生命世界无奇有走不进科学 解读生命

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3 专题译述 一 破解表观基因组难题 机遇与挑战并存 1. 表观基因组学的概念 大规模表观基因组学研究的意义 规划大规模表观基因组学研究项目 总结... 9 二 表观遗传学修饰与人体疾病的关系 1. 表观遗传学修饰机制及其相关因子 肿瘤细胞中的表观遗传学修饰情况 表观遗传学修饰作用与神经发育紊乱的关系 表观遗传学修饰与神经变性疾病和神经系统疾病的关系 表观遗传学修饰与自身免疫性疾病之间的关系 结论及展望 三 表观基因组学研究意义探讨 基因组功能及常见疾病诠释新方法 1. 表观基因组学 : 基因组功能的解剖学 表观基因组研究会取代单基因的表观遗传学疾病研究模式 未来的技术发展 四 促进表观基因组学数据比对工作早日开展 1. 表观基因组学比对技术的应用实例 计算问题和技术难题 小结 下一期预告 : 海量生物学数据管理和分析的计算解决方案 随着新一代测序技术 实时成像技术和质谱技术的发展, 我们每周会产生几百 GB 甚至 TB 的 DNA RNA 和蛋白质序列数据 生命科学的成功不在于取得这些数据而在于我们合理诠释这些大规模 高维度数据的能力, 这对生物信息学家提出了很高的挑战 下期 生命奥秘 将从现有的一些计算环境如网格计算 集群计算 云计算等出发, 讨论我们如何掌握这些工具来成功解决海量数据的储存 处理和分析问题 热点话题 计算机能破解基因组密码吗? 生命百态 田螺会睡觉吗? 鸽子用右鼻孔嗅出回家之路 本刊文章主要由国外网站文章编译而成, 如有版权问题, 请版权所有人与本刊联系 凡本刊所载文章, 版权归作者本人和本刊所有, 如需转载, 请注明作者及出处 生命奥秘 本刊提供的任何信息都不能作为医疗凭证和依据, 仅供科研参考

4 专题译述 Worthy Issues 破解表观基因组难题 机遇与挑战并存 前言 表观遗传学研究领域是近几年里众多生物学研究方向中进展最为迅速的一门学科 表观遗传学研究领域在这几年里取得了一系列突破性的进展, 比如获得了精确度高达单个碱基的人类 DNA 甲基化组图谱 (human DNA methylome) 发现了 CpG 岛海滩现象 (CpG island shores, 即在基因组甲基化的位置中大约有 76% 出现在离 CpG 岛不远的地方, 距离大约在 200 至 2000 个 bp 左右, 因此将它们命名为 CpG 岛海滩, 意即 CpG 岛外的甲基化现象 ) 发现了许多新的组蛋白变异体及修饰方式, 还构建了全基因组核小体位置图谱 (genome-wide nucleosome positioning map), 这一切成果都表明在最近这两年里表观遗传学研究领域的进展速度是惊人的 科研界对表观遗传学研究领域的关注度不断增加的这几年也是科研技术与方法不断取得重大突破的几年, 由于这些新兴技术的出现, 科学家才能够开展大规模的表观遗传学研究, 比如对 DNA 甲基化 组蛋白修饰 核小体定位 ( 这对于基因表达调控和非编码 RNA 的表达至关重要 ) 等等表观遗传学标志现象开展研究 只有掌握了这些研究成果我们才能够进一步了解这些表观遗传学标志异常以及表观遗传学机制异常与人体疾病的关系 只有先全面了解各种表观遗传学修饰机制 各机制间的相互作用以及它们在正常人体和患病情况下发生了哪些变化才能够更进一步地开展生物医学研究 而表观遗传疗法在恶性血液病方面的成功则坚定了人们在这个领域的转化信心 但是, 我们需要放更多精力, 不仅要阐述分子分化时传出的表达或沉默状态分子的机制信号, 还要在不同发育阶段和疾病过程中了解不同类型细胞中的 DNA 和 / 或染色质修饰, 例如 RNA 转录因子 核定位因子中的信号转导途径之间的相互作用 有了这些信息, 表观遗传就有望对药物研制做出更大贡献了 1

