8 华南农业大学学报第 38 卷 Key words: glutathione; Oreochromis niloticus O. aureus; primary hepatocyte; proliferation; biochemical function 谷胱甘肽 (Glutathione,GS

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明罗
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华南农业大学学报 2017, 38(5): 7-12 Journal of South China Agricultural University doi: 10.7671/j.issn.1001-411X.2017.05.002 陈标, 焦彩红, 朱选, 等. 谷胱甘肽对奥尼罗非鱼原代肝细胞增殖及生化功能的影响 [J]. 华南农业大学学报, 2017, 38(5): 7-12.

1 华南农业大学学报 2017, 38(5): 7-12 Journal of South China Agricultural University doi: /j.issn X 陈标, 焦彩红, 朱选, 等. 谷胱甘肽对奥尼罗非鱼原代肝细胞增殖及生化功能的影响 [J]. 华南农业大学学报, 2017, 38(5): 谷胱甘肽对奥尼罗非鱼原代肝细胞增殖及生化功能的影响陈标 1, 焦彩红 1, 朱选 2, 潘庆 (1 华南农业大学海洋学院, 广东广州 ; 2 海大集团, 广东广州 ) 摘要 : 目的研究谷胱甘肽 (Glutathione, GSH) 对奥尼罗非鱼 Oreochromis niloticus O. aureus 原代肝细胞增殖和生化功能的影响, 探究谷胱甘肽的促生长作用机制方法用添加 φ 为 10% 胎牛血清和未添加血清的培养液培养奥尼罗非鱼原代肝细胞 48 h, 随后在培养液中分别加 GSH 至 mg L 1, 每个水平设 6 个重复, 培养和 72 h 后测定奥尼罗非鱼原代肝细胞增殖情况及培养液中胰岛素样生长因子白蛋白过氧化氢含量和谷草转氨酶 γ 谷氨酰转肽酶活性结果谷胱甘肽显著促进了奥尼罗非鱼原代肝细胞增殖, 提高了培养液上清中胰岛素样生长因子白蛋白的含量和 γ 谷氨酰转肽酶活性, 降低了培养液上清中过氧化氢含量和谷草转氨酶活性 (P<0.05) 在无血清培养试验组中添加谷胱甘肽, 对奥尼罗非鱼原代肝细胞增殖及生化指标的影响比添加血清培养试验组效果明显结论谷胱甘肽能促进奥尼罗非鱼肝细胞增殖, 且具有保护肝脏的作用 1 关键词 : 谷胱甘肽 ; 奥尼罗非鱼 ; 原代肝细胞 ; 增殖 ; 生化功能中图分类号 : S 文献标识码 : A 文章编号 : X(2017) Effects of glutathione on proliferation and biochemical function of primary hepatocyte in hybrid tilapia (Oreochromis niloticus O. aureus) CHEN Biao 1, JIAO Caihong 1, ZHU Xuan 2, PAN Qing 1 (1 College of Marine Sciences, South China Agricultural University, Guangzhou , China; 2 Haid Group, Guangzhou , China) Abstract: Objective To investigate the effects of glutathione (GSH) on proliferation and biochemical function of primary hepatocyte in hybrid tilapia (Oreochromis niloticus O. aureus). Method Tilapia primary hepatocytes were cultured in cell culture medium with 0 or 10% fetal calf serum for 48 h. GSH was then added into the two kinds of cell culture medium to the final concentration