412 应用海洋学学报 36 卷 CTACATTCTCTTAGT 3 ; C1 R: 5 CAGGAAA CAGCTATGACGCNAGTCAGCTAAANACTTT 3 ;C2 F:5 CGGCCAGTCCTCGATCCTACATTCTCTTAGTT AACAGCTAA 3 ;C2 R:5 TGT

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1 第 36 卷第 3 期应用海洋学学报 Vol 36,No 年 8 月 JournalofApplied Oceanography Aug.,2017 COⅠ 基因序列在蛇鳗科鱼类种类鉴定中的适用性研究 张稚兰, 林汝榕, 邢炳鹏 ( 国家海洋局第三海洋研究所, 福建厦门 ) 摘要 : 为研究 DNA 条形码技术在蛇鳗科鱼类分类鉴定中的可行性, 选取了蛇鳗科 7 属 10 种 36 个个体进行 COⅠ 基因扩增, 结果共获取 36 条基因序列, 平均长度为 655bp, 序列中 T C G A 碱基的平均含量分别为 :27 50% 28 10% 26 00% 18 40%,A+T 含量均高于 50%. 样品种内 种间和属间的遗传距离 (K2P) 分别为 :0 52% 20 07% 23 96%, 遗传距离随着分类阶元的提高而增大, 种间遗传距离是种内遗传距离的 倍, 符合 Hebert 提出的相差 10 倍的物种鉴定标准, 表明 COⅠ 基因序列可以作为蛇鳗科鱼类分类鉴定的有效 DNA 条形码. 关键词 : 海洋生物学 ; 蛇鳗科 ; 细胞色素 C 氧化酶亚基 Ⅰ 基因 ;DNA 条形码 ; 物种鉴定 DOI: /J.ISSN 中图分类号 :P735 文献标识码 :A 文章编号 : (2017) 蛇鳗科 (Ophichthidae) 鱼类隶属于鳗鲡目 (An guiliformes), 是鳗鲡目中种类分化最多的一个科, 目前已发现 55 属 260 多种, 我国已定名有 13 属 33 种, 其中蛇鳗属 (Ophichthus) 有 14 种 [1]. 主要分布于各大海洋的热带和亚热带大陆架浅水水域, 多数生活于珊瑚礁和沙质沿岸, 有些种类栖息于河口, 少数可进入淡水生活 [2]. 蛇鳗科鱼类身体细长, 前段一般呈圆形, 尾部常稍侧偏, 外形及其相似, 又缺少鳞片 腹鳍和尾鳍等结构, 可用作鉴别的形态特征相对较少, 且在不同生长阶段的形态特征不尽相同, 增加了形态分类鉴定的难度. 蛇鳗科鱼类不同属间的物种性状间存在重复和交叉, 如蛇鳗属和蠕鳗属 (Scolecenchelys) 都有鳃膜骨条交叠现象等, 依据形态的分类方式十分困难, 易鉴别错误 [3]. 鱼类的形态学鉴定主要是通过外部形态特征进行区分, 但鱼类样品在采集过程中外部形态特征常受到损坏, 并且样品形态性状受环境因子影响较大, 从而导致分类困难甚至错误 [4].DNA 条形码技术对样品形态完整性要求低, 操作简便 结果准确, 已被广泛应用于鱼类的物种鉴定中, 尤其是在保护生物 学和生物多样性调查等领域 [4 6]. 线粒体 DNA 的分子结构简单, 呈母性遗传, 进化速度快且几乎不发生重组, 是一种应用较广的分子标记, 其中线粒体细胞色素 C 氧化酶亚基 Ⅰ 基因 (COⅠ) 是动物物种鉴定常用的目的基因 [7 10]. 因此本研究对蛇鳗科 7 属 10 种鱼类样品的线粒体 COⅠ 基因片段进行了 PCR 扩增及序列测定, 分析该基因在蛇鳗科鱼类样品鉴定中的适用性, 为蛇鳗科鱼类物种鉴定及多样性研究提供分子生物学数据. 1 材料与方法 1.1 实验材料文中所用样品均采集于福建沿海, 采样时间为 2014~2015 年 ( 表 1). 