5 生命奥秘 一 破解表观基因组难题 机遇与挑战并存 表观遗传学状态的改变与正常的生理过程和疾病发生 发展过程都有着密切的联系 但是到目前为止, 我们对于绝大多数细胞的整体表观遗传学状况还是不甚了解 随着基因组学研究的不断深入, 尤其是大规模高通量测序技术的飞速发展, 表观遗传学也终于迎来了发展的契机 人们现在已经可以在全基因组范围内对组蛋白的表观基因组修饰情况进行研究了, 而且能够对每一个 DNA 碱基的甲基化情况进行分析, 即 DNA 甲基化研究的分辨率已经达到了单碱基水平 1. 表观基因组学的概念 众所周知, 人类基因组是由多个 DNA 碱基组成的 这些碱基通过一定的顺序排列在一起, 构成了能表达特定遗传信息的 DNA 序列 表观基因组除了上述这些信息之外, 还包括 DNA 的修饰信息和组蛋白的修饰信息 细胞基因就是 听命于 这些修饰因子 ( 修饰信息 ) 的 基因在什么时候表达, 基因组上什么位置的基因才能表达, 这一切都受到这些修饰因子的指挥 我们现在对 DNA 硬件 (DNA 的组成 序列等信息 ) 已经比较熟悉了, 但是还不能从全基因组水平上对 DNA 软件 ( 表观遗传学 ) 有一个系统的认识 困扰我们的最主要的问题就是数据量太大, 即便是一个研究对象 ( 比如一个人 ) 也会产生海量的表观基因组学数据 我们每一个人体内都有一个基因组, 但是每一个个体内的每一种细胞的表观基因组信息都不相同, 每个细胞都会有一个与细胞发育状态相对应的独特的表观基因组 因此, 理论上来说, 一个人体内有多少种细胞就会有多少份表观基因组 细胞的表观遗传学状态除了受到细胞发育状态的影响, 也会受到环境因素的影响, 所有这些内部和外部的影响因素都会给细胞留下 记忆, 即表观遗传学印记 其它的一些环境因素和基因转录因素也会影响到细胞基因组 DNA 的修饰和组蛋白的修饰, 这些因素包括细胞营养状态 毒素 药物 微生物感染以及疾病等等 因此, 表观遗传学就是一份细胞档案, 通过它我们可以了解到细胞的过去 染色质 (chromatin) 的稳定性是会发生改变的, 有些改变是暂时的, 可有些改变却是长久的 有一些染色质改变能够通过细胞有丝分裂传递下去 (mitotically heritable), 继而影响到体细胞组织 (somatic tissue); 有一些染色质改变能够通过细胞减数分裂 (meiosis) 传递下去, 继而影响到下一代 表观遗传学状态还有可能会受到基因突变的影响, 但是基因突变的影响力究竟有多大还有待研究 据此, 我们应该能够想象出表观基因组数据的规模该有多么庞大 在基因组水平研究表观遗传学问题就是表观基因组学研究的工作内容, 不过这个概念的更新非常快, 主要是因为 DNA 测序技术的飞速发展 最近, 有研究人员开始通过芯片技术进行小规模的表观基因组学研究, 我们相信随着新一代测序技术的广泛推广, 很快就能以更高的分辨率在全基因组范围内开展表观基因组学研究了 2

