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庙肪纪
7 years ago
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1 发酵工程 Fermentation Engineering 第三章发酵培养基主讲人 : 郭金玲

2 第三章发酵培养基教学目的 : 了解发酵培养基的要求培养基的类型和功能 ; 掌握发酵培养基中的碳源, 氮源, 无机盐和微量元素, 生长因子前体和产物促进剂 ; 掌握发酵培养基的设计和优化方法教学重点难点 : 工业上常用的糖类及不同碳源对发酵的影响及其选择 ; 氮源的种类及对发酵的影响 ; 无机盐使用时应注意的问题 ; 前体使用的方法和用量 ; 正交法设计和优化发酵培养基 2

3 培养基 : 广义上讲培养基是指一切可供微生物细胞生长繁殖所需的一组营养物质和原料同时培养基也为微生物培养提供除营养外的其它所必须的条件发酵培养基的作用 : 促进产物的形成满足菌体的生长 3

4 内容速览 1碳源 3.1培养基的类型及功能 2氮源 3.2成分及来源 3.3设计和优化 5水 3无机盐及微量元素 4生长因子前体等 4

5 1 培养基的类型及功能培养基按其组成物质的纯度状态用途可分为三大类型一按组成物质的纯度合成培养基 : 所用的原料其化学成分明确稳定适合于研究菌种基本代谢和过程的物质变化等科研工作 ; 培养基营养单一, 价格较高, 不适合用于大规模工业生产天然培养基 : 采用天然原料, 其成分不那么纯发酵培养基普遍使用天然培养基 ; 原料来源丰富 ( 大多为农副产品 ) 价格低廉适合于工业化生产 ; 由于其成分复杂, 不易重复, 如果对原料质量等方面不加控制会影响生产稳定性 5

6 二按状态固体培养基 : 适合于菌种和孢子的培养和保存, 也广泛应用于有子实体的真菌类, 如香菇白木耳等的生产半固体培养基 : 即在配好的液体培养基中加入少量的琼脂, 一般用量为 0.5%~0.8%, 主要用于微生物的鉴定液体培养基 :80%~90% 是水, 其中配有可溶性的或不溶性的营养成分, 是发酵工业大规模使用的培养基 6

7 三按用途 ( 从发酵生产应用考虑 ) 孢子 ( 斜面 ) 培养基 : 菌体迅速生长, 产较多优质孢子, 不易引起菌种变异要求 : 营养不太丰富无机盐浓度适量合适 ph 和湿度常用 : 麸皮培养基小米大米玉米碎屑琼脂斜面培养基种子培养基 : 孢子发芽生长和大量繁殖菌丝体要求 : 营养丰富完全最后一级接近发酵培养基发酵培养基 : 供菌体生长繁殖和合成产物 7

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9 一碳源 2 发酵培养基的成分及来源 1 作用提供微生物菌种的生长繁殖所需的能源和合成菌体所必需的碳成分 ; 提供合成目的产物所必须的碳成分 9

10 10

11 3 工业上常用的糖类 1 葡萄糖 ( 速效碳源 ) 几乎所有的微生物都能利用葡萄糖抗生素氨基酸有机酸多糖甾体转化但是过多会引起葡萄糖效应分解代谢物阻遏指细胞内同时有两种分解底物存在时, 利用快的那种底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象工业上常用淀粉水解糖, 但是糖液必须达到一定的质量指标 11

12 2 糖蜜糖蜜是制糖生产时的结晶母液, 它是制糖工业的副产物, 含丰富的糖维生素, 无机盐, 是发酵培养基价廉物美的碳源糖蜜主要含有蔗糖, 总糖可达 50%~75% 一般糖蜜分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜 12

13 糖蜜使用的注意点 : 除糖份外, 含有较多的杂质, 其中有些是有用的, 但是许多都会对发酵产生不利的影响, 需要进行预处理例 : 谷氨酸发酵有害物质 : 胶体成分 ( 起泡结晶 ) 钙盐 ( 结晶 ) 生物素 ( 发酵控制 ) 预处理 : 澄清脱钙脱除生物素例 : 柠檬酸发酵有害物质 : 铁离子含量高 ( 导致异柠檬酸的生成 ) 预处理 : 预先加入黄血盐除铁 13

