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1 2440 海南医学院学报 2016,22(20) Journalof Hainan MedicalUniversity DOI: /j.cnki.jhmu 网络出版地址 :htp:// 十全大补丸内服联合膀胱灌注化疗对浅表性膀胱癌术后复发及恶性程度的影响 张强 1, 幸一士 1, 崔猛甲 1, 杨增悦 2 (1. 陕西省三原县医院泌尿外科, 陕西咸阳 ;2. 第四军医大学唐都医院泌尿外科, 陕西西安 ) [ 摘要 ] 目的 : 研究十全大补丸内服联合膀胱灌注化疗对浅表性膀胱癌术后复发及恶性程度的影响. 方法 : 选择在我院接受经尿道肿瘤电切术的 102 例浅表性膀胱癌患者, 随机分为接受术后十全大补丸内服联合膀胱灌注化疗的联合组与接受术后膀胱灌注化疗的常规组, 随访术后 3 年的肿瘤复发情况, 测定血清肿瘤标志物含量 外周血以及复发病灶内干细胞标志分子 免疫调节分子的表达量. 结果 : 联合治疗组术后 1 年复发率 术后 3 年复发率均显著低于常规组 (P<0.05), 平均复发时间显著长于常规组 ; 术后 1 年时, 联合组血清中 VEGF αfgf β FGF MMP2 MMP9 的含量显著低于常规组 (P<0.05), 外周血单个核细胞中 ALDH1 Sox2 Nanog CD47 CD133 B7GH1 PDG1 PDGL1 的 mrna 含量显著低于常规组 (P<0.05); 肿瘤复发后, 联合治疗组复发病灶中 ALDH1 Sox2 Nanog CD47 CD133 B7GH1 PDG 1 PDGL1 的 mrna 含量显著低于常规组 (P<0.05). 结论 : 十全大补丸内服联合膀胱灌注化疗预防浅表性膀胱癌术后复发的效果优于单纯应用膀胱灌注化疗, 对膀胱癌电切术后的肿瘤负荷 干细胞特性 免疫应答均具有调节作用. [ 关键词 ] 浅表性膀胱癌 ; 膀胱灌注化疗 ; 干细胞 ; 免疫应答 [ 中图分类号 ]R [ 文献标识码 ]B [ 文章编号 ]1007G1237(2016)20G2440G03 EfectoforaladministrationofShiquandabupilcombinedwithbladderperfusionchemotherG apyonthepostoperativerecurenceandmalignantdegreeofsuperficialbladdercancer ZHANG Qiang 1,XING YiGshi 1,CUIMengGjia 1,YANGZengGyue 2 (1.UrologyDepartment,SanyuanCountyHospitalofShaanxiProvince,XianyangCity,ShaanxiProvince,713800;2.UrologyDeG partment,tangdu HospitaloftheFourthMilitary MedicalUniversity,Xi ancity,shaanxiprovince,710038) [FoundationProject]:ThisstudywassupportedbyscienceandtechnologyplanofShaanxiprovince (grantno.sx2014ss63) [Author]:ZHANGQiang (1975G),Male,XianyangShaanxi,M.B.,Atendingphysician,Tel: ,EGmail:zhangqiang _1975@foxmail.com. [Correspondenceto]:YANGZengGyue,Tel: Received:2016G07G29 Revised:2016G08G16 JHMC,2016;22(20):2440G2443 Viewfromspecialist:Itiscreative,andofcertainscientificandeducationalvalue. [ABSTRACT]Objective:TostudytheefectoforaladministrationofShiquandabupilcombinedwithbladderperfusion chemotherapyonthepostoperativerecurrenceandmalignantdegreeofsuperficialbladdercancer.methods:atotalof102pag