6 2. 大规模表观基因组学研究的意义 2.1 大规模表观基因组学研究的科研意义 大规模的表观基因组学测序工作可以促进以下三方面的研究 : 基因表达调控研究 细胞分化和细胞重编程研究以及医学研究 ( 表 1) 表 1 大规模的表观基因组学测序工作在以下三个方面发挥的作用 研究方向 表观基因组学测序工作发挥的具体作用 通过表观基因组图谱 (epigenome-wide map) 了解染色质修饰特征的详尽信息, 继而向上游追踪, 找出与基因表达有关的转录因子 调控因子以及启动 调节并维持表观遗传状态的调控通路 ; 基因表达调控研究 根据表观基因组图谱开展下游研究, 搜寻具有相同表观遗传学特征的基因 这些基因可能会协同作用, 一起调控基因表达 在同种细胞系里寻找 DNA 甲基化修饰 组蛋白修饰以及非编码 RNA 等信息可以帮助人们更好地理解表观遗传学的作用机制, 并了解这些调控措施如何共同对细胞发挥调控作用 ; 有助于我们发现染色体上有功能的区域 例如, 分析表观基因组数据和其它数据, 可以预测增强子 microrna 印记位点 可激活位点 (loci poised for activation) 等顺式调控序列 (cis-regulatory sequence); 将人体胚胎干细胞 (hesc) 的表观基因组数据与不同的 已分化细胞的表观基因组数据进行比对可发现, 人体胚胎干细胞的表观基因组是非常独特的, 尤其在 DNA 甲基化方面的差异更加明显 ; 细胞分化和细胞重编程研究 医学研究 弄清楚人体胚胎干细胞的表观基因组状态是如何随着细胞的分化进程而逐渐发生改变的这一点非常重要, 它有助于了解正常的细胞发育机制, 也能够理解发育异常会导致什么后果, 比如新生儿异常或者出生后患病等 ; 了解表观基因组的重编程机制和重编程限度 ( 尤其是对可诱导多潜能干细胞,iPS 细胞进行这方面的研究 ) 非常有前途, 这将有助于开发再生药物或疗法, 帮助那些细胞永久损伤或缺失的患者 ; 已开展目前为止最为详尽的疾病表观遗传学调查, 发现有越来越多的其它种类疾病也与表观遗传学失调有关, 至少表观遗传失调能够部分导致这些疾病的发生和发展 ; 拿到与某种特定的疾病密切相关的 ( 对于该病意义重大的 ) 细胞和组织的表观基因组学图谱意义重大, 科研人员通过图谱既可以发现导致该病的上游因子和调控通路, 也可以找到受该疾病影响的下游基因 而且不论表观遗传学状态是否真的能够致病, 它都可以作为非常好的生物标志物来使用 人们可以通过表观遗传学状态来判断是否患病 是否存在毒物 感染 药物或心理压力等外界环境压力, 这对于疾病的诊断和病程掌控都非常重要 对于在致病机制中环境影响因素起到非常重要作用的疾病来说, 全表观基因组关联研究的价值就更为突出, 因为通过全表观基因组关联研究可以从统计学上发现与疾病及表型密切相关的表观遗传学的变异情况 先掌握了某种细胞或组织的表观基因组学图谱就好像拿到了寻宝图一样, 可以按图索骥, 设计出全表观基因组关联研究计划, 系统地寻找表观遗传学突变位点, 然后弄清楚这些突变与疾病的关系 有了全基因组关联研究和全表观基因组关联研究技术, 就可以更深入一步, 研究基因突变和表观遗传学突变与疾病的关系 相比基因突变来说, 表观遗传学突变更加富有弹性, 也更多变, 因此也更适合成为医疗干预的靶点 ; 3

7 生命奥秘 大规模表观基因组学研究的实用意义如果将细胞类别 环境因素 病理状态 基因组变异等情况综合考虑, 那么单个个体的表观基因组数据规模就会是一个天文数字 因此最有效的方法应该是有组织地构建一个系统的表观基因组学图谱, 即按照默认的细胞类别, 用标准化的工作流程和质控标准将相似的表观遗传学特征进行归类, 形成高质量的数据库, 而且这样得到的不同细胞的表观基因组学数据还可以互相比较 使用这种标准化的方法可以更容易地发现与某种细胞状态有关的表观遗传学特征 越来越多的科研工作者开始对表观遗传学与疾病的关系产生了兴趣, 从美国国立健康研究院的基金申请情况中就可以发现这一点 ( 图 1) 