of 0, 30, 100, 300 or 900 mg L 1 respectively. Each concentration group had six replicates. The proliferation status of the primary hepatocyte, contents of insulin-like growth factor 1 (IGF-, albumin and H 2 O 2, as well as glutamate-oxaloacetate transaminase (GOT) and γ-glutamyl transpeptidase (γ-gt) activities of tilapia were detected after cultured for 24, 48 and 72 h, respectively. Result GSH significantly increased the proliferation of primary hepatocyte,the contents of IGF-1 and albumin,and γ-gt activity in supernatant,while reduced H 2 O 2 content and GOT activity(p<0.05). Such effects of GSH were more evident in the group without fetal calf serum compared to the group with 10% fetal calf serum. Conclusion GSH could enhance the proliferation of primary hepatocyte and has the function of protecting liver in hybrid tilapia. 收稿日期 : 优先出版时间 : 优先出版网址 : 作者简介 : 陈标 (1987 ), 男, 博士研究生, chenbiao11@mails.ucas.ac.cn; 通信作者 : 潘庆 (1969 ), 女, 教授, 博士, qpan@scau.edu.cn 基金项目 : 广东省科技厅研发与产业化项目 (2013B ); 广州市科技计划项目 (2014YZ-00208)

2 8 华南农业大学学报第 38 卷 Key words: glutathione; Oreochromis niloticus O. aureus; primary hepatocyte; proliferation; biochemical function 谷胱甘肽 (Glutathione,GSH) 主要是在肝脏以谷 [1] 氨酸半胱氨酸和甘氨酸为底物合成, 广泛分布于所有生物细胞中, 其中, 动物的肝脏肾脏含量较为 [2] 丰富 GSH 具有保护机体酶蛋白巯基不被氧化, 促进自由基清除, 减少自由基对细胞损伤, 调节机 [3] 体免疫机能等作用 GSH 作为药物已广泛应用于 [4] 人类医疗, 作为功能性食品添加剂及营养强化剂 [5] 用于食品生产有研究表明, 在草鱼饲料中添加 GSH 能够增 [6] 强生长激素活性, 促进草鱼生长在凡纳滨对虾饲料中添加 GSH 能够提高对虾成活率和饲料转化 [7] 率在吉富罗非鱼饲料中添加 GSH 能够促进生长 [8] 激素的分泌蛋白质合成和细胞增殖, 提高生长性 [9] 能和免疫相关酶活性在奥尼罗非鱼 Oreochromis niloticus O. aureus 饲料中添加 GSH 能促进幼鱼生长, 提高饲料利用率, 促进 IGF-I 和 T3 分泌, 提高机 [10] 体抗氧化能力目前, 鲜见在细胞水平上探讨谷胱甘肽的作用及其机理, 通过细胞水平的研究, 将从不同层面和水平揭示 GSH 作用机理因此, 本试验通过奥尼罗非鱼肝脏原代细胞培养, 研究 GSH 对细胞增殖的影响, 初步揭示 GSH 的促生长作用机理, 为 GSH 在水产动物饲料中应用提供理论基础 1 材料与方法 1.1 试验鱼和主要试剂奥尼罗非鱼购自广州白云区鱼苗厂, 体质量约为 30 g, 鱼体消毒后在水族箱中暂养 3 周, 备细胞培养用, 暂养期间投喂不添加 GSH 的纯化饲料, 饲料配方的质量分数为 : 干酪素 35% 马铃薯淀粉 45% 玉米油 5% 微晶纤维素 5% 羧甲基纤维素钠 2% 