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1 中国细胞生物学学报 Chinese Journal of Cell Biology 2011, 33(11): 分子伴侣 BiP 结构域分析及对肝癌细胞增殖和凋亡的影响李祥柱刘艳娜赵文君周菁华郭风劲 * ( 重庆医科大学细胞生物学及遗传学教研室, 重庆医科大学分子医学及肿瘤研究中心, 重庆 ) 摘要结合免疫球蛋白 (binding immunoglobulin protein, BiP), 是 Hsp70 (70 kilodalton heat shock proteins) 蛋白家族的成员之一, 是内质网应激 (endoplasmic reticulum stress, ERS) 主要的调节器为了研究 BiP 的分子结构与生物学功能的关系, 首先, 分析 BiP 的 DNA 序列和蛋白质空间构象, 接着利用重叠 PCR 方法分别克隆 ATPase 结构域缺失体和 peptide-binding 结构域缺失体 (BiPa 和 BiPp), 成功构建带 myc 标签的真核表达载体, 转染 LO2 细胞和 SMMC-7721 细胞, 应用免疫印迹方法检测其在细胞内的表达 ; 运用 MTT 法 BrdU 免疫组化法及流式细胞仪分别检测细胞的增殖和凋亡 ; 检测 BiP 及两个组成结构域对 SMMC-7721 细胞增殖和凋亡的影响酶切电泳和 DNA 测序结果显示, BiP 全长和两个缺失体的真核表达载体构建成功 ; 免疫印迹检测到 BiP 三种真核载体在 LO2 细胞和 SMMC-7721 细胞中均能正确表达 ; MTT 和 BrdU 免疫组化结果表明, BiP 全长和缺失体 BiPa BiPp 三种真核载体均能有效促进 SMMC-7721 的增殖, 各组间细胞增殖率结果分析提示 ATPase 功能域可能抑制细胞增殖, 而 peptide-binding 结构域可能促进细胞的增殖 ; 流式细胞仪结果显示, 转染 BiP BiPa BiPp 三种真核载体均可以促进 SMMC-7721 的凋亡, 缺失体 BiPa 与全长 BiP 组间凋亡率差异不显著 ; 而缺失体 BiPp 组细胞凋亡率明显低于全长 BiP 组, 两组差异具有显著性 (P<0.05); 提示 ATPase 功能域与细胞凋亡可能不相关, 而 peptide-binding 结构域可能促进细胞的凋亡上述结果表明, BiP 的两个组成结构域 : ATPase 功能域与 peptide-binding 结构域, 独立存在或者共同存在时, 调控细胞增殖与凋亡具有差异性 ; 当两个结构域共同存在时, 它们会协同调控细胞的增殖与凋亡, 具体的分子机制还需要进一步的实验研究和探讨关键词 BiP; 缺失体 ; 生物信息学 ; 细胞增殖结合免疫球蛋白 (binding immunoglobulin protein, BiP), 又称 GRP78 或 HspA5, 是位于内质网 (endoplasmic reticulum, ER) 的重要分子伴侣, 属于热休克蛋白 (Hsp70) 家族成员之一人类 BiP 基因定位于 9q33.3, 具有高度保守的结构域, BiP 由 654 个氨基酸组成 : 包括 N 端 ATPase 功能域, C 端 peptide-binding 功能域, C 末端可变区 BiP 与许多内质网蛋白都有短暂的相互作用, 因此是内质网维持内环境稳态的一个感应器它参与前体蛋白质转运到内质网及随后的折叠组装和运输, 包括错误折叠和错误组装蛋白质的输出及相关降解 (ERAD), 调节相关内质网应激 (ER stress, ERS) 的三条主要信号通路 : IRE1/ XBP1S PERK ATF6, 调节内质网钙离子内稳态 [1-2] 等诸多生物学过程多年来的研究表明, BiP 及其相互作用的蛋白质与多种疾病相关, 如传染性疾病遗传性疾病及多种癌症关于分子伴侣 BiP 及各组成结构域与肿瘤细胞增殖与凋亡的关系, 目前报道甚少本实验针对 BiP 各组成结构域, 成功构建相应结构域缺失体的真核表达载体, 初步研究 BiP 各组成结构域与肝癌细胞增殖与凋亡的关系, 为进一步深入揭示 BiP 各组成结构域的生物学功能奠定实验基础 1 材料与方法 1.1 材料 Taq DNA 高保真聚合酶为日本东洋纺 (TOYO- 收稿日期 : 接受日期 : 国家自然基金 (No ) 和教育部留学人员基金 (No ) 资助项目通讯作者 Tel: , guo.fengjin@gmail.com

2 李祥柱等 : 分子伴侣 BiP 结构域分析及对肝癌细胞增殖和凋亡的影响 1205 BO) 公司的高保真聚合酶, 内切酶胶纯化及 DNA 回收试剂盒为大连宝生物 (TaKaRa) 公司产品, 质粒小量提取试剂盒为 Omega 公司产品, 抗体均为 Santa Cruz 公司产品, 脂质体为 Invitrogen 公司产品测序由华大基因提供, 含 BiP 全长基因质粒由日本熊本大 [3] 学 Takashi Sato 博士后和美国佛罗里达大学 Marina [4] 教授惠赠, pcdna3.1(-) 真核载体 LO2 SMMC 细胞由本实验中心保存 1.2 人类 BiP 全长及缺失体真核表达载体的构建与测序人类 BiP 全长基因的克隆与测序根据人类 BiP 全长核苷酸序列 (NM_005347), 用 NTI 软件设计一对 PCR 引物上游引物 BiP Sense: 5 -CGG GAT CCA TGA AGC TCT CCC TGG TG-3 ( 含 BamH I 酶切位点及其相应的保护碱基 ); 下游引物 BiP Antisense: 5 -CCC AAG CTT GGG CAA CTC ATC TTT TTC TG -3 ( 含 Hind III 酶切位点及其相应的保护碱基 ) 用含 BiP 