王丽娴等携带三种报告基因慢病毒载体的构建及其实验研究!& 本研究采用基于人类免疫缺陷病毒的慢病毒载体通过分子生物学手段构建一种携带红色荧光蛋白荧光素酶基因 ( ) 及绿色荧光蛋白 +, 种报告基因的慢病毒载体在 # : 中包装获得病毒后感染 -!&. ' ) 恶性脑胶质瘤母细胞经过 *

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进邹
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1 中国生物工程杂志!"# 携带三种报告基因慢病毒载体的构建及其实验研究王丽娴王东阳李星夏海滨陕西师范大学生命科学学院基因治疗研究室西安 &" 摘要慢病毒是逆转录病毒科的一个属它具有可以感染分裂期及非分裂期细胞容纳外源性目的基因片段大目的基因表达时间较长免疫反应小等诸多优点因此成为运载目的基因的理想载体而得到广泛的应用构建了带有种报告基因即红色荧光蛋白荧光素酶基因 ( ) 及绿色荧光蛋白 *+, 的慢病毒载体其中及 *+, 由于其成像的直观性特点便于用于体外细胞株的筛选而 ( ) 由于其敏感性高则可以用于灵敏检测动物体内肿瘤模型的生长及转移情况选择了一种恶性程度较高的脑胶质瘤母细胞 -!&.* ' ) 作为研究对象体外成功构建了表达种报告基因的细胞株并建立了裸鼠体内肿瘤模型为该肿瘤疾病动物体内的实验治疗效果评估及肿瘤转移的检测奠定了基础同时也为携带报告基因的其它肿瘤细胞系及其肿瘤模型的建立提供了方便的载体工具关键词慢病毒载体报告基因脑胶质瘤动物模型中图分类号 /&!# 慢病毒为逆转录病毒科的一个属它包括灵长类慢病毒如人类免疫缺陷病毒型 01 $ 和型 01 $ 猴免疫缺陷病毒 1 和非灵长类慢病毒如 ) 病毒牛免疫缺陷病毒 1 猫免疫缺陷病毒 +1 和马传染性贫血病毒 1 等慢病毒除了具有一般逆转录病毒和个基本基因结构外还包含 % 个辅助基因 ( ( 和个调节基因和目前用于实验研究的慢病毒载体主要是在人类免疫缺陷病毒 01 及猫免疫缺陷病毒 +1 的基础上经过改建所得到一种重组慢病毒载体慢病毒能够有效地感染分裂期和非分裂期的细胞而且其宿主范围也非常广泛它可以有效地感染神经元细胞肝细胞心肌细胞肿瘤细胞内皮细胞干细胞等多种类型的细胞 $ 使用慢病毒载体可以将目的基因高效整合到宿主细胞基因组当中从而使目标分子持续表达目前国外已有多项研究利用慢病毒毒性低感染范围广效率高的特点构建了多种肿瘤细胞株用于建立肿瘤模型 %$2 收稿日期 $!$# 修回日期 $$% 国家自然科学基金资助项目!& ## & & 通讯作者电子信箱 ' " 恶性脑胶质瘤 ' ) 是严重危害人类健康的肿瘤疾病之一它来源于星形细胞或少突胶质细胞约占颅内肿瘤的 %%3"#4 占全身恶性肿瘤的具有血管生长丰富侵润性强等特点目前除早期手术摘除术后放疗和化疗外尚无有效的治疗手段 " 近些年来人们对脑胶质瘤肿瘤机制的研究一直没有中断过建立一种无创可实时观察的动物模型对于该疾病的实验治疗研究具有重要的意义目前已经发展了多种可对活体肿瘤进行无创观测的体外成像方法包括 6 射线成像超声波扫描术核磁共振成像.71 等但是这些方法应用成本高不能进行多次重复成像而且对实验活体具有潜在的伤害不能实时示踪活体内肿瘤的发展过程 & 为了克服这些方法的缺点逐渐发展起来一种新的技术即活体光学成像技术活体光学成像的主要原理是利用荧光报告基团或荧光素酶基因标记细胞或 89 在高灵敏度的光学检测仪器下可以直接检测活体生物体内的细胞活动基因行为等与其他成像技术相比它具有操作简单测量快速灵敏度高结果直观及费用低廉等优势! 目前该技术已经广泛应用于医学研究生命科学药物开发等领域 #$