矿物质预混物 5% 维生素预混物 3% 谷胱甘肽购自 AMRESCO 公司 (φ 99%) DMEM/F12 培养液和 II 型胶原酶干粉购自 GIBCO 公司 1.2 肝细胞原代培养罗非鱼用 φ 为 0.01% 的高锰酸钾溶液消毒 0.5 h 取出毁髓,φ 为 70% 的酒精消毒鱼体后移入超净工作台用已消毒好的手术剪剪开罗非鱼一侧腹腔, 小心取出肝脏, 用预冷的 DMEM/F12 培养液清洗 3 次, 将肝组织剪成约 1 mm 3 左右的组织块, 清洗 3 次后转入含有 φ 为 0.05% 胶原酶的培养瓶中,26 水浴中消化 10 min, 充分吹打,200 目滤网过滤去除碎块,1 500 r min 1 冷冻离心 2 min, 收集肝细胞, 再以 900 r min 1 冷冻离心 2 min 以去除混杂在肝细胞中的杂细胞细胞以 DMEM/F12 培养液重悬后, 计数细胞密度, 使其达到个 ml 1, 随后接种于多个 24 孔细胞培养板 ( 美国 Corning), 在 φ(co 2 ) 为 5% 的 26 培养箱中培养 1.3 GSH 处理肝细胞培养 48 h 后, 吸出培养液并用 Hank 氏液清洗, 分别加入含有 φ 为 10% 胎牛血清和不含胎牛血清的 DMEM/F12 培养液, 在 2 种培养液中加入 GSH, 使其终质量浓度为和 900 mg L 1, 不加入 GSH 组为对照组, 每个水平设 6 个重复在培养和 72 h 后, 分别测定肝细胞的增殖情况, 随后以 r min 1 离心 5 min, 取培养液上清, 分装于 0.5 ml 的离心管中, 保存于 20 冰箱中以备分析 1.4 测定方法 [11] 肝细胞的增殖采用 MTT 法测定, 测得的光密度 (D 490 nm ) 与活细胞的数目具有良好的相关性 ; IGF-1 的测定采用放射免疫测定法, 样品的前处理采用酸醇提取法 [12], 具体操作参照测定试剂盒 ( 天津九鼎医学生物工程公司 ) 说明书进行由于测定试剂盒为人医研制, 硬骨鱼类的和人类的 IGF-1 氨基酸序列有近 80% 的相似性 [13], 因此, 经逐级稀释罗非鱼血清样品后测定 IGF-1 含量, 得出血清浓度与样品 IGF-1 含量的回归方程为 :y=0.122x , R 2 = , 确定该试剂盒可用于测定罗非鱼样品 IGF-1 的含量上清液中白蛋白含量测定采用溴甲酚绿比色法, 谷草转氨酶 (Glutamate-oxaloacetate transaminase,got) 活性测定采用赖氏法,γ 谷氨酰转肽酶 (γ-glutamyl transpeptidase,γ-gt) 和过氧化氢含量均采用试剂盒测定 ( 南京建成生物工程研究所 ) 谷草转氨酶和 γ 谷氨酰转肽酶活性用 U 表示, 其代表 1 分钟内转化 1 μmol 底物所需的酶量 1.5 数据统计分析采用 SPSS20.0 统计软件对数据进行统计和方差分析数据采用平均数 ± 标准误表示, 组间数据经方差分析后有显著差异再做 Duncan s 多重比较 2 结果与分析 2.1 罗非鱼肝细胞的形态无血清培养条件下, 培养 24 和 48 h 后经 GSH 处理的肝细胞生长情况比未经 GSH 处理的细胞折光性好, 但各处理组间肝细胞形态没有明显差别在 72 h 后添加 900 mg L 1 GSH 的肝细胞生长状况最好, 未见细胞连成网状及从培养板底部脱落的现象, 而此时对照组有大量细胞从培养板底部脱落

3 第 5 期陈标, 等 : 谷胱甘肽对奥尼罗非鱼原代肝细胞增殖及生化功能的影响 9 添加血清培养条件下, 肝细胞在各时间段生长情况良好, 组间形态差别不明显 2.2 罗非鱼肝细胞的增殖如表 1 所示, 无血清培养条件下, 在培养和 72 h 后, 经 GSH 处理的肝细胞增殖均显著高于对照组 (P<0.05); 在 72 h 后, 随着 GSH 的加入量增加,D 490 nm 显著增加, 且各处理组间均有显著差异添加血清培养条件下, 在 24 h 后添加 mg L 1 GSH 组肝细胞增殖显著高于其他各组, 在 48 h 后添加 300 mg L 1 GSH 组肝细胞增殖显著高于其他各组, 在 72 h 后添加 mg L 1 GSH 组肝细胞增殖显著高于对照组表 1 不同培养时间罗非鱼肝细胞培养液的光密度 (D 490 nm ) Tab. 1 D 490 nm value of tilapia hepatocyte culture