全长基因重组质粒作为模板进行 PCR 扩增, 扩增条件 : 94 ºC 变性 5 min, 94 ºC 30 s, 58 ºC 30 s, 72 ºC 2 min, 30 个循环, 72 ºC 延伸 10 min 将 PCR 产物回收纯化后用限制性内切酶 BamH I 和 Hind III 双酶切, 同时对 pcdna3.1(-) 载体双酶切, 连接转化后, 挑取菌落提取质粒酶切鉴定并送测序, 得到 BiP 全长基因重组质粒 pcdna3.1(-)-bip BiP 缺失体真核表达载体的构建与测序在获得 BiP 基因全长重组质粒和生物信息学分析的基础上, 进行 BiP ATPase 区和 peptide-binding 区核苷酸 [5] 序列缺失的序列拼接, 并参照 Karin 等的重叠 PCR 技术的相关报道, 用 NTI 软件设计相应的 PCR 引物分别引入 BamH I 和 Hind III 酶切位点及其相应的保护碱基 ( 表 1, 酶切位点用下划线表示 ) 以全长 BiP 重组质粒 pcdna3.1(-)-bip 为模板, 分别以 P1+P2 P3+P4 P1+P5 P6+P4, 进行第一次 PCR (PCR1#), 反应条件参见表 2, 得到的片段分别命名为 AB1 CD1 AB2 CD2 再分别以 AB1 和 CD1 AB2 和 CD2 为模板, 用构建全长 BiP 的引物 (BiPS BiPA) 进行第二次 PCR (PCR2#), 获得的片段分别命名为 AD1 AD2 将第二次 PCR 产物 AD1 AD2 分别克隆入 pcdna3.1(-) 载体, 得到缺失 ATPase 的真核表达载体 pcdna3.1(-)-bipa ( 缺失第 125~280 aa) 和缺失 peptide-binding 区的真核表达载体 pcdna3.1(-)-bipp ( 缺失第 400~500 aa), 将构建好的两个缺失突变重组质粒进行双酶切鉴定并测序, 图 1 是构建 BiP 两个缺失突变体的结构示意图 1.3 BiP 各组成功能域生物信息学分析结合已发表的研究报道, 登陆 NCBI 获得 BiP 核酸及蛋白序列, 提交 BiP 蛋白序列到 PDB (Protein Date Bank) 数据库查询其主要通过 X- 射线衍射和核表 1 克隆 Bip 缺失体引物序列 Table 1 Primers of cloning Bip deletions coden sequence 质粒 PCR1# 引物序列 (5-3 ) 长度 (bp) PCR2# 引物序列 (5-3 ) 长度 (bp) Plasmid Primer Sequence (5-3 ) Length (bp) Primer Sequence (5-3 ) Length (bp) P1 CGG GAT CCA TGA 386 BiPS CGG GAT CCA AGC TCT CCC TGA AGC TCT P2 ATT GTC AGT TTT CCC TGG TG CTT TTC AAC CAC C BiPa P3 TGA AAA GAA AAC BiPA CCC AAG CTT TGA CAA TAG GGG CAA CTC P4 AGC TGT GCA GCC ATC TTT TTC TG CAA GCT TGG GCA ACT CAT CTT TTT C BiPp P1 CGG GAT CCA TGA AGC BiPS CGG GAT CCA TCT CCC TGA AGC TCT P5 TAT CTC AAA AGC AGC CCC TGG TG ACC ATA CGC P6 GGT GCT GCT TTT GAG 483 BiPA CCC AAG CTT ATA GAT GTG AAT GG GGG CAA CTC P4 CCC AAG CTT GGG ATC TTT TTC TG CAA CTC ATC TTT TTC

3 1206 研究论文表 2 重叠 PCR 法克隆 Bip 缺失突变体第一次 PCR 条件 Table 2 Program of cloning Bip deletion mutants gene 质粒 PCR1# 引物变性变性退火延伸循环延伸保存 Plasmid Primer Denaturation Denaturation Anneal Extend Cycle Extend Hold pcdna3.1(-)- P1/P2 52 ºC, 30 s 72 ºC, 35 s Bipa P3/P4 94 ºC 94 ºC 58 ºC, 30 s 72 ºC, 95 s pcdna3.1(-)- P1/P5 5 min 2 min 52 ºC, 30 s 72 ºC, 35 s ºC 10 min 4 ºC Bipp P6/P4 56 ºC, 30 s 72 ºC, 95 s 图 1 Bip 全长及其两个缺失体结构域图解 Fig.1 Schema of the Bip full-length and two mutant domains 磁共振 (NMRI) 试验测定的结构域 ; 提交 BiP 蛋白序列到 SWISS-MODEL 服务器进行同源建模预测目前没有经试验测定的结构域 ; 并结合 NTI 软件对 BiP 蛋白结构进行综合分析 1.4 BiP 全长及缺失体的表达检测将构建好的 BiP 基因全长重组质粒 pcdna3.1(-)- BiP 和两个 BiP 基因缺失体的重组质粒 pcdna3.1(-)- BiPa pcdna3.1(-)-bipp 用脂质体转染入 LO2 细胞, 提取蛋白, 利用 Western blot 检测 BiP 全长及缺失体 BiPa BiPp 在真核细胞中的表达 1.5 MTT 法检测 BiP 及缺失体对 SMMC-7721 细胞生长的影响取对数生长期 SMMC-7721 细胞接种于 96 孔板 ; 转染 