1122 第 24 卷 Fld 都是富含酸性氨基酸的蛋白质, 一般含有 140~180 个残基, 相对分子质量在 ~ 之间, 分子中心 5 个平行 β 片层 (β 片层内的链顺序是 21345) 被外围的 2 层 α 螺旋包围着组成 αβα 形式的三明治结构 ( 图 1)

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容域剧
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1 第 24 卷第 10 期 2012 年 10 月 Chinese Bulletin of Life Sciences Vol. 24, No. 10 Oct., 2012 文章编号 : (2012) 黄素氧化还原蛋白研究进展卢明锋 1,2, 张月杰 1 * (1 山东理工大学学院, 淄博 ;2 山东师范大学学院, 济南 ) 摘要 : 黄素氧化还原蛋白 (flavodoxin, Fld) 是一类通过非共价键与黄素单核苷酸 (flavin mononucleotide, FMN) 紧密结合的小黄素蛋白, 在原核生物及低等真核生物中作为重要的低电势电子传递载体参与了众多的生化反应在 Fld 的结构和分类 FMN 与脱辅基 Fld 结合途径以及 Fld 结构与功能的关系等方面综述了近年来的相关研究进展关键词 : 黄素氧化还原蛋白 ; 配体结合 ; 氧化还原电位中图分类号 :Q513 ;Q6-33 文献标志码 :A Research advances of flavodoxin LU Ming-Feng 1,2, ZHANG Yue-Jie 1 * (1 School of Life Sciences, Shandong University of Technology, Zibo , China; 2 School of Life Sciences, Shandong Normal University, Ji nan , China) Abstract: Flavodoxins are small flavoproteins which non-covalently bind with a molecular of FMN and participate in a varity of biochemical reactions acting as low redox potential electron carriers in prokaryotic and low eukaryotic organism. The structural characteristics of flavodoxin, classification, binding pathway between FMN and apoflavodoxin and influence factors on redox potentials of flavodoxin were reviewed in this paper. Key words: flavodoxin; ligand binding; redox potential 黄素氧化还原蛋白 (flavodoxin, Fld) 是指一类与黄素单核苷酸 (flavin mononucleotide, FMN) 非共价键结合, 具有单一结构域的小黄素蛋白 (flavoprotein) 除了真核生物中的绿藻和红藻,Fld 仅存在于细菌中, 并在许多种属, 如普通脱硫弧菌 (Desulfovibrio vulgaris) 埃氏巨型球菌 (Megasphaera elsdenii) 棕色固氮菌 (Azotobacter vinelandii) 巴氏梭菌 (Clostridia pasteurianum) 蓝藻鱼腥藻 (Cyanobacteria anabaena) 中都普遍存在 [1] Fld 作为电子传递载体在电子传递系统中具有重要的作用, 参与了大量的生化反应, 如 Fld 在光生物合成中可以作为单电子转运中心在光系统 I (photo system I, PS I) 和 NADP + - 铁硫蛋白氧化还原酶 (ferredoxin-nadp + reductase, FNR) 间逐个地传递电子 [2] ; 在幽门螺旋杆菌 (Helicobacter pylori) 乙酰辅酶 A 的生物合成中作为丙酮酸 :Fld 氧化还原酶的电子受体 [1] ; 在枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) 脂肪酸去饱和反应中起到电子供体的作用 [3] ; 在 A. vinelandii 中参与氮气的固定和还原 ; 在环境条件恶劣时替代铁氧化还原蛋白 (ferredoxin, Fd) [4] 1 Fld 的结构和分类按照 SCOP (structural classification of proteins) 分类标准,Fld 属于 α/β Class ( 类 ),Flavodoxin-like fold ( 折叠类型 ),Flavoprotein supperfamily ( 超家族 ),Flavodoxin-related (bind FMN) family ( 家族 ), Flavodoxin domain ( 结构域 ) 目前, 所有已知的收稿日期 : ; 修回日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金项目 ( ); 山东省高等学校科技计划 (J12LE03) * 通信作者 : zhangyuejie221@yahoo.com.cn; Tel:

1122 第 24 卷 Fld 都是富含酸性氨基酸的蛋白质, 一般含有 140~180 个残基, 相对分子质量在 14 000~23 000 之间, 分子中心 5 个平行 β 片层 (β 片层内的链顺序是 21345) 被外围的 2 层 α 螺旋包围着组成 αβα 形式的三明治结构 ( 图 1) Fld 可分成相对分子质量在 14 000~17 000 之间的短链 Fld (D.