after culturing for different time 无血清 0( 对照 ) 0.032±0.001a 0.048±0.002a 0.025±0.001a ±0.001b 0.079±0.002bc 0.032±0.002b ±0.003b 0.083±0.003c 0.041±0.001c ±0.001b 0.084±0.005c 0.052±0.003d ±0.005b 0.070±0.004b 0.062±0.002e 有血清 0( 对照 ) 0.040±0.004a 0.077±0.001a 0.079±0.002a ±0.004a 0.079±0.001a 0.082±0.002ab ±0.004a 0.080±0.001a 0.084±0.002ab ±0.007b 0.085±0.001b 0.088±0.001b ±0.006b 0.078±0.001a 0.087±0.002b 相同培养条件同列数据后凡具有一个相同小写字母者, 表示差异不显著 (P>0.05,Duncan s 法 ) 2.3 肝细胞培养液中 H 2 O 2 含量如表 2 所示, 无血清培养条件下, 在培养和 72 h 后经 GSH 处理的肝细胞培养液中 H 2 O 2 含量显著低于对照组添加血清培养条件下, 在 24 h 后添加和 900 mg L 1 GSH 组中 H 2 O 2 含量显著低于对照组, 在 48 和 72 h 后, 各处理组肝细胞培养液中 H 2 O 2 含量无显著差异 (P>0.05) 表 2 不同培养时间肝细胞培养液中 H 2 O 2 的含量 Tab. 2 H 2 O 2 content in hepatocyte culture after culturing for different time mmol ml 1 无血清 0( 对照 ) 12.00±0.00c 11.83±0.17c 14.00±1.12b ±0.33b 11.17±0.30b 11.33±0.33a ±0.22b 10.67±0.21ab 10.33±0.21a ±0.33ab 10.50±0.22ab 10.17±0.17a ±0.21a 10.33±0.21a 11.17±0.17a 有血清 0( 对照 ) 13.00±0.52b 12.00±0.36a 12.33±0.88a ±0.17ab 11.83±0.17a 12.00±0.58a ±0.21a 11.17±0.31a 11.33±0.33a ±0.67a 11.17±0.48a 11.33±0.33a ±0.43a 11.17±0.31a 10.67±0.33a 2.4 肝细胞培养液中 IGF-1 含量如表 3 所示, 无血清培养条件下, 在培养 24 h 后添加 100 和 300 mg L 1 GSH 组中 IGF-1 含量显著高于对照组, 在 48 h 后添加 300 mg L 1 GSH 组中 IGF-1 含量显著高于各处理组, 在 72 h 后添加 900 mg L 1 GSH 组中 IGF-1 含量显著高于对照组

4 10 华南农业大学学报第 38 卷添加血清培养条件下, 在 24 h 后添加和 900 mg L 1 GSH 组中 IGF-1 含量显著高于对照组, 在 48 和 72 h 后添加 mg L 1 GSH 组中 IGF-1 含量均显著高于对照组随着培养时间延续, 各处理组培养液中 IGF-1 含量呈现升高的趋势表 3 不同培养时间肝细胞培养液中 IGF-1 含量 Tab. 3 IGF-1 content in hepatocyte culture after culturing for different time ng ml 1 无血清 0( 对照 ) 41.00±3.17a 40.86±1.96a 39.76±2.19a ±2.95ab 43.65±2.65a 41.40±0.59ab ±2.06bc 45.74±1.75a 42.70±3.14ab ±1.55c 56.59±3.16b 44.58±0.97ab ±1.79abc 44.32±0.98a 47.97±3.41b 有血清 0( 对照 ) 41.57±3.16a 51.49±1.99a 56.44±1.31a ±2.78ab 53.87±1.44ab 61.25±6.73ab ±2.12bc 55.56±1.48abc 62.78±1.74ab ±4.65c 63.02±5.03c 