BiP 全长及缺失体 BiPa BiPp 真核表达载体, 并设调零孔组转染空载体对照组, 每组设定 5 个复孔 ; 分别在转染前和转染后培养 1, 2, 3, 4 d 相应时间终止, 每孔加入 MTT ( 噻唑蓝, 5 mg/ml) 20 μl, 37 ºC 孵育 4 h; 吸去培养液, 每孔加入 150 μl 二甲基亚砜 (DMSO) 振荡 10 min; 以等体积的 DMSO 调零, 用酶联免疫检测仪在 490 nm 波长处检测各孔的吸光度 (D) 值, 计算每组平均 D 值按以下公式计算细胞增殖率 (proliferation rate, PR): PR=( 实验组平均 D 值 - 对照组平均 D 值 )/ 对照组平均 D 值 100%, 以 x- ±s 来表示, 统计分析采用统计学 t 检验, P<0.05 差异显著, 有统计学意义 1.6 BrdU 免疫组化法检测 BiP 及缺失体对 SM- MC-7721 细胞增殖的影响 6 孔板中每孔分别接种对数生长期 SMMC 细胞, 每组细胞平行做两复孔分别转染 BiP 全长及缺失体 BiPa BiPp 真核表达载体培养 48 h 后, 加入 15 μmol/l BrdU, 37 ºC 孵育 2 h, PBS 洗 1 次, 进行常规免疫组化, DAB 染色后, 显微镜下观察细胞核着色情况每孔随机计数 10 个高倍视野中细胞总数及 BrdU 阳性细胞数, 计算着色细胞比例 1.7 FCM 检测 BiP 及缺失体对 SMMC-7721 细胞凋亡的影响取处于对数生长期的 SMMC-7721 细胞, 以 /ml 细胞密度接种于 6 孔培养板中, 2 ml/ 孔, 待

4 李祥柱等 : 分子伴侣 BiP 结构域分析及对肝癌细胞增殖和凋亡的影响 1207 细胞融合率达 95% 时进行实验实验分为 : (1) 转染空质粒 pcdna3.1(-) 对照组 ; (2) 转染 BiP 全长真核表达载体组 ; (3) 转染缺失体 BiPa 真核表达载体组 ; (4) 转染缺失体 BiPp 真核表达载体组, 细胞继续培养 48 h 分别收集上述各组细胞, PBS 洗涤 2 次, 加入 100 μl 标记溶液 (FITC-Annexin V 和 PI 的终质量浓度均为 1 μg/ml) 重悬细胞, 室温下避光培育 10~15 min 离心沉淀细胞, 加培育缓冲液洗涤 1 次加入荧光 (SA- FLOUS) 溶液于 4 ºC 培育 20 min, 避光振动, 上流式细胞仪分析各组细胞的细胞凋亡率, 上述各实验组分别设定 5 个平行组, 不同实验组细胞凋亡率取各平行组的平均值, 其中, 流式细胞仪检测由重庆医科大学生命科学院完成 2 结果 2.1 BiP 全长及缺失突变体重组质粒构建与鉴定 BiP 全长及缺失突变体重组质粒构建与酶切鉴定 BiP 全长基因 PCR 结果 ( 图 2A), 重组质粒经 Hind III 和 BamH I 双酶切鉴定均得到证实 ( 图 2B) A: BiP 全长及重叠 PCR 产生的两个缺失突变体 PCR 琼脂糖电泳图 ; M: DL DNA marker; 1: BiP PCR 产物 (1 982 bp); 2: BiPa PCR2# 片段产物 (1 498 bp); 3: BiPp PCR2# 片段产物 (1 679 bp); B: 重组质粒 Hind III 和 BamH I 双酶切琼脂糖电泳图 ; M: DL DNA marker; 1: BiP 酶切分析 ; 2: BiPa 酶切分析 ; 3: BiPp 酶切分析 A: PCR amplification of target gene; M: DL DNA marker; 1: BiP PCR product (1 982 bp); 2: BiPa PCR2# fragment product (1 498 bp); 3: BiPp PCR2# fragment product (1 679 bp); B: the recombinant plasmids digested with Hind III and BamH I; M: DL DNA marker; 1: BiP restriction analysis; 2: BiPa restriction analysis; 3: BiPp restriction analysis. 图 2 BiP 全长及两个缺失突变体真核表达载体的构建 Fig.2 Construction of BiP and its two deletions eukaryotic expression vectors BiP 全长及缺失突变体重组质粒的序列测定与比对 BiP 全长及 2 个缺失突变体重组质粒的测序和 NTI 软件比对结果均证实所构建 BiP 全长及 2 个缺失突变体重组质粒的序列与目的基因序列完全一致, 说明各重组质粒构建正确 2.2 BiP 蛋白功能域分析根据现有研究报道, BiP 作为 Hsp70 家族的一员, 拥有 Hsp70 家族共有的三个结构区域 [6-7] : (1) N 端 : ATPase 功能域含 4 个 α 螺旋形成一个裂缝, 裂缝底部带有 ATP 结合位点, 有 ATP 酶活性, 结合 ATP 并将其水解成 ADP; (2) C 端 : peptide-binding 结构域由 4 个反相平行的 β- 折叠和 1 个 α 螺旋构成一个中性的疏水氨基酸残基凹槽, 能与长达 7 个残基的多肽相互作用 ; (3) C 末端可变区富含 α 螺旋结构 : 相当于给 C 端 peptide-binding 结构域加一个盖子, 当一个 Hsp70 蛋白与 ATP 结合时, 此盖子打开, 与之结合的多肽很快被释放 ; 而当 Hsp70 蛋白与 ADP 结合时, 此盖子关闭, 多肽就会紧密的结合在 C 端 peptide-binding 结构域 [8] 登陆 PDB 