tientswithsuperficialbladdercancerwhoreceivedtransurethralresectionofbladdertumorinourhospitalwereselectedand randomlydividedintocombinedgroupwhoreceivedpostoperativeoraladministrationofshiquandabupilcombinedwithbladg derperfusionchemotherapyandroutinegroupwhoreceivedpostoperativebladderperfusionchemotherapy,thepostoperative tumorrecurrencewasfolowedupfor3years,andthelevelsoftumormarkersinserumaswelastheexpressionlevelsofstem [ 基金项目 ] 陕西省科技计划项目 (SX2014SS63) [ 作者简介 ] 张强 (1975G), 男, 陕西咸阳人, 本科, 主治医师, 电话 : ,EGmail:zhangqiang_1975@foxmail.com. [ 通讯作者 ] 杨增悦, 电话 : [ 收稿日期 ]2016G07G29 [ 修回日期 ]2016G08G16 网络出版时间 :2016G8G2316:22

2 张强等. 十全大补丸内服联合膀胱灌注化疗对浅表性膀胱癌术后复发及恶性程度影响 2441 celmarkermoleculesandimmunoregulation moleculesinperipheralbloodandrecurrentlesions weredetermined.results: Postoperative1Gyearrecurrencerateandpostoperative3Gyearrecurrencerateofcombinedtreatmentgroup weresignificantly lowerthanthoseofroutinegroup(p<0.05),andthemeanrecurrencetimewassignificantlylongerthanthatofroutinegroup; 1yearafteroperation,serum VEGF,αFGF, β FGF,MMP2and MMP9levelsweresignificantlylowerthanthoseofroutine group (P<0.05),and ALDH1,Sox2,Nanog,CD47,CD133,B7GH1,PDG1andPDGL1 mrnalevelsinperipheralblood mononuclearcelsweresignificantlylowerthanthoseofroutinegroup (P <0.05);aftertumorrecurrence,ALDH1,Sox2, Nanog,CD47,CD133,B7GH1,PDG1andPDGL1mRNAlevelsinrecurrentlesionsofcombinedtreatmentgroupweresignifiG cantlylowerthanthoseofroutinegroup(p<0.05).conclusion:oraladministrationofshiquandabupilcombinedwithbladder perfusionchemotherapyhasbeterefectonpreventingpostoperativerecurrenceofsuperficialbladdercancerthanbladderperg fusionchemotherapyalone,andithasregulatingefectontumorload,characteristicsofstemcelsandimmuneresponseafter transurethralresectionofbladdertumor. [KEY WORDS]Superficialbladdercancer;Bladderperfusionchemotherapy;Stemcels;Immuneresponse 浅表性膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤, 经尿道膀胱肿瘤电切术是治疗浅表性膀胱癌最常用 [1,2] 的方式, 能够有效清除肿瘤病灶. 