为与重要生理过程和疾病相关的细胞或组织构建表观基因组学图谱可以为全世界的科研工作者提供更多的参考数据, 大家都可以利用这些图谱研究各自感兴趣的基因或生理进程的表观基因组学调控机制, 就不用每一个研究小组都自己去构建图谱, 重复劳动了 当然, 构建表观基因组学图谱的工作是一项非常基础的工作, 是为全体科研人员服务的工作, 只有那些非常感兴趣的科研人员才会从事这项工作 因为从事大规模图谱构建工作的科研团体都是这方面的专业人员, 所以他们相比从事小规模表观基因组学研究的实验室能够以更便宜 更快 重复性更高的方法获得表观基因组学数据 而且这些专业团体还可以随时解决工作中碰到的问题, 比如改进研究方法 验证反应试剂和条件 对数据进行标准化处理 进行质量控制等, 而且还能集中相关领域里最优秀的科研人员一起从事这项工作 这种专业化的科研团体还能够很好地发现试验中的各种误差以及导致误差的原因, 并且找出改进的方法, 最大限度地减少误差 如果能够很好地解决表观遗传学研究里的技术问题, 寻找到更好 更可靠的研究方法, 那么全世界的科研工作者就能更好地利用这项技术, 更方便地研究他们自己感兴趣的问题 由于高通量测序仪的使用变得越来越普遍, 有很多科学家也开始考虑在自己的实验室里开展表观基因组学研究 各个开展小规模表观基因组学研究的课题组之间不可避免地会进行良性竞争 良性竞争非常重要, 因为只有友好合作才能避免重复工作, 才能最大化地发挥各自的优势, 得到尽可能多的细胞和组织的表观基因组学数据 图 1 美国 NIH 近 5 年来资助的科研项目中与表观遗传学有关的项目呈逐年增长的趋势 用 表观遗传学 或 表观基因组学 为关键词对 NIH 的 RePORTER 科研项目数据库 ( 按年份进行搜索就能得到上图所示的结果 这些项目的题目 摘要或科研目的中至少会含有上述两个关键词之一或全部 4

8 3. 规划大规模表观基因组学研究项目 由于表观基因组与多个科研领域都有关, 因此可以预见至少有好几个领域都有可能开展大规模的表观基因组学研究项目, 只不过各自的侧重点会有所不同 可能有的项目会比较关注干细胞, 有的会关注肿瘤, 还有的会关注神经表观基因组学 (neuroepigenomics) 基因与表观遗传间的相互关系 发育生物学或者个体表观基因组变异等等 每一个领域都会有自己最关注的生物学问题, 也有自己最需要解决的困难 与人类基因组计划相比, 大规模表观基因组计划可能不会有标准答案, 或者说不会有一个像人类基因组序列图谱那样的唯一结果, 因此对于这个领域来说, 最关键的是对每个研究项目的范围进行限制, 保证每个项目都能在一定的时间和资金条件下得到确定的 令人信服的科学结果 尤其需要强调的是, 对每一个项目的研究深度和广度都必须做出明确的界定, 比如对哪种组织或细胞进行分析, 对哪些表观遗传学特征进行检测, 对哪些细胞或组织的功能进行检测等等 项目规划人员还需要考虑该如何才能最好地管理 分析以及处理如此大规模的数据 接下来, 我们就要详细地逐一介绍该如何处理这些问题 3.1 如何选择组织和细胞 明确选择哪种组织或细胞作为研究材料选择来源比较充足的 可以满足科研需要的细胞或组织 由于研究个体表观基因组学变异情况以及基因组和表观基因组的相互作用情况将成为研究的重点, 因此最为合适的表观基因组学研究材料, 最好是那些已经经过基因组测序, 拿到了完整基因组序列的组织或细胞 当然了, 现在要对组织进行基因组测序还比较困难, 不过我们可以先把组织冻存起来, 等待将来有一天测序费用大大降低的时候再对这些组织进行测序研究 选择什么物种进行研究人体是首选, 同时也可选择其它具有非常重要价值的模式生物, 例如小鼠 斑马鱼 果蝇 线虫 海参 