只获得 Wisniewska 等经试验测定的 BiP ATPase 功能域三维结构图 (3IUC, 图 3A) 登陆 NCBI 数据库获得 BiP 的 654 个氨基酸序列, 以 BiP 同系物酵母 Kar 经试验测定的 peptide-binding 结构域三维结构为模板进行同源建模产生预测的 peptidebinding 结构域三维结构模型 ( 图 3B), 序列一致性 : %; 以人类 Hsp70 经试验测定的 C 末端可变区三维结构为模板进行同源建模产生预测的 C 末端可变区结构模型 [9-11] ( 图 3C), 序列一致性 : %, 结果都与目前的报道一致其中, 带有 ATPase 活性的 ATPase 功能域和 peptidebinding 结构域为 Hsp70 蛋白家族成员共同拥有两个 [12] 主要的功能域本实验参考 Lee 等论文提及的相关信息 : BiP 含 654 个氨基酸 (aa), 包括氨基端的 ER 信号肽 (1~18 aa) 一个 ATPase 功能域 (125~280 aa) 一个 peptide-binding 结构域 (400~500 aa) 和一个羧基端定位 ER 的 KDEL 序列 (651~654 aa), 来构建 BiP 分别缺失 AT- Pase 和 peptide-binding 区的缺失体 (BiPa BiPp) 的真核表达载体, 并基于前面对 BiP 蛋白质结构的了解和分析, 预测成功构建的 BiP 全长和 2 个缺失体的真核表达载体在 LO2 细胞中均能正确表达 2.3 BiP 全长与缺失突变重组质粒在 LO2 细胞和 SMMC-7721 细胞中的表达将构建好的 BiP 基因全长重组质粒和缺失体

1208 研究论文 A: BiP ATPase 功能域 (residues D26-D410): 含 4 个 α 螺旋形成一个裂缝 ; B: BiP peptide-binding 结构域 (residues D418-D566): 含 4 个反相平行的 β- 折叠和 1 个 α 螺旋 ; C: C 末端可变区 (Residues D556-D636)- 富含 α 螺旋结构 A: the

5 1208 研究论文 A: BiP ATPase 功能域 (residues D26-D410): 含 4 个 α 螺旋形成一个裂缝 ; B: BiP peptide-binding 结构域 (residues D418-D566): 含 4 个反相平行的 β- 折叠和 1 个 α 螺旋 ; C: C 末端可变区 (Residues D556-D636)- 富含 α 螺旋结构 A: the structure of the BiP ATPase domain (Residues D26-D410)-contains 4 α-helix domains forming 2 lobes with a deep cleft between; B: the structure of the BiP peptide-binding domain (Residues D418-D566)-contains two 4-stranded antiparallel β-sheets and single α-helix; C: the structure of the BiP C-terminal domain (Residues D556-D636)-rich in α-helix structure. 图 3 人 BiP 结构域三维图 Fig.3 Three-dimensional structures of the human BiP 重组质粒用脂质体分别转染入 LO2 细胞和 SMMC 细胞, 免疫印迹检测显示 BiP 全长及两个缺失突变体的重组质粒均可以在 LO2 细胞和 SMMC-7721 细胞内正确表达 ( 图 4) 2.4 BiP 促进 SMMC-7721 细胞的增殖 MTT 法检测 BiP 全长及缺失体对 SMMC-7721 细胞增殖的影响 MTT 结果表明, 无应激条件下, SMMC-7721 细胞转染 BiP 全长和缺失体 BiPa BiPp 重组质粒后, 分别在培养 1, 2, 3, 4 d 后检测细胞的增殖情况结果显示 SMMC-7721 细胞分别在转染 BiP 全长和缺失体 BiPa BiPp 重组质粒 1, 2, 3, 4 d 后, 细胞增殖率 (PR) 均逐渐增加, 其中, 转染 BiP 全长重组质粒 1, 2, 3, 4 d 后的细胞增殖率分别为 19.79% 27.34% 46.85% 71.25%; 转染 BiPa 重组质粒 1, 2, 3, 4 d 后的细胞增殖率分别为 28.09% 33.70% 54.73% 82.70%; 转染 BiPp 重组质粒 1, 2, 3, 4 d 后的细胞增殖率分别为 -0.94% 3.44% 20.95% 33.12%, 各组与相应的空白对照组比较差异均具有统计学意义 (*P<0.05, **P<0.01, 图 5A), 说明上调 BiP 全长和缺失体 BiPa BiPp 都可以明显促进细胞的增殖, 其中转染 BiP 全长和 BiPa 缺失体重组质粒组与空质粒对照组相比, 细胞增殖具有极显著差异 ; 缺失体 BiPp 组与对照组相比, 细胞增殖具有显著性差异, 各组结果均具有统计学意义 BrdU 免疫组化方法检测 BiP 及缺失体对 SMMC 细胞增殖的影响 BrdU 免疫组化结果显示, 转染 BiP 及缺失体 BiPa BiPp 重组质粒 48 h 后, 细胞增殖能力均有不同程度上升, 与对照组相比, 转染 BiP BiPa BiPp 重组质粒后, SMMC-7721 细胞的增殖率逐渐增加, 分别为 10.62% 15.42% 23.11% 20.21%, 各转染组与对照组相比, 差异均具有统计学意义 (*P<0.05, 图 6A 和图 6B) 1: 未转染组 ; 2: 转染 pcdna3.1(-) 空载体组 ; 3: 转染 pcdna3.1(-)-bip 真核表达载体组 ; 4: 转染 pcdna3.1(-)-bipa 真核表达载体组 ; 5: 转染 pcdna3.1(-)-bipp 真核表达载体组 1: cells without transfection; 2: cells transfected with pcdna3.1(-); 3: cells transfected with pcdna3.1(-)-bip; 4: cells transfected with pcdna3.1(-)- BiPa; 5: cells transfected with pcdna3.1(-)-bipp. 