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穴邦巫
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1 第 31 卷第 1 期 2012 年 2 月华中农业大学学报 JournalofHuazhongAgriculturalUniversity Vol.31 No.1 Feb.2012,82~87 奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼几种谷胱甘肽 S- 转移酶基因克隆与分析瞿春梅梁旭方沈丹何珊白小丽华中农业大学水产学院, 武汉摘要通过 RT-PCR 法和 RACE 法, 分别从奥利亚罗非鱼 (Oreochromiscoaureus) 肝脏获得 alpha rho1 rho2 型 GST (GSTA GSTR1 GSTR2) 基因 cdna 全序列, 从尼罗罗非鱼 (Oreochromisnilotica) 肝脏获得 GSTR1 GSTR2 基因 cdna 全序列结果表明 : 奥利亚罗非鱼 GSTA 基因 cdna 全序列为 933bp,5 非翻译区 (5 -UTR) 为 98bp,3 非翻译区 (3 -UTR) 为 166bp, 开放阅读框 (ORF) 为 669bp, 编码 222 个氨基酸奥利亚尼罗罗非鱼 GSTR1 基因 ORF 均为 681bp 均编码 226 个氨基酸 ; 奥利亚尼罗罗非鱼 GSTR2 基因 ORF 均为 693bp, 均编码 230 个氨基酸氨基酸序列同源性比较和系统进化分析均表明, 罗非鱼 GST 基因与鱼类 GST 同源性较高, 与哺乳类鸟类两栖类 GST 同源性较低关键词谷胱甘肽 S- 转移酶 ; 基因克隆 ; 序列分析 ; 奥利亚罗非鱼 ; 尼罗罗非鱼中图分类号 Q 文献标识码 A 文章编号 (2012) 微囊藻毒素 (microcystins,mcs) 是蓝藻的一些属产生的单环七肽, 在发生水华的水体中普遍存在 [1] 该毒素已经确定了多种异构体, 最常见的为 MC-LR MC-RR MC-YR 三种 [2], 其中 MC-LR 因其高急性毒性, 强促癌活性而受到广泛的关注水体中含一定浓度的 MCs 可导致鱼卵变形鱼类行为和生长异常及死亡 [3-4], 对人类健康也构成严重威胁 [5-6] 肝脏是微囊藻毒素去毒与致毒的靶器官 [7] 有研究表明, 谷胱甘肽 S- 转移酶 (glutathione S-transferase,GST) 能催化微囊藻毒素等毒性物质与还原型谷胱甘肽 (GSH) 的巯基结合, 使亲电的疏 cdna 第一链的合成使用 ToYoBoReverTraAce- 水化合物变成亲水物质, 易于经排泄系统排出体外, α- TM 试剂盒, 分别以奥利亚罗非鱼尼罗罗非鱼总减少其毒性, 在微囊藻毒素去毒过程中发挥重要作 [8] [9] [10] 用而在大口黑鲈草鱼等淡水鱼类中, alpha 型 GST(GSTA) 和 rho 型 GST(GSTR) 蛋白是鱼类肝脏 GST 蛋白的主要类型因此, 笔者对奥利亚罗非鱼 (Oreochromiscoaureus) 尼罗罗非鱼 (Oreochromisnilotica) 不同型 GSTA GSTR 基因 cdna 全序列进行克隆, 旨在为进一步比较研究不同品种罗非鱼微囊藻毒素去毒能力的关系及从分子水平揭示不同品种罗非鱼肝脏不同型 GST 基因的表达水平与表达调控机制提供基础资料 1 材料与方法试验用奥利亚罗非鱼尼罗罗非鱼均由广东罗非鱼良种场提供 1.1 总 RNA 提取和 cdna 第一链的合成分别从奥利亚罗非鱼尼罗罗非鱼分离肝脏组织, 总 RNA 的提取与纯化按 Promega 公司的 SV TotalRNAIsolationSystem 试剂盒推荐方法进行 RNA 为模板,oligo (dt) 20 为反转录引物, 操作按试剂盒推荐方法进行 -80 保存备用 1.2 cdna 核心序列的克隆根据已发表的脊椎动物 alpha 型 rho 型 GST 氨基酸序列的保守区域设计 2 对简并引物以上述 cdna 为模板, 用 GSTA01F 与 GSTA02R 和 GSTR01F 与 GSTR02R 引物扩增奥利亚罗非鱼 GSTA 和 GSTR 基因 cdna 核心片段 ; 用收稿日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金项目 ( ) 广东省科技计划项目 (2007B ) 瞿春梅, 硕士研究生. 研究方向 : 鱼类功能基因 @qq.com 通讯作者 : 梁旭方, 博士, 教授. 研究方向 : 鱼类摄食与代谢机制及应用技术. xufang_liang@yahoo.com