2 王丽娴等携带三种报告基因慢病毒载体的构建及其实验研究!& 本研究采用基于人类免疫缺陷病毒的慢病毒载体通过分子生物学手段构建一种携带红色荧光蛋白荧光素酶基因 ( ) 及绿色荧光蛋白 *+, 种报告基因的慢病毒载体在 # : 中包装获得病毒后感染 -!&.* ' ) 恶性脑胶质瘤母细胞经过 *%! 筛选及克隆化成功获得表达种报告基因的 -!&.* 细胞株并在此基础上建立了裸鼠肿瘤模型此研究结果为该肿瘤疾病动物体内的治疗效果评估及肿瘤转移的检测奠定了基础同时该结果也为其它肿瘤细胞携带报告基因及其肿瘤模型的建立提供了方便的载体工具材料与方法材料 33 细胞恶性脑胶质瘤母细胞系 -!&.* 和人胚肾细胞系 # : 由本实验室冻存均在体外使用含 4 新生牛血清 ; 青霉素及 % -; 链霉素的 8.. 培养基中培养培养环境均为 & 24 孵箱 33 实验动物,+ 级 ; $ ; 裸鼠 5% 周体重! 5 雌性由军事医学科学院实验动物中心提供 33 载体 2 ; $. $9 和 2 ; $. $ 69 由本实验室构建并保存这两种载体都属于腺病毒区穿梭载体主要区别是多克隆位点的不同慢病毒载体 $ +$ *+, 购自美国 ) ) ) 1 公司包膜质粒. $ * 及辅助质粒,, 6 购自公司 33% 实验试剂及仪器 $ 谷氨酰胺 *1 公司双抗 *1 公司 8.. *1 公司新生牛血清杭州四季青公司 *%!.7 公司荧光素酶底物 8$ (, 公司活体成像仪 6 公司倒置荧光显微镜.,- 16& 公司倒置显微镜 9< : 公司方法 3 3 慢病毒载体的构建带有种报告基因和抗性筛选基因的慢病毒载体 801 $. 9 80$. $ $: $ $: $ *+,; +$ 通过以下几个步骤进行克隆后得到图克隆过程中所用到的模板质粒均为本实验室之前构建并保存带有抗性基因慢病毒载体的构建,7 扩增获得带有酶切位点 1 和 1 的片段将其连入经 1 和 1 双酶切的慢病毒载体 $ +$ *+, 中获得带有抗性基因的慢病毒载体 801 $9 80. $ +$ 携带报告基因载体的构建,7 扩增获得带有酶切位点 1 和 1 的报告基因与经 1 和 1 双酶切的载体 2 ; $. $9 连接获得载体 2 ; $.$9 即 2 ; $ $9 此时原载体上的 1 位点消失携带报告基因 ( ) 和载体的构建,7 扩增获得 = 端带有一段自剪切多肽 : 的报告基因其两端带有酶切位点 1 和 1 与经 1 和 1 酶切的相连得到载体 2 ; $.$9 % 携带种报告基因载体的构建,7 扩增获得 2= 端带有 : 的报告基因 *+, 片段其两端带有酶切位点 1 和 1 与经 1 和 1 酶切的连接后得到带有种报告基因的载体 2 ; $. $9 2 带有新酶切位点 1 载体的构建将 % 经 1 和 1 酶切后得到的个报告基因片段连入经相同酶切后的另一载体 2 ; $. $69 此载体带有 1 酶切位点得到载体 2 ; $. $69 " 将 2 得到的携带种报告基因的载体 2 ; $. $69 经过 1 和 1 酶切后所获得含有种报告基因的酶切片段与经相同限制性内切酶处理的携带有抗性基因的慢病毒载体 801 $9 相连接最终得到带有种报告基因和抗性筛选基因的慢病毒载体 801 $. 9 80$. $ $: $ $: $ *+,; +$ 3 3 慢病毒载体的包装使用磷酸钙共沉淀的方法将重组质粒 801 $. 9 包膜质粒. $ * 及辅助质粒,, 6 共转染培养至 "4 5&4 融合的 # : 细胞转染前将培养皿中的培养液换成含有 4 小牛血清的 8.. 转染 % 后换成正常培养基收集 % %! & 转染细胞上清液用 3%2 滤器过滤除去细胞碎片后于 >! 保存 3 3 带有报告基因的 -!&.* 稳定细胞株的构建及检测取上述获得的病毒液室温融化后感染培养至 %4 融合的 -!&.* 感染第加 *%! 至终浓度 ; 进行筛选培养从感染第开始可在荧光显微镜下观察到部分细胞表达及 *+, 连续加药筛选代后显微镜下观察细胞荧光蛋白表达稳定且

