞠 4, 宋燕燕 4 5, 杨默 (1. 暨南大学医学院生理学教研室, 广东广州 ;2. 成都经济开发区实验高级中学, 四川成都 ; 3. 广东药学院基础学院生理学教研室, 广东广州 ;4. 广州市妇女儿童医疗中心新生儿科, 广东广州 ; 5. 南方医科大学南方医院血液科, 广东广州 ) [ 摘要 ] 目的 : 观察外源性促血小板生成素 (TPO) 对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后脑功能的保护作用. 方法 :7 日龄 SD 大鼠随机分成对照组 (C 组 ) TPO 治疗组缺氧缺血 (HIBD) 组. 于日龄检测脑质量损伤百分比皮层脑组织 HE 染色免疫组化观察皮层神经元巢蛋白 (Nestin) 的表达 ; 日龄检测脑干诱发电位 (BA EP). 结果 : 与对照组相比较,HIBD 组大鼠可见损伤侧的脑皮质组织学分层消失结构紊乱, 切片中出现大量条索状空洞, 高倍镜下核异常深染核固缩 ;TPO 治疗组能明显改善大鼠脑组织形态变化 ;TPO 治疗组在各取样时间点的脑质量损伤百分比均分别小于 HIBD 组 (P<0 05).HIBD 组大鼠造模 3d 后可见少量 Nestin 蛋白阳性表达出现在神经细胞胞浆轴突和树突内, 造模后第 7 天 Nestin 的阳性表达达到高峰 ; 在相同时间点 TPO 治疗组 Nestin 的阳性表达与 HIBD 组趋势相似.BAEP 检测发现,TPO 治疗组各日龄绝大部分的波峰潜伏期 (PL) 与对照组相比无明显差异 ( 除 21 日龄的 Ⅲ 波,28 日龄的 Ⅱ Ⅲ 波,35 日龄的 Ⅱ Ⅳ 波外 ); 从 14 日龄起 TPO 治疗组绝大部分的 PL 与 HIBD 组相比显著缩短 (P<0 05, 除 14 日龄的 Ⅴ 波尚未能测出外 );14 日龄起,HIBD 组大鼠各波峰间潜伏期 (IPL) 均明显长于对照组 (P<0 05),TPO 治疗组大鼠的大部分 IPL 相比 HIBD 组明显缩短 (P<0 05,14 日龄的各个 IPL,28 日龄的 Ⅲ Ⅴ 除外 ). 结论 : 外源性 TPO 能够在 HIBD 发生早期起到神经保护的作用, 减轻缺氧缺血导致的脑功能损伤. [ 关键词 ] 促血小板生成素 ; 新生大鼠 ; 缺氧缺血 ; 脑 ; 巢蛋白 ; 脑干听觉诱发电位 (BAEP) [ 中图分类号 ] R722.1;R338 [ 文献标志码 ] A [ 文章编号 ] (2014) ProtectionofTPO inneonatalratswithhypoxicischemicbraindamage CHENMeiyuan 1, LIUQing 1,2, ZENGZhi 3, ZHOUZhuoyan 1, CAIYueju 4, SONGYanyan 4, YANGMo 5 (1.DepartmentofPhysiology,MedicalColegeofJinanUniversity,Guangzhou510632,Chnia; 2.EconomicDevelopmentZoneofChengduExperimentalHighSchool,Chendu610100,China; 3.DepartmentofPhysiology,SchoolofBasicCoursesofGuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,Chnia; 4.DepartmentofNeonatology,GuangzhouWomenandChildren smedicalcenter,guangzhou510623,china; 5.DepartmentofHematology,NanfangHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510000,China) [Abstract] Aim:Toobservethebrainfunctionimprovementofapplicationofexogenousthrombopoietin (TPO)inhypoxicischemicbraindamage(HIBD)rats.Methods:Sprague Dawleyrats(7 dayold) wererandomlydividedintoshamoperationgroup(cgroup),tpotreatmentgroupandhibdgroup.the percentageofbrainqualitydamage,pathologicalchangesandtheexpresionofthenestinweredetected afterbirth10d,14dand21dbymorphologicalmethodandimmunohistochemistrymethod.brainstem auditoryevokedpotential(baep)wererecordedafterbirth14d,21d,28dand35d.results:com paredtoshamoperationgroup,themiceinhibdgroupshowedapparenthistopathologicalchangesin [ 收稿日期 ] [ 基金项目 ] 国家自然科学基金项目 ( ) [ 作者简介 ] 陈美苑 (1988-), 女, 硕士研究生, 研究方向 : 神经生理学通信作者 : 周卓妍, 女, 副教授, 硕士生导师,Tel: ; zhuoyanzhou@126.com

广东药学院基础学院生理学教研室, 广东广州 510006;4. 广州市妇女儿童医疗中心新生儿科, 广东广州 510623; 5.