2 第 1 期瞿春梅等 : 奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼几种谷胱甘肽 S- 转移酶基因克隆与分析 83 GSTR01F 与 GSTR02R 引物扩增尼罗罗非鱼 GSTR ( 表 1) PCR 扩增条件均为 :94 预变性 3min;94 1min,40 1min,72 1 min, 共 30 个循环 ;72 延伸 5min 表 1 奥利亚罗非鱼尼罗罗非鱼 GST 基因 PCR 引物 Table1 PCRprimersequencesforcloningofblue 引物 Primer 核心序列 cdna GSTA01F GSTA02R GSTR01F GSTR02R 5 RACE AOGSTA5 01R AOGSTA5 02R GSTR15 01R GSTR15 02R GSTR25 01R GSTR25 02R 3 RACE AOGSTA3 01F AOGSTA3 02F GSTR13 01F GSTR13 02F GSTR23 01F GSTR23 02F 末端 cdna 扩增 tilapiaandniletilapiagstsgene 引物序列 (5 3 )Primersequence 5 -ATCCTGAACTACATCGCAGG(A/G)AA (G/A)TA(T/C)-3 5 -TGGAGGTTTCCTAGCGCTGCC (A/T/ C)GG(T/C)TG-3 5 -TGGAGGGTGATGATCGCGCTGGA (A/ G)GA(A/G)AA(A/G)-3 5 -CGTGTCTGGACCCTCAGG(T/G)TT(T/ C)TCCA(A/G)CCA-3 5 -CCACCAAAGGGACCTGTTG-3 5 -CCGAGTTGTCAGAAGCAC-3 5 -TGAATGTTGGAAGCTGTC-3 5 -CTTCTTTGGACTTGTGCTC-3 5 -TGATGACATTGTCTCCATG-3 5 -CTTGTTGGGACTTGTGTT-3 5 -CTTGCTGATGTGCTGCTTG-3 5 -CAGGGCAGGATGACACAA-3 5 -TCAGGCTCTCATGTGGCAG-3 5 -GGAGAGTATCACAATCTGC-3 5 -CCAACAGTTGGCACTCTCTT-3 5 -GGAGAGTATCACAATCTGC-3 根据获得的奥利亚罗非鱼肝脏 GSTA 基因 cd- NA 核心序列和 2 种罗非鱼 GSTR 基因 cdna 核心序列, 设计 6 条特异引物 (AOGSTA5 01R 和 AOGSTA5 02R GSTR15 01R 和 GSTR15 02R PCR 产物经 2% 琼脂糖凝胶电泳纯化,H.Q. GSTR25 01R 和 GSTR25 02R) 用于 5 RACE &Q.GelExtractionKit I(Uḡene) 回收后克隆至 ( 表 1) 5 RACE 的操作按 SMART RACEcDNA pmd 19-T 载体 (TaKaRa), 转化感受态 E.coli 扩增试剂盒 (Clontech,USA) 推荐方法进行, 取 1μL DH5α, 利用 M13 正反向引物, 通过 PCR 筛选阳性总 RNA( 约 1μg), 以试剂盒提供的 5 -RACECDS 克隆, 阳性克隆菌液由上海英骏生物技术公司 ABI PrimerA,SMARTⅡ TM A Oligonucleotide 为引物, 3730 测序仪进行测序将所获得的 5 3 末端片段合成 cdna 第一链后, 用 TE Bufer 稀释 10 倍备与核心片段进行序列拼接, 得到罗非鱼 GSTs 基因用首次 PCR 反应体系为 :10 倍稀释产物 2.5μL cdna 全序列 10 PCR bufer5 μl dntp ( 各 10 mmol/l) PCR 反应条件为 :94 预变性 3 min;94 1 min, 62 1 min,72 1 min,25 个循环 ;72 延伸 5min 取首次扩增产物 1μL, 用试剂盒提供的 Nested Universal Primer (NUP ) 引物以 AOGSTA5 02R GSTR15 02R GSTR25 02R 引物进行 2 次 PCR 扩增, 反应条件为 :94 预变性 3min,94 1min,57 1min,72 1min, 共 30 个循环, 最后 72 延伸 5 min 获得奥利亚罗非鱼肝脏 GSTA 基因和 2 种罗非鱼 GSTR1 GSTR2 cdna 序列的 5 末端末端 cdna 扩增根据获得的奥利亚罗非鱼肝脏 GSTA 基因 cd- NA 核心序列和 2 种罗非鱼 GSTR 基因 cdna 核心序列, 设计 6 条特异引物 (AOGSTA3 01F 和 AOGSTA3 02F GSTR13 01F 和 GSTR15 02F GSTR23 01F 和 GSTR23 02F) 用于 3 RACE ( 表 1) 参考 3 -FulRACE CoreSet 试剂盒 (TaKa- Ra) 所提供方法, 以 oligodt-3sitesadaptorprimer 