2 1122 第 24 卷 Fld 都是富含酸性氨基酸的蛋白质, 一般含有 140~180 个残基, 相对分子质量在 ~ 之间, 分子中心 5 个平行 β 片层 (β 片层内的链顺序是 21345) 被外围的 2 层 α 螺旋包围着组成 αβα 形式的三明治结构 ( 图 1) Fld 可分成相对分子质量在 ~ 之间的短链 Fld (D. vulgaris, C. pasteurianum) 和相对分子质量在 ~ 之间的长链 Fld (Anabaena PCC7119, A. vinelandii, E. coli, H. pylori) 两种类型两者共有的功能性 loop 分别是 N 末端的磷酸结合 loop (P loop) 和含有保守芳香族氨基酸残基的异咯嗪结合 loop (W loop 和 Y loop) 两者的唯一区别在于长链 Fld 在 C 末端具有一个额外的长约 20 个氨基酸的的 loop 结构由于去除长链 Fld 这段额外的 loop 后并不影响脱辅酶黄素氧化还原蛋白 (apoflavodoxin, apofld) 的折叠和稳定性, 对 FMN 与 apofld 结合的影响也较小, 所以,Lopez-Llano [6-7] 等认为长链 Fld 特有的这段 loop 可能与其 parter ( 伙伴 ) 间的识别有关, 并从结构特征的角度出发提出短链 Fld 起源于长链 Fld 的观点 2 FMN 与 apofld 的结合途径 Fld 的显著特征是可以非常紧密地与 FMN 以非共价键结合 ( 解离平衡常数 K d <1 nm) 氧化型 FMN 分子由一分子磷酸一分子核醇基团和一分子异咯嗪基团组成由于 Fld 分子上不存在结合核图 1 D. vulgaris 黄素氧化还原蛋白 (pdb:1j8q) 的三维结构醇基团的保守序列, 所以,FMN 与 Fld 的识别应该只涉及磷酸基团异咯嗪基团与 P loop W loop 及 Y loop 间的相互作用 2.1 磷酸基团先结合途径 Curley 等 [8] 研究 M. elsdenii apofld 与辅因子结合性质时发现,FMN 与 apofld 的结合非常紧密 (K d = 0.24 nmol/l), 而与核黄素 (riboflavin) 的结合却非常弱 (K d = 0.72 μmol/l) 由于核黄素与 FMN 的差别只是在分子结构的核醇基团末端少了一个磷酸基团, 因此, 磷酸基团被认为对 FMN 与 apofld 的识别与结合具有重要的作用 Barman 等 [9] 发现 apofld 与 FMN 的结合涉及两次松弛, 而与核黄素的结合只涉及一次松弛, 因此, 其推断蛋白质内部构象的改变需要 FMN 的磷酸基团的参与, 进而提出磷酸基团首先与 apofld 结合并确保构象改变有利于异咯嗪环的结合 [1] [10] Carlson 等研究黄素 (flavin) 与 A. vinelandii apofld 结合热动力学时发现, 与黄素腺嘌呤二核苷酸 (flavin adenine dinucleotide, FAD) 和 8- 羧基核黄素 (8-carboxyriboflavin) 相比,FMN 与 apofld 的结合焓最低, 因而推断 FMN 的磷酸基团使其更易插入 apofld 上已有的 FMN 结合口袋 Genzor 等 [11] 分析了 Anabaena PCC 7119 的 apofld X-ray 晶体结构, 发现其整体结构与黄素氧化还原全酶 (holo-flavodoxin,holofld) 基本相似, 但在异咯嗪结合位点存在明显的残基塌陷, 他们将这种现象描述为酪氨酸 / 色氨酸芳香门的关闭 ( closure of tyr/trp aromatic gate ) 由于磷酸基团结合位点可以被溶液中二价磷酸或硫酸阴离子占据, 且其结构和指向都与 holofld 的结构相似, 所以, 他们推断初始的配体识别发生在磷酸结合位点, 其引起的构象改变有利于异咯嗪的结合 2.2 异咯嗪基团先结合途径 Steensma 等 [12] 认为仅依据上述结果不能断定是磷酸基团先引发了 FMN 与 apofld 的结合, 因为 X-ray 晶体结构只是偶然冻结了一个 flavin 结合位点的构象 NMR 测定结果也证明,A. vinelandii 来源的 apofld 的结构与 holofld 基本一致, 但 apofld 并没有现成的磷酸结合位点, 且在整个 Flavin 结合区都具有非常大的灵活性 [13] Lostao 等 [14] 采用定点突变技术研究了 Anabaena PCC 7119 的 Fld 的 W loop Y loop 和 P loop 氨基酸组成对 FMN 与 apofld 结合的影响,W loop 和 Y loop 的芳香族氨基酸被替换后显著降低了 holofld 的形成率, 而 P loop 的氨基酸组成不影响结合速率常数, 因此他们认为是异