73.40±3.35b ±4.96c 60.28±1.68bc 72.42±3.67b 2.5 肝细胞培养液中白蛋白的含量如表 4 所示, 无血清培养条件下, 在培养 24 h 后经 GSH 处理的各处理组间白蛋白含量无显著差异, 在 48 h 后 300 mg L 1 组中白蛋白含量显著高于对照组, 在 72 h 后添加 300 和 900 mg L 1 GSH 组中白蛋白含量显著高于其他各组添加血清培养条件下, 在 24 和 72 h 后经 GSH 处理的各组间白蛋白含量无显著差异, 在 48 h 后添加 100 和 300 mg L 1 GSH 组中白蛋白含量显著高于其他各组添加血清培养肝细胞培养液中白蛋白的含量明显高于无添加血清培养肝细胞培养液中白蛋白的含量表 4 不同培养时间肝细胞培养液中白蛋白含量 Tab. 4 Albumin content in hepatocyte culture after culturing for different time mg ml 1 无血清 0( 对照 ) 0.155±0.022a 0.298±0.022a 0.171±0.017a ±0.021a 0.325±0.027ab 0.172±0.011a ±0.020a 0.350±0.041ab 0.177±0.018a ±0.022a 0.368±0.061b 0.239±0.021b ±0.013a 0.315±0.050ab 0.273±0.043c 有血清 0( 对照 ) 4.10±0.18a 6.74±0.62a 6.35±0.52a ±0.74a 6.95±0.82a 7.46±0.54a ±0.96a 8.42±0.45b 7.60±1.30a ±1.13a 8.07±0.71b 7.49±0.54a ±0.63a 6.76±1.28a 7.32±0.67a 2.6 肝细胞培养液中 γ-gt 活性如表 5 所示, 无血清培养条件下, 在培养 24 和 48 h 后添加和 900 mg L 1 GSH 组中 γ-gt 活性显著高于对照组和添加 30 mg L 1 GSH 组, 在 72 h 后添加 300 和 900 mg L 1 GSH 组中 γ-gt 活性显著高于对照组添加血清培养条件下, 在 48 h 后添加 300 mg L 1 GSH 组中 γ-gt 活性显著高于对照组

5 第 5 期陈标, 等 : 谷胱甘肽对奥尼罗非鱼原代肝细胞增殖及生化功能的影响 11 表 5 不同培养时间肝细胞培养液中 γ-gt 的活性 Tab. 5 γ-gt activity in hepatocyte culture after culturing for different time U ml 1 无血清 0( 对照 ) 51.17±0.40a 52.00±0.52a 50.33±1.02a ±0.99ab 53.00±0.52a 52.50±1.02ab ±1.37b 56.50±0.50b 52.83±0.40ab ±0.92c 57.33±1.11b 53.83±1.42b ±1.11c 57.50±0.92b 54.50±0.62b 有血清 0( 对照 ) 56.67±0.61a 53.83±1.42a 54.67±0.33a ±0.95a 56.67±1.12ab 54.67±0.33a ±0.88a 56.67±1.38ab 55.33±0.88a ±0.68a 57.83±0.60b 56.67±1.67a ±1.43a 57.00±0.45ab 57.00±1.54a 2.7 肝细胞培养液中 GOT 活性如表 6 所示, 无血清和添加血清培养条件下, 经 GSH 处理的试验组各阶段 GOT 活性均随 GSH 增加而下降表 6 不同培养时间肝细胞培养液中 GOT 的活性 Tab. 6 GOT activity in hepatocyte culture after culturing for different time U ml 1 无血清 0( 对照 ) 13.17±0.55c 11.87±0.93c 11.00±0.63c ±0.52b 9.26±0.66b 9.97±0.40bc ±0.58b 8.92±0.80b 8.92±0.69ab ±0.57b 8.27±0.71b 8.61±0.41ab ±0.52a 4.64±0.39a 7.12±0.74a 有血清 0( 对照 ) 19.61±0.88c 