但是, 膀胱癌电切术后的复发率较高且复发后的恶性程度增加 [3] 侵袭转移能力增强, 更加容易发生远处转移. 因此, 浅表性膀胱癌患者在接受电切除术后常需要进行膀胱灌注化疗, 其目的是彻底杀灭癌细胞 降低肿 [4,5] 瘤复发的风险. 表柔比星是细胞周期非特异性的化疗药物, 被广泛用于膀胱灌注化疗, 对膀胱癌细胞的杀伤作用明确, 但是毒副作用较大 部分患者会 [6,7] 出现明显的膀胱刺激症状并影响化疗效果. 中医理论认为膀胱癌的发生与气血两虚有关, 化疗药物的损伤会进一步加重气血两虚的状态, 健脾 益气 补血对膀胱癌患者的机体状态具有改善作用. 十全大补丸是具有温补气血功效的中成药物, 能够针对膀胱癌患者气血两虚的状态进行治疗. 本研究分析了十全大补丸内服联合膀胱灌注化疗对浅表性膀胱癌术后复发及恶性程度的影响. 1 资料与方法 1.1 一般资料选择 2012 年 4 月 ~2015 年 4 月在我院接受经尿道肿瘤电切术的 102 例浅表性膀胱癌患者作为研究对象, 所有患者经病理学确诊为浅表性膀胱癌且在电切术后规律接受膀胱灌注化疗, 术后 3 年内的随访资料完整. 根据术后膀胱灌注化疗过程中是否进行中医治疗分为联合组和常规组, 每组各 51 例. 联合组接受十全大补丸内服联合膀胱灌注化疗, 包括男性 39 例 女性 12 例, 年龄 (56.2±7.2) 岁 ; 常规组仅接受膀胱灌注化疗, 包括男性 37 例 女性 14 例, 年龄 (56.9±7.5) 岁. 两组一般资料的比较, 差异无统计学意义 (P>0.05), 具有可比性. 1.2 治疗方法两组均由同一组医生进行经尿道膀胱肿瘤电切术, 术后 1 周后开始进行膀胱灌注化疗, 方法如下 : 灌注前排空膀胱, 消毒尿道外口后置入导尿管, 排尽膀胱内残余尿液, 而后经导尿管注入化疗药物, 包括溶解在 60 ml 生理盐水中的 50 mg 表柔比星 溶解在 60 ml 生理盐水中的 40 mg 丝裂霉 素, 拔除导尿管后嘱患者每 10 分钟变换体位 1 次, 化疗药物在膀胱内至少保留 2h, 而后自行排出体外. 术后 1~4 周期间每周进行 1 次灌注化疗, 共 4 次, 术后第 2 个月开始每个月进行 1 次灌注化疗, 共 7 次. 联合组同时给予十全大补丸治疗, 方法如下 : 术后 1 周开始给予十全大补丸口服,9g/ 次,3 次 /d, 连续服用 7 个月. 1.3 术后随访方法术后采用膀胱镜或膀胱 B 超进行检查, 对于能够耐受的患者首选膀胱镜检查, 对于不能耐受膀胱镜的患者选择膀胱 B 超检查. 术后第 1 年, 每 2 个月进行一次膀胱镜或膀胱 B 超检查 ; 术后 1 年以后, 每 6 个月进行一次膀胱镜或膀胱 B 超检查. 若发现病灶则进行膀胱镜下活检, 经病理学检查确诊膀胱癌是否复发. 1.4 血清指标检测方法术后 1 年时, 采集两组患者的空腹外周静脉血 5 ml, 室温放置 30min 自然凝血后离心并分离血清, 采用酶联免疫吸附试剂盒测定血管内皮生长因子 (VEGF) α 碱性成纤维细胞生长因子 (αfgf) β FGF 基质金属蛋白酶 2(MMP2) MMP9 的含量. 1.5 免疫分子及干细胞标志分子表达量的检测方法术后 1 年时, 采集两组患者的空腹外周静脉血 5 ml 并用 EDTA 抗凝, 采用密度梯度离心法分离单个核细胞, 加入 Trizol 裂解液后抽提细胞中的 RNA, 反转录得到 cdna 第一链. 膀胱镜确认肿瘤复发后, 取活检的复发肿瘤病灶, 加入 Trizol 裂解液后抽提细胞中的 RNA, 反转录得到 cdna 第一链. 分别取外周血单个核细胞对应的 cdna 样本和复发肿瘤组织对应的 cdna 样本, 进行荧光定量 PCR 扩增, 扩增的目的基因包括 B7GH1 PDG1 PDGL1 ALDH1 Sox2 Nanog CD47 CD133, 内参基因为 βgactin, 分别计算外周血单个核细胞和复发肿瘤组织中上述分子的 mrna 含量. 1.6 统计学处理采用 SPSS20.0 软件录入并分析数据, 两组间计数资料的分析采用卡方检验 计量资料的分析采用 t 检验,P<0.05 为差异具有统计学意义. 2 结果 2.1 两组术后复发情况联合组术后 1 年复发 3 例, 复发率 5.88%, 术后 3 年复发 8 例, 复发率 15.69%, 平均复发时间 (34.86±5.23) 个月 ;