图 4 8% SDS-PAGE 检测 BiP 全长及两个缺失体融合蛋白在 LO2 细胞和 SMMC-7721 细胞的表达 Fig.4 8%SDS-PAGE analysis on the expression of BiP full-length and two mutant fusion proteins in LO2 cells and SMMC-7721 cells

6 李祥柱等: 分子伴侣BiP结构域分析及对肝癌细胞增殖和凋亡的影响 1209 A: 转染BiP全长及BiPa BiPp两个缺失体后, 各组分别培养1, 2, 3, 4 d后检测d490值; B: BiP及两个缺失体处理细胞后, 各处理组细胞的增长率 (t test, *P<0.05, **P<0.01) A: the D490 value of 1, 2, 3, 4 d after transfected with BiP three eukaryotic expression vectors in each group; B: the proliferation rate of transfected cells in each group (t test, *P<0.05, **P<0.01). Fig.5 Fig.6 图 5 MTT法检测转染BiP基因全长及缺失体对SMMC-7721细胞生长的影响(n=5) Effects on the cell growth of SMMC-7721 cells after transfected with BiP three expression plasmids by MTT assay (n=5) 图 6 BrdU染色检测转染BiP及其缺失体48 h后smmc-7721细胞增殖情况(*p<0.05) The proliferation of SMMC-7721 cells after transfected with BiP three eukaryotic expression vectors by BrdU staining analysis (*P<0.05) Fig.7 图 7 FCM检测各组SMMC-7721细胞的凋亡率(*P<0.05) Analysis on apoptosis rate in every SMMC-7721 cell groups by flow cytometry (*P<0.05)

7 1210 研究论文 2.5 BiP 促进 SMMC-7721 细胞的凋亡 FCM 检测结果表明, 转染 BiP 全长及两个缺失体 BiPa BiPp 重组质粒后, SMMC-7721 细胞的凋亡率分别为 28.95% 27.14% 23.22%, 与未处理对照组 (14.83%) 比较, 转染 BiP 全长及两个缺失体 BiPa BiPp 重组质粒后, 均可以明显促进肝癌细胞 SMMC 的凋亡, 差异具有统计学意义 (*P<0.05, 图 7A 和图 7B) 上述结果说明, 增加 BiP 或者 BiPa BiPp 的表达能有效促进细胞凋亡, BiP 的两个重要组成结构域 BiPa 和 BiPp 可能共同参与肝癌细胞的凋亡过程 3 讨论人类 BiP 由 HSPA5 基因编码, 是位于内质网腔的 Hsp70 分子伴侣 BiP 是几乎在所有生长条件下都富含的蛋白质, 但它在内质网未折叠多肽积累的情况下合成更加显著 BiP 与许多内质网蛋白都有短暂的相互作用, 因此是内质网维持内环境稳态的一个感应器它参与前体蛋白质转运到内质网及随后的折叠和组装, 错误折叠和错误组装蛋白质的输出及相关降解 (ERAD), 调节相关内质网应激 (ER stress, ERS) 的信号传导, 调节内质网钙离子内稳态等诸多生物学过程通过对 BiP 各组成结构域的研究, 进一步分析 BiP 蛋白的活性中心, 对于探讨 BiP 蛋白的功能和 BiP 蛋白作用机理有着重要的指导意义目前的研究表明, BiP 拥有 Hsp70 蛋白家族成员共同拥有的两个主要功能域 : 带有 ATPase 活性的 AT- Pase 功能域和 peptide-binding 结构域当 ATP 与 AT- Pase 功能域结合时, 它的 peptide-binding 结构域能与未折叠 / 错误折叠蛋白作用, 随后 ATP 水解作用加强 BiP 与这些未折叠 / 错误折叠蛋白的作用在此情况下, 蛋白质二硫键异构酶 (PDI) 可促进二硫键还原重排再氧化直到蛋白质构象正确完成, 促使 ADP 交换成 ATP 结束了 BiP 与这些蛋白的作用而与其他未折叠 / 错误折叠蛋白结合 [13] 可见, BiP 的 ATPase 功能域与 ADP/ATP 结合的变化可以调控 peptidebinding 结构域的运转, 同时, 多肽与 peptide-binding 结构域的结合 / 释放也可以刺激 ATPase 功能域上 ATPase 的活性因此, BiP ATPase 功能域与 peptidebinding 结构域两功能域间的相互作用是 Hsp70 蛋白家族成员实现其功能的重要原因 