2 38 暨南大学学报 ( 自然科学与医学版 ) 第 35 卷 cludedneuronnecrosis,vacuolizationandkaryopyknosisetc.,buttheseweremuchslighterintpotreat mentgroup.thelosofthepercentageofbrainqualitydamageimprovedsignificantlyintpotreatment groupcomparedhibdgroup(p<0 05)ateverysamplingpoint.Thenumberofnestinpositivecelsin TPOandHIBDgroupweremorethanCgroupateverysamplingpoint(P<0 05).Therewerenosignifi cantdiferenceofpeaklatency(pl)ofbaepintpotreatmentgroupandshamcontrolgroupexpectⅢ wavein21days,Ⅱ Ⅲ wavein28daysandⅢ Ⅳwavein35days.Thereweresignificantlonger(P< 0 05)ofPLinHIBDgroupcomparedTPOtreatmentgroupafter14days(expectⅤ wavein14days). Thereweresignificantlongerofinterpeaklatency(IPL)inHIBDgroupcomparedwithsham operation group(p<0 05)andTPOtreatmentgroup(P<0 05).Conclusion:IntheearlystageofHIBD,the administeredimmediatelywiththrombopoietincanplayaneuroprotectiverole,reducingneuronalnecrosis andimprovedthebraindysfunction. [Keywords] thrombopoietin; neonaterat; hypoxia ischemia; brain; Nestin; brainstemaudi toryevokedpotentials(baep) 新生儿缺氧缺血性脑损伤 (hypoxic ischemic braindamage,hibd) 是指各种因素导致围生期新生儿窒息, 继而引起脑组织缺氧缺血所致的脑损伤综合症 [1], 严重影响新生儿生存率及其今后的生存质量. 促血小板生成素 (thrombopoietin,tpo) 是一种由肝脏分泌的造血生长因子, 在体内的主要生理作用是刺激造血干细胞向巨核系祖细胞增殖分化以及巨核细胞的成熟和释放血小板. 最新研究发现 TPO 能减轻由于缺血造成的脑损伤, 并且能提高损伤后的感觉运动功能 [2]. 脑干听觉诱发电位 (brain stemauditoryevokedpotentials,beap) 是一种较准确的客观测听法 [3], 可敏感地反映外周听神经和脑干的功能活动情况. 颅顶皮下记录的脑干听觉诱发电位源自通路中的突触后电位和神经纤维动作电位. 其波峰潜伏期 (peaklatency,pl) 和波峰间潜伏期 (inter peaklatency,ipl) 主要反映刺激点到发生源之间的神经通路结构功能的完整性, 且后者更为灵敏 [4]. 本实验用组织学及免疫组化检测, 动态测量 BAEP 的 PL 及 IPL 等方法来观察外源性 TPO 对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑组织形态和功能的保护作用, 并探讨其可能的作用机制. 1 材料与方法 1.1 材料 (1) 实验动物清洁级 7 日龄 (7d) 新生 Spra gue Dawley(SD) 大鼠, 购自中山大学实验动物中心 ; 许可证号 :SCXK( 粤 ) , 雌雄不限, 体质量介于 12~17g 之间. (2) 主要试剂与仪器重组人促血小板生成素注射液购自沈阳三生制药有限责任公司 ; 混合气体 : 氧气和氮气体积分数分别为 7 99% 与 92 1%, 购自肇庆高能达化工有限公司 ; 免疫组化染色试剂盒, 购自上海沪试化工有限公司 ; 大鼠抗巢蛋白 401(Anti Nestin,clonerat 401) 购自 MiliporeCorparation;DAB 显示试剂盒, 购自上海生工生物工程有限公司. CY 12C 数字测氧仪为建德市梅城电化分析仪器厂产品 ;LeicaRM2255 病理切片机为德国莱卡公司产品 ;BDM130/200 数码生物显微镜 ; 诱发电位仪 (Neuropack2Ⅱ plus,meb25200) 购自日本光电公司. 1.2 方法 (1) 动物模型的制备及分组 7 日龄新生 SD 大鼠, 随机分成 3 组, 每组 15 只.1 对照组 (C 组 ): 仅分离左侧颈总动脉然后缝合, 不做血管结扎和缺氧处理 ;2TPO 治疗组 (TPO 组 ): 动物在缺氧缺血模型建立成功后立即按照 15U/10g 的质量分数腹腔注射 rhtpo 稀释液 ;3 缺氧缺血组 (HIBD 组 ): 按动物建模的方法进行缺氧缺血处理, 对应 TPO 治疗组的给药剂量给药时间, 腹腔注射等量生理盐水. TPO 组 HIBD 组按文献 [5] 制备 HIBD 模型 : 用苦味酸标记 7d 新生大鼠并称重. 室温下用乙醚麻醉大鼠后固定在手术板上, 用手术刀在颈部正中偏左 2mm 处做一纵切口, 钝性分离皮下各层组织, 使左侧颈总动脉暴露, 双线结扎, 中间离断, 继而缝合切口. 送回母鼠身边休息 1h 后, 置 37 2 恒温水浴缺氧仓内 2h, 缺氧仓按文献 [6] 方法设计, 持续以 2 0L/min 的速度向缺氧仓内通低氧混合气体使氧体积分数维持在 8%. 同时在缺氧箱出气口接测氧仪监测仓内氧体积分数 (8 0±0 5)%. 舱底滤网下铺适量钠石灰以吸收产生的 CO 2 和水蒸气.

