1698 畜牧兽医学报 43 卷 mutationof 犈犘犗犚 genecanafectthehctandthisgenecanbeapotentialcandidategenefor immunityrelatetraits(e.g.hct)forfurtherstudy. 犓犲狔狑狅狉犱狊 :

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栓冷密从
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1 畜牧兽医学报 2012,43(11): 犃犮狋犪犞犲狋犲狉犻狀犪狉犻犪犲狋犣狅狅狋犲犮犺狀犻犮犪犛犻狀犻犮犪猪红细胞生成素受体基因突变与血常规性状关联分析 1,2 宋欣, 曹随忠 2, 张龙超 1, 程笃学 1, 王立刚 1, 李勇 1, 刘欣 1, 马小军 1, 梁晶 1, 陈少康 3, 罗维真 1, 颜华 1, 赵克斌 1, 王立贤 1 (1. 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所, 北京 ;2. 四川农业大学动物医学院, 雅安 ;3. 中国农业大学动物科技学院, 北京 ) 摘要 : 本研究旨在探索红细胞生成素受体基因 ( 犈犘犗犚 ) 影响红细胞相关性状的分子机理对犈犘犗犚基因第 1 内含子和第 4 内含子突变位点 g.705g>t 和 g.2373c>t, 以飞行时间质谱进行个体基因型分型, 在构建的大白猪民猪 F2 代资源群体内开展其与 6 种血常规性状 ( 红细胞压积血红蛋白平均红细胞血红蛋白量平均红细胞体积红细胞计数及红细胞分布宽度 ) 的关联分析结果表明, 第 1 内含子突变位点 g.705g>t 未发现与血常规性状显著关联 ; 第 4 内含子突变位点 g.2373c>t 群体内只发现 2 种基因型, 其中 CT 基因型个体的红细胞压积显著高于 CC 基因型个体 ( 犘 <0.05), 但并未发现与其他性状显著关联结果显示, 犈犘犗犚基因突变可显著影响红细胞压积, 说明该基因可作为影响红细胞压积的主效候选基因开展深入研究关键词 : 血常规性状 ; 犈犘犗犚基因 ; 免疫性状 ; 猪 ;SNP 中图分类号 :S828;S813.3 文献标识码 :A 文章编号 : (2012) 犃狊狅犮犻犪狋犻狅狀狅犳犛犖犘狊犻狀犈狉狔狋犺狉狅狆狅犻犲狋犻狀犚犲犮犲狆狋狅狉犌犲狀犲狑犻狋犺犅犾狅狅犱犘犪狉犪犿犲狋犲狉狊 SONGXin 1,2,CAOSui zhong 2,ZHANGLong chao 1,CHENGDu xue 1,WANG Li gang 1, LIYong 1,LIU Xin 1,MAXiao jun 1,LIANGJing 1,CHENShao kang 3,LUO Wei zhen 1, YAN Hua 1,ZHAOKe bin 1,WANG Li xian 1 (1. 犐狀狊狋犻狋狌狋犲狅犳犃狀犻犿犪犾犛犮犻犲狀犮犲, 犆犺犻狀犲狊犲犃犮犪犱犲犿狔狅犳犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾犛犮犻狀犲犮犲狊, 犅犲犻犼犻狀犵 , 犆犺犻狀犪 ;2. 犆狅犾犲犵犲狅犳犞犲狋犲狉犻狀犪狉狔犕犲犱犻犮犻狀犲, 犛犻犮犺狌犪狀犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔, 犢犪犪狀 , 犆犺犻狀犪 ;3. 犆狅犾犲犵犲狅犳犃狀犻犿犪犾犛犮犻犲狀犮犲犪狀犱犜犲犮犺狀狅犾狅犵狔, 犆犺犻狀犪犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔, 犅犲犻犼犻狀犵 , 犆犺犻狀犪 ) 犃犫狊狋狉犪犮狋 :Theaimofpresentstudywastoinvestigatetheefectofporcineerythropoietinreceptor (EPOR)geneon blood parameters.six blood parameters,hematocrit (HCT),hemoglobin (HGB),meancorpuscularhemoglobin (MCH),meancelvolume(MCV),redbloodcelcount (RBC)andredbloodceldistributionwidth (RDW),weremeasuredinLarge White Minzhu intercrossporcinepopulation. 