15.08±0.60b 13.20±0.85b ±1.31c 14.94±0.83ab 12.69±1.18b ±0.76bc 13.86±0.86ab 11.70±1.28b ±0.62ab 13.46±0.77ab 10.27±1.39ab ±1.43a 12.54±0.78a 7.343±0.48a 3 讨论与结论 3.1 GSH 对体外培养罗非鱼肝细胞增殖的影响 GSH 具有促进有丝分裂和调控细胞增殖的作 [14] 用, 并可以清除细胞内过多的 H 2 O 2, 调控自由基 [15-17] 水平, 间接影响 DNA 合成有研究表明, 上皮纤维细胞 (GM0868) 培养液中加入 GSH 合成抑制剂能够降低上皮纤维细胞增殖, 而加入 GSH 的前体物 ( 氧化四氢噻唑羧基盐 ) 能降低细胞自由基水平, [15] 促进上皮纤维细胞增殖本试验中, 为排除血清中所含 GSH 的干扰, 设置添加血清和未添加血清试验组, 分析结果显示 GSH 均能促进罗非鱼肝细胞在体外增殖 GSH 处理 72 h 后, 无血清培养的细胞出现死亡现象, 而此时添加 900 mg L 1 GSH 组的细胞数目最多,H 2 O 2 含量在 GSH 处理组亦显著低于对照组, 说明 GSH 本身可以被吸收利用, 促进细胞增殖, 且可以降低 H 2 O 2 含量 [18] 因此, 本试验结果用罗非鱼肝细胞印证了 GSH 的作用和作用机理 3.2 GSH 对体外培养罗非鱼肝细胞生化功能的影响肝脏具有合成和分泌 IGF-1 的功能 [19] 本试验中, 在添加血清和未添加血清试验组中 GSH 均能显著促进 IGF-1 分泌, 且 IGF-1 分泌与肝细胞增殖表现出一致性其中, 添加血清培养时细胞的增殖和 IGF-1 的分泌明显高于无血清培养时, 说明肝细 [20] 胞在营养充足的情况下具有较高的 IGF-1 分泌能力和增殖能力

6 12 华南农业大学学报第 38 卷白蛋白由肝脏合成, 作为脂肪酸运输载体, 是反应肝功能的主要指标之一本试验中未添加血清培养肝细胞时, 肝细胞具有合成分泌白蛋白的能力, 且随着培养时间延长, 较高剂量的 GSH 处理能促进白蛋白的分泌在添加血清培养肝细胞时, 分泌的白蛋白的量仍远远高于无血清培养时, 说明在无血清培养时, 肝细胞合成分泌白蛋白的功能有所下降 GSH 的 γ 谷氨酰基可作为氨基酸转运的载体, 参与小肠吸收的氨基酸从微绒毛细胞膜外转运到细胞内, 此过程在 γ 谷氨酰基转移酶 (γ-gt) 催化下完成 [21] 本研究表明, 无血清培养时, 随着 GSH 处理剂量增大, 培养液中 γ-gt 活性显著升高, 说明 GSH 可增加肝细胞中 γ 谷氨酰基水平, 提高细胞膜基质上的 γ-gt 的活性, 促进氨基酸的吸收添加血清培养时,γ-GT 的活性随着 GSH 处理剂量的增加有升高的趋势, 仅 GSH 处理 48 h 后 300 mg L 1 组 γ-gt 活性显著升高, 说明在营养充足时 GSH 提高 γ-gt 活性的作用没有营养相对不足时强 3.3 GSH 对体外培养罗非鱼肝细胞的保护作用转氨酶主要存在于细胞内, 在氨基酸代谢及蛋白质脂肪糖三者代谢转化过程中占有重要地位, 当组织病变引起细胞膜的通透性增加, 或细胞受到损伤时, 细胞内的转氨酶才会大量释放出来研究表明 GSH 具有保护肝脏的作用, 在肝脏受到损伤后, 可加快肝组织的恢复 [22] 本试验中, 无论是否有血清添加, 罗非鱼肝细胞培养液中 GOT 活性均随 GSH 处理剂量的增加而下降, 表明 GSH 对肝细胞有一定的保护作用, 能防止肝细胞膜通透性增加, 从而减少 GOT 释放到培养液中综上所述, 本文从细胞水平揭示,GSH 能够促进奥尼罗非鱼原代肝细胞分泌 IGF-1 和白蛋白, 提高 γ-gt 活性, 降低 H 2 O 2 含量和 GOT 活性, 促进肝细胞增殖与生长, 进一步地验证了 GSH 调控奥尼罗非鱼生长代谢的理论数据, 为 GSH 在奥尼罗非鱼饲料的生产提供了技术支持参考文献 : [1] [2] [3] [4] 郑希帆. 谷胱甘肽的合成及其检测技术研究 [D]. 南昌 : 南昌大学, 代涛. 谷胱甘肽的合成及其活性的初步评价 [D]. 承德 : 承德医学院, 贾贞, 王丹, 游松. 谷胱甘肽的研究进展 [J]. 沈阳药科大学学报, 2009, 3(26): 时兆燕, 汪伟民, 邓松华. 