为引物进行反转录反应然后以试剂盒提供的引物 3sitesAdaptorprimer 分别与引物 AOGSTA3 01F GSTR13 01F GSTR23 01F 进行首次 PCR 反应, 反应条件为 :94 预变性 3 min,94 1 min,55 1min,72 1 min, 共 30 个循环, 最后 72 延伸 5min; 巢式 PCR 所用引物为 3sitesAdaptorprimer 与 AOGSTA3 02F GSTR13 02F GSTR23 02F, 进行 2 次 PCR 反应, 与 5 RACE 二次 PCR 扩增条件相同, 获得奥利亚罗非鱼肝脏 GSTA 基因和 2 种罗非鱼 GSTR1 GSTR2cDNA 序列 3 末端片段 1.5 PCR 产物的克隆分析及系统树构建根据测序结果整理得到奥利亚罗非鱼肝脏 1μL PowerScript Reverse Transcriptase 1 μl, GSTA GSTR1 GSTR2 基因 cdna 全序列和尼罗 AOGSTA5 01R GSTR15 01R GSTR25 01R 引物罗非鱼 GSTR1 GSTR2cDNA 全序列, 推测其氨基分别为 1μL 试剂盒提供的 10 UniversalPrimer 酸序列, 应用 BLAST(htp:// A Mix (UPM) 引物 5μL, 最后加双蒸水至 50μL Nih ġov/blast/) 和 VectorNTIsuite8.0 软件与 GenBank 上发表的多种脊椎动物 GSTs 氨基酸序

3 84 华中农业大学学报第 31 卷列进行序列同源性分析用 Mega4.0 软件采用邻接法构建系统树,1000 次重复计算靴带 (booṯ strap) 值 2 结果与分析 2.1 奥利亚罗非鱼 GSTA GSTR1 GSTR2 基因 cdna 全序列的克隆与分析利用 RT-PCR 和 RACE 技术, 我们从奥利亚罗非鱼肝脏克隆得到 GSTA GSTR1 GSTR2 基因 cdna 全序列对其分析发现, 奥利亚罗非鱼 GSTA GSTR1 GSTR2 基因 cdna 全序列分别为 bp, 其中 5 非翻译区 (5 -UTR) 分别为 bp,3 非翻译区 (3 -UTR) 分别为 bp, 开放阅读框 (ORF) 为 bp, 分别编码个氨基酸, 终止密码子为 TAA TGA TGA,polyA 加尾信号为 AATAAA TATTAA AATTAA (GenBank no.fj436095, FJ436093,FJ436094) 氨基酸序列中的 - 表示比较时必要的氨基酸缺口, * 表示保守的氨基酸残基下图同 Theaminoacidsequenceofdashesindicatetheaminoacidgapsthatarenecessarytoalignthesesequences,theconservedresiduesinalsequencesareindicatedbyasterisk.The sameasbelow. 图 1 奥利亚罗非鱼推测氨基酸序列及与其他鱼类哺乳类 GSTA 氨基酸序列同源性的比较 Fig.1 ComparisonofthededucedaminoacidsequencesofGSTAfrom bluetilapiawithotherfishesandmammals 图 2 奥利亚尼罗罗非鱼 GSTR1 GSTR2 推测氨基酸序列同源性的比较 Fig.2 Comparisonofthededucedaminoacidsequencesof GSTR1andGSTR2frombluetilapiaandNiletilapia

4 第 1 期瞿春梅等 : 奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼几种谷胱甘肽 S- 转移酶基因克隆与分析 85 ThesequencesofglutathioneS-transferaserespectivelywereGSTpi:HumanHomosapiensBC010915,mouseMusmusculus NM_ ,zebrafishDaniorerio NM_131734,commoncarpCyprinuscarpio DQ497597,and AfricanclawedfrogXenopuslaevis NM_ ;GST mu:humannm_000849,africanclawedfrogaj416998,commoncarpdq411312,andzebrafishnm_212676;gst alpha:humannm_145740,ratratusnorvegicus NM_017013,mouseBC012639,noblecarp Hypophthalmichthysnobilis EF