14 3 淀粉糊精使用条件 : 微生物必须能分泌水解淀粉糊精的酶类, 经水解成单糖后再被吸收利用缺点 : 难利用 ; 发酵液比较稠一般 >2.0% 时加入一定的 α- 淀粉酶 ; 成分比较复杂, 有直链淀粉和支链淀粉等等优点 : 来源广泛价格低廉 ; 可以克服葡萄糖效应的弊端常用的淀粉为玉米淀粉小麦淀粉和甘薯淀粉 14

15 淀粉水解糖工业上常用淀粉水解糖, 但是糖液必须达到一定的质量指标 15

16 不同的制糖工艺生产的糖液质量差别很大 16

17 4 脂类 o 常用 : 豆油菜油葵花籽油猪油棉子油玉米油亚麻子油橄榄油 o 微生物 : 具有比较活跃的脂肪酶 o 耗氧量增加, 增加需氧量否则导致有机酸增加,pH 下降 o 消泡剂 17

18 5 有机酸 o 乳酸醋酸柠檬酸延胡索酸或它们的盐及醇 o 甘油 : 抗生素甾体转化 o 调节 ph 18

19 6 其他 o 碳酸气石油正构石蜡天然气甲醇乙醇等 o 嗜甲烷棒杆菌 : 甲醇 SCP, 转化率 47% o 乳糖发酵短杆菌 : 乙醇谷氨酸转化率 31% o 正烷烃 (C14~18 直链烃 ): 有机酸抗生素维生素氨基酸酶制剂 SCP 19

20 20

21 微晶纤维素棉纤维 21

22 研究了碳源对纤维素酶生产的影响, 发现不同碳源对其酶活的影响相差很大可溶性糖类作为碳源的酶活明显低于纤维性碳源的酶活, 可溶性糖类对纤维素酶的合成存在一定的抑制作用纤维性碳源中结晶度高的优于工业化的粗纤维碳源纤维素酶是诱导酶, 在微生物发酵过程中, 碳源物质同时又是诱导物的主要来源 22

23 苏勤, 林业化学与工业,2004 嗜碱芽胞杆菌 (AC-2) 中碳源对碱性纤维素酶分泌的影响结果 : 各种碳源相差不大推论 : 该菌种的碱性纤维素酶为组成型 23

24 二氮源氮源主要用于构成菌体细胞物质 ( 氨基酸, 蛋白质核酸等 ) 和含氮代谢物常用的氮源可分为两大类 : 有机氮源和无机氮源 1 无机氮源种类 : 铵盐硝酸盐和氨水特点 : 微生物对它们的吸收快, 所以也称之谓迅速利用的氮源 ( 速效氮源 ) 但无机氮源的迅速利用常会引起 ph 的变化如 : (NH 4 ) 2 SO 4 2NH H 2 SO 4 NaNO 3 + 4H 2 NH 3 + 2H 2 O + NaOH 24

25 无机氮源被菌体作为氮源利用后, 培养液中就留下了酸性或碱性物质, 这种经微生物生理作用 ( 代谢 ) 后能形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性物质, 如硫酸铵 ; 若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质, 如硝酸钠正确使用生理酸碱性物质, 对稳定和调节发酵过程的 ph 有积极作用所以选择合适的无机氮源有两层意义 : q 满足菌体生长 q 稳定和调节发酵过程中的 ph 25

26 毛霉产蛋白酶的研究陈涛, 中国酿造,2004 无机氮源的影响 : 硫酸铵 > 硝酸铵 > 硝酸钠 > 尿素 26

27 毛霉产蛋白酶的研究陈涛, 中国酿造,

28 毛霉产蛋白酶的研究陈涛, 中国酿造,2004 ph 中性偏酸比较好, 中性蛋白酶影响大 28

29 2 有机氮源来源 : 工业上常用的有机氮源都是一些廉价原料, 花生饼粉黄豆饼粉棉子饼粉玉米浆玉米蛋白粉蛋白胨酵母粉鱼粉蚕蛹粉尿素废菌丝体和酒糟成分复杂 : 除提供氮源外, 有些有机氮源还提供大量的无机盐及生长因子例玉米浆 ( 是用亚硫酸浸泡玉米而得的浸泡液的浓缩物 ), 是一种很容易被微生物利用的良好氮源 : 速效 1 含丰富的氨基酸生长因子 ( 生物素苯乙酸 ); 2 较多的乳酸 ; 3 丰富的硫磷微量元素等 29

