中国中西医结合杂志年月第卷第期! * & 6 * ) & & )(& )& &8 & 6./ 01 * & & )& )(& 4/. )(& 34# 0 5 & )( )(& 34# )(& )& &8 & 6./ 01 * & () & )& )(& 4/. 0 5 * 4/. * & (

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臭颗袭
5 years ago
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1 降糖益肾方对高胰岛素诱导的人肾小球系膜细胞增殖及./01 蛋白表达的影响吴勇军喻嵘成细华吴慧伍参荣魏冠德张琴摘要目的观察降糖益肾方对高胰岛素诱导的人肾小球系膜细胞 ( & & *& 增殖及其胰岛素受体底物 &*& ) ) )&./ 磷脂酰肌醇激酶 ( ( ) )2 & 01 蛋白表达的影响方法将分为正常空白对照组空白组高胰岛素模型组抑制剂组中药组首先预实验确定胰岛素抑制剂和降糖益肾方用药浓度各组分别加入不同培养液空白组予.0 % 培养液其余组均予含 -3 胰岛素的培养液培养 ( 同时抑制剂组中药组分别予 " # -3 降糖益肾方干预继续培养 " ( 采用法及流式细胞技术检测增殖采用免疫组化和 & )& ) 技术检测./01 蛋白表达结果在高胰岛素诱导下中药组和抑制剂组增殖均显著降低./01 蛋白表达水平下调 0 5 与抑制剂组比较中药组./01 蛋白表达水平下调稍弱 0 5 结论降糖益肾方具有降低高胰岛素诱导的增殖的作用其机制可能与干预胰岛素信号通路有关关键词降糖益肾方肾小球系膜细胞胰岛素受体底物磷脂酰肌醇激酶 '66&*) 6 4 (&.&* & ( *& & 0 6& ) 6 7 & & & )(& '8 & 6.&*& ) / ) )& 0( ( ) )2 & 9 4 : 49. '!7 ; ( 9 9 ' 7 &!7 & & 6 0( * 9 & ) 6 ( & & & * & ( ( " ( 1& 3 ) 6 )& & * & 6 ) ( & & & * & 9 & ) 6 ( & & & * & ( ( " ( 1& 3 ) 6 & &* &*( 9 & ) 6 ( & & & * & ( ( " ( /., :&*) & & ) )& )(& &66&*) 6 ) 4 (&.&* & 4/. ( ( *& *& 6& ) 6 ( & & *& )(& &8 & 6 &*& ) ) )&./ ( ( ) )2 & 01 &)( & & & ) & )(& & ) & * ) )(& ( ( & )(& 4/. )(& 34# (& * *& ) ) 6 4/. 34# & &*) & * 6 & & &8 & & ) + 66& & ) * ) & ) & &*) & & 6 66& & ).0 % * ) & ) & 6 )(& & ) & * ) ( & )(& & ) & & * ) & -3 6 ( & ( & 6 )(& 4/. )(& 34# & & &8 & ) -3 4/. " -3 34# & &*) & 6 6 )(& " ( (& 6& ) 6 &)&*)& 6 * ) &) (& )& &8 & 6./ 01 &)&*)& ( )*(& * & )& ).& ) (& 6& ) 6 *& ( ( 基金项目国家自然科学基金资助项目! ""! "#! "$$ 湖南省自然科学基金资助项目!" 湖南省自然科学省市联合基金项目! # 湖南省大学生研究性学习和创新性实验计划项目! $ 湖南省普通高等学校科学研究项目!#% 作者单位湖南中医药大学药学院长沙 " 湖南中医药大学中医内科学重点实验室长沙 " 湖南中医药大学细胞生物学与分子技术重点实验室长沙 " 通讯作者喻嵘 &$ """#' () * +, $%%- #$