还原型谷胱甘肽联合腺苷 [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] 蛋氨酸治疗化疗药物性肝损害的临床疗效 [J]. 安徽医科大学学报, 2014, 49(: 周宇光, 付国平, 肖仔君. 谷胱甘肽的生产和应用研究进展 [J]. 食品工业科技, 2003, 24(3): 赵红霞, 谭永刚, 周萌, 等. 饲料中添加谷胱甘肽对草鱼生长生理指标和抗病力的影响 [J]. 中国水产科学, 2007, 14(4): 刘晓华, 曹俊明, 吴建开, 等. 饲料中添加谷胱甘肽对凡纳滨对虾生长及组织生化组成的影响 [J]. 水生生物学报, 2008, 32(3): 周婷婷. 谷胱甘肽对吉富罗非鱼生长性能和抗氧化功能的影响 [D]. 武汉 : 华中农业大学, 周婷婷, 曹俊明, 黄燕华, 等. 饲料中添加谷胱甘肽对吉富罗非鱼生长组织生化指标和非特异性免疫相关酶的影响 [J]. 水产学报, 2013, 37(5): 焦彩虹, 潘庆, 汪小东, 等. 谷胱甘肽对罗非鱼生长性能及激素分泌的影响 [C]// 熊思岳. 第五届世界华人鱼虾营养学术研讨会论文集. 广州 : 中山大学, 2004: 程宝鸾. 动物细胞培养技术 [M]. 广州 : 华南理工大学出版社, 2000: PIERCE A L, BECKMAN B R, SHEARER K D, et al. Effects of ration on somatotropic hormones and growth in coho salmon[j]. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol, 2001, 128(2): 华益民, 林浩然. 鱼类胰岛素样生长因子 -Ⅰ 的研究进展 [J]. 水产学报, 1997, 21(3): 陈斌斌, 杨修亮, 杭宝建, 等. 谷胱甘肽双功能合成酶的克隆表达酶学性质及其应用的研究 [J]. 药物生物技术, 2015, 22(5): 朱帆. 哈氏弧菌谷胱甘肽抗氧化系统与耐药的相关性研究 [D]. 湛江 : 广东海洋大学, 唐亮. 3 条谷胱甘肽生物合成途径在酿酒酵母中组合表达的研究 [D]. 北京 : 北京协和医学院, 阮海宁. 生物转化法生产谷胱甘肽的工艺研究 [D]. 杭州 : 浙江大学, SUN Y, OBERLEY L W. Redox regulation of transcriptional activators[j]. Free Radic Biol Med, 1996, 21(3): STEPHENSEN E, STURVE J, FORLIN L. Effects of redox cycling compounds on glutathione content and activity of glutathione-related enzymes in rainbow trout liver[j]. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol, 2002, 133(3): PÉREZ-SÁNCHEZ J, LE BAIL, P Y. Growth hormone axis as marker of nutritional status and growth performance in fish[j]. Aquaculture, 1999, 177(: MEISTER A. Glutathione metabolism[j]. Meth Enzymol, 1995, 251: 3-7. 周建生. 谷胱甘肽硫转移酶 M1(GSTM 在原发性肝细胞癌中的作用及机制研究 [D]. 上海 : 第二军医大学, 责任编辑庄延

第期黄雪莲等响应面优化绿色木霉菌培养基材料与方法菌种仪器与试剂菌种的活化单因素试验响应面优化试验优化工艺的验证数据处理结果与分析

第期黄雪莲等响应面优化绿色木霉菌培养基材料与方法菌种仪器与试剂菌种的活化单因素试验响应面优化试验优化工艺的验证数据处理结果与分析第卷第期年月食品与生物技术学报响应面优化绿色木霉菌培养基黄雪莲于新仲恺农业工程学院轻工食品学院广东广州利用响应面分析法对绿色木霉菌的培养基进行优化通过测量不同营养条件下绿色木霉菌落生长直径研究其生物学特性在单因素实验的基础上选定葡萄糖添加量丙氨酸添加量和磷酸二氢钾添加量个因素进行中心组合实验建立二次回归方程并应用响应面分析法进行优化结果表明绿色木霉菌最佳培养基为葡萄糖