30 氮源使用的一些相关问题 : q 有机氮源和无机氮源应当混合使用早期 : 容易利用易同化的氮源无机氮源中期 : 菌体的代谢酶系已形成, 则利用蛋白质 q 有些产物会受氮源的诱导和阻遏例 : 蛋白酶的生产 q 有机氮源选取时也要考虑微生物的同化能力 q 开发效果好有针对性的有机氮源仍然是令人感兴趣的课题 30

31 31

32 单一氮源以蛋白胨或 NaNO 3 为佳, 一般复合氮源对木聚糖酶产量的提高是有利的 32 返回

33 三无机盐和微量元素 P Mg S K Fe Na Pb Cl Zn Co Mn 等无机盐和微量元素, 作为酶的激活剂生理活性物质的组成或生理活性作用的调节剂低浓度时对细胞生长和产物的合成有促进作用, 高浓度时表现显著抑制作用 1 硫是许多含硫氨基酸的组成成分, 是许多酶的辅酶活性基 2 铁是细胞色素细胞色素氧化酶等组成成分, 有氧氧化必不可少的元素 3 镁锌钴铜锰等是某些酶的辅酶或激活剂 4 钾钠钙 : 维持细胞一定的渗透压和细胞透性, 并且还是许多酶的激活剂 33

34 34

35 1 作用: 各种不一样 2 来源:C N 源, 以盐的形式补充 3 用量: 根据具体的产品, 以实验决定 4 使用注意点 A. 对于其它渠道有可能带入的过多的某种无机离子和微量元素在发酵过程中必须加以考虑 35

36 例 : 铁离子青霉素发酵中, 铁离子的浓度要小于 30μg/ml 发酵罐一般都是铁制的, 必须进行表面处理 : 内壁涂漆或耐热环氧树脂 B 使用时注意盐的形式 (ph 的变化 ) 例 : 黑曲酶 NRRL-330, 生产 α- 淀粉酶,pH 对酶活的影响 ph 酶活不加加 K 2 HPO 加 KH 2 PO

37 四生长因子前体和产物促进剂 1 生长因子从广义上讲, 凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质, 如氨基酸嘌呤嘧啶维生素等均称生长因子如以糖质原料为碳源的谷氨酸生产菌均为生物素缺陷型, 以生物素为生长因子, 生长因子对发酵的调控起到重要的作用有机氮源是这些生长因子的重要来源, 多数有机氮源含有较多的 B 族维生素和微量元素及一些微生物生长不可缺少的生长因子 37

38 2 前体前体指某些化合物加入到发酵培养基中后, 能直接使微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去, 而其自身的结构并没有多大变化, 但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高青霉素 : 分子量 356 苯乙酸 : 分子量

39 作用 : 前体有助于提高产量和组份用量 : 前体的用量可以按分子量衡算, 具体使用注意转化率的问题例 :60000 单位 /ml 的青霉素 G, 理论上需要多少苯乙酸? 青霉素 =60000*0.6( 微克 )=36mg/ml 0.6μg / 单位苯乙酸 =(36*136)/356=13.8mg/ml 实际使用时的转化率在 46-90% 之间例某厂苯乙酸消耗为 :0.337(kg/10 亿单位青霉素 ) 转化率为 :? /[0.337 (356/136)] 100%=68% 39

40 用法 : 前体使用时普遍采用流加的方法前体一般都有毒性, 浓度过大对菌体的生长不利苯乙酸, 一般基础料中仅仅添加 0.07% 流加也有利于提高前体的转化率前体相对价格较高, 添加过多, 容易引起挥发和氧化 40

41 几种常用的前体产物前体产物前体青霉素 G 苯乙酸苯乙酰胺放线菌素 C 3 肌氨酸链霉素肌醇甲硫氨酸精氨酸维生素 B12 钴化物金霉素氯化物胡萝卜素 β- 紫罗兰酮红霉素丙酸丙醇丙酸盐 L- 色氨酸乙酸盐邻氨基苯甲酸灰黄霉素氯化物 L- 丝氨酸甘氨酸 41

42 3 产物促进剂产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物, 又非前体, 但加入后却能提高产量的添加剂 LS 脂肪酰胺磺酸钠 42