Hendershot 等 [14] 的研究发现, 孤立表达 BiP 的 peptide-binding 结构域能与配体永久性地结合, 也能干扰 ER 的正常功能 ; 相反, 孤立表达 BiP 的 ATPase 功能域不能与配体相互作用并且测不出对 ER 的损伤作用 BiP 的 ATPase 功能域具有与 ATP 结合的作用和水解活性, 这被认为是 ER 折叠组装蛋白功能必不可少 [15] 的 ; Snowden 等在植物细胞中发现, 虽然缺少 ATPase 功能域的 BiP 缺失体对 ER 功能没有不利影响, 但孤立表达 BiP 的 ATPase 功能域会干扰分泌蛋白的合成 Hardy 等 [16] 则把细胞表面表达的 BiP 描述为内皮细胞上一个新生的血管生成因子受体, 其 peptide-binding 结构域可以诱导内皮细胞血管生成及毛细血管增加肿瘤细胞内质网中 BiP 升高增加了肿瘤细胞存活的机会, 使得肿瘤细胞对化疗药物产生抵抗从而造成肿瘤患者愈后不良和治疗失败近年来发现, BiP 在肿瘤细胞的细胞表面表达, 对肿瘤血管的生成也有促进作用 [16-17], 研究表明通过下调肿瘤细胞 BiP 的表达有望成为肿瘤治疗中一个新的辅助靶点因此, 进一步阐明 BiP 及各组成结构域与肿瘤细胞增殖凋亡的关系, 可为肿瘤治疗提供一定的理论基础本实验在成功构建 BiP 及各组成结构域缺失体真核表达载体基础上, 运用 MTT 法 BrdU 免疫组化法初步验证 BiP 及 BiPa BiPp 的过表达均能有效促进肝癌细胞 SMMC-7721 的增殖, 其中各组细胞分别转染 BiP 全长 BiPa 和 BiPp 真核载体后, 继续培养 1, 2, 3, 4 d 后, 采用 MTT 法检测各组细胞的增殖率 (PR), 各组细胞增殖率大小顺序为 : BiPa>BiP>BiPp; BrdU 法测得 BiP 全长 BiPa 和 BiPp 转染各组细胞后, 细胞增殖率大小为 : BiPa>BiPp>BiP 结果表明, 缺失 ATPase 功能域的缺失体 BiPa 促进 SMMC-7721 肿瘤细胞的增殖作用比 BiP 全长和缺失体 BiPp 更加显著, 提示组成 BiP 的两个结构域 : peptide-binding 结构域与 ATPase 功能域调控细胞增殖的作用具有差异性, 独立的 ATPase 功能域可能抑制细胞增殖, 而独立的 peptide-binding 结构域可能促进细胞的增殖, 当组成 BiP 的这两个结构域共同存在时, 它们协同调控, 促进细胞的增殖, 具体的分子机制还需要进一步的实验研究和探讨细胞增殖与凋亡是两个既独立又互相联系的生物学过程, 为了进一步研究 BiP 及两个组成结构域与凋亡的关系, 我们通过流式细胞仪分别检测转染 BiP BiPa BiPp 重组质粒后, 肝癌细胞 SMMC 的凋亡率, 结果显示, 与对照组凋亡率 14.83% 比较, 三个实验组细胞凋亡率均明显增加, 分别为

8 李祥柱等 : 分子伴侣 BiP 结构域分析及对肝癌细胞增殖和凋亡的影响 % 27.14% 23.22%, 与对照组相比, 差异均具有统计学意义 (P<0.05); 其中, 缺失 ATPase 功能域的缺失体 BiPa 与全长 BiP 两组间凋亡率差异不显著 ; 而转染缺失体 BiPp 组细胞凋亡率明显低于全长 BiP 组, 两组差异具有显著性 (P<0.05), 提示 ATPase 功能域可能与细胞凋亡不相关, 而 peptide-binding 结构域可能促进细胞的凋亡 ; 当 ATPase 功能域与 peptidebinding 结构域同时存在时, 它们会协同调控促进细胞的凋亡综上所述, 我们的研究初步分析了内质网分子伴侣 BiP 的两个主要功能域 : ATPase 功能域与 peptide-binding 结构域单独存在或者共同存在时与细胞增殖及凋亡的关系, 我们认为两个结构域独立存在或者共同存在时, 调控细胞增殖与凋亡是有差异性的, 初步认为造成这种差异性的原因是组成 BiP 的这两个结构域在功能上具有相互作用当它们共同存在时, 可以相互协同调控细胞的增殖与凋亡, 正是这种功能上的协同作用导致 BiP 这一复杂的生物学功能我们的这些研究结果为进一步分析和探讨 BiP 及各组成结构域的生物学功能奠定基础, 为研究 BiP 与肿瘤增殖凋亡及相关调节基因表达的信号转导机制奠定基础, 有利于阐明内质网分子伴侣在肿瘤生物学治疗中的实际意义至于 BiP 作为内质网分子伴侣, 与真核细胞其他生物学特性的关系, 还有待进一步扩大细胞类型深入研究参考文献 (References) 1 Dudek J, Benedix J, Cappel S, Greiner M, Jalal C, Müller L, et al. Functions and pathologies of BiP and its interaction partners. Cell Mol Life Sci 2009; 66(9): Guo FJ, Lin EA, Liu P, Lin J, Liu C. XBP1U inhibits the XBP1Smediated upregulation of the inos gene expression in mammalian ER stress response. Cell Signal 2010; 22(12): Susuki S, Sato T, Miyata M, Momohara M, Suico MA, Shuto T, et al. The endoplasmic reticulum-associated degradation of transthyretin variants is negatively regulated by BiP in mammalian cells. J Biol