Thenumberofnestinpositivecelsin TPOandHIBDgroupweremorethanCgroupateverysamplingpoint(P<0 05).

3 第 1 期陈美苑, 等 :TPO 对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的保护作用 39 (2) 各组大鼠各日龄脑质量损伤百分比的检测各组大鼠在日龄时用水合氯醛麻醉后打开胸腔从左心室灌注质量浓度为 40g/L 多聚甲醛, 断头取脑, 剔除嗅球小脑脑干等, 分割左右半球, 用微量天平分别称重. 大鼠各日龄的脑质量损伤 % =( 右脑质量 - 左脑质量 )/ 右脑质量 100%. (3) 脑组织形态学和 Nestin 表达 1 大鼠脑组织切片 HE 染色 HE 染色标本制备 : 各组大鼠在生长 21d 后, 通过吸入乙醚麻醉后打开胸腔, 从左心室灌注至少两倍于大鼠体重的质量浓度为 40g/L 的多聚甲醛后, 断头取脑, 去除脑干小脑和嗅球等组织, 置于足量质量浓度为 40g/L 多聚甲醛中浸泡固定. 按常规步骤脱水透明浸蜡包埋制做蜡块, 参照大鼠脑立体定位图谱 [7], 于石蜡切片机上连续冠状切片, 切片部位位于大鼠对耳线 6 2 ~4 2mm 之间, 切片厚度 4μm, 此区域主要包括第一听皮质第二听皮质海马等结构. 作常规 HE 染色, 观察脑组织形态变化. 2Nestin 表达各组大鼠于不同日龄取脑, 按常规制成蜡块切片, 经脱蜡脱水, 微波抗原修复 10~20min 后, 室温下用体积分数为 3% H 2 O 2 封闭 10min 阻断内源性过氧化物, 加正常山羊血清工作液于组织切片, 室温下封闭 20min,1 80 Nestin 抗体 4 过夜, 滴加生物素化二抗,37 中孵育 20min,DAB 显色, 苏木素复染, 脱水透明中性树脂封片. 对照实验以浓度 0 01mol/LPBS 液代替一抗孵育切片, 在 400 倍的显微镜下随机选取相关区域 5 个视野摄片, 利用 Image ProPlus6 0 软件进行图像处理以及细胞计数, 并采用单盲法即阅片时未知样本资料统计实验结果. (4) 检测脑干听觉诱发于和 35 日龄时, 将各组大鼠乙醚吸入麻醉后用诱发电位仪描绘 BAEP 波形, 测量各 PL, 并计算得出个 IPL.BAEP 检测方法 : 颈总动脉结扎侧采用单耳声刺激, 同时利用橡皮泥堵塞对侧耳道, 在相同条件下重复记录 3 次. 使用无损皮下定位针安放电极, 在实验记录前电极针和大鼠皮肤须用体积分数为 75% 酒精进行消毒. 在两耳根连线的中点即颅顶皮下放置引导电极, 上颌皮下则放置参考电极, 接地电极连接于尾部皮下. 记录 BAEP 参数设定为 : 扫描时间 10ms, 声刺激为交替短声, 声刺激强度 90dB(soundpresurelev el,spl), 滤波频带 100Hz~3000Hz, 刺激重复率 10Hz, 叠加次数 256 次. 记录 BAEP 时须监测干扰情况, 防止周围的电磁干扰和大鼠肌肉收缩活动等其它生物电流对 BAEP 记录的影响. 