3 第 10 期卢明锋, 等 : 黄素氧化还原蛋白研究进展 1123 咯嗪结合位点发生的疏水 / 芳香相互作用推动了 FMN 与 apofld 的结合, 即异咯嗪环先结合 2.3 合作结合途径采用停留荧光分光光度技术研究 D. vulgaris 来源的 apofld 与 Flavin 结合动力学性质时,Murray 和 Swenson 等 [15] 发现 FMN 与 apofld 在磷酸盐缓冲液中的结合会导致两个不同速率的荧光淬灭过程, 而在无磷酸盐缓冲液时则只有一个荧光淬灭过程 ; 核黄素与 apofld 在磷酸盐缓冲液中的结合也只有一个荧光淬灭过程, 而无磷酸盐缓冲液时核黄素不能与 apofld 结合他们认为造成这种差异的原因是由于 FMN 是以两种不同的途径与 apofld 结合, 并提出了一个基于磷酸结合位点与异咯嗪结合位点间具有合作性关系的新模型 ; 还认为异咯嗪基团的结合依赖于磷酸结合位点上磷酸基团的存在, 当缓冲液中存在磷酸阴离子时 FMN 可以通过两种途径与 apofld 结合 :(1) 首先是磷酸基团的插入, 然后是异咯嗪环的结合即磷酸优先 (phosphate-first), 由于核黄素缺乏磷酸基团, 所以不能与 apofld 结合 ; (2) 当缓冲液中的无机磷酸基团占据磷酸结合位点后, 能够提高 FMN 异咯嗪环的结合速率即异咯嗪环优先 (ring-first) 事实上,Fld 的 flavin 结合位点具有很大的灵活性,Fld 酰胺骨架上的化学位移证实了磷酸基团与 P loop 的结合,NMR 和近紫外圆二色性光谱 (near-uv circular dichroism, near-uv CD) 数据表明, 这种结合虽然对 Y loop 没有影响, 但却有利于 W loop 芳香族氨基酸侧链的移动和构象改变 [16], 证明合作结合途径的合理性 2.4 构象不均一结合途径 Murray 等 [16] 的合作模型无法解释缓冲液中是否有磷酸分子时,FMN 与 H. pylori 的 apofld 的结合都是两个不同速率的荧光淬灭过程在 D. vulgaris 来源 Fld 的 W60A 突变体中也发现了类似的现象 [17-18] 一系列针对 H. pylori 来源 Fld 的异咯嗪和磷酸结合位点的突变实验表明, 磷酸结合位点的突变对 FMN 的结合速率常数几乎没有影响, 所以,FMN 与 Fld 的结合应该是受到 FMN 与异咯嗪结合位点间的相互作用控制 Ayuso-Tejedor 等认为 H. pylori 的 apofld 具有一些固有的不均一构象, 两相淬灭过程就是这些不均一构象与 FMN 结合的结果其中包括 :(1) 顺序结合机制, 先结合异咯嗪位点, 然后再与磷酸位点结合 ;(2) 任意选择结合异咯嗪或磷酸位点, 然后快速重组 ;(3) 任意选择结合天然态或部分去折叠态 apofld, 迅速形 [17] 成平衡态中间体 ;(4) 任意选择已结合有磷酸阴离子的 apofld 或完全自由的 apofld, 迅速完成阴离子加载途径 3 配体结合对 Fld 折叠过程的影响很多蛋白都需要配体的非共价结合才具有生物学功能, 但配体结合在蛋白质折叠过程中的作用却 [19] 缺乏详尽的研究 Bollen 等研究了 FMN 对 Fld (A. vinelandii) 折叠的影响, 提出了 Fld 折叠的后进先出机制, 其主要内容为 :holofld 折叠过程中天然态的 apofld 自发形成是非常必要的 ; 过量的 FMN 不能加速 holofld 的折叠,FMN 也不能作为折叠的成核位点 ;FMN 在折叠的最后一步与天然态的 apofld 结合形成 holofld ; 即使是在强变性剂下,holoFld 也必须先解离下 FMN 才能发生去折叠与 Bollen 的后进先出机制所认为的 apofld 折叠先于 FMN 的结合相反,Muralidahara 等却认为 FMN 可以通过一种被称为辅因子飞雕 (fly casting) 模型的方式加速 Fld (D. vulgaris) 的折叠过程根据 Muralidahara 等的实验结果可知,FMN 可以在毫秒内完成与去折叠多肽的结合, 并指导其迅速折叠成天然态 holofld, W loop 和 Y loop 上的保守芳香氨基酸替换对折叠过程无影响 Muralidahara 等认为由于来源于 D. vulgaris 和 A. vinelandii 的 Fld 与 FMN 的亲和力相差近 100 倍, 所以长链 Fld ( 例如 A. vinelandii) 和短链 Fld (D. vulgaris) 各自有其偏好的折叠 / 结合途径 4 Fld 结构与功能的关系 Fld 通过非共价结合 FMN 而使蛋白质具有了氧化还原性质, 在铁离子缺乏时甚至能够代替铁硫蛋白 Fld 上的氧化型 (fully oxidized, ox )FMN 在异咯嗪环上接受一个电子和质子后被还原为中性的半醌型 (semiquinone, one-electron reduced form, sq ), 继续接受一个电子后可以被彻底地还原为氢醌型 (hydroquinone, two-electron reduced form, hq ) 4.1 芳香门保守性氨基酸对氧化还原电位的影响绝大多数 Fld 中,FMN 的异咯嗪环是被堆叠在两个芳香氨基酸之间 ( 图 1) 在异咯嗪环的 si-face 通常是 Y loop 上非常保守的酪氨酸残基 Y, 在 re-face 则是 W loop 上保守性相对较小的色氨酸残基 W Y 或 W 分别被其他两种芳香族氨基酸替换, 使 E 1 略趋向于负值而 E 2 变得更趋向正值 Y 替换引起的 E 2 变化幅度小于 W 替换, 而 E 1 变化幅度大