Chem 2009; 284(13): Gorbatyuk MS, Knox T, LaVail MM, Gorbatyuk OS, Noorwez SM, Hauswirth WW, et al. Restoration of visual function in P23H rhodopsin transgenic rats by gene delivery of BiP/Grp78. Proc Natl Acad Sci USA 2010; 107(13): Heckman KL, Pease LR. Gene splicing and mutagenesis by PCR-driven overlap extension. Nat Protoc 2007; 2(4): Kiang JG, Tsokos GC. Heat shock protein 70 kda: Molecular biology, biochemistry, and physiology. Pharmacol Ther 1998; 80(2): Chevalier M, King L,Wang C, Gething MJ, Elguindi E, Blond SY. Substrate binding induces depolymerization of the C-terminal peptide binding domain of murine GRP78/BiP. J Biol Chem 1998; 273(41): Wisniewska M, Karlberg T, Lehtiö L, Johansson I, Kotenyova T, Moche M, et al. Crystal structures of the ATPase domains of four human Hsp70 isoforms: HSPA1L/Hsp70-hom, HSPA2/Hsp70-2, HSPA6/Hsp70B, and HSPA5/BiP/GRP78. PLoS One 2010; 5(1): e Arnold K, Bordoli L, Kopp J, Schwede T. The SWISS-MODEL Workspace: A web-based environment for protein structure homology modelling. Bioinfor-matics 2006; 22(2): Schwede T, Kopp J, Guex N, Peitsch MC. SWISS-MODEL: An automated protein homology-modeling server. Nucleic Acids Res 2003; 31(13): Guex N, Peitsch MC. SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer: An environment for comparative protein modelling. Electrophoresis 1997; 18(15): Zhang Y, Liu R, Ni M, Gill P, Lee AS. Cell surface relocalization of the endoplasmic reticulum chaperone and unfolded protein response regulator GRP78/BiP. J Biol Chem 2010; 285(20): Hendershot LM, Valentine VA, Lee AS, Morris SW, Shapiro DN. Localization of the gene encoding human BiP/GRP78, the endoplasmic reticulum cognate of the HSP70 family, to chromosome 9q34. Genomics 1994; 20(2): Hendershot LM, Wei JY, Gaut JR, Lawson B, Freiden PJ, Murti KG. In vivo expression of mammalian BiP ATPase mutants causes disruption of the endoplasmic reticulum. Mol Biol Cell 1995; 6(3): Snowden CJ, Leborgne-Castel N, Wootton LJ, Hadlington JL, Denecke J. In vivo analysis of the lumenal binding protein (BiP) reveals multiple functions of its ATPase domain. Plant J 2007; 52(6): Hardy B, Raiter A. Peptide-binding heat shock protein GRP78 protects cardiomyocytes from hypoxia-induced apoptosis. J Mol Med 2010; 88(11): Gonzalez-Gronow M, Selim MA, Papalas J, Pizzo SV. GRP78: A multifunctional receptor on the cell surface. Antioxid Redox Signal 2009; 11(9):