1.3 统计学处理实验数据以 ( 均数 ± 标准差 )( x±s) 珋表示. 用 SPSSforWindows13 0 软件对数据进行单因素方差分析 (One WayANOVA). 组间两两比较采用 S N K 检验 (Student Newman Keuls,q 检验 ), 其中试验组两两比较采用 Bonferoni 法, 与对照组比较采用 Dunnet 法,P<0 05 为有统计学差异. 2 结果 2.1 各组大鼠脑质量损伤百分比的比较 HIBD TPO 组大鼠不同时间点的脑质量损伤 % 均明显大于对照组 (C 组 )(P<0 05);TPO 组在不同时间点的脑质量损伤 % 均分别小于 HIBD 组 (P< 0 05);HIBD TPO 组的脑质量损伤 % 随日龄增加而增大, 且 HIBD 组脑质量损伤 % 随日龄的增加趋势较 TPO 组明显 ( 表 1). 表 1 不同日龄组大鼠脑质量损伤百分率 Table1 Qualityofeachdiferentdayageofratsbrain damagepercentage( x±s,ms) 珔组别 10 日龄 14 日龄 21 日龄 n 脑损伤 % n 脑损伤 % n 脑损伤 C ± ± ±0.04 HIBD ±6.19 1) ±3.11 1) ±2.53 1) TPO ±1.89 1) ±4.61 1),2) ±5.06 1) 1) 与 C 组相比较,P<0 05;2) 与 HIBD 相比较,P< 各组大鼠脑组织切片 HE 染色 HE 染色病理观察 HE 染色结果显示造模后 14dHIBD 组与 TPO 组大鼠脑组织切片出现明显差异.HIBD 组大鼠左侧大脑皮质结构紊乱组织学分层消失呈现疏松空网状. 呈见神经元丢失坏死, 空泡形成, 高倍镜下无法辨认其轴树突, 核异常深染固缩. 与对照组 (C 组 ) 相比, 脑组织形态差异明显 ( 图 1).TPO 治疗组大鼠脑组织结构基本正常, 镜下少见空洞. 神经细胞形态基本正常, 核仁较清晰. 神经胶质细胞形态亦基本正常, 与假手术组比较, 镜下差异不明显 ( 图 1). 2.3 各组大鼠 Nestin 的表达变化免疫组织化学染色后在光镜下观察发现 :Nestin 蛋白在大鼠脑组织阳性表达呈棕黄色染色, 主要表达于神经细胞的胞浆轴突和树突, 在大脑皮层和海马区域均可见有散在的表达 ( 图 2).TPO 治疗组大鼠在造模 3dNestin 蛋白阳性表达开始增多, 造模

(3) 脑组织形态学和 Nestin 表达 1 大鼠脑组织切片 HE 染色 HE 染色标本制备 : 各组大鼠在生长 21d 后, 通过吸入乙醚麻醉后打开胸腔, 从左心室灌注至少两倍于大鼠体重的质量浓度为 40g/L 的多聚甲醛后, 断头取脑, 去除脑干小脑

4 ４０暨南大学学报自然科学与医学版第３５卷１４对照组２５ＨＩＢＤ组３６ＴＰＯ组１３４０４６４００图１建模１４ｄ大鼠大脑皮质ＨＥ染色Ｆｇ１Ｂｕｌｄｇｆｒ１４ｄｒｃｒｂｒｌｃｒｘＨＥｇ图２大鼠Ｎ免疫组织染色４００Ｆｇ２ＮｍｍｕｈｃｈｍｃｌｇｌｃｒＤｐｈｘｐｒｆｎｐｖ４００