1124 第 24 卷于 W 替换非芳香氨基酸替换均较芳香替换使 E 2 和 E 1 均大幅度趋向于正值所有突变型的 Fld ox 的 K d 均增大 ( 较野生型高 15~5000 000 倍 ), 但非芳香替换增大幅度远高于芳香替换 [20] 上述结果表明, 芳香氨基酸残基能够紧固 apofld 与 FMN 间的结合 ; Y 残基对 E 1 影响较大主要是因为其较 W 残基更有

4 1124 第 24 卷于 W 替换非芳香氨基酸替换均较芳香替换使 E 2 和 E 1 均大幅度趋向于正值所有突变型的 Fld ox 的 K d 均增大 ( 较野生型高 15~ 倍 ), 但非芳香替换增大幅度远高于芳香替换 [20] 上述结果表明, 芳香氨基酸残基能够紧固 apofld 与 FMN 间的结合 ; Y 残基对 E 1 影响较大主要是因为其较 W 残基更有利于提高 Fld hq 的相对不稳定性 ; 而 W 残基显著影响 E 2 则主要是因为其更有利于提高 Fld sq 的相对稳定性 ; 其他氨基酸在上述两个位点的替换将导致 Fld hq 的相对不稳定性和 Fld sq 的相对稳定性的降低, 从而使 E 1 和 E 2 均更倾向于正值 4.2 影响 Fld hq 相对不稳定的原因野生型 Fld 中非常稳定的 Fld sq 稳定的 Fld ox 和相对不稳定的 Fld hq 是由多种因素共同作用的结果由于 Y 残基的苯酚侧链与 FMN 异咯嗪环的 outface 近乎共平面, 而 W 残基与异咯嗪环间也只有小于 40º 的夹角, 两者均可与 FMN 之间通过广泛的范德华力形成芳香堆积相互作用 [21] ( 图 2) 从辅因子结合导致的自由能变化角度看, 野生型 Y loop 上的 Y 和 W loop 上的 W 能够分别通过与 FMN 形成更为有利的相互作用, 使 apofld 与三种氧化还原状态的 FMN 结合能处于最低状态, 在整个催化循环中保证了非共价结合的辅因子与 apofld 始终紧密结合在一起 [20] Fld hq 的相对不稳定性一方面可能是由于 FMN hq 在极性溶液中的稳定构象是非平面的 butterfly bend, 但在 Fld 的芳香门非极性环境中 [21] 图 2 Fld 中 FMN 结合位点的芳香族氨基酸指向却被迫采用不稳定的平面构象由于 Fld ox Fld sq 的稳定构象本身就是平面的, 所以,Fld ox Fld sq 相对于 Fld hq 更稳定另一方面,Fld hq 的相对不稳定与 FMN hq 的阴离子特性具有更直接的关系由于 Fld 是一种富含酸性氨基酸的酸性蛋白质, 在 FMN 结合位点附近有大量的负电荷, 静电排斥作用会导致 Fld hq 的不稳定, 这种不利的静电环境将使 FMN sq [22] 的还原变得更为困难 Zhou 和 Swenson 等对 D. vulgaris 来源的 Fld 的 FMN 结合位点内距离 FMN 的 N(1) 原子在 13Å 以内的六个酸性氨基酸与氧还还原电位的关系研究结果表明,E 2 与静电环境无明显相关性, 但 E 1 与酸性氨基酸的替换有很强的相关性, 平均每个酸性残基的替换使 E 1 的负值减少 15 mv 进一步的研究结果表明, 负静电环境和 Y 残基与异咯嗪环间的芳香堆积导致 FMN hq 不稳定表现出的 E 1 的负值减少具有线性累加性 [22] 由于 FMN 上还有一个负电基团磷酸, 所以, 他们随后分别研究了中性 P loop 的碱性氨基酸替换核黄素结合对 Fld 氧化还原电位的影响 Zhou 和 Swenson 等 [23] 发现 P loop 上的氨基酸仅具有普通的静电效应, 而磷酸基团的存在与否对 E 2 几乎没有影响, 但却使 E 1 趋向正值 180 mv, 这种现象很可能是由于缺少磷酸基团导致 apofld..