经形态鉴定后置超低温冰箱保存, 每种各选 3~4 条, 使用天根动物基因组 DNA 提取试剂盒提取总 DNA. 1.2 PCR 扩增及测序根据 COⅠ 基因序列设计的 2 对引物组合进行巢式 PCR, 引物 C1 F 和 C1 R C2 F 和 C2 R 的序列如下 :C1 F:5 TGTAAAACGACGGCCAGTCCTCGATC 收稿日期 : 基金项目 : 国家海洋局第三海洋研究所基本科研经费资助项目 ( 海三科 ); 海洋公益性行业科研专项经费资助项目 ( , ); 厦门市海洋与渔业局资助项目 (12PZP001SF10 5) 作者简介 : 张稚兰 (1985~), 女, 硕士研究生, 助理研究员 ;E mail:zhangzhilan@tio.org.cn 通讯作者 : 邢炳鹏 (1983~), 男, 硕士研究生, 助理研究员 ;E mail:bluprin@tio.org.cn

2 412 应用海洋学学报 36 卷 CTACATTCTCTTAGT 3 ; C1 R: 5 CAGGAAA CAGCTATGACGCNAGTCAGCTAAANACTTT 3 ;C2 F:5 CGGCCAGTCCTCGATCCTACATTCTCTTAGTT AACAGCTAA 3 ;C2 R:5 TGTAAAACGACGGC CAGTTCAACCAACCACAAAGACATTGGCACCC 3. 表 1 实验样品相关信息 Tab.1 Informationofsamplesinthisstudy 序号属名种名 GenBank 序列号 1 蠕蛇鳗属 (Scolecenchelys) 2 虫鳗属 (Muraenichthys) 3 蛇鳗属 (Ophichthus) 大鳍蠕蛇鳗 (Scolecenchelysmacroptera) 裸鳍虫鳗 (Muraenichthysgymnopterus) 短尾蛇鳗 (Ophichthusbrevicaudatus) KX KX KY KY KX KX KX KY KX X KY KY 蛇鳗属 尖吻蛇鳗 (Ophichthusapicalis) 5 蛇鳗属 西里伯蛇鳗 (Ophichthuscelebicus) KX KX KY KY KX KX KY 豆齿鳗属 (Pisodonophis) 7 豆齿鳗属 (Pisoodonophis) 8 新鳗属 (Nenchelys) 9 须鳗属 (Cirhimuraena) 10 无鳍蛇鳗属 (Apterichtus) 食蟹豆齿鳗 (Pisodonophiscancrivorus) 杂食豆齿鳗 (Pisoodonophisboro) 微鳍新鳗 (Nenchelysparvipectoralis) 中华须鳗 (Cirhimuraenachinensis) 克氏无鳍蛇鳗 (Apterichtusklazingai) KX KX KY KX KX KX KX KX KX KX KY KX KX KX KY KX KX JQ JQ JQ JQ 蛇鳗属 黄蛇鳗 (Ophichthuszophochir) 12 虫鳗属 裸虫鳗 (Scolecenchelysgymnota) GU EU JQ JQ 油鳗属 (Myrophis) 14 阿尔鳗属 (Ahlia) 扁吻油鳗 (Myrophisplatyrhynchus) 大眼阿尔鳗 (Ahliaegmontis) GU GU GU GU 注 : 表示序列从 Genbank 数据库获取 PCR 反应分两轮进行, 使用 TIANGEN 公司 2 TaqPlusPCRMasterMix 试剂盒, 体系均为 25mm 3. 第一轮 PCR 反应循环为 :95 预变性 2min,95 变性 15s,60 退火 30s, 每个循环退火温度降低 0 5 ;72 延伸 50s,30 个循环 ;72 延伸 10min, 4 保存. 每次反应均设置阴性对照以检测是否存在污染. 第 2 轮 PCR 反应循环为 :98 预变性 2min; 95 变性 15s,60 C 退火 30s, 每个循环退火温度降 低 0 3 ;68 延伸 40s,35 个循环 ;72 延伸 10 min,4 保存.PCR 产物经 1 2% 琼脂糖凝胶电泳检测并进行双向测序, 保证序列的可靠性. 1.3 生物信息学分析运用 DNAman 及 Chromas 软件拼接每个样品正反向测序结果并进行校对后提交至 GenBank( 表 1) 并计算序列长度 碱基组成及 GC 含量. 利用 Clust alw 及 MEGA6 0 软件检测多态位点和简约信息位