犈犘犗犚 wasgenotypedusingmatrix assistedlaserdesorption/ioni zation time of flight massspectrometry (MALDI TOF).Theassociationsofg.705G > Tin intron1andg.2373c>tinintron4 withthesixbloodparameterswereanalyzed.theresult showedthatthesnpatg.705g>t wasnotsignificantlyassociatedwithanytrait.twogeno types(ccandct)ofsnpatg.2373c>t werefoundinthispopulation.thehctofindividu alswithctgenotypewashigherthanthatofindividualswithccgenotype ( 犘 <0.05),while thissnp wasnotsignificantassociated withotherfivetraits.theseresultsindicatethatthe 收稿日期 : 基金项目 : 十二五国家科技支撑计划项目 (2011BAD28B01); 现代农业产业技术体系 ; 中国农业科学院基本科研业务专项 (2011cj 5) 作者简介 : 宋欣 (1986 ), 男, 河南虞城人, 硕士生, 主要从事兽医产科学方面的研究,E mail:songxin7788@163.com 通讯作者 : 张龙超,E mail:lczhang@iascaas.net.cn; 王立贤,E mail:iaswlx@263.net

2 1698 畜牧兽医学报 43 卷 mutationof 犈犘犗犚 genecanafectthehctandthisgenecanbeapotentialcandidategenefor immunityrelatetraits(e.g.hct)forfurtherstudy. 犓犲狔狑狅狉犱狊 :bloodparameter; 犈犘犗犚 gene;immunityrelatetrait;pig;snp 随着猪育种工作的持续开展, 当前的生猪生长速度已经达到了很高的水平但是, 近年来大规模疾病的屡次暴发, 说明猪群的免疫功能降低了这与长期以来育种工作集中于生长方面, 而忽略了免疫性状的育种有很大关系我国地方猪种长期以来并没有开展专门化的育种工作, 其生产性能低于外来引进猪种, 但是其免疫抗病能力强是众所周知的我国地方猪种在大规模疾病暴发中, 维持了较低的死亡率, 充分证明了这一点因此, 探索我国地方猪种免疫抗病能力强的分子机制就成为当前育种工作的重点血液指标具有非常重要的免疫功能指示作用, 已经开始作为疾病预测相关的生物学标记应用于人 [1] 类和动物医学领域有研究表明, 一些血液指标 [2 4] 与人类 Ⅱ 型糖尿病的发生率显著关联由于猪的体质量器官大小等与人类接近, 因此, 猪除了作为非常重要的产肉动物外, 还可以作为人类疾病的研究模型被广泛应用猪红细胞生成素受体基因 (Erythropoietinreceptor, 犈犘犗犚 ) 定位于 2 号染色 [5] 体上红细胞压积 (HCT)QTL 区间内, 然而, 此基因突变位点与猪红细胞相关性状的关联分析尚未见报道本研究开展犈犘犗犚基因突变位点与血液指标的关联分析, 为今后探讨犈犘犗犚基因影响血液指标的分子机理奠定基础 1 材料与方法 1.1 实验材料本研究选用大白猪东北民猪 F 2 代资源群体个体 171 头 ( 饲养于中国农业科学院北京畜牧兽医研究所昌平基地实验猪场 ) 肌肉组织中提取 DNA,-70 保存血液是在猪大约 240 日龄时由前腔动脉采取, 送至中国中医科学院西苑医院进行血常规指标测定, 检测指标包括 : 红细胞压积 (HCT) 血红蛋白 (HGB) 平均红细胞血红蛋白量 (MCH) 平均红细胞体积 (MCV) 红细胞计数 (RBC) 及红细胞分布宽度 (RDW) 1.2 试验方法 [6] 基因组 DNA 提取采用高盐提取法从猪肌肉组织中提取基因组 DNA,0.8% 琼脂糖凝胶电泳检测纯度, 用分光光度计估计含量, 调整其工作液浓度至 100μg μl 犈犘犗犚基因突变位点选择及基因分型 [7] [8] 根据本研究组前期研究结果及 Valet 等对猪犈犘犗犚基因多态位点的探索及其与产仔性状的关联分析结果, 