核黄素半醌极端不稳定引起的, 而不会是因静电作用产生的 4.3 氢键对 Fld sq 稳定性的影响 Fld sq 较高的相对稳定性与还原态 Fld 中异常复杂的氢键网络密切相关由于磷酸基团的氧原子与 P loop 位点的氨基酸残基间有非常保守的氢键连接, 所以, 这种氢键相互作用与 Fld sq 的稳定性具有直接的关系 [24] 除了磷酸基团的氧原子外,FMN ox 还可以通过核醇链上的羟基异咯嗪环上的两个 (O2) (O4) 羰基氧原子及 (N1) (N3)H 与其邻近的氨基酸形成非常复杂的氢键网络 [25] Ludwig 等 [26] 还发现 FMN ox 在被还原为 FMN sq 时还能够诱导 FMN 结合位点附近的氨基酸发生构象转变及结构重排, 并建立起新的氢键网络使 Fld sq 更稳定另外, 还原态的 FMN 在质子化的 (N5)H 上也可以与邻近的氨基酸建立起一些新的氢键连接稳定 Fld sq, 且野生型的 Fld sq 形成的氢键强度最大 [27-29] 由于这三种氧化还原状态 FMN 的稳定性具有显著的差异, 所以, 分别形成了 Fld ox/sq 的氧化还原电势 E 2 和 Fld sq/hq 的氧化还原电势 E 1 自由的 FMN sq 相对于 FMN ox 和 FMN hq 是不稳定的, 所以其 E 2 =-238 mv 低于 E 1 =-172 mv 虽然不同来源

5 第 10 期卢明锋, 等 : 黄素氧化还原蛋白研究进展 1125 Fld 的氧化还原电位各不相同, 但其共同特征是具有稳定的 Fld sq 和相对不稳定的 Fld ox Fld hq 态, 因此, 具有非常低的 E 1 (-172~<-400 mv) 和相对较高的 E 2 (-50~-260 mv), 在生物体内能够以 sq/hq 作为单电子转运中心逐个地传递电子 5 展望由于 Fld 相对分子质量较小, 所以, 非常适合采用定点突变结合核磁共振技术 (nuclear magnetic resonance, NMR) 或 X-ray 技术研究蛋白质结构和功能的关系作为一个模型蛋白, 对 Fld 的研究也有助于理解蛋白质稳定性蛋白质折叠和蛋白质 - 配体识别途径蛋白质结构与功能的关系等生物物理学热点问题由于 Fld 是 H. pylori 的一种组成型蛋白, 所以, 有望成为一种治疗 H. pylori 感染的药物靶点 [30] ; 在类囊体中过表达 Fld 能够诱导抗氧化代谢发生改变, 延缓紫花苜蓿根瘤衰老, 提高淀粉的积累 [31] ; 在叶绿体中共表达 Fld 和 FNR 能够增加植物对活性氧的耐受性, 提高植物对逆境的抗性 [32-34] 综上所述,Fld 不但具有重要的理论研究价值, 而且具有极其重要的应用价值, 值得进一步深入研究 [ 参考文献 ] [1] Sancho J. Flavodoxins: sequence, folding, binding, function and beyond. Cell Mol Life Sci, 2006, 63 (7-8): [2] Medina M. Structural and mechanistic aspects of flavoproteins: photosynthetic electron transfer from photosystem I to NADP +. FEBS J, 2009, 276 (15): [3] Lorena CC, Leticia Martiarena, Diego de M. Role of ferredoxin and flavodoxins in bacillus subtilis fatty acid desaturation. J Bacteriol, 2011, 193(16): [4] Tognetti VB, Palatnik JF, Fillat MF, et al. Functional replacement of ferredoxin by a cyanobacterial flavodoxin in tobacco confers broad-range stress tolerance. Plant Cell, 2006, 18 (8): Muralidhara BK, Rathinakumar R, Wittung-Stafshede P. Folding of Desulfovibrio desulfuricans flavodoxin is accelerated by cofactor fly-casting. Arch Biochem Biophys, 2006, 451 (1): 51-8 [6] Lopez-Llano J, Maldonado S, Bueno M, et al. The long and short flavodoxins: I. The role of the differen-tiating loop in apoflavodoxin structure and FMN binding. J Biol Chem, 2004, 279 (45): [7] Lopez-Llano J, Maldonado S, Jain S, et al. The long and short flavodoxins: II. The role of the differentiating loop in apoflavodoxin stability and folding mechanism. J Biol Chem, 2004, 279 (45): [8] Curley GP, Carr