植物 酵母等 这些模式生物的基因型和生长的环境因素都是可以被人为控制的, 而且这些模式生物也非常适合进行功能研究和表观基因组状态调控研究 对不同生长环境下生长的模式生物或者身患各种疾病的模式生物进行表观基因组学研究意义同样重大, 这对于隔代调查研究或对很难从人体获得的细胞系进行的研究显得尤其重要 对来自不同物种的相同细胞系的表观基因组学数据进行比对也能得到很多有意义的结论, 帮助我们发现表观基因组学调控机制 3.2 表观基因组学检测方法究竟应该对哪些表观基因组学标志物或特征进行检测呢? 这个问题受到技术和资源的限制, 只能在现有的技术手段和人力 物力和财力条件下选择合适的检测手段和方法 有几种检测手段是必须的, 比如检测组蛋白修饰的方法 检测 DNA 修饰的方法 检测小非编码 RNA 的方法等, 但是其它的检测手段也是非常有价值的, 它们能够带给我们更多的有关染色质的信息, 比如转录因子结合位点信息 染色质相互作用蛋白信息 组蛋白变异信息 核小体位置信息等 当然, 各种高通量检测手段和普通的检测方法并不一定能够满足我们所有的需要, 检测出所有的信息, 所以在本文中我们只对 DNA 修饰检测方法和组蛋白修饰检测方法进行介绍 5

9 生命奥秘 DNA 修饰检测方法 对于大规模的 DNA 甲基化研究项目来说, 现在已经有各种检测方法可以使用了, 不过这几 种方法的分别率和详尽程度各有不同 ( 表 2) 表 2 大规模的 DNA 甲基化研究项目的检测方法的特点 检测方法优点缺点 甲基化 DNA 免疫沉淀检测方法 (methylated DNA immunoprecipitation Assay) 约化表示重亚硫酸盐测序方法 (reducedrepresentation bisulfite sequencing) 定向重亚硫酸盐测序方法 (targeted bisulfite sequencing) MethylC-seq 测序方法 / 分别率可达 1bp 可测定 DNA 甲基化的情况, 既能对全基因组进行研究, 又能达到单碱基水平的高分辨率, 已有人利用这种技术对两种人体细胞系开展研究, 试图构建出高密度 DNA 甲基化图谱 ; 分别率只能达到 100bp 只能分析基因组局部, 可能会错过许多重要的表观基因组区域, 漏掉很多重要的信息 ; 非常昂贵, 利用这种技术对大量的细胞或组织开展研究不太实际 ; 最近发现的另一种 DNA 共价修饰现象 羟甲基胞嘧啶 (hydroxymethyl-cytosine,hmc) 修饰又给我们出了一个难题 理论上来说, 特异性针对羟甲基胞嘧啶的抗体应该能够用于特异性的羟甲基胞嘧啶 DNA 免疫沉淀试验 (hydroxymethyl-dna immunoprecipitation assay) 然而, 因为甲基胞嘧啶和羟甲基胞嘧啶都不能进行重亚硫酸盐转换 (bisulfite conversion, 所谓重亚硫酸盐转换就是通过重亚硫酸盐将未甲基化的胞嘧啶转换成尿嘧啶 ), 所以首先还需要开发一种技术 能够区分甲基胞嘧啶和羟甲基胞嘧啶, 而且这种技术的分辨率应该达到单碱基水平 组蛋白修饰检测方法组蛋白方面, 人们现在已经发现了 100 多种组蛋白翻译后修饰现象, 而且这个数字还在逐月递增 不过, 这些组蛋白修饰究竟有什么作用现在还不清楚, 只知道有一些组蛋白修饰与染色质活化有关, 有一些组蛋白修饰则与染色质抑制有关 目前主要有两种组蛋白修饰检测方法 ( 表 3) 6