9 1212 研究论文 Analysis on Molecular Chaperone BiP Domain and Influence on Proliferation and Apoptosis in Hepatoma Cells Li Xiangzhu, Liu Yanna, Zhao Wenjun, Zhou Jinghua, Guo Fengjin* (Department of Cell Biology and Genetics, Chongqing Medical University, Molecular Medicine and Cancer Research Center, Chongqing Medical University, Chongqing , China) Abstract Binding immunoglobulin protein (BiP) is a resident member of Hsp70 family and master regulator for Endoplasmic Reticulum Stress (ERS). To study the relationship of Bip domain with the physiological function, BiP DNA sequence and protein structure were analysed, two deletion mutants of BiP and BiP full-length eukaryotic expression vectors with myc tag were successfully constructed with the method of overlapping PCR mutagenesis respectively. BiPa deletion mutant is BiP mutant with ATPase domain deleted, BiPp deletion mutant is BiP mutant with peptide-binding domain deleted. After these eukaryotic expression vectors were transfected into LO2 and SMMC-7721 cells, they were identified the expression by Western blot. Then cell proliferation and apoptosis were analysed by MTT assay, BrdU immunohistochemistry and flow cytometry (FCM) respectively, next the relationship between cell proliferation/apoptosis and BiP/BiPa/BiPp were also analysed. Both the full-length BiP and the deletion mutants BiPa, BiPp can effectively improve SMMC-7721 cells proliferation by MTT assay and BrdU immuno-histochemistry. Besides, every group of cell proliferation rate results showed that ATPase domain might be inhibit cell growth, while peptide-binding domain might be increase cell growth. FCM results showed that both the full-length BiP and the deletion mutants BiPa, BiPp can enhance SMMC-7721 cells apoptosis. The difference of apoptosis rate between group BiPa and group BiP were no significance, however, the apoptosis rate of group BiPp was clearly lower than group BiP (P<0.05). It was showed that ATPase domain might be unconcerned with cell apoptosis, while peptide-binding domain might be increase cell apoptosis. These two domains, ATPase and peptide-binding, can coregulate cell proliferation and cell poptosis when they combined with each other. The molecular mechanism of them need to be studied deeply. Key words BiP; deletion; bioinformatics; cell proliferation Received: May 29, 211 Accepted: August 22, 2011 This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (No ) and the Education Ministry Study Abroad Staff Foundation (No ) *Corresponding author. Tel: , guo.fengjin@gmail.com

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