MC, Mayhew SG, et al. Redox and flavin-binding properties of recombinant flavodoxin from Desulfovibrio vulgaris (Hildenborough). Eur J Biochem, 1991, 202(3): [9] Berman K, Boyer PD. Characteristics of the reversible heat, solvent, and detergent denaturation of leucine binding protein. Biochemistry, 1972, 11 (25): [10] Carlson R,Langerman N.The thermodynamics of flavin binding to the apoflavodoxin from Azotobacter vinelandii. Arch Biochem Biophys, 1984, 229(2):440-7 [11] Genzor CG, Perales-Alcon A, Sancho J, et al. Closure of a tyrosine/tryptophan aromatic gate leads to a compact fold in apo flavodoxin. Nat Struct Biol, 1996, 3 (4): [12] Steensma E, van Mierlo CP. Structural characterisation of apoflavodoxin shows that the location of the stable nucleus differs among proteins with a flavodoxin-like topology. J Mol Biol, 1998, 282 (3): [13] van Mierlo CP, van Dongen WM, Vergeldt F, et al. The equilibrium unfolding of Azotobacter vinelandii apoflavodoxin II occurs via a relatively stable folding intermediate. Protein Sci, 1998, 7 (11): [14] Lostao A, Daoudi F, Irun MP, et al. How FMN binds to anabaena apoflavodoxin: a hydrophobic encounter at an open binding site.j Biol Chem, 2003, 278 (26): [15] Murray TA, Swenson RP. Mechanism of flavin mononucleotide cofactor binding to the Desulfovibrio vulgaris flavodoxin. 1. Kinetic evidence for cooperative effects associated with the binding of inorganic phosphate and the 5'-phosphate moiety of the cofactor. Biochemistry, 2003, 42 (8): [16] Murray TA, Foster MP, Swenson RP. Mechanism of flavin mononucleotide cofactor binding to the Desulfovibrio vulgaris flavodoxin. 2. Evidence for cooperative conformational changes involving tryptophan 60 in the interaction between the phosphate- and ring-binding subsites. Biochemistry, 2003, 42 (8): [17] Ayuso-Tejedor S, Abian O, Velazquez-Campoy A, et al. Mechanism of FMN binding to the apoflavodoxin from Helicobacter pylori. Biochemistry, 2011, 50 (40): [18] Mayhew SG, O'Connell DP, O'Farrell PA, et al. Regulation of the redox potentials of flavodoxins: modification of the flavin binding. Biochem Soc Trans, 1996, 24 (1): [19] Bollen YJ, Nabuurs