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1 DOI: /j.cnki.bingduxuebao CHINESEJOURNALOF VIROLOGY Vol.34 No.1 January 2018 RT-RAA * ( ; ) : (MERS-CoV) (RAA) MERS-CoV MERS-CoV RT-RAA RT-PCR MERS-CoV QC- MD MERS-CoV : RT-RAA 10 RT-PCR (100 ) (4.8~13.6min) RT-PCR (90min); 8 ; RT-RAA : (MERS-CoV); ; :R373.1 :A : (2018) (Middleeastrespiratorysyn- : ; : : ( : 2016YFF ) ; ( :LY16H260004), ; ( :2016IK176) : (1979-),,,Tel: , zhoudg@nbciq.gov.cn * : (1973-),,,Tel: , yuxj@nbciq.gov.cn MERS-CoV drome,mers) RNA,upE (MERScoronavirus,MERS-CoV) ORF1b Nseq,SARS-CoV 55% MERS-CoV (Severeacuterespiratorysyndromecoronavirus, RT-PCR LAMP, SARS-CoV) RT-PCR [1-3] 2012 ;LAMP, (WHO) , 2040MERS-CoV 722 (Reverse-transcriptionrecombinase-aid 35% SARS-CoV, assay,rt-raa) RAA, RNA 27 82% DNA PCR [4] o C~39 o C MERS-CoV RT-RAA,RNA [5] cdna,, DNA,cDNA [6] RT-RAA MERS, MERS MERS-CoV

2 46 34 MERS-CoV PBS -80, RT-RAA MERS-CoV MERS-CoV, RNA 10 MERS-CoV,10,100,1000 2μl PCR 1 MERS-CoV P3 GenBank MERS-CoV (Ac- cessionnumberkt )upe (27180 bp~27514bp),orf1b (17700bp~19000 bp) Nseq (28500bp~30000bp), 2 MERS-CoV, H1N1 HKU1 OC43 229E NL638 PCR 2014 ( EcoRI QCMD(QualityControlforMolecularDiagnos- BamHⅠ ), tics) ( ) HIV-1 (pcmv- MCS-CopGFP)( ) GenBank MERS-CoV DNAMan (PLP1,PLP2,VSVG)( MERS- ) 293T (ATCC CRL- CoV (KM ),N ) 48h 72h 1 1 RT-RAA Table1 PrimersandprobesusedfortheRT-RAAassay Name Sequence Length GC Tm Genelocation F1 TAACAATGATTCAGCTATTGTTACACAATTCG % F2 TCCACATTGAGGGGACTGGAGGCAATAGTC % R1 GATCACCTCCTACTGCTCCGATTCCAGATG % R2 GAGTTTCCTGATCTTGAACCTTGTGAACTAGATC % P GAGGCAATAGTCAATCATCTTCAAGAGCC (FAM- dt)(thf)(bhq-dt)agcgtaagcagaaac % : FAM 6- ;THF ;BHQ blackhole Notes:FAM:6-Carboxyfluorescein;THF:tetrahydrofuran;BHQ:blackholequencher PCR MERS-CoV ; H1N1 HKU1 OC43 229E NL63

3 1,. RT-RAA 47 RT-PCR RT-RAA MERS-CoV RT-RAA MERS-CoV RT-PCR ( RT-RAA N ) RT-RAA :M.Marker;1.F1/R1 ; ;3.F2/R1 MERS-CoV ;5.F1/R2 ;7.F2/R2 2014QCMD ( ) Figure1 Agarose-gelelectrophoresisoffour combinationsofprimers Notes:M. Marker;1.F1/R1;2.Negative;3.F2/R1;4. Negative;5.F1/R2:6.Negative;7.F2/R2;8.Negative. HKU1(HCoV-HKU1) OC43(HCoV- 1 OC43) 229E(HCoV-229E) NL63(HCoV-NL63) RT- PCR,Ct 25~29 MERS-CoV, 100nm, /ml PCR / μ L 30.1 / μ L,8 7.4 / μ L (3) 2.730± /ml /ml MERS-CoV, /ml /ml /ml MERS-CoV /ml /ml /ml, 10 /ml6 RT- 1.5% (1) RAA RT-PCR, ( 4) 10 /ml,rt-raa RT-PCR , /ml, RT-RAA 10 RT /ml(e4) 10 3 /ml(e3) 10 2 /ml RAA 13.6min RT-PCR (E2) 10 /ml(e1) 90min (2) F1/R1 5 F2/R1 10 MERS-CoV, F2/R1 F1/R1 F2/R1 (MERS-CoV-China001), ; QCMD 3 ( )(QCMD-M QCMD- H1N1 M QCMD-M201405) (InfluA-H1N1) (InfluB) (5) (RSV) (RV)