3 !! 中国生物工程杂志 3 93 加药不死采用有限稀释法将细胞数分别调整到个 ; 孔 2 个 ; 孔个 ; 孔分于 #" 孔板中进行克隆化重复此克隆化一次共获得 # 株稳定表达及 *+, 的克隆细胞株 3 3% 荧光素酶活性测定取 -!&.* 细胞及带标记的 -!&.* 克隆细胞株将细胞数调整到 2 个用等量裂解液裂解细胞后均取上清加入 2 荧光素底物 8$ ( ; 测其荧光值每组重复测定次比较各克隆细胞株的荧光强度 3 32.:: 法绘制克隆化细胞株的生长曲线将克隆细胞株和正常 -!&.* 细胞接种到 #" 孔板接种密度为个 ; 孔接种后 5" 每天从各克隆细胞株中选取 " 个重复孔每孔加 2.::2 ; & 孵育 % 后吸去上清加 2 8. 后混匀孔中 8. 使结晶充分溶解利用酶标仪测其 2& 处吸光值根据时间 $ 吸光值绘制各克隆细胞株的生长曲线 3 3" 裸鼠皮下移植瘤模型的建立选取生长状态较好且荧光值较高的克隆 % 细胞株及无标记的 -!&.* 细胞制备单细胞悬液使用无血清的 8.. 重悬细胞调整细胞数到 3 & 个 ; 接种到裸鼠背部两侧近后肢的皮下每株细胞接种 % 个荷瘤点接种后第 & 开始用游标卡尺测量肿瘤大小每测量一次共测量根据?@ 宽长计算肿瘤体积比较各实验组裸鼠肿瘤大小绘制肿瘤 $ 时间生长曲线同时采用精诺真活体成像系统 1 1 观测皮下肿瘤细胞的生长情况观测前每只裸鼠腹腔注射 2 荧光素酶的底物 8$ ( 2 ; 注射后 5 2 使用活体成像系统检测 ( ) 的表达情况每周次连续检测周 3 3& 肿瘤组织冰冻切片观察荧光表达及石蜡切片 0 染色各组实验裸鼠在接种肿瘤细胞 % 周后断颈处死取部分皮下肿瘤组织进行冰冻切片荧光显微镜下观察组织中 *+, 及的表达另取部分肿瘤组织进行石蜡切片并对其进行 0 染色显微镜下观察比较各肿瘤组织形态结果获得带有报告基因的慢病毒载体本研究以实验室已有的质粒为模板通过,7 的方法扩增获得带有酶切位点的及个报告基因的片段其中 ( ) 和 *+, 上还分别带有一段自剪切多肽 : 首先利用酶切连接的方法将连入慢病毒载体 801 获得由 + 启动抗性基因表达的慢病毒载体 801 $9 采用酶切连接的方法将种报告基因依次连入已构建好的载体 2 ; $. $9 得到携带种报告基因的载体 2 ; $. $9 由于连入报告基因时使 2 ; $. $9 上的 1 位点消失因此得到的载体 2 ; $. $9 上缺乏和慢病毒载体相同的酶切位点所以将其经 1 和 1 酶切后得到的个报告基因片段连入一个带有新 1 酶切位点的载体 2 ; $. $69 中得到带有新酶切位点 1 和个报告基因的载体 2 ; $. $69 最后经 1 和 1 双酶切将个报告基因一起连入慢病毒载体 801 $ 9 得到携带种报告基因及抗性基因的慢病毒载体 801 $. 9 80$. $ $: $ $ : $ *+,; +$ 构建流程如图所示稳定表达!" 的 #$%& 细胞株的建立及鉴定经过 *%! 抗药性筛选及克隆化后共获得的 # 株克隆均稳定持续表达 *+, 和图仅给出 -!&.* 克隆 % 稳定表达 *+, 和而且经过几个月的连续培养荧光强度未发生较大的改变定量检测各个克隆细胞株和未标记的 -!&.* 细胞的荧光素酶活性发现经过筛选后的细胞株除了克隆以外其他克隆均有较强的荧光素酶活性其中克隆克隆克隆 % 克隆 2 荧光素酶活性最高大约是克隆 " 克隆 & 克隆! 克隆 # 的 5" 倍图确定克隆 5 克隆 # 为阳性克隆 ' 表达!" 的 #$%& 细胞株的生长特性通过.:: 法绘制 -!&.* 克隆细胞株与亲本 -!&.* 细胞的生长曲线总体来说筛选得到的 -!&.* 克隆细胞株与正常 -!&.* 细胞在较长的生长周期中生长趋势基本一致表明通过慢病毒感染的方法构建细胞株对细胞株的生长特性没有产生较大的影响图 % 仅给出克隆 % 与未标记 -!&.* 细胞的生长曲线我们选取了荧光素酶表达活性较高且生长状态较好的克隆 % 细胞株用于进一步的体内实验研究