SM, van Berkel WJ, et al. Last in, first out: the role of cofactor binding in flavodoxin folding. J Biol Chem, 2005, 280 (9): [20] Lostao A, Gomez-Moreno C, Mayhew SG, et al. Differential stabilization of the three FMN redox forms by tyrosine 94 and tryptophan 57 in flavodoxin from Anabaena and its influence on the redox potentials. Biochemistry, 1997, 36 (47): [21] Swenson RP, Krey GD. Site-directed mutagenesis of tyrosine-98 in the flavodoxin from Desulfovibrio vulgaris (Hildenborough): regulation of oxidation-reduction properties of the bound FMN cofactor by aromatic, solvent, and electrostatic interactions. Biochemistry, 1994, 33 (28): [22] Zhou Z, Swenson RP. The cumulative electrostatic effect

6 1126 第 24 卷 of aromatic stacking interactions and the negative electrostatic environment of the flavin mononucleotide binding site is a major determinant of the reduction potential for the flavodoxin from Desulfovibrio vulgaris (Hildenborough). Biochemistry, 1996, 35 (50): [23] Zhou Z, Swenson RP. Evaluation of the electrostatic effect of the 5'-phosphate of the flavin mononucleotide cofactor on the oxidation--reduction potentials of the flavodoxin from Desulfovibrio vulgaris (Hildenborough). Biochemistry, 1996, 35 (38): [24] Alagaratnam S, van Pouderoyen G, Pijning T, et al. A crystallographic study of Cys69Ala flavodoxin II from Azotobacter vinelandii: structural determinants of redox potential. Protein Sci, 2005, 14 (9): [25] Macheroux P, Kappes B, Ealick SE. Flavogenomics-a genomic and structural view of flavin-dependent proteins. FEBS J, 2011, 278 (15): [26] Ludwig ML, Pattridge KA, Metzger AL, et al. Control of oxidation-reduction potentials in flavodoxin from Clostridium beijerinckii: the role of conformation changes. Biochemistry, 1997, 36 (6): [27] O'Farrell PA, Walsh MA, McCarthy AA, et al. Modulation of the redox potentials of FMN in Desulfovibrio vulgaris flavodoxin: thermodynamic properties and crystal structures of glycine-61 mutants. Biochemistry, 1998, 37 (23): [28] Chang FC, Swenson RP. The midpoint potentials for the oxidized-semiquinone couple for Gly57 mutants of the Clostridium beijerinckii