3 3 期张稚兰, 等 :COⅠ 基因序列在蛇鳗科鱼类种类鉴定中的适用性研究 413 点数量, 使用 Kimura 2 parameter(k2p) 双参数模型计算种内距离及种间距离 ( 表 2). 结合 Genbank 检索到的 12 条蛇鳗科序列, 以邻接法 (Neighbor Join ing) 构建系统发育树 [11]. 2 结果与讨论 2.1 序列结构特征分析本研究共测序获得蛇鳗科 7 属 10 种 36 个个体的 COⅠ 基因片段. 经比对后得到 COⅠ 基因 5 端一段长度为 655bp 的序列, 共编码 218 个氨基酸, 所有序列没有插入 缺失密码子并不含终止密码子.36 条 COⅠ 序列共有 20 个单倍型.20 个 COⅠ 单倍型之间共检测到保守位点 441 个 ( 约占 67 33%), 变异位点 215 个 ( 约占 32 82%), 包括 214 个简约信息位点和 1 个自裔位点. COⅠ 序列碱基组成分析显示平均碱基含量为 T(27 50%) C(28 10%) A(26 00%) 和 G (18 40%), 其中 C 含量最高,G 含量最低,A+T 含量为 53 5%, 高于 G+C 含量 46 5%. 密码子 3 个位点在碱基使用偏向性中, 只有 C 使用频率相近, 其余 3 个碱基使用频率有显著不同 : 第 1 密码子中 4 种碱基使用频率相近, 分别为 T(25 00%) C (25 10%) A(29 00%) 和 G(20 50%); 第 2 密码子中 4 种碱基分别为 T(27 00%) C(27 30%) A (23 60%) 和 G(21 60%); 第 3 密码子中 C 含量最高, 高达 32 00%,A(25 30%) 和 T(30 00%);G 的含量最低, 仅为 13 20%, 出现了明显的反 G 偏倚现象. 本研究采用 Kimura 2 parameter(k2p) 双参数模型, 使用 MEGA6 0 软件, 结合 Genebank 数据库中 12 条 COⅠ 序列, 计算分析样品种内 种间及属间的遗传距离. 结果显示实验样品种内的 K2P 遗传距离为 0~1 41%, 平均为 0 52%, 其中最小距离为 0, 最大为大眼阿尔鳗 1 41%, 其次为微鳍新鳗 1 02%, 其余均小于 1 00%. 种间遗传距离为 3 97% ~ 29 33%, 平均为 20 07%, 是种内遗传距离的 倍. 种间遗传距离最小的两个种为大鳍蠕蛇鳗和短尾蛇鳗, 其中大鳍蠕蛇鳗的种内遗传距离为 0, 大鳍蛇鳗的种内遗传距离为 0 20%. 属间的遗传距离为 14 83% ~37 41%, 平均为 23 96%. 属间的遗传距离大于种内和种间的遗传距离, 分类阶元越高遗传距离越大, 而且遗传距离的增长随分类阶元的增加变缓. 表 2 各阶元 K2P 遗传距离 Tab.2 K2Pgeneticdivergencesamongdiferenttaxonomiclevels 阶元 样品数 平均值 /% 最小值 /% 最大值 /% 标准误差 /% 种内 种间 属间 系统进化分析利用距离法构建 NJ 树 ( 图 1),14 个物种共分成 14 组, 同一物种的序列均聚合在一起, 与形态学分析一致. 在属及属以上阶元中,NJ 系统进化树与形态学系统进化树并不一致, 同属的样品未能完全聚合在一起, 存在一定的交叉. 