andzebrafishbc060914;gsttheta:humannm_000853andmousemmu48419;gstzeta:humannm_145870,mousenm_010363; GSTomega:MouseNM_214050,ratNM_010362,puferfishTakifugurubripes NM_ ;GSTrho:GrasscarpCtenopharyngodonidela EU107283,commoncarpDQ411314,zebrafishNM_ ;GSTkappa:MouseNM_029555,ratNM_181371andhumanNM_015917;andbluetilapiaGSTalpha,rho1,rho2andNiletilapiaGSTrho1,rho2arehighlightedbyblackdiamond. 图 3 罗非鱼 GSTA GSTR1 GSTR2 和其他生物的 GSTs 基因核苷酸系统进化树 Fig.3 PhylogenetictreeofglutathioneS-transferasebasedonnucleotidesequencesofbluetilapia Oreochromiscoaureus,NiletilapiaOreochromisniloticaandotherspecies 2.2 尼罗罗非鱼 GSTR1 GSTR2 cdna 全序列的克隆与分析利用 RT-PCR 和 RACE 技术, 从尼罗罗非鱼肝脏克隆得到 GSTR1 GSTR2 基因 cdna 全序列分析发现, 尼罗罗非鱼 GSTR1 GSTR2 基因 cdna 全序列分别为 bp, 其中 5 非翻译区分别

5 86 华中农业大学学报第 31 卷为 60 67bp,3 非翻译区分别为 bp, 开放阅读框为 bp, 编码个氨基酸, 终止密码子均为 TGA,polyA 加尾信号为 TATTAA AATAAT (GenBankno.EU107284,FJ436092) 2.3 氨基酸同源性比较与系统树分析使用 VectorNTIsuite8.0 软件进行氨基酸序列比较发现, 奥利亚罗非鱼 GSTA 与尼罗罗非鱼真鲷 (Pagrusmajor) 斑马鱼 (Daniorerio)GSTA 同源性较高, 分别为 99.5% 75.2% 64.3%, 与鸡 (Galusgalus) 非洲爪蟾 (Xenopuslaevis) 人 (Homosapiens)GSTA 同源性较低, 分别为 55.9% 58.5% 50.9% ( 图 1) 用 VectorNTIsuite8.0 软件进行氨基酸序列比较发现, 奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼 GSTR 基因氨基酸序列高度保守其中, 奥利亚与尼罗罗非鱼 GSTR1 GSTR2 氨基酸序列同源性, 分别高达 99.6% 94.8% 而奥利亚罗非鱼 GSTR1 与 GSTR2 氨基酸序列同源性仅为 81.3%, 尼罗罗非鱼 GSTR1 与 GSTR2 氨基酸序列同源性仅为 82.2% ( 图 2) 根据基因结构氨基酸序列底物特异性化学亲和力及动力学行为等不同标准, 哺乳动物的 GST 可分为 :alpha mu pi sigma theta omega kappa 和 zeta 型近年来在其他生物中又相继发现了许多类型 : 如鱼类中的 rho 型, 细菌中的 beta 型, 昆虫中的 delta U epsilon 型, 植物中的 tau lambda 和 phi 型等 [11-12] 将所获得的罗非鱼 GSTscDNA 全序列采用 Mega4.0 软件, 以邻接法 (NJmethod) 构建系统进化树 ( 图 3) 系统进化树结果表明, 各型 GST 分别聚为一支, 其中克隆所得到的奥利亚罗非鱼 GSTA 与其他鱼类哺乳类 GSTA 聚为一支, 且从进化水平上与鱼类更近与哺乳类较远, 与其在进演了重要角色 [13-14] GST 是鱼类重要的第二时相去毒酶基因, 其表达产物一方面缓解氧化压力抑制活性氧对机体的损伤, 另一方面催化毒素形成亲水化合物经排泄系统排出体外 [15] 本研究从奥利亚罗非鱼获得 933bp 的 GSTA 基因 cdna 全序列, 其中 5 -UTR 为 98bp,3 -UTR 为 166bp,ORF 为 669bp, 编码 222 个氨基酸与我们先前获得的尼罗罗非鱼 GSTA 基因高达 99.5% 的同源性, 与真鲷斑马鱼 GSTA 同源性适中, 分别为 75.2% 64.3%, 与鸡 ( 鸟类 ) 非洲爪蟾 ( 两栖类 ) 人 ( 哺乳类 )GSTA 同源性较低, 分别为 55.9% 58.5% 50.9% 奥利亚尼罗罗非鱼 GSTR1 基因 5 -UTR 分别为 61 60bp,3 -UTR 分别为 bp,ORF 均为 681bp, 均编码 226 个氨基酸 ; 奥利亚尼罗罗非鱼 GSTR2 基因 5 -UTR 分别为 61 67bp,3 -UTR 分别为 bp,ORF 均为 693bp, 均编码 230 个氨基酸其中, 