2 中国中西医结合杂志年月第卷第期! * & 6 * ) & & )(& )& &8 & 6./ 01 * & & )& )(& 4/. )(& 34# 0 5 & )( )(& 34# )(& )& &8 & 6./ 01 * & () & )& )(& 4/. 0 5 * 4/. * & ( ( *& 6& ) 6 ) &*( () & & )& ) )( 1'4,.+/ ) 4 (&.&* & & & *& &*& ) ) )& ( ( ) )2 & 肾小球系膜细胞的增殖在糖尿病肾病发生发展过程中处于十分重要的地位既往研究表明降糖益肾方对糖尿病及肾病并发症具有一定的防治作用本研究采用细胞培养的方法观察降糖益肾方对高胰岛素诱导的人肾小球系膜细胞 ( & & *& 增殖以及其胰岛素受体底物 &*& ) ) )&./ 磷脂酰肌醇激酶 ( ( ) )2 & 01 表达的影响结果报道如下材料与方法细胞株细胞株由武汉大学中国典型培养物保藏中心提供复苏培养传代取第代实验药物降糖益肾方以左归丸化裁由熟地黄芪 " 山茱萸菟丝子 % 牛膝 # 黄连 % 丹参 # 玉米须益母草 # 组成饮片购自湖南中医药大学附属第一医院药房经鉴定为正品后经三蒸水煎煮次搅拌均匀后静置过滤浓缩制备成生药浓度为 - 3 的药液 - 离心除杂质取上清液灭菌后储存备用胰岛素注射液 9-3 江苏万邦生化医药公司批号 # 青霉素 7% 万 9 华北制药厂批号 # 链霉素万 9 华北制药厂批号 " 试剂及仪器.0 % 批号 # 新生牛血清! / 批号 %# 均购自美国 7 * 公司胰蛋白酶美国 + 6& 公司批号 %# 牛血清白蛋白杭州四季青生物工程公司批号 "#% 01 抑制剂 34# 美国 ' 公司批号 /$$ 免疫组化用兔抗大鼠 7< 一抗 7< 一抗及即用型 / 试剂盒均购自武汉博士德生物公司细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒购自上海碧云天生物技术研究所批号 0" 蛋白 2& 购自杭州宝科生物科技有限公司批号 / " 细胞培养瓶细胞培养板 #% 孔和孔盖玻片均购自武汉亚法生物工程公司, 培养箱 /3 型美国 /(&3 公司遥控酶标仪 /9!.'/ 型奥地利 &* 公司倒置显微镜 1 型日本, 公司流式细胞仪 < / 型美国 + 公司电泳和转膜装置 / & 美国. 公司高速离心机 37 型北京京立离心机有限公司胰岛素 34# 降糖益肾方用药浓度确定胰岛素浓度的确定培养的分为空白组胰岛素 -3 组空白组加入培养液含 =! / 的.0 % 培养液加 - 3 青霉素 - 3 链霉素用 $=!, 液调值至 $ $ 其余组分别加入含不同浓度胰岛素注射液的培养液胰岛素 -3 每组设 " 个复孔培养 ( 后法检测胰岛素对增殖的抑制作用及与共培养的最佳时间结果显示随着胰岛素浓度的升高光密度,+ 值越大胰岛素浓度达 -3 时,+ 值达最大值 -3 胰岛素,+ 值反而下降因而实验用胰岛素浓度选为 -3 此时细胞增殖最强胰岛素浓度为 -3 时结果显示随着胰岛素与共培养时间的延长,+ 值增大 ( 达平台期因此胰岛素与共培养时间选为 ( 34# 浓度确定培养的分为空白组 34# " -3 组空白组加入培养液同前其余组分别加入含不同浓度胰岛素信号通路抑制剂 34# 的培养液 34# " -3 每组设个复孔培养 ( 后法检测 34# 对增殖的抑制作用结果显示 34# 浓度为 " - 3 时对增殖均有显著抑制作用其中浓度为 " - 3 时对抑制率为 $= 因而实验确定 34# 浓度为 " - 3 降糖益肾方用药浓度确定培养的