4 王丽娴等携带三种报告基因慢病毒载体的构建及其实验研究!# 图慢病毒载体 (&)* 构建流程 +, -."/ /-.-./0 "0/- (&)* 图稳定表达或的 #$%& 克隆 1 细胞株 +,#$%& -.1."/! ".+ - *+,'

&.* 皮下成瘤潜伏期约为 & 注射第 % 达到对数生长期两种皮下瘤的生长趋势基本一致腹腔注射荧光素酶底物使用活体成像系统监测皮下瘤的生长情况如图 " 所示 -!&.* 细胞形成的皮下瘤体积随时间的增加而增大但没有显示荧光素酶活性而克隆 % 在接种后 & 均有很强的荧光素酶活性随着肿瘤体积的增加荧光信号也逐渐增强由此说明成功构建了带报告基因的裸鼠 3 肿瘤组织冰冻切片及病理学观察对亲本 -!

5 # 中国生物工程杂志 3 93 皮下肿瘤模型图 3 裸鼠皮下移植瘤生长曲线 +,3 + -2/ 0- / -.. 图 ' 携带有荧光蛋白标记基因的 #$%& 细胞株荧光素酶活性的测定 +,' //-.-!"!/0/. #$%&.!.+ - "./ -/. 6 ) )( ( ) ) ) )( ( ( ) ) 7 - 图 4 活体成像系统检测皮下亲本 #$%& 及 #$%& 克隆 1 细胞系移植瘤体内生长情况 +,4!+.+ - " /!.- "/ / -!./! #$%& - #$%& 图 1#$%& 克隆细胞株的生长曲线 +,1 + -2/ 0- #$%& -. 1 裸鼠皮下移植瘤的建立本实验选取了未标记亲本 -!&.* 以及 ( ) 相对表达较高的克隆 % 细胞株建立裸鼠皮下移植瘤后处死老鼠株细胞均在接种位置成瘤未发现明显的远处转移游标卡尺测量肿瘤的体积后绘制生长曲线如图 2 所示克隆 % 和 -!&.* 皮下成瘤潜伏期约为 & 注射第 % 达到对数生长期两种皮下瘤的生长趋势基本一致腹腔注射荧光素酶底物使用活体成像系统监测皮下瘤的生长情况如图 " 所示 -!&.* 细胞形成的皮下瘤体积随时间的增加而增大但没有显示荧光素酶活性而克隆 % 在接种后 & 均有很强的荧光素酶活性随着肿瘤体积的增加荧光信号也逐渐增强由此说明成功构建了带报告基因的裸鼠 3 肿瘤组织冰冻切片及病理学观察对亲本 -!&.* 细胞携带报告基因的 -!&.* 克隆 % 肿瘤组织进行冰冻切片在荧光显微镜下观察到克隆 % 细胞株形成的肿瘤组织中 *+, 表达而在对照细胞株 -!&.* 肿瘤组织中未发现明显表达结果未给出 0 染色显示克隆细胞株与亲本 -!&.* 细胞形成的肿瘤组织形态没有明显差异光镜下可见皮下瘤呈巢状排列多分裂相核大且染色较深核质比大细胞形状不规则分化程度小图 & ' 讨论目前 01 $ 载体系统研究得最为广泛和深入 01 $ 的基因组为双链正链 79 分子除包括与简单逆转录病毒相同的和个编码病毒颗粒的基本结构基因外还有个调节基因及 % 个辅助基因