奥利亚与尼罗罗非鱼 GSTR1 GSTR2 氨基酸序列同源性, 分别高达 99.6% 94.8% 而奥利亚罗非鱼 GSTR1 与 GSTR2 氨基酸序列同源性仅为 81.3%, 尼罗罗非鱼 GSTR1 与 GSTR2 氨基酸序列同源性仅为 82.2% 系统进化分析也进一步表明, 罗非鱼 GST 基因与鱼类 GST 同源性较高, 与哺乳类鸟类两栖类 GSTs 同源性较低, 且各型 GST 分支清晰明确, 分别聚为一支对于比较研究, 同一型 GST 基因在不同品种罗非鱼肝脏微囊藻毒素代谢过程中所起作用的大小, 以及同种罗非鱼不同型 GST 在其微囊藻毒素代谢过程中所起作用的大小次序是否与这些鱼类对微囊藻毒素耐受能力的高低次序呈一定的相关性, 还需进一步确定本研究成功克隆的奥利亚罗非鱼的 GSTA GSTR1 GSTR2 以及尼罗罗非鱼的化中的地位相一致奥利亚尼罗罗非鱼 GSTR1 GSTR1 GSTR2 基因 cdna 全序列, 为从分子水平 GSTR2, 均与其他鱼类 GSTR 聚为一支, 证实所得研究淡水鱼类肝脏微囊藻毒素的代谢去毒分子机制 GST 基因均属于 rho 型, 而对 2 种 rho 型 GST 基因及调控机制奠定了基础, 对罗非鱼的选育和安全养功能的确定仍有待进一步研究殖也有一定的指导意义 3 讨论淡水水体富营养化导致有害蓝藻水华频频发生, 并可能产生具有严重危害的微囊藻毒素罗非鱼具有食性杂抗逆性强等优点, 可吞食消化有毒微囊藻关于罗非鱼微囊藻毒素去毒作用分子机制的研究表明,GST 在微囊藻毒素去毒代谢过程中扮参考文献 [1] CARMICHAEL W W.Thetoxinsofcyanobacteria [J].Sci Am,1994,270: [2] FASTNERJ,CODD G A,METCALFJS,etal.Aninternationalintercomparisonexerciseforthedeterminationofpurified microcystiṉlr and microcystinsincyanobacterialfield

6 第 1 期瞿春梅等 : 奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼几种谷胱甘肽 S- 转移酶基因克隆与分析 87 material[j].analbiochem Chem,2002,374: [3] LINDHOLM T,OHMAN P,KURKI-HELASMO K,etal. ToxicalgaeandfishmortalityinabrackisẖwaterlakeinAḻ and,sw Finland[J].Hydrobiologia,1999,397: [4] NISHIWALI-MATSUSHEMA R,OHTA T,NISHIWAKIS, etal.livertumorpromotionbythecyanobacterialcyclicpeptidetoxin microcystiṉlr [J].CancerResClinoncol,1992, 118: [5] HALLEGREFF G M.Areviewofharmfulalgalbloomsand theirapparentglobalincrease [J].Phycologia,1993,32: [6] POURIAS,ANDRADEA,BARBOSAJ,etal.FatalmicrocystinintoxicationinhaemodialysisunitinCaruaru,Brazil[J]. Lancet,1998,352: [7] ERIKSSONJE,MERILUOTOJA O,KUJARIH P,etal. Preliminarycharacterizationofatoxinisolatedfromthecyanobacterium Nodulariaspumigena[J].Toxicon,1988,26: [8] PFLUGMACHERS,WIEGANDC,OBEREMM A,etal.Identifiationofanenzymaticalyformedglutathioneconjugateofthecyanobacterialhepatotoxin microcystiṉlr:thefiststepofdetoxication[j].biochimbiophysacta,1998,1425: [9] DOIA M,PHAM R T,HUGHESE M,etal.MolecularcloningandcharacterizationofaglutathioneS-transferasefrom largemouthbass (Micropterussalmoides)liverthatisiṉ volvedinthedetoxificationof4-hydroxynonenal[j].biochem Pharmacol,2004,67: [10]FUJ,XIEP.TheacuteefectsofmicrocystinLRonthetraṉ scriptionofnineglutathiones-transferasegenesincommon carpcyprinuscarpio L.