3 分为空白组降糖益肾方 % 及 -3 组空白组加入培养液同前其余组分别加入含不同浓度降糖益肾方的培养液降糖益肾方 % 及 -3 每组设个复孔培养 ( 后法检测降糖益肾方对毒性增殖结果显示降糖益肾方浓度为 % -3 时对增殖均有显著抑制作用其中浓度为 -3 时对抑制率为 = 因而实验确定降糖益肾方浓度为 -3 分组及干预方法按 - 3 的密度接种于孔平底培养板盖玻片上 3 - 孔倒置显微镜下观察放入, 孵箱中继续进行爬片培养待细胞适当扩增 ( 后吸弃旧培养液加入 3 新培养液分为正常组空白组模型组胰岛素诱导组抑制剂组 34# 及中药组降糖益肾方每组设个复孔模型组抑制剂组中药组每孔加培养液稀释的 -3 胰岛素注射液 3 正常组加 3 培养液培养 ( 后吸弃旧培养液加入 3 新培养液同时抑制剂组每孔加培养液稀释的 " # 液 3 中药组每孔加培养液稀释的 -3 降糖益肾方液 3 正常组和模型组加 3 培养液继续培养 " ( % 增殖及./01 蛋白表达观察收集各组细胞用预冷的 0 / 洗涤次重悬于结合缓冲液中采用碘化丙啶 0 双染色法以流式细胞仪检测 & & ) 软件分析细胞周期和细胞凋亡 & ) & ) 技术检测./01 蛋白质表达以.0 裂解液提取各组细胞总蛋白测定蛋白含量后取蛋白样品进行 /+/ 聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳湿转法将蛋白质转移至硝酸纤维素膜 = / 封闭后加入一抗室温 ( / 洗膜次再加入二抗室温孵育 ( / 洗膜次用 '/3 发光检测同时采用免疫细胞化学染色技术 / 法检测各组细胞./01 蛋白表达 $ 统计学方法数据结果采用 /0// % 软件处理计量资料以 8 表示多组计量资料符合正态性方差齐性采用方差分析组间比较采用 > 检验不符合正态性方差不齐采用非参数检验 0 5 为差异有统计学意义结果各组增殖结果比较表图与正常组比较模型组 7 期细胞显著减少 7? / 期细胞显著增加凋亡率显著降低 0 5 与模型组比较抑制剂组中药组给药后 7 期细胞显著减少 7? / 期细胞显著增多凋亡率显著升高 0 5 与抑制剂组比较中药组凋亡率降低 0 5 表各组增殖结果比较 = 8 组别干预浓度凋亡率 7 期 7? / 期正常 $ "$ 模型 $ # # 抑制剂 " - 3 %#" $"" $" 中药 -3 " $$% % 注与模型组比较 0 5 与抑制剂组比较 0 5 & )& ) 技术检测各组./01 蛋白表达结果比较表图与正常组比较模型组./01 的蛋白表达水平升高 0 5 与模型组比较中药组和抑制剂组./01 的蛋白表达水平明显降低 0 5 而与抑制剂组比较中药组下调./01 蛋白表达水平的作用稍弱 0 5 表 & )& ) 技术检测各组./ 01 蛋白表达灰度值比较 8 组别干预浓度./- *) 01- *) 正常 % $ 模型 # $ %$ 抑制剂 " - 3 " " $ 中药 -3 # % 注与模型组比较与抑制剂组比较 0 5 注为正常组为模型组为抑制剂组 + 为中药组蓝色区域为凋亡峰红色区域为 7-7 峰图各组增殖结果

中国中西医结合杂志年月第卷第期! 注为正常组为模型组为拟抑剂组 + 为中药组图 & )& ) 技术检测各组./ 01 蛋白表达结果 / 法检测各组./01 蛋白表达结果比较表图与正常组比较模型组./ 01 蛋白表达水平升高 0 5 与模型组比较中药组和抑制剂组./01 蛋白表达水平明显降低 0 5 与抑制剂组比较中药组.

及其所致的细胞分泌障碍是型糖尿病及其并发症发病过程中的两个主要环节在胰岛素抵抗糖尿病糖尿病肾病这一病理生理过程中细胞胰岛素信号传导的异常靶细胞胰岛素受体及受体后的功能缺失可导致. 出现高胰岛素血症形成糖脂代谢紊乱及炎症因子细胞因子等的产生现代研究表明内存在胰岛素受体底物 & *& ) ) )&.