3 2442 海南医学院学报 Vol 22No 20Oct 2016 常规组术后 1 年复发 11 例, 复发率 21.57%, 术后 3 年复发 率 23 例, 复发率 45.10%, 平均复发时间 (21.37±3.93) 个月. 经卡方检验, 联合治疗组术后 1 年复发率 术后 3 年复发率 均显著低于常规组 (P<0.05); 经 t 检验, 联合治疗患者的平 均复发时间显著长于常规组 (P<0.05). 2.2 两组术后血清肿瘤标志物含量 术后 1 年, 联合组血清中 VEGF αfgf β FGF MMP2 MMP9 的含量显著低于常规组, 差异均具有统计学意义 (P <0.05). 见表 1. 表 1 两组血清肿瘤标志物含量的比较 (n=51, x±s ) 组别 VEGF ( μg /L) αfgf (pg/l) βfgf (pg/l) MMP2 (mg/l) MMP9 (mg/l) 联合组 15.58± ± ± ± ±10.35 常规组 29.46± ± ± ± ±22.41 t 两组术后外周血中肿瘤干细胞标志物的表达量 术后 1 年, 联合组外周血单个核细胞中 ALDH1 Sox2 Nanog CD47 CD133 的 mrna 含量显著低于常规组, 差异均具有统计学意 义 (P<0.05). 见表 2. 表 2 两组外周血肿瘤干细胞标志物表达量比较 (/ β Gactin,n=51, x±s ) 组别 ALDH1 Sox2 Nanog CD47 CD133 联合组 0.36± ± ± ± ±0.06 常规组 1.06± ± ± ± ±0.14 t 两组术后免疫功能 术后 1 年, 联合组外周血单个核细胞中 B7GH1 PDG1 PDG L1 的 mrna 含量显著低于常规组, 差异具有统计学意义 (P <0.05); 确认膀胱癌复发后, 联合组复发病灶内 B7GH1 PDG 1 PDGL1 的 mrna 含量显著低于常规组, 差异均具有统计学 意义 (P<0.05). 见表 3. 表 3 两组术后免疫功能比较 (/ β Gactin,n=51, x±s ) 组别 外周血单个核细胞 复发肿瘤病灶 B7GH1 PDG1 PDGL1 B7GH1 PDG1 PDGL1 联合组 0.42± ± ± ± ± ±0.05 常规组 1.02± ± ± ± ± ±0.13 t < 两组患者复发病灶内肿瘤干细胞标志物的表达量 确认膀胱癌复发后, 联合组复发病灶内 ALDH1 Sox2 Nanog CD47 CD133 的 mrna 含量显著低于常规组, 差异 均具有统计学意义 (P<0.05). 见表 4. 表 4 tin,n=51, x±s ) 3 讨论 两组复发病灶内肿瘤干细胞标志物表达量比较 (/ β GacG 组别 ALDH1 Sox2 Nanog CD47 CD133 联合组 0.36± ± ± ± ±0.06 常规组 1.06± ± ± ± ±0.14 t 丝裂霉素联合表柔比星是膀胱灌注化疗最常用 的方案. 丝裂霉素是一类细胞周期非特异性药物, 能够作用于细胞分裂的各个时相 阻碍细胞周期的 进程以及细胞的增殖 ; 表柔比星同样是一类细胞周 期非特异性的化疗药物, 能够进入细胞核并作用于 DNA, 造成 DNA 双链结构破坏, 抑制 DNA 复制, 进而抑制细胞的增殖 [8-10]. 膀胱癌术后应用丝裂霉素 联合表柔比星进行膀胱灌注化疗对肿瘤复发的预防 价值确切, 但是上述两种细胞周期非特异性化疗药 物的毒副作用较大, 不仅会引起膀胱刺激症状, 还会 对机体功能 尤其是免疫功能造成影响, 进而影响整 体化疗效果 [11]. 近年来, 中药药物被越来越多地用 于恶性肿瘤的治疗, 中医理论认为膀胱癌患者的特 征是气血两虚且气血两虚的状态在灌注化疗过程中 会进一步加重, 应当进行健脾 益气 补血等中医对 症治疗. 十全大补丸的组成成分包括四物汤 四君 子汤, 外加黄芪 肉桂, 具有温补气血的中医功效. 现代药理学研究证实, 十全大补丸中含有皂苷 生物 碱等成分, 对机体的免疫应答具有调节作用. 本研 究在膀胱癌术后采用十全大补丸内服联合膀胱灌注 化疗的方式进行治疗, 对两组患者术后 3 年的肿瘤 复发情况进行了随访, 结果显示 : 联合治疗组术后 1 年复发率 术后 3 年复发率均显著低于常规组, 平均 复发时间显著长于常规组. 这就说明十全大补丸联 合膀胱灌注化疗对膀胱癌术后复发的预防价值较单 纯应用膀胱灌注化疗更为明确. 在膀胱癌的发生 发展以及复发过程中, 肿瘤病 灶本身能够合成和分泌多种细胞因子 蛋白酶分子 来介导癌细胞的恶性生物学行为.VEGF αfgf βfgf MMP2 MMP9 是与膀胱癌组织内血管新生以及癌细胞侵袭 迁移密切相关的恶性分子, 由肿瘤 病灶分泌进入血液循环后能够成为反应肿瘤负荷程 度的标志分子 [12-14].VEGF 是目前已知促血管新 生作用最强大的细胞因子, 能够诱导内皮细胞形成 血管样结构 ;FGF 包括 αfgf 和 βfgf 两种不同的 亚型, 对内皮细胞的游走 增殖具有促进作用, 同样 具有促血管新生的作用.MMP2 和 MMP9 是基质 金属蛋白酶家族中的两类胶原酶, 对细胞外基质中 的 Ⅳ 型胶原具有特异性水解作用, 能够促进癌细胞