本研究选择了与产仔性状显著关联的第 1 内含子突变位点 (g.705g>t) 及第 4 内含子突变位点 (g.2373c>t) 对所有个体开展此 2 个突变位点基因分型, 所用方法为飞行时间质谱基因分型方法 (MALDI TOF,Sequenom,SanDiego,CA), 此分型工作均在毅新兴业 ( 北京 ) 科技有限公司进行, 飞行时间质谱分型所用引物及探针序列见表统计方法构建如下动物模型 : 犢 = μ + 犘 + 犅 + 犛 + 犌 + 犲表 1 犈犘犗犚基因突变位点质谱分型所用引物和探针序列犜犪犫犾犲 1 犘狉犻犿犲狉狊犪狀犱狆狉狅犫犲狊犳狅狉犵犲狀狅狋狔狆犻狀犵犪狊犪狔犳狅狉犛犖犘狊狅犳犈犘犗犚犵犲狀犲突变位点 SNP 引物 Primer 序列 (5 3 )Sequence g.705g>t g.2373c>t Forward Reverse Probe Forward Reverse Probe ACGTTGGATGACACGGTTTTCAAGCAGACG ACGTTGGATGATAGCGCCAACCGTGCCCCT TTGCCCCCCTCCCTC ACGTTGGATGATCAGAGAAAGGACGAACCG ACGTTGGATGTCTGATTGGTCCCAGCTTTC CCTGCTTTCATTGCCTA

3 11 期宋欣等 : 猪红细胞生成素受体基因突变与血常规性状关联分析 1699 其中, 犢为性状值, μ 为总体均值, 犘为胎次效应, 犅为屠宰批次效应, 犛为性别效应, 犌为基因型效应, 犲为残差效应本研究根据位点基因型分组, 利用 SAS 软件中的 GLM 过程分析针对每一个 SNP 座位, 在群体内运用 χ 2 检验分析等位基因频率是否符合哈代温伯格平衡 (Hardy weinbergequilibrium) 2 结果 2.1 血常规性状经测定, 本研究所用大白猪民猪 F 2 代资源群体 6 种血常规性状的平均值标准差最大值及最小值见表 2 由表 2 可知, 本群体红细胞计数血红蛋白红细胞压积平均红细胞体积平均红细胞血红蛋白量及红细胞分布宽度平均值分别为 L g L % 53.74fL 17.28pg 及 16.68% 这 6 种血常规性状的群体变异系数分别为 18.99% 9.09% 9.72% 7.15% 5.79% 和 4.68% 2.2 猪犈犘犗犚基因犵.705 犌 > 犜及犵.2373 犆 > 犜位点检测通过飞行时间质谱基因分型可清晰准确地对 g.705g>t 及 g.2373c>t 位点开展基因型分型, 二者的飞行时间质谱基因分型图分别见图 1 和 2 根据每个个体基因型分型结果, 开展群体内 2 个位点基因型频率等位基因频率及哈代温伯格平衡检验, 结果见表 3 由表 3 可知, 第 1 内含子突变位点 g.705g>t 的 GG TT 及 GT 基因型频率分别为和 ,G 和 T 等位基因频率分别为和 ; 第 4 内含子突变位点 g.2373c >T 只发现 2 种基因型 CC 和 CT, 基因型频率分别为和 , 其中 C 和 T 等位基因频率分别为和经哈代温伯格平衡检验发现, 这 2 个突变位点在群体中均处于不平衡状态表 2 群体 6 个血常规性状统计数犜犪犫犾犲 2 犇犲狊犮狉犻狆狋犻狏犲狊狋犪狋犻狊狋犻犮狊狅犳狊犻狓犺犲犿犪狋狅犾狅犵犻犮犪犾狆犪狉犪犿犲狋犲狉狊狅犳狆狅狆狌犾犪狋犻狅狀性状 Trait 平均值 ± 标准差 Mean± 狊最大值 Maximum 最小值 Minimum 红细胞计数 /(10 12 L -1 )RBC 7.90± 血红蛋白 /(g L -1 )HGB ± 红细胞压积 /% HCT 43.94± 平均红细胞体积 /fl MCV 53.74± 平均红细胞血红蛋白量 /pg MCH 17.28± 红细胞分布宽度 /% RDW 16.68± A B C 分别为 GG 纯合基因型 TT 纯合基因型及 GT 杂合基因型 A,BandCareGG,TTandGTgenotypes,respectively 图 1 犈犘犗犚基因第 1 内含子突变位点犵.705 犌 > 犜飞行时间质谱基因分型犉犻犵.1 犜犺犲犵犲狀狅狋狔狆犲狊狅犳犈犘犗犚犵犲狀犲犛犖犘犪狋犵.705 犌 > 犜犻狀犻狀狋狉狅狀 1 犳狉狅犿犕犃犔犇犐犜犗犉