flavodoxin correlate with changes in the hydrogen-bonding interaction with the proton on N(5) of the reduced flavin mononucleotide cofactor as measured by NMR chemical shift temperature dependencies. Biochemistry, 1999, 38 (22): [29] Frago S, Goni G, Herguedas B, et al. Tuning of the FMN binding and oxido-reduction properties by neighboring side chains in Anabaena flavodoxin. Arch Biochem Biophys, 2007, 467 (2): [30] Cremades N, Velazquez-Campoy A, Martinez-Julvez M, et al. Discovery of specific flavodoxin inhibitors as potential therapeutic agents against Helicobacter pylori infection. ACS Chem Biol, 2009, 4 (11): [31] Redondo FJ, de la Pena TC, Morcillo CN, et al. Overexpression of flavodoxin in bacteroids induces changes in antioxidant metabolism leading to delayed senescence and starch accumulation in alfalfa root nodules.plant Physiol, 2009, 149 (2): [32] Blanco NE, Ceccoli RD, Segretin ME, et al. Cyanobacterial flavodoxin complements ferredoxin deficiency in knockeddown transgenic tobacco plants. Plant J, 2011, 65 (6): [33] Zurbriggen MD, Tognetti VB, Fillat MF, et al. Combating stress with flavodoxin: a promising route for crop improvement. Trends Biotechnol, 2008, 26 (10): [34] Mariana G, Romina DC, Hugo OP, et al. An in vivo system involving co-expression of cyanobacterial flavodoxin and ferredoxin NADP + reductase confers increased tolerance to oxidative stress in plants. FEBS Open Biol, 2011, 1: 7-13

第 33 卷第 2 期 2010 年 4 月 - 149 - 脱蛋白较好的方法是 Sevag 法, 它是根据蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性的特点, 使蛋白质变性成胶状, 此法条件温和, 可避免多糖的降解

第 33 卷第 2 期 2010 年 4 月 - 149 - 脱蛋白较好的方法是 Sevag 法, 它是根据蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性的特点, 使蛋白质变性成胶状, 此法条件温和, 可避免多糖的降解 - 148 - Drug Evaluation Research Vol.33 No.2 April 2010 植物多糖的研究进展陶遵威 1, 郑夺 1, 邸明磊 2, 单晓菊 1 天津市医药科学研究所, 天津 300020; 2 天津中医药大学, 天津 300073 2 摘要多糖是由单糖连接而成的多聚物,

1122 第 24 卷 Fld 都是富含酸性氨基酸的蛋白质, 一般含有 140~180 个残基, 相对分子质量在 ~ 之间, 分子中心 5 个平行 β 片层 (β 片层内的链顺 序是 21345) 被外围的 2 层 α 螺旋包围着组成 αβα 形式的三明治结构 ( 图 1)

1122 第 24 卷 Fld 都是富含酸性氨基酸的蛋白质, 一般含有 140~180 个残基, 相对分子质量在 ~ 之间, 分子中心 5 个平行 β 片层 (β 片层内的链顺序是 21345) 被外围的 2 层 α 螺旋包围着组成 αβα 形式的三明治结构 ( 图 1)