2 3 讨论 DNA 条形码是利用一段标准的短序列进行物种鉴定, 具有操作简且不受样品的形态完整性及生长发育影响, 能准确鉴别形态相似种 发掘隐存种等优点, 已广泛用于鱼类物种鉴定中 [12 14].Ward 等 (2005) 对澳大利亚海洋鱼类的 COⅠ 基因进行了研究 [15], 共获取了 207 种鱼类的 754 条 COⅠ 基因序列, 分析了它们的 GC 含量以及种内 种间及属科遗传距离的差异, 得出 COⅠ 基因序列可以用于鱼类物 种鉴定.Zhang 等 (2011) 利用 COⅠ 基因对日本海洋鱼类进行了鉴定研究 [16], 发现 158 个鱼类样品的种间遗传距离是种内遗传距离的 60 倍, 并证明了 DNA 条形码在鱼类不同生长阶段中鉴定的可行性. Baros Garcia 等 (2016) 利用 DNA 条形码技术对深海鱼类海蜥鱼科和棘背鱼科的样品进行了鉴定, 96% 的样品鉴定到种 [17]. 本研究通过扩增测序共获得蛇鳗科 7 属 10 种 36 个个体的 COⅠ 基因片段. 经比对后得到 COⅠ 基因 5 端一段长度为 655bp 的序列, 碱基组成分析显示平均碱基含量为 T(27 5%) C(28 1%) A (26 0%) 和 G(18 4%).36 条 COⅠ 序列的 A+T 含量相似, 最高为尖吻蛇鳗 (55 3%), 最低为大鳍蠕蛇鳗 (52 2%), 平均含量为 53 5%, 均高于 G+C 含量, 与以往鱼类 COⅠ 基因序列的研究结果一

4 414 应用海洋学学报 3 6卷 图 1 基于 COⅠ序列的蛇鳗科鱼类邻接关系树 F g 1 N g b o r j o n n gt r o fop c t d a b a s dcoⅠ s q u n c s 致 12 密码子 3个位点对碱基使用偏向性有显著差 25 0 0 C 2 5 10 A 29 00 和 G 异 第 1密码子中 4种碱基使用频率相近 分别为 T 2 0 5 0 第 2密 码 子 中 4种 碱 基 分 别 为 T

5 3 期张稚兰, 等 :COⅠ 基因序列在蛇鳗科鱼类种类鉴定中的适用性研究 415 (27 00%) C (27 30%) A (23 60%) 和 G (21 60%); 第 3 密码子中 C 含量最高, 高达 32 00%,A(25 30%) 和 T(30 00%);G 的含量最低, 仅为 13 20%, 出现了明显的反 G 偏倚现象, 在鳎科鱼类中也发现类似现象 [18]. 在物种进化中, 线粒体基因密码子位点会受到不同程度的碱基突变选择压, 碱基使用偏向性可能是由密码子位点上碱基突变压力造成的. DNA 序列能否成为物种鉴定条形码的主要标准为种内和种间遗传距离的大小.Hebert 等 (2003) 对动物 COⅠ 基因研究后得出物种种内的遗传距离通常低于 2%, 并提出只有种间遗传距离大于种内遗传距离, 且差异高于 10 倍时,COⅠ 基因才可对物种进行有效鉴定 [19]. 本研究所有蛇鳗科鱼类样品中,COⅠ 序列种内的遗传距离为 0~1 41%, 平均为 0 52%, 其中最小距离为 0, 最大为大眼阿尔鳗 1 41%, 其次为微鳍新鳗 1 02%, 其余均小于 1%. 种间遗传距离为 3 97% ~29 33%, 平均为 20 07%, 是种内遗传距离的 倍, 符合 Hebert 提出的标准, 表明 COI 基因序列可以作为蛇鳗科鱼类物种鉴定的 DNA 条形码. 本研究利用距离法构建 NJ 系统进化树, 在种的水平上,36 样品序列首先与同种的序列聚合,14 个 物种共分成 14 组, 与形态学分析一致, 具有一定的低阶元系统进化分析能力, 同时也验证了 COⅠ 序列在蛇鳗科鱼类鉴定中的可行性. 同属的样品并未在 NJ 系统进化树聚合到一枝, 不同科属间样品存在一定交叉, 这与形态学系统进化树不符, 可靠性明显降低. 