43 促进剂提高产量的机制还不完全清楚, 其原因是多方面的 : 有些促进剂本身是酶的诱导物 ; 有些促进剂是表面活性剂, 可改善细胞的透性, 改善细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产 ; 也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用 ; 有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子 43

44 五水对于发酵工厂来说, 恒定的水源是至关重要的, 因为在不同水源中存在的各种因素对微生物发酵代谢影响甚大水源质量的主要考虑参数包括 ph 值溶解氧可溶性固体污染程度以及矿物质组成和含量对于酿造行业, 水的重要性不言而喻对于常规发酵, 可靠持久能提供大量成分一致且清洁的水 44 返回

45 3 发酵培养基的设计和优化一般来讲, 培养基的设计首先是培养基成分的确定, 然后再决定各成分在培养基中的比例但目前还不能完全从生化反应的基本原理来推断和计算出适合某一菌种的培养基配方, 只能用生物化学细胞生物学微生物学等的基本理论, 参照前人所使用的较适合某一类菌种的经验配方, 再结合所用菌种和产品的特性, 采用摇瓶实验室发酵罐等小型发酵设备, 按照一定的实验设计和实验方法选择出较为适合的培养基 45

46 一成分含量的确定 1 理论转化率与实际转化率理论转化率是指理想状态下根据微生物的代谢途径进行物料衡算, 所得出的转化率的大小例 : 如在酒精生产中葡萄糖转化为酒精的理论转化率计算如下葡萄糖转化为酒精的代谢总反应衡算式为 C 6 H 12 O 6 2C 2 H 5 OH + 2CO 2 葡萄糖转化为酒精的理论得率为 2*46 Y = =

47 实际转化率是指实际发酵过程中转化率的大小, 由于它会受到一些因素的影响, 因而要小于理论转化率但理论转化率为培养基成分浓度的确定提供了重要的参考在发酵过程中如何控制实际转化率尽可能接近于理论转化率是发酵控制的一个目标 47

48 2 实验设计设计原则 : 目的明确营养协调理化适宜经济节约设计方法 : 1 生态模拟 2 参阅文献 3 精心设计 4 试验比较 48

49 2 实验设计生物统计附试验设计 u 培养基成分和浓度的确定最终都是通过实验获得一般首先通过单因素实验确定培养基的各成分 ; 再通过多因素实验确定各成分对培养基的影响大小及其适宜的浓度 u 合理的实验方法多因素实验 : 正交实验设计均匀设计响应面分析等 49

50 二培养基设计的步骤 1 根据前人的经验和培养基成分, 初步确定可能的培养基成分 ; 2 通过单因素实验最终确定出最为适宜的培养基成分 ; 3 当培养基成分确定后, 剩下的问题就是各成分最适的浓度, 由于培养基成分很多, 为减少实验次数常采用一些合理的实验设计方法 50

51 例 : 类胡萝卜素高产菌 Y11 的培养基的优化郭秒, 食品与工业发酵,2004 原培养基 : 类球红细菌 Rhodobacter sphaeroides NH 4 Cl 1g, 丁二酸钠 1g, KH 2 PO 4 0.2g,MgSO 4 7H 2 O 0.005g, Na 2 CO 3 0.2g, 酵母膏 0.1g, 复合无机盐溶液 1 ml, 水 1000mL,pH7.0 优化后的培养基 : NH 4 Cl 2g, 乙酸钠 2g, KH 2 PO 4 0.1g,MgSO 4 7H 2 O 0.01g, Na 2 CO 3 0.1g, 酵母膏 0.5g, 复合无机盐溶液 0.05 ml, 水 1000mL,pH7.0 51

52 初步确定可能的培养基成分 ( 以碳源为例 ) 52

53 通过单因素实验确定适宜的培养基成分及浓度 ( 以碳源为例 ) 考虑到成本 : 乙酸钠是较为合适的碳源 500 克丁二酸钠柠檬酸钠和乙酸钠的售价分别为元 23 元和 13 元 53

54 0. 2% 的乙酸钠浓度下菌株生长得最好, 过量的乙酸钠浓度反而会抑制菌株的生长 54

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57 单因素结果 : 碳源 : 乙酸钠 0.2% 氮源 : 氯化铵 0.2% 酵母膏 0.03% 无机盐 : 复合无机盐 0.05% 57