4 中国中西医结合杂志年月第卷第期! 注为正常组为模型组为拟抑剂组 + 为中药组图 & )& ) 技术检测各组./ 01 蛋白表达结果 / 法检测各组./01 蛋白表达结果比较表图与正常组比较模型组./ 01 蛋白表达水平升高 0 5 与模型组比较中药组和抑制剂组./01 蛋白表达水平明显降低 0 5 与抑制剂组比较中药组./ 01 的蛋白表达水平升高 0 5 表 / 法检测各组./ 01 蛋白表达灰度值比较 8 组别干预浓度./ 01 正常 " " 模型 $ 抑制剂 " - 3 $ # $ 中药 -3 # $ 注与模型组比较与抑制剂组比较 0 5 讨论现代研究表明胰岛素抵抗 & ) *&. 及其所致的细胞分泌障碍是型糖尿病及其并发症发病过程中的两个主要环节在胰岛素抵抗糖尿病糖尿病肾病这一病理生理过程中细胞胰岛素信号传导的异常靶细胞胰岛素受体及受体后的功能缺失可导致. 出现高胰岛素血症形成糖脂代谢紊乱及炎症因子细胞因子等的产生现代研究表明内存在胰岛素受体底物 & *& ) ) )&./ 是连接胰岛素 - 胰岛素样生长因子 2& )( 6 *) 7< 信号转导途径上下游的信号分子胰岛素 -7< 信号途径能够通过 01 途径激活下游相关蛋白激酶可促进细 % 胞增殖和抑制细胞凋亡高水平胰岛素可通过胰岛素信号途径促进系膜细胞增殖增强系膜细胞分泌细胞外基质 &8) *& ) 8 ' 促进 ' 积聚从而在糖尿病肾病发生发展过程中处于十分重要的地位降糖益肾方为本课题组临床治疗糖尿病肾病有效方以左归丸加减化裁由熟地黄芪山茱萸菟丝子黄连丹参牛膝玉米须益母草 # 味药组成方中重用熟地滋阴养肾为主药以填真阴山茱萸菟丝子牛膝补益肝肾强健腰膝黄芪益气健脾黄连清热解毒丹参益母草活血化瘀玉米须清热利湿利尿消肿诸药合用共奏滋阴益气活血解毒利尿消肿之功效课题组前期研究表明降糖益肾方具有显著降低 1. 转基因型糖尿病小鼠空腹血糖血清胰岛素水平同时能够显著降低糖尿病小鼠血清尿素氮肌酐和尿微量白蛋白微球蛋白含量明显改善肾脏血流动力学异常降低肾小球内高压及高滤过状态电镜下 1. 鼠肾小球毛细血管基底膜节段性增厚足突节段性融合系膜细胞及基质明显增生可见散在电子高密度沉积物而降糖益肾方具有改善足细胞形态结构及肾小球系膜细胞与基质增生的病理损害显著降低血注 ' 为正常组 < 为模型组 7 为抑制剂组 + 为中药组 + 为./ 蛋白表达 ' 为 01 蛋白表达图各组./01 蛋白表达结果 /