4 张强等. 十全大补丸内服联合膀胱灌注化疗对浅表性膀胱癌术后复发及恶性程度影响 2443 突破局部基底膜的限制并向周围浸润及远程转移. 本文对术后 1 年时, 两组血清中上述标志分子含量 的分析发现 : 联合组血清中 VEGF αfgf β FGF MMP2 MMP9 的含量显著低于常规组. 这就说明联合使用十全大补丸能够降低膀胱癌患者术后的肿 瘤负荷, 抑制血管新生以及细胞侵袭. 近年来关于浅表性膀胱癌术后复发的研究认 为, 局部病灶组织中存在的肿瘤干细胞是造成肿瘤 复发的病理基础. 膀胱癌干细胞是膀胱组织中一类 具有多向分化潜能的特殊细胞群, 被视作膀胱癌发 生和复发的启动细胞, 膀胱癌电切术后残留的膀胱 癌干细胞能够诱发肿瘤形成.ALDH1 Sox2 Nanog CD47 CD133 是膀胱癌干细胞表面的标志分子 [15,16].ALDH1 定位于细胞质中并参与干细胞 的早期分化,Nanog 则主要参与干细胞自我更新的 调节 ;Sox2 是定位于细胞核的转录因子, 主要参与 干细胞的形成及功能的维持 ;CD47 又称为整合素相 关蛋白, 能够与巨噬细胞表面受体 SIRPα 结合并阻 断巨噬细胞的吞噬作用 ;CD133 是一类细胞表面黏 附分子, 常被用于干细胞的鉴定. 本文对外周血及 复发病灶中干细胞标志的表达量进行了分析, 结果 显示 : 联合组外周血单个核细胞和复发病灶组织中 ALDH1 Sox2 Nanog CD47 CD133 的 mrna 含量显著低于常规组. 这就说明联合使用十全大补丸 能够抑制膀胱癌的干细胞特性, 进而预防膀胱癌的 术后复发. 在膀胱癌的复发过程中, 机体免疫监视功能低 下, 异常增殖的癌细胞无法被免疫系统清除并在体 内不断扩增 形成肿瘤病灶.T 淋巴细胞所介导的 免疫应答是体内发挥抗肿瘤免疫的主要方式, 细胞 表面多种分子能够调节 T 细胞的活性, 进而影响机 体的抗肿瘤免疫应答.B7GH1 是一类抑制性共刺激 分子, 能够提供抑制性信号并抑制 T 细胞的活化 诱导 T 细胞凋亡, 进而造成机体抗肿瘤免疫应答处 于抑制状态 ;PDG1 及其配体 PDGL1 是调节 T 淋巴 细胞成熟 分化的重要分子,PDG1 与 PDGL1 结合后 不仅能够直接抑制 CD8 + T 淋巴细胞的成熟及其对 癌细胞的杀伤作用, 还能够通过促进抑制性 Treg 细 胞增殖的方式来抑制 CD8 + T 淋巴细胞的分 化 [17,18]. 本文对外周血及复发病灶中抑制性免疫调 节分子的表达量进行了分析, 联合组患者外周血单 个核细胞和复发病灶组织中 B7GH1 PDG1 PDGL1 的 mrna 含量显著低于常规组. 这就说明联合使 用十全大补丸能够抑制 B7GH1 PDG1 PDGL1 等抑 制性免疫调节分子的表达, 进而改善膀胱癌患者术 后的免疫抑制状态 增强机体的抗肿瘤免疫应答. 综上所述, 十全大补丸内服联合膀胱灌注化疗 预防浅表性膀胱癌术后复发的效果优于单纯应用膀胱灌注化疗, 对膀胱癌电切术后的肿瘤负荷 干细胞特性 免疫应答均具有调节作用. 参考文献 1 RexerH,GeschäftsstelederAUO.Studyforthetreatmentof nonmuscleinvasivebladdercancer:aphaseⅢ eficacytrialfor intravesicalinstilationofmistletoeextractinsuperficialbladder cancer(tim)gab40/11oftheauo [J].UrologeA,2016,55 (7):963G StromanL,TschobotkoB,AbboudiH,etal.ImprovingcomG pliancewithasinglepostgoperativedoseofintravesicalchemog therapyaftertransurethralresection ofbladdertumour [J]. NephrourolMon,2016,8(1):e PortenSP,Leapman