5 第 1 期陈美苑, 等 :TPO 对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的保护作用 41 7d 后此阳性表达有轻微升高的趋势, 造模 14d Nestin 的阳性表达略有下降 ;HIBD 组大鼠与 TPO 治疗组大鼠 Nestin 蛋白的阳性表达变化趋势相似 ; 对照组大鼠 (C 组 ) 不同时间点可见少量散在的 Nestin 的棕黄色阳性表达, 但各时间点表达的区别不大. 大鼠脑组织切片经 Nestin 免疫组织化学染色后的阳性细胞数目改变反映了大鼠脑组织神经干细胞的数目变化情况.TPO HIBD 组大鼠在日龄时 Nestin 阳性细胞数目均多于同日龄对照组 (C 组 )(P<0 05); 但 TPO 组与 HIBD 组的 Nestin 阳性细胞数目无明显差别 ( 表 2). 2.4 各组大鼠 BAEP 的变化各组大鼠在日龄时 BAEP 的波形变化 ( 图 3). 结果表明从对照组 (C 组 ) 到 TPO 治疗组到 HIBD 组各组大鼠 BAEP 的 Ⅰ 至 Ⅴ 波的波峰 (PL) 出现时间, 逐渐延长. 表 2 不同日龄组大鼠 Nestin 阳性细胞 Table2 GroupsofratswithdiferentdayageNestinposi tivecelsnumbercomparison( x±s) 珔 10 日龄 14 日龄 21 日龄组别 n Nestin 阳性细胞 / 个 Nestin 阳性细胞 / 个 Nestin 阳性细胞 / 个 C ± ± ±11.48 HIBD ± ) ± ) 71.33± ) TPO ± ) 97.33± ) 82.83± ) 1) 与 C 组相比较,P<0 05;2) 与 HIBD 相比较,P< :14 日龄 ;2:21 日龄 ;3:28 日龄 ;4:35 日龄 ;C: 对照组 ;TPO:TPO 组 ;HIBD:HIBD 组. 图 3 不同日龄组大鼠 BAEP 波形变化 Fig.3 DiferentdayageofBAEPwaveformchangesinrats

TPO HIBD 组大鼠在 10 14 21 日龄时 Nestin 阳性细胞数目均多于同日龄对照组 (C 组 )(P<0 05); 但 TPO 组与 HIBD 组的 Nestin 阳性细胞数目无明显差别 ( 表 2). 2.4 各组大鼠 BAEP 的变化各组大鼠在 14 21 28 35 日龄时 BAEP 的波形变化 ( 图 3).

6 42 暨南大学学报 ( 自然科学与医学版 ) 第 35 卷 TPO 治疗组不同日龄绝大部分的波峰潜伏期 (PL) 与对照组 (C 组 ) 相比无明显差异 ( 除 21 日龄的 Ⅲ 波,28 日龄的 Ⅱ Ⅲ 波,35 日龄的 Ⅱ Ⅳ 波外 ); 从 14 日龄起 TPO 治疗组绝大部分的 PL 与 HIBD 组相比显著缩短, 除 14 日龄的 Ⅴ 波尚未能测出外 ( 表 3) 14 日龄时,HIBD 组大鼠各波峰间潜伏期 (IPL) 均明显长于对照组 (C 组 ),TPO 治疗组大鼠的大部分 IPL 相比 HIBD 组明显缩短,14 日龄的各个 IPL, 28 日龄的 Ⅲ Ⅴ 除外 ( 表 4). 表 3 不同日龄组大鼠波峰潜伏期 (PL) 在 BAEP 变化 Table3 GroupsofratswithdiferentdayageofBAEPchangesinPL( x±s,ms) 珔日龄 /d 组别 n Ⅰ 波 PL Ⅱ 波 PL Ⅲ 波 PL Ⅳ 波 PL Ⅴ 波 PL 14 C ± ± ± ±0.58 TPO ±0.31 1) 3.56± ±0.51 1) 7.21± HIBD ±0.44 2) 3.72± ±0.35 2) 7.48±0.44 2) 21 C ± ± ± ± ±0.30 TPO ±0.11 1) 3.24±0.41 1) 3.94±0.4 1),2) 5.24±0.68 1) 6.91±0.54 1) HIBD ±0.09 2) 3.82±0.49 2) 4.60±0.51 2) 6.53±0.50 2) 7.44±0.49 2) 28 C ± ± ± ± ±0.22 TPO ±0.07 1) 2.67±0.2 1),2) 3.56±0.3 1),2) 4.63±0.33 1) 6.71±0.50 1) HIBD ±0.15 2) 3.32±0.42 2) 4.40±0.48 2) 5.82±0.30 2) 7.34±0.64 2) 35 C ± ± ± ± ±0.20 TPO ±0.29 1) 2.53±0.23 1),2) 3.53±0.1 1),2) 4.53±0.1 1),2) 5.74±0.5 1),2) HIBD ±0.27 2) 3.16±0.35 2) 4.30±0.52 2) 5.67±0.39 2) 7.53±0.47 2) 未测试 ;1)HIBD 组相比较,P<0 05;2) 对照组相比较,P<0 05. 表 4 不同日龄组大鼠各波峰间潜伏期 (IPL)BAEP 变化 Table4 GroupsofratswithdiferentdayageIPLofBAEPchanges( x±s,ms) 珔日龄 /d 组别 n Ⅰ ~Ⅱ 波 IPL Ⅰ ~Ⅲ 波 IPL Ⅱ ~Ⅳ 波 IPL Ⅰ ~Ⅳ 波 IPL 14 C ± ± ± ±0.34 TPO ± ±0.52 1) 3.69± ±0.25 2) HIBD ± ±0.33 2) 3.81± ±0.62 2) 21 C ± ± ±0.08 TPO ±0.49 1),2) 3.08±0.38 1) 5.62±0.67 1) HIBD ±0.62 2) 3.31±0.51 2) 5.95±0.37 2) 28 C ± ± ±0.62 TPO ±0.27 1),2) 3.16±0.25 2) 5.47±0.48 2) HIBD ±0.57 2) 2.96±0.28 2) 5.89±0.61 2) 35 C ± ± ±0.15 TPO ±0.31 1),2) 2.25±0.64 1) 4.56±0.37 1) HIBD ±0.49 2) 3.28±0.36 2) 6.23±0.46 2) 未测试 ;1) 与 HIBD 组相比较,P<0 05;2) 对照组相比较,P< 讨论造血生长因子是一类能调节造血功能的蛋白质因子, 在血液系统内的主要功能是调节和促进各类血细胞的增殖分化和成熟释放. 新近的研究发现, 造血生长因子也具有神经保护作用 [8]. 本研究组以往的研究表明 : 促红细胞生成素 (erythropoietin, EPO) 早期使用可起到良好的神经保护作用, 减轻