5 清视黄醇结合蛋白 &) )&. 0 和纤溶酶原激活物抑制剂 & * ) ) ( ) 0 水平显著改善肾脏基质金属蛋白酶 0 蛋白表达抑制系膜细胞增殖及细胞外基质积聚的作用本实验在体外证明高胰岛素培养可诱导增殖而胰岛素信号通路的激活参与了高胰岛素培养的增殖实验研究显示高胰岛素诱导的模型组增殖活性增强而胰岛素信号通路抑制剂 34# 与降糖益肾方均能显著降低胰岛素诱导的增殖两药物作用后所诱导的凋亡可能是将细胞阻断在细胞周期的 /? 7 期进一步研究表明与胰岛素共培养的内./01 的蛋白表达均增强而胰岛素共培养的中给予 01 的抑制剂 34# 后./01 蛋白表达降低说明胰岛素可通过 01 来传导增殖信号而中药组./ 01 蛋白表达降低的程度稍弱于 34# 表明中药组抑制高胰岛素诱导的./ 01 蛋白表达的作用弱于 01 抑制剂 34# 笔者认为胰岛素可通过 01 途径激活细胞增殖信号途径可能是增殖的重要分子机制 %$ 增殖的和堆积的系膜基质将导致肾小球的肥大可进一步导致肾小球纤维化本课题组前期研究已表明滋阴益气解毒活血立法的中药复方降糖益肾方可通过调控胰岛素信号通路改善 1. 转基因型糖尿病小鼠的肾损伤 % 本实验证实该中药复方通过调控胰岛素信号通路改善高胰岛素培养的人肾小球系膜细胞的增殖在糖尿病肾病肾小球损伤过程中发挥了保护作用由于本研究工作尚初步开展对调控胰岛素信号相关通路从而影响糖尿病肾小球纤维化的作用与机制还有待进一步深入参考文献杨桢华陆晓华廖蕴华系膜细胞与糖尿病肾病及其微血管病理改变的研究进展医学综述 " $ $ 艾碧琛肖漫江喻嵘等降糖益肾方对 1. 鼠型糖尿病肾病早期的保护作用中国中医药信息杂志 $ #. ))@ ' /)&6 2 + &) * & ( )( ) & &)& 1 & + ##%$ %$ # / 6 0. & 3 & ) *& ( & & & : &*( * )!& ( % % ( & 1 & &* 6 * & 6./ )& * & ) ) & ' * &) % $ $ $" %3&& 0 / && & 7 * & & & ) & *) ) ) & & *& ' & & & & ) + &)&, )&) &) % " " "" $4! 2 + ' ( &) ) & * 6 )(& &*& ) ))& )& *& * * ) 6 6 &*) & & *& & / # "/( ) 1 (! &) < ) ) ))& )& 7< *& '.1- *) ) *& 6& ) & * * & & ) ( & *& 3 6& /* # " $ $ # *( ' ) ' 0( ( ) & 2 & * )6 6 ) ( & ' * $ # % 吴欣宇张荔群吴进等磷脂酰肌醇激酶与胰岛素抵抗现代生物医学进展 % % 杜晓刚甘华高水平胰岛素对大鼠系膜细胞!< 活化及细胞外基质合成的影响基础医学与临床 % %" 袁芳刘伏友段绍斌等胰岛素对大鼠肾系膜细胞增殖及损伤和 0 合成的影响中国中西医结合肾病杂志 $ "# % 成细华喻嵘明霞等左归降糖益肾方对高脂饮食型糖尿病 1. 小鼠糖脂代谢及炎症反应的影响中国实验方剂学杂志 % " 艾碧琛肖漫江喻嵘等降糖益肾方对 1. 鼠型糖尿病肾病早期的保护作用中国中医药信息杂志 $ # 明霞艾碧琛喻嵘等降糖益肾方对高脂饲养的 1. 鼠糖代谢肾功能的影响湖南中医药大学学报 % # % 吴慧喻嵘成细华等降糖益肾方干预胰岛素信号通路改善转基因型糖尿病 1. 鼠肾损伤的研究湖南中医药大学学报 # # 收稿 % 修回

考生编号政治政治分外语外语分科目 1 科目 1 分科目 2 科目 2 分总分专业代码专业名称考试方式报名号思想政治理论缺考英语一 45 生物综合 38 生理学缺考药理学全国统考思想政治理论

考生编号政治政治分外语外语分科目 1 科目 1 分科目 2 科目 2 分总分专业代码专业名称考试方式报名号思想政治理论缺考英语一 45 生物综合 38 生理学缺考药理学全国统考思想政治理论 100019008910001 思想政治理论缺考英语一 45 生物综合 38 生理学缺考 83 078006 药理学全国统考 110190172 100019008910002 思想政治理论 61 英语一缺考药学综合 ( 缺考生理学 51 112 078006 药理学全国统考 110199187 100019008910003 思想政治理论缺考英语一缺考生物综合缺考生物化学与分子生物学缺考 --

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