MS,GreeneKL.Intravesicalchemotherapy innongmuscleginvasivebladdercancer[j].indianjurol,2015, 31(4):297G SeoGH,KimJH,KuJH.Clinicalpracticepaternofimmediate intravesicalchemotherapyfolowingtransurethralresectionofa bladdertumorinkorea:nationalhealthinsurancedatabasestudy [J].SciRep,2016,15(6): CarvalhoDR.Improvingaccesstoadjuvantintravesicalytherapy fornongmuscleinvasivebladdercancerinacommunityhospital [J].UrolNurs,2015,35(6):287G LiK,ChenX,LiuC,etal.PirarubicininducesanautophagiccyG toprotectiveresponsethroughsuppression ofthe mammalian targetofrapamycinsignalingpathwayinhumanbladdercancer cels[j].biochem BiophysResCommun,2015,460(2):380G Huang W,WangF,WuC,etal.Eficacyandsafetyofpirarubicin combinedwithhyaluronicacidfornongmuscleinvasivebladder canceraftertransurethralresection:aprospective,randomized study[j].inturolnephrol,2015,47(4):631g SteinbergRL,ThomasLJ,NeppleKG.IntravesicalandalternaG tivebladdergpreservationtherapiesinthe managementofnong muscleginvasive bladder cancer unresponsive to bacilus CalmeteGGuérin [J].UrolOncol,2016,34(6):279G WuK,WangB,ChenY,etal.DAB2IPregulatesthechemoresisG tancetopirarubicinandtumorrecurrenceofnongmuscleinvasive bladdercancerthroughstat3/twist1/pgglycoproteinsignaling [J].CelSignal,2015,27(12):2515G JiangSJ,YeLY,MengFH.Comparisonofintravesicalbacilus calmetegguerinandmitomycincadministrationfornongmuscle invasivebladdercancer:a metaganalysisandsystematicreview [J].OncolLet,2016,11(4):2751G LernerSP,Robertson AG.MolecularSubtypesofNonGmuscle InvasiveBladderCancer[J].CancerCel,2016,30(1):1G3. 12 PuntoniM,Petrera M,CamporaS,etal.Prognosticsignificance ofvegfaftertwentygyearfolowgupinarandomizedtrialof fenretinidein nongmuscleginvasivebladdercancer [J].Cancer PrevRes(Phila),2016,9(6):437G WieczorekE,JablonowskiZ,TomasikB,etal.MMP,VEGFand TIMPasprognosticfactorsinrecurringbladdercancer[J].ClinG Biochem,2015,48(18):1235G1240. ( 下转第 2447 页 )

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