( 表 4). 表 3 不同日龄组大鼠波峰潜伏期 (PL) 在 BAEP 变化 Table3 GroupsofratswithdiferentdayageofBAEPchangesinPL( x±s,ms) 珔日龄 /d 组别 n Ⅰ 波 PL Ⅱ 波 PL Ⅲ 波 PL Ⅳ 波 PL Ⅴ 波 PL 14 C 15 1.52±0.15 3.33±0.44 4.

7 第 1 期陈美苑, 等 :TPO 对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的保护作用 43 HIBD 造成的脑组织神经元的坏死和丢失, 改善脑功能, 促进脑发育 [8-9].TPO 是多肽糖蛋白,N 端有与 EPO 相似的部分存在 23% 氨基酸残基相同, 此端可参与受体的结合,TPO 是否也具有与 EPO 相似的功能? 即能在神经受损后, 发挥一定神经保护作用 [10] [11]. 杨默等利用免疫组织化学法和 RT PCR 等方法对促血小板生成素的受体在中枢神经系统中的表达进行研究, 发现许多部位如大脑半球小脑, 小鼠神经干细胞株 C17 2 细胞中均有 TPO 受体的表达, 后续实验结果还发现 TPO 能促进 C17 2 细胞生长和对抗 C17 2 细胞凋亡的作用. 进一步提示 TPO 可能也具有神经保护作用. 本实验利用新生大鼠缺氧缺血性脑损伤为模型, 研究外源性 TPO 在新生大鼠缺血缺氧性脑损伤后是否有神经保护作用以及其可能的保护机制. 本研究结果显示,HIBD 组大鼠损伤早期能观察到脑组织水肿现象以及出血点或坏死灶的出现.10 日龄时,HIBD 组大鼠脑质量损伤百分率明显大于正常组大鼠 ;TPO 治疗组大鼠则情况要好得多, 且随日龄增加, 脑质量损伤百分率始终小于未经治疗的 HIBD 大鼠. 说明 TPO 的治疗对于减轻损伤早期的脑水肿现象以及后期的脑组织坏死萎缩均有很大帮助, 能够减轻由此带来的脑组织结构破坏和脑功能障碍. 脑组织切片 HE 染色中可看出, HIBD 发生后, 大脑皮层细胞排列紊乱, 细胞间隙增大, 出现大量条索状空洞, 脑组织结构呈海绵状, 神经元胞体边界不清, 核深染固缩, 神经细胞大多出现明显皱缩, 高倍镜下无法辨认其轴树突, 部分可观察到核裂解现象. 造模后给予 TPO 治疗的大鼠 (TPO 组 ) 脑组织损伤程度较 HIBD 组明显减轻, 神经细胞基本正常, 少见坏死现象, 与正常大鼠接近. 这说明早期给予 TPO 治疗在一定程度上能减轻 HIBD 带来的脑组织病理改变. 巢蛋白 (Nestin) 是在胚胎神经前体细胞及成年神经干细胞中阶段性表达的一种中间丝蛋白,Nestin 随神经干细胞 (neuralstem cel,nscs) 移行和分化后表达逐渐减少直至消失. 可将巢蛋白当作 CNS 发育过程中的阶段性标志 [12].NSCs 分布于哺乳动物的 CNS 中, 在生理情况下, 成年哺乳动物的 NSCs 大多保持静止状态 [13]. 发生脑损伤时,NSCs 通过增殖定向移行并分化来修复和再生受损的神经系统 [14]. 