4 1700 畜牧兽医学报 43 卷 A 和 B 分别为 CC 纯合基因型和 CT 杂合基因型 AandBareCCandCTgenotypes,respectively 图 2 犈犘犗犚基因第 4 内含子突变位点犵.705 犌 > 犜飞行时间质谱基因分型犉犻犵.2 犜犺犲犵犲狀狅狋狔狆犲狊狅犳犈犘犗犚犵犲狀犲犛犖犘犪狋犵.705 犌 > 犜犻狀犻狀狋狉狅狀 4 犳狉狅犿犕犃犔犇犐犜犗犉表 3 猪犈犘犗犚基因内含子区突变位点在群体中的分布及哈代温伯格平衡检验犜犪犫犾犲 3 犜犺犲犱犻狊狋狉犻犫狌狋犻狅狀狅犳犛犖犘狊狅犳狆狅狉犮犻狀犲犈犘犗犚犪狀犱犎犪狉犱狔狑犲犻狀犫犲狉犵犲狇狌犻犾犻犫狉犻狌犿狋犲狊狋犻狀狆狅狆狌犾犪狋犻狅狀突变位点基因区域基因型频率等位基因频率卡方值 SNP Region Genotypicfrequency Alelefrequency χ 2 g.705g>t 内含子 1 GG(0.0409) GT(0.3918) TT(0.5673) G(0.2368) T(0.7632) g.2373c>t 内含子 4 CC(0.9415) CT(0.0585) C(0.9708) T(0.0292) χ 2 2,0.05=5.991, χ 2 2,0.01=9.210 ; χ 2 1,0.05=5.991, χ 2 1,0.01= 犈犘犗犚基因突变位点犵.705 犌 > 犜及犵.2373 犆 > 犜与血常规性状关联分析本研究开展了犈犘犗犚基因第 1 内含子突变位点 g.705g>t 及第 4 内含子突变位点 g.2373c>t 基因型与 6 种血常规性状的关联分析, 结果见表 4 由表 4 可知, 第 1 内含子突变位点 g.705g>t 各基因型与 6 种血常规性状均没有显著关联 ( 犘 >0.05); 第 4 内含子突变位点 g.2373c>t 仅与红细胞压积 (HCT) 性状显著关联 ( 犘 <0.05), 其中 CT 基因型个体红细胞压积显著高于 CC 基因型个体表 4 犈犘犗犚基因突变位点基因型与六项血液指标的关联分析犜犪犫犾犲 4 犜犺犲犪狊狅犮犻犪狋犻狅狀狅犳狆狅犾狔犿狅狉狆犺犻狊犿狊狅犳犈犘犗犚狑犻狋犺狊犻狓犫犾狅狅犱狆犪狉犪犿犲狋犲狉狊突变位点基因型个体数红细胞血红蛋白红细胞平均红细胞平均红细胞血红细胞分布 SNP Genotype Number 计数 RBC HGB 压积 HCT 体积 MCV 红蛋白量 MCH 宽度 RDW GG ± ± ± ± ± ±1.05 g.705g>t TT ± ± ± ± ± ±0.71 GT ± ± ± ± ± ±0.84 g.2373c>t CC ± ± ±4.17 b 53.11± ± ±0.78 CT ± ± ±2.99 a 53.87± ± ±1.13 a,b. 上标字母不同表示差异显著 ( 犘 <0.05) a,b.meanswithdiferentsuperscriptsaresignificantlydiferent( 犘 <0.05)

5 11 期宋欣等 : 猪红细胞生成素受体基因突变与血常规性状关联分析讨论血红细胞生成素 (Erythropoietin,EPO) 是一种造血激素, 它是由胎儿的肝脏和成年动物的肾脏分泌的, 在造血器官血红细胞的增殖分化和成熟过程中起着非常重要的作用, 且对于血液循环中红血球 [9 11] 的数量起到维持作用 EPO 的促血细胞生成功能的发挥必须依赖于与红细胞生成素受体的结合 [12 15] 红细胞生成素受体位于造血系祖细胞表面, 在红细胞生成的过程中起着关键作用研究结果表明, 母猪妊娠 24~40d 是猪胎儿红细胞生成的关键 [16] 时期, 且在这一时间段, 猪胎儿肝脏中的犈犘犗犚 [17] 基因表达量急剧增高, 说明该基因可能与红细胞生成相关虽然犈犘犗犚基因定位于 2 号染色体上 [5] 红细胞压积 (HCT)QTL 区间内, 但对该基因的很多研究都集中在产仔数方面有研究表明, 犈犘犗犚基因第 4 内含子中存在 1 个与猪子宫容积及产活仔数显著关联的突变 (C/T) [8] 可能是该突变影响了血液指标, 血液中红细胞相关指标提高了, 则增加了胎儿血液的携氧及养分能力, 从而提高了胎儿的生存能力, 最终导致产活仔数的增加中国地方猪种以其高产仔数抗逆性强耐粗饲耐寒等优良特性闻名于世, 尤其以我国的梅山 [18] 猪民猪等为代表国内外的许多学者试图通过研究红细胞生成的差异来解释我国地方猪种的这些优良特性, 尤其是其高产仔数特性有研究发现, 在妊娠 24 及 40d 时, 梅山猪胎儿体内的红血球含量 [13] 要显著高于外种白猪又有研究发现, 相比外种 [19] 白猪, 梅山猪胎儿的红细胞生成速度更快然而, 与红细胞生成素和红细胞生成素受体直接相关的是血液中红细胞血红蛋白红细胞压积等血常规指标, 