[J].AquaticToxicol,2006,80: [11]HAVESJD,FLANAGANJU,JOWSEYIR.Glutathionetransferases[J].AnnuRevPharmacolToxicol,2004,45: [12]KONISHIT,KATO K,ARAKIT,etal.AnewclassofglutathioneS-transferasefrom thehepatopancreasoftheredsea breampagrusmajor[j].biochemj,2005,388(1): [13]BEATTIEK A,RESSLERJ,WIEGANDC,etal.Comparative efectsand metabolism oftwo microcystinsandnodularinin thebrineshrimpartemiasalina[j].aquattoxicol,2003,62: [14] MONOD G,BOUDRY M A,GILLET C.Biotransformation enzymesandtheirinductionby B-naphtoflavoneduringembryolarvaldevelopmentinsalmonidspecies [J].CompBiochem PhysiolC,1996,114: [15]GEHRINGER M M,SHEPHARD E G,DOWNING T G,et al.aninvestigationintothedetoxificationofmicrocystiṉlr bytheglutathionepathwayinbalb/cmice[j].intjbiochem CelBiol,2004,36(5): Molecularcloningandsequenceanalysisofalpha-andrho-clases ofglutathiones-transferasesintwotilapias,oreochromisco aureusandoreochromisnilotica QU Chuṉmei LIANG Xu-fang SHEN Dan HEShan BAIXiaoḻi ColegeofFisheries,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan430070,China Abstract ThefuḻlengthcDNAsencodingalpha-class,rho1-class,rho2-classGST (GSTA,GSTR1, andgstr2)wereclonedandsequencedfromthebluetilapia(oreochromiscoaureus),andthegstr1, GSTR2wereclonedandsequencedfromtheNiletilapia(Oreochromisnilotica)byRT-PCRandRACE method.thefuḻlengthbluetilapiagstacdna was933bpinlength,containinganopenreadingframe of669bp(encoding222aminoacids),flankedby98bp5 UTRand166bp3 UTR.Boththebluetilapia andniletilapiagstr1cdna ORF were681bp (encoding226aminoacids),andboththebluetilapia andniletilapiagstr2cdna ORFwere693bp(encoding230aminoacids),respectively.Homologyand thephylogenetictreeconstructedbasedongst sequencesshowedthatthetilapiagstsaminoacidsequence werehighlyconservedwithfish,andhadlowhomologousrelationshipwithamphibian,birdandmammalgsts. Keywords glutathiones-transferase;molecularcloning;sequenceanalysis;oreochromiscoaureus;oreochromisnilotica ( 责任编辑 : 边书京 )

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