因此, 体内 TPO 的保护作用是否也是通过促进神经干细胞的增殖分化来发挥促进神经元再生, 脑组织结构重塑和功能修复? 本实验结果显示, HIBD 组大鼠 10 日龄时可见 Nestin 蛋白阳性表达增加, 且出现在神经细胞胞浆轴突和树突内,14 日龄时 Nestin 的阳性表达达到高峰 ; 在相同时间点 TPO 治疗组 Nestin 的阳性表达与 HIBD 组增加趋势相似, 但两组 Nestin 阳性细胞数目差别不大. 此结果表明, 单次给予 15U/10g 的 TPO 组与 HIBD 组相比无明显提高 Nestin 阳性细胞数目.TPO 组 Nestin 阳性细胞数目增多的原因可能与 HIBD 组相同, 是缺氧缺血刺激引起的 Nestin 表达的上调. 提示体内 TPO 的神经保护作用可能通过其它机制发挥作用. BAEP 是评价脑功能的一个重要指标,BAEP 与脑功能直接相关, 其结果的异常反映了中枢听觉传导通路及其邻近神经结构的形态和功能的病变情况. 有研究表明, 当脑结构损伤及功能异常时 BAEP 会出现明显异常, 主要表现为 PL 和 IPL 的延长, 其延长程度与脑损伤程度成正比 [15], 故可以通过测量 PL 和 IPL 来判断 HIBD 造成的脑功能损伤严重程度 [16] [17]. 本研究小组早期的结果显示 : 大鼠的听觉发育模式属于生后发育型, 且 BAEP 的各 PL 和 IPL 随日龄的增长而缩短. 本实验中, 随着大鼠日龄的增长, 假手术对照组大鼠 BAEP 的 PL 和 IPL 随日龄的增长而缩短, 与本研究小组以往的研究结果相符. 未经治疗的 HIBD 大鼠从 14 日龄至 35 日龄的各 PL IPL 相比假手术对照组大鼠均明显延长, 说明缺氧缺血明显影响 HIBD 组大鼠听觉神经系统的发育及功能. 而 TPO 组大鼠 BAEP 各波的 PL 及 IPL 随日龄增长逐渐缩短, 接近正常大鼠水平, 与正常大鼠听觉神经系统的生后发育规律一致, 提示 TPO 干预能够对 HIBD 造成新生鼠脑功能障碍起到治疗和改善作用. 减轻脑缺氧缺血对脑部发育的影响. 综上, 在 HIBD 发生的早期应用 TPO 能够起到神经保护的作用,TPO 能明显改善新生大鼠缺氧缺血后的脑发育和功能, 减少缺血缺氧时神经元的坏死和丢失, 有利于脑功能的恢复. 但 TPO 在 HIBD 中的具体治疗机制仍不十分明确, 有待进一步研究探讨. [ 参考文献 ] [1] ANDERSONCA,ARCINIEGASDB.Cognitivesequel aeofhypoxic ischemicbraininjury:areview[j].neuro Rehabilitation,2010,26(1): [2] ZHOUJ,LIJ,ROSENBAUMDM,etal.Thrombopoie

杨默等利用免疫组织化学法和 RT PCR 等方法对促血小板生成素的受体在中枢神经系统中的表达进行研究, 发现许多部位如大脑半球小脑, 小鼠神经干细胞株 C17 2 细胞中均有 TPO 受体的表达, 后续实验结果还发现 TPO 能促进 C17 2