究其原因, 虽然 COⅠ 基因序列在属及属以上水平变异增大, 但是所获取基因仅为 COⅠ 基因 5 端一段长度为 655bp 的序列, 信息位点数量少, 且在高级分类阶元中碱基置换趋于饱和, 因而系统学水平上的分辨效果较差, 不适合作为蛇鳗科属科阶元系统进化研究的分子标记. 3 结论本研究共获得蛇鳗科 7 属 10 种 36 个个体的 COⅠ 基因片段,COⅠ 序列种间的 K2P 遗传距离平均为 20 07%, 种内的 K2P 遗传距离平均为 0 52%, 种间遗传距离是种内遗传距离的 倍, 符合 Hebert 等 (2003) 提出的相差 10 倍的物种鉴定标准 [19], 表明 COⅠ 基因序列可以作为蛇鳗科鱼类物种鉴定的条形码. 另外,COⅠ 基因序列在属及属以上阶元分辨效果较差, 不适合用于高级分类阶元分类鉴定及系统进化的研究. 参考文献 : [1] 唐文乔, 张春光. 蛇鳗科分类综述及中国蛇鳗科系统分类 ( 鱼纲, 鳗鲡目 )[J]. 上海水产大学学报,2004,13(1): [2] 中国科学院动物研究所, 中国科学院海洋研究所, 上海水产学院. 南海鱼类志 [M]. 北京 : 科学出版社,1962. [3] 刘东, 唐文乔, 张春光. 中国南海蛇鳗科一新纪录属及一新纪录种 ( 鱼纲, 鳗鲡目 )[J]. 动物分类学报,2005,30(1): [4] 产久林, 姜华鹏, 刘一萌, 等.COⅠ 和 16SrRNA 基因在高原裂腹鱼物种鉴定中的应用 [J]. 水生态学杂志,2015,36(4): [5] 张馨月, 刘岩, 张秀梅, 等. 基于 COⅠ 基因的西南大西洋部分经济鱼类 DNA 条形码鉴定 [J]. 水生生物学报,2014,38 (6): [6] 彭居俐, 王绪祯, 王丁, 等. 基于线粒体 COⅠ 基因序列的 DNA 条形码在鲤科 属鱼类物种鉴定中的应用 [J]. 水生生物学报,2009,33(2): [7] BaekSY,JangKH,ChoiEH,etal.DNAbarcodingofmetazoanzooplanktoncopepodsfromSouthKorea[J].PLoSONE, 2016,11(7):e [8] GajapathyK,TharmasegaramT,EswaramohanT,etal.DNAbarcodingofSriLankanphlebotominesandfliesusingcytochrome coxidasesubunitirevealsthepresenceofcrypticspecies[j].actatropica,2016,161:1 7. [9] 辛翠娜, 王莹, 彭建军, 等.DNA 条形码在龟鳖类物种鉴定中的应用 [J]. 林业实用技术,2010(4): [10] 王中铎, 郭昱嵩, 陈荣玲, 等. 南海常见硬骨鱼类 COⅠ 条码序列 [J]. 海洋与湖沼,2009,40(5): [11] KimuraM.Asimplemethodforestimatingevolutionaryratesofbasesubstitutionsthroughcomparativestudiesofnucleotide se quences[j].journalofmolecularevolution,1980,16(2): [12] 毕潇潇, 高天翔, 肖永双, 等.4 种鳕鱼线粒体 16SrRNA COⅠ 和 Cytb 基因片段序列的比较研究 [J]. 南方水产,2009, 5(3): [13] 彭居俐. 东亚特有鲤科类群的 DNA 条形码研究及其系统发育分析 [D]. 武汉 : 中国科学院研究生院 ( 水生生物研究所 ),2007.

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