58 正交实验优化培养基配方第一步 : 确定因素水平表第二步 : 选用合适的正交表, 确定正交表头, 并安排实验第三步 : 根据正交表给出的方案, 进行实验第四步 : 对实验结果进行分析验证因素水平表 58

59 L 9 (3 4 ) 正交实验结果最优培养基配方 A 1 B 2 C 3 D 1 59

60 最优配方为 A 1 C 1 B 2 60

61 12# 改进后培养基 9# 原培养基改进后培养基的发酵结果 61

62 三摇瓶水平到反应器水平的优化配方摇瓶反应器培养基研究的两个层次 q 摇瓶培养基设计的第一步 q 反应器最终的优化的基础配方 62

63 例 : 青霉素发酵发酵摇瓶 : 玉米浆 4%, 乳糖 10%,(NH 4 )SO 4 0.8% 轻质碳酸钙 1% 发酵罐 : 葡萄糖流加控制总量 10-15%, 玉米浆总量 4-8% 补加硫酸前体等摇瓶培养基和发酵罐的基础培养基差别很大 63

64 摇瓶优化配方 : 菌种筛选, 反应器研究的基础 64

65 发酵罐 : 反应器水平, 可以得出最终优化的基础配方 65

66 ph 控制摇床 : 反应器水平上的摇瓶研究 66

67 四培养基设计时注意的一些相关问题 q 原料及设备的预处理原料 : 除杂粉碎去皮等设备 : 防止铁离子脱落 q 原材料的质量 q 发酵特性的影响在抗生素发酵生产中往往喜欢所谓的稀配方, 因为它既降低成本灭菌容易且使氧传递容易而有利于目的产物的生物合成如果营养成分缺乏, 则可通过中间补料方法予以弥补如, 红霉素发酵时, 淀粉含量过高不仅成本增加而且发酵液粘稠会影响氧的传递, 进而影响红霉素的合成 67

68 q 灭菌在大规模发酵中应该尽可能的采取连续灭菌的操作, 以减少营养物质的损失, 而且保证灭菌条件的稳定是保证发酵稳定的前提有时避免营养物质在加热的条件下, 相互作用, 可以将营养物质分开灭菌 Na 2 HPO 4 +CaCO 3 CaHPO 4 +Na 2 CO 3 有些物质由于挥发和对热非常敏感, 就不能采用湿热蒸汽灭菌法如氨水的灭菌常用过滤除菌法进行 68

69 思考题 1 发酵培养基的特点和要求? 2 常用的碳源有哪些? 常用的糖类有哪些? 3 什么是生理性酸性物质? 什么是生理性碱性物质? 4 常用的无机氮源和有机氮源有哪些? 有机氮源在发酵培养基中的作用? 5 什么是前体? 前体添加的方式? 6 什么是生长因子? 生长因子的来源? 7 举例说明培养基设计的方法与步骤? 69

长春医学高等专科学校教案教学改革及创新根据本节课的内容特点, 本节课的内容比较简单, 容易理解, 可以通过让学生带着问题自学, 然后通过提问了解学生自学的情况, 在进行归纳总结, 提高学生的自学能力教学手段和教学方法教学方法 : 讨论式教学培养基配制的一般原则协作学习法应用在培养基的成分的

长春医学高等专科学校教案教学改革及创新根据本节课的内容特点, 本节课的内容比较简单, 容易理解, 可以通过让学生带着问题自学, 然后通过提问了解学生自学的情况, 在进行归纳总结, 提高学生的自学能力教学手段和教学方法教学方法 : 讨论式教学培养基配制的一般原则协作学习法应用在培养基的成分的长春医学高等专科学校教案第次课 2 学时任课教师姓名臧学丽职称副教授教龄 10 年授课时间 3 月 13 日 1 单元月日单元月日单元月日单元月日单元授课地点 5209 教教学内容纲要时间分配项目三培养基的制备任务一固体培养基的制备一培养基条件与微生物生理学和形态学的相关性二培养基的要素三配制工业发酵培养基的一般要求四培养基配制的原则任务二液体培养基的制备课内知识能力素质目标

Microsoft PowerPoint - 第三章 发酵培养基.ppt

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