8 4 暨南大学学报 ( 自然科学与医学版 ) 第 35 卷 tinprotectsthebrainandimprovessensorimotorfunc tions:reductionofstroke inducedmmp 9upregulation andblood brainbarierinjury[j].journalofcerebral BloodFlowandMetabolism,2011,31(3): [3] 谢浩勋, 杨思达, 罗慧, 等. 脑干听觉诱发电位在新生儿缺血缺氧性脑病中的价值 [J]. 广州医药,2010, 41(1): [4] ZHOU X,JEN PH,SEBURN K L,etal.Auditory brainstem responsesin10inbredstrainsofmice[j]. BrainRes,2006,1091(1): [5] 马殿伟, 谢学军, 李晓微, 等. 缺氧实验模型研究进展 [J]. 医学综述,2007,13(23): [6] 陈惠金, 周泽汉, 周建德, 等. 新生大鼠缺氧实验装置的研制 [J]. 上海实验动物科学,1999,19(1): [7] PAXINOSG,WATSONC 著, 诸葛启钏主译. 大鼠脑立体定位图谱 [M]. 第 3 版. 北京 : 人民卫生出版社, 2005: [8] 曾志, 周卓妍, 宋燕燕, 等. 促红细胞生成素对新生大鼠缺氧缺血型脑损伤的保护作用 [J]. 暨南大学学报 : 医学版,2011,32(2): [9] 刘青, 曾志, 周卓妍, 等.EPO 对新生大鼠缺血缺氧性脑损伤 NSE 表达的影响 [J]. 暨南大学学报 : 医学版,2012,32(6): [10] 夏文杰, 项鹏, 杨默, 等. 血小板生成素 thrombo poietin 对神经保护作用的体外研究 [J]. 热带医学杂志,2007(07): [11] 杨默, 夏文杰, 李桂霞, 等. 中枢神经系统表达 TPO 受体的初步研究 ( 英文 )[J]. 中国实验血液学杂志,2004(04): [12] 林进平. 巢蛋白与神经干细胞 [J]. 现在诊断与治疗, 2009,20(6): [13] GAGEFH.Mammalianneuralstemcels[J].Science, 2000,287(5457): [14] MACKOWIAKM,CHOCYKA,Markowicz KulaK,et al.neurogenesisintheadultbrain[j].poljpharmacol, 2004,56(6): [15] ACIOLYM A,CARVALHOCH,KOERBELA,etal. Intraoperativebrainstem auditoryevokedpotentialobser vationsaftertrigeminocardiacreflexduringcerebelopon tineanglesurgery[j].jneurosurganesthesiol,2010, 22(4): [16] 王惠娟. 脑干听觉诱发电位脑电图在新生儿缺血缺氧性脑病诊断中的作用 [J]. 中国医疗前沿,2007,2 (12): [17] 何斯纯, 林兴会, 周卓妍, 等. 大鼠脑干听觉诱发电位和中潜伏期反应的生后发育 [J]. 中国应用生理学杂志,2001,17(2): [ 责任编辑 : 朱颖?]

Auditory brainstem responsesin10inbredstrainsofmice[j]. BrainRes,2006,1091(1):16-26. [5] 马殿伟, 谢学军, 李晓微, 等. 缺氧实验模型研究进展 [J]. 医学综述,2007,13(23):1795-1798. [6] 陈惠金, 周泽汉, 周建德, 等.

596.doc

596.doc 2005596 4 3 2794 2796 51 2800 51 238 238 1. 238 238 1 2. 3 2 2 6 3. 238 238 4. 238 2 238 1. 4 3 2. 3. 1. 2005107 2. 238 1. 238 2. 3. 1 238 2 238 238 238 1. 0.8mm 1.6mm 10 55 Hz 1Hz /min 95±5 min 24 ±4

38 暨 南 大 学 学 报 ( 自 然 科 学 与 医 学 版 ) 第 35 卷 cludedneuronnecrosis,vacuolizationandkaryopyknosisetc.,buttheseweremuchslighterintpotreat mentgroup.thelosof

38 暨南大学学报 ( 自然科学与医学版 ) 第 35 卷 cludedneuronnecrosis,vacuolizationandkaryopyknosisetc.,buttheseweremuchslighterintpotreat mentgroup.thelosof