6 王丽娴等携带三种报告基因慢病毒载体的构建及其实验研究 # 图 %#$%& 亲本细胞及 #$%& 克隆 1 细胞肿瘤组织 ) 染色形态学观察 1 +,% )"/! ! /./ - - -!./! #$% &.!. #$%& -.1.1, -!&.*' -!&.* % 在病毒复制的过程中其本身具有核定位信号有利于整合前复合物进入靶细胞核而不完全依赖靶细胞的分裂状态此为慢病毒可感染非分裂细胞的主要机制目前慢病毒多采用三质粒表达系统包括转移质粒包膜蛋白质粒及包装质粒包装质粒表达病毒复制所需的全部反式激活蛋白但不产生病毒包膜蛋白及辅助蛋白将载体系统分成个质粒可以使序列重叠的机会大大减少减少载体重组过程中产生有复制能力野生型病毒的可能性通过三质粒共转染 # 细胞超速离心后病毒滴度可达 # - ; 本研究所构建的基于个报告基因的慢病毒载体可以很直观方便地观察实验结果慢病毒本身不仅感染宿主范围广而且可将自身基因整合到细胞基因组内因此可作为构建长期稳定表达目的基因细胞系的理想载体工具近来活体光学成像技术作为将分子和细胞生物学从体外实验应用到体内试验的有力技术手段在监测动物体内基因表达细胞活动病原体感染等方面得到了很大程度的应用该技术主要采用生物发光和化学发光两种发光技术生物发光主要是应用荧光基因 *+, 7+, 8 ) 对 89 或基因组进行标记化学发光主要应用荧光素酶基因进行标记通过灵敏的光学仪器直观地检测目标细胞或基因的行为生物发光需要激发光但体内很多组织可能会受到激发产生非特异性荧光所以灵敏度相对较低化学发光不需要激发光而是利用酶和底物的相互作用产生荧光其他组织本身不会发光所以背景噪音低灵敏度高即使在较深组织中也能检测到微小病灶本研究采用了两种荧光蛋白标记和荧光素酶标记相结合的方法一方面通过 *+, 可以在体外直接观测慢病毒感染效果通过克隆化挑选带有荧光蛋白的阳性克隆细胞株提高了细胞株的筛选效率另一方面考虑到只有荧光蛋白标记不够灵敏的缺陷使用荧光素酶 ( ) 标记可以在活体内进行实时无创伤观察使肿瘤模型更为理想 % ##% 年 ( 等首次在大肠杆菌和线虫中表达 *+, 开启了使用荧光标记直观检测基因表达的先河此后越来越多的研究者将更多的标记基因应用 2 到细胞标记活体模型建立方面的研究如李小颖等建立了用 *+, 标记的人结肠腺癌的裸鼠肿瘤模型而对脑胶质瘤细胞标记并建立肿瘤模型的研究相对较少本研究利用慢病毒载体构建了稳定表达 ( ) 及 *+, 等个报告基因的 -!&.* 脑胶质瘤细胞株并成功建立了裸鼠体内肿瘤模型为今后对脑胶质瘤的研究提供了一个稳定灵敏的动物模型参考文献 + A<. 6 *. $ ( ) ) " #$2 7 * ( $ )( 8 ) 2!!$ % B. ) C + ( C 0 ( ) $ ) ) ) ( 7)7 ) <+ ) ) C % &! % $% % A C0 )$') 8)7 $ $ )( )( ( ) ) ) C ( 7 ) #2&" $& 2 B( :, 0 * + 0 ) ). : 2"$2 " 张纪深入开展胶质瘤综合治疗及其基础研究中华神经外科杂志 #$ A C C9 ) #$ & ) D ) 9 ( * '@ C7 ) )( C (! & $!! # 7, D. * ' ' ) ) ) ( ( ) ()( 7 ) " " "$"2

7 # 中国生物工程杂志 3 93 B ' ) ) ) &!!&$! E *. 0 : ) ) ' ) ') ( :7 %#&$22 6 :C * ()' $ ) ($ ). : #&$%,7 19 ) 8B ) ) ) 9. ##! % %2$ %& % (. : )< * * ( ) ) < ( ) ##% "! $!2 2 李小颖高凯刘学丽等人结肠腺癌细胞 0: 绿色荧光标记肿瘤模型的建立中国比较医学杂志 ##& #$ % 6 *B 6 ) C (. # #&#$ % -."/ /-.-! (./0 " /- ) " /."!. /")./! 6/ D 9* $ D 9*8 $ $' ' (* : ( ( ) 9 - ) 6 &" 7 "/!/ ) ) ) ) ) ) ( ( : ( )@ ) ) ( ( ) )( ( ) *+,@) ). *+, ' ) ( ) ' ) ( ) ' ) )))( ) ) ) ) : )( ' ) -!&.* ) )( ' )( ) 1 ( ( ( ' ) ) ( ) )@ ) 8 2- " 7 * ' )

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