4 RT-RAA :A.F1/R1 ;B.F2/R1 ;C.F2/R1 ;D.F2/R2 ;E /ml;e /ml; E /ml;e1.10 Figure2 RT-RAAresultsoffourcombinationsforprimersandprobes Notes:A.F1/R1group;B.F2/R1group:C.F2/R1group:D.F2/R2group;E copies/ml;e copies/ml: E copies/ml:e1.10copies/ml. [9,10] MERS-CoV MERS-CoV MERS-CoV 3 RT-RAA Figure3 SpeficityoftheRT-RAAassay RT-PCR PCR LAMP [11-14] RT-PCR,LAMP LAMP RAA PCR ( RAA ) PCR [7,8],MERS-CoV PCR PCR MERS-CoV, RAA

5 1期 周冬根 等 中东呼吸综合征冠状病毒 RT RAA 快速检测方法的建立及应用 49 性 与 Ahmd Abd 等人 15 建立的方法一致 但本研 究的灵敏度是基于 假 病 毒 颗 粒 其 更 接 近 于 真 实 样 本 而 Ahmd Abd 等人 15 则是采用 RNA 质 粒 特 异性检测只有 MERS CV 假 病 毒 颗 粒 标 准 品 出 现 阳性信号 表明该方法具有良好的特异性 与实时荧 光 RT PCR 检测方法相比 该方法耗时 13 6m n 与 Ahmd Abd 等人 15 建 立 的 方 法 基 本 一 致 且 大 大 快于实时荧光 RT PCR 检 测 方 法 检 测 的 灵 敏 度 高 出本研究小 组 建 立 的 实 时 荧 光 RT PCR 检 测 方 法 灵敏度 1 个数量 级 且 操 作 方 便 污 染 少 本 研 究 建 立的方法已应用于临床样本的检测 而 Ahmd Abd 等人 15 并未 实 际 用 于 临 床 样 本 检 测 本 研 究 建 立 的 RT RAA 检测方 法 较 之 传 统 检 测 方 法 具 有 更 加 安全 可靠 灵 敏 快 速 等 特 点 为 我 国 进 行 MERS CV 的快速诊断提供 了 准 确 可 靠 的 检 测 技 术 也 为 MERS 的预防和流行病学研究奠定了基础 参考文献 1 A A MG A P T M P CS ARb h 图 4 RT RAA 以及荧光 RT PCR 检测灵敏度比较 注 A RT RAA 方 法 B E6 106 拷 贝 ml E5 qrt PCR 方 法 ngd A A bdu fz N A d M A A A Cumm mu h m A Mkhdm H Mdn H A hk m R A 105 拷贝 ml E4 104 拷 贝 ml E3 103 拷 贝 ml E2 102 拷 Twf n M W nsj K m P Zum qja C 贝 ml E1 10 拷贝 ml A I Mm h Z A KSA MERS CV I nv n g F 4 Cmp n f h n v w n h gu yb T m H p u b k f M dd E p y RT RAA ynd mrt PCR nv u J Nw Eng J Md 2013 369 ynd m N A RT RAA m hd B qrt PCR m hd E6 ml E5 ml p 105 p 106 5 407 416 2 B m nghm A Chnd M A B wn C S A n E Tng C Lng h C H h K B wn K G n R Pbdy R G G n HK Bdd ng n N M My L Gp R P N Nwh m W D n C Fuh R A Zmbn M S v p n y nv u np u dbynv n n f d d K ngdm f m h M dd E Sp mb h Un 2012 20290 J Eu Su v 2012 17 40 p 3 Zk A M vn Bh mn S B b T M O 图 5 RT RAA 检测临床样品结果 hua D Fuh R A I n fnv nv F 5 ThRT RAA u f n mp gu uf mmnw hpnumn nsud A b J Nw 一个反应里检测到 不 同 的 目 的 基 因 这 是 其 他 恒 温 核酸扩增技术或巢式 PCR 技术无法实现的 6 15 本研究通过 采 用 MERS CV 假 病 毒 颗 粒 阳 性 标准品为检测对象 建立相应的 RT RAA 核酸检测 方法 设计位点位于 N 基因区域 与 Ahmd Abd 等 Eng J Md 2012 367 19 1814 1820 4 Th W d H h O z n M dd E p gn m nv u MERS CV 2017 A upd yynd www wh m m v b f m h n p gn v n 5 陆柔剑 邹丽容 王延群 赵 彦 杰 周 为 民 武 婕 王 文 玲 人 15 设计位点相似本 研 究 建 立 的 RT RAA 方 法 武桂珍 柯昌文 谭 文 杰 中 国 首 例 输 入 性 中 东 呼 吸 综 检测的灵敏度达 10 个 拷 贝 ml 且 具 有 良 好 的 重 复 合征冠状病毒 结 构 基 因 与 附 属 基 因 的 序 列 分 析 J 病