因为这些指标才是直接影响产仔数和抗病性等性状的相关因素, 犈犘犗犚基因通过突变影响血液指标等抗病性状从而间接影响产活仔数性状 [8] Valet 等研究发现, 犈犘犗犚基因第 4 内含子 C/T 突变位点 ( 即本研究所用突变位点 g.2373c>t) 在所检测群体内只发现 CC 及 CT2 种基因型, 且 CT 基因型个体的子宫容积和产仔数显著高于 CC 基因型个体 ( 犘 <0.05) 本实验室前期研究发现, 此突 [7] 变位点与产仔性状无显著关联 ; 但发现, 第 1 内含子突变位点 g.705g>t 与产仔性状显著关联 ( 犘 < 0.05) 二者都推测, 犈犘犗犚基因突变导致了胎儿红细胞生成差异, 可能影响了妊娠 24~40d 子宫内胎儿的存活, 从而导致产仔性状出现差异但二者都未直接开展该基因突变与血红细胞性状的关联研究本研究正是弥补了上述研究空白, 试验发现第一内含子突变位点 g.705g>t 并未与血常规性状 [8] 显著关联与 Valet 等的研究结果一致, 本研究同样发现在 g.2373c>t 处只有 CC 和 CT2 种基因型, 通过关联分析发现,CT 基因型个体红细胞压积显著高于 CC 基因型个体, 此结果与 Valet 等的研究结果一致 4 结论本研究结果提示, 犈犘犗犚基因第 4 内含子突变位点 g.2373c>t 与红细胞压积显著关联, 该基因可以作为红细胞压积性状的主效候选基因之一, 有必要在更大的群体中开展进一步研究, 为今后对猪开展免疫相关性状遗传育种提供了一个新的潜在候选基因参考文献 : [1] M LLER M,BREM G.Diseaseresistanceinfarm animals[j]. 犈狓狆犲狉犻犲狀狋犻犪,1991,47(9): [2] NAKANISHI N, SUZUKI K, TATARA K. Haematocritandriskofdevelopmentoftype2diabe tesmelitusinmiddle agedjapanesemen [J]. 犇犻犪犫犲狋犕犲犱,2004,21(5): [3] TAMARIZLJ,YOUNGJH,PANKOWJS,etal. Bloodviscosityandhematocritasriskfactorsfortype 2diabetes melitus:theatherosclerosisriskincom munities(aric)study[j]. 犃犿犑犈狆犻犱犲犿犻狅犾,2008, 168(10): [4] TULLOCH REID M K,HANSON R L,SAREMI A,etal.Hematocritandtheincidenceoftype2dia betesinthepimaindians[j]. 犇犻犪犫犲狋犲狊犆犪狉犲,2004, 27(9): [5] REINER G,FISCHERR,HEPPS,etal.Quantita tivetraitlociforredbloodceltraitsinswine [J]. 犃狀犻犿犌犲狀犲狋,2007,38(5): [6] MILLER S A,DYKES D D,POLESKY H F.A simplesaltingoutprocedureforextractingdnafrom humannucleatedcels[j]. 犖狌犮犾犲犻犮犃犮犻犱狊犚犲狊,1988, 16(3):1215. [7] ZHANGLC,WANGLG,LIY,etal.Erythropoi etinreceptorgene (EPOR)polymorphismsareasso ciated withsowlitersizes [J]. 犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾犛犮犻犲狀犮犲狊犻狀犆犺犻狀犪,2011,10(6):

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殐殐 27 1 Vol.27 No ImagingScienceandPhotochemistry Jan.,2009 檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭殐殐 *O! "# #B) 1,CDE 1, 2, 1 (1., ;2., ) $ %:3 J = 2J4

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