6 50 34,2015,31(4): [6],. [11],,,,, [J]. :,2010,40(10): [7]AbrougF,Slim A,Ouanes-BesbesL,HadjKacem M A,DachraouiF,OuanesI,Lu X,Tao Y,Paden C, CaidiH,MiaoC,Al-HajriM M,Zorraga M,Ghaouar W,BenSalahA,GerberSI;WorldHealthOrganization GlobalOutbreak Alertand Response Network Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus International InvestigationTeam.Familyclusterof MiddleEastre- spiratorysyndromecoronavirusinfections[j].new Engl JMed,2013,368(26): [8]. [14],,,., [J]., RT-PCR 2014,14(4): [J].,2016,32(3): [9]ChanJF,LauSK,ToK K,Cheng V C,WooPC, rysyndrome[j].the Lancet,2015,386(23): PCR [J].,2014,9(8): [12],,,,,,,,. PCR [J].,2015,10(1):1-5. [13],,,,. [J].,2015,31(3): [15]AbdElWahedA,PatelP,HeidenreichD,HufertFT, YuenK Y.MiddleEastrespiratorysyndromecoronavir- us:anotherzoonoticbetacoronaviruscausingsars-like disease[j].clin MicrobiolRev,2015,28(2): [10]ZumlaA,HuiDS,PerlmanS.MiddleEastrespirato- Weidmann M. Reversetranscriptionrecombinasepol- ymeraseamplificationassayforthedetectionofmiddle Eastrespiratorysyndromecoronavirus[J/OL].PLoS CurrentsOutbreaks,2013,5.

7 1,. RT-RAA 51 DevelopmentandApplicationofaRT-RAAAssaytoDetectMiddleEast RespiratorySyndromeCoronavirus ZHOU Donggen 1,LUOJie 1,CHENJianhua 2,YU Xuejun 1* (1.NingboInternational Travel HealthcareCenter,Ningbo315012,China;2.ComprehensiveServiceCenterfor Technical Measuresto Tradeof Ningbo Entry-exitInspectionand Quarantine Bureau,Ningbo315012,China) Abstract:Wewishedtoestablisharapid,sensitiveandspecificassaytodetecttheMiddleEastRespiratory SyndromeCoronavirus(MERS-CoV)usingareverse-transcriptionrecombinase-aidassay.Severalprimers andprobesweredesignedinaccordingtotheconservedsequenceofmers-cov.rt-raa wasperformed usingoptimizedparametersandpositivernapreparedbyserialtenfolddilutionofvirus-likeparticles.in addition,thespecificityandsensitivityofthert-raaassaywereverified,andclinicalsamplesweretested usingthisassay.thert-raaassaycoulddetectasfewas10copies,andwasmoresensitivethanthereal- timepolymerasechainreaction (PCR)developedbyourresearchteam (100copies).Positivesignalswere observedin MERS-CoVvirus-likeparticles.Nosignalswereobservedwitheightcontrolrespiratorydis- easepathogensandcoronavirusweredetectedusingthert-raaassay,anditsdetectiontime(4.8~13.6 min)wasfarfasterthanthatofreal-timepcr(90min).theresultofusingthert-raaassayonclinical sampleswasconsistentwiththeactualresult.insummary,wedevelopedart-raaassaywas.thatwas highlysensitive,specificandrapid,thisrt-raaassaylaysthefoundationforonsitediagnosisandthe epidemiologicstudyofmers-covinfection. Keywords:MiddleEastRespiratorySyndromeCoronavirus(MERS-CoV);RT-RAA;Virus-likeparticle; On-site Funding:Thepresent work wassupportedbythe National Key R&D Program of China(2016YFF : Researchonidentificationand traceabilitytechnologyofimported fungiand bacteria with high frequency );thezhejiang Provincial NaturalScience Foundation (LY16H260004: Fundamentalresearchon detectionof pathogenicbacteriaby RPA method );thescientific Research Program of AQSIQ (2016IK176: Researchonkeytechnology and portabledevicesforfieldrapid detectionof new emerginginfectiousdiseases ). *Corresponding author:yu

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