10 表 3 两种组蛋白修饰检测方法的比较 技术名称原理优点缺点 与芯片技术相结合的表观基因组学研究方法 (ChIP-chip 技术 ) 与高通量测序技术相结合的表观基因组学研究方法 (ChIP-seq 技术 ) 两种方法的原理都是染色质免疫沉淀技术 (ChIP), 即使用特异性针对某种化学修饰组蛋白的抗体进行免疫沉淀, 钓出 和这种组蛋白结合的染色质, 然后再通过芯片技术或高通量测序技术进行测序分析 ; / 不受芯片序列限制, 得到的信息更多, 花费更少 ; 受到芯片序列限制, 得到的信息较少, 花费较多 ; 获得的 成倍增多的数据对于计算机存储和分析工作也会是一个不小的挑战 ; 然而, 缺乏有效的 特异性的抗体是目前困扰组蛋白表观遗传学研究 ChIP 试验的最大障碍 要想得到详尽的表观基因组图谱就应该对每一种修饰方法都进行检测, 不过目前只有大约 30 种有效的抗体, 而且如果想对大量的组织或细胞进行这种分析, 花费会非常大 不过, 有一种方法可以降低试验费用, 那就是先对几种关键的 对于细胞非常重要的 能提供大量有效信息的 同时又有高质量抗体可用的组蛋白修饰情况进行检测 比如, 美国 NIH 的表观基因组学图谱工作路线图协会 (Roadmap Epigenomics Mapping Consortium) 就曾经确定了 6 种组蛋白修饰目前最为首选的研究目标, 这 6 种组蛋白修饰分别是 H3K4me1 H3K4me3 H3K9ac H3K9me3 H3K27me3 和 H3K36me3 如果要对不同试验得到的数据进行比较, 那么就得保证试验中使用的抗体在质量上保持稳定 但是商业化的抗体大多都是多克隆抗体, 因此每个批次的产品之间都会有所差异, 所以使用 ChIP 技术得到的数据就不可避免的会有所出入 单克隆抗体的情况就要好得多, 有一个统一的标准, 不过由于单克隆抗体只能与一个抗原表位结合, 所以用于 ChIP 试验的效果不会那么好 综上所述, 开发出一种重复性高的 标准化的抗体是开展 ChIP 试验的关键 当然,ChIP 试验也存在它自己的问题 比如有一些表观遗传学修饰会被其它的蛋白掩盖, 所以抗体是无法检测到这一类修饰情况的 而且要进行 ChIP 试验需要大量的细胞样品 虽然可以预见在很长一段时间里 ChIP 试验仍旧会是开展表观遗传学研究的主要方法, 但是我们相信, 弥补 ChIP 试验不足之处的技术一定会出现 比如从某一个基因位点里分离出特定的染色质, 然后再通过质谱技术 (mass spectrometry) 进行分析, 鉴定出所有与该染色质结合的蛋白质及其翻译后的修饰情况 这种研究策略可以极大的提升科研工作者们研究基因表达情况的能力 3.3 增值信息 (Value-added information) 除了前面介绍的技术手段之外, 我们还需要一些有关生物样品试验方面的信息 比如应该尽可能多地搜集与试验组织材料有关的表型信息, 这样才能将搜集到的表观基因组学信息与样品生长的环境因素 患病情况 年龄 性别以及其它各种信息联系起来, 得到最有价值的结论 正如前面已经提到的, 遗传变异也会影响表观基因组状态, 因此了解被研究细胞或组织的 DNA 序列也至关重要 掌握足够的基因表达信息能够将表观基因组信息与转录调控信息联系起来 我们可以借助 7

11 生命奥秘 芯片技术或新一代测序技术了解基因表达的情况, 还可以锁定编码 RNA 和非编码 RNA 非编码 RNA 对于表观基因组进程的意义和作用现在还不清楚, 不过在某些细胞和组织中已经有足够的证据表明, 非编码 RNA 与某些组蛋白修饰和 DNA 修饰有关 因此, 了解基因表达情况, 定量了解非编码 RNA 的水平都将帮助科学家们了解这些 RNA 与其它表观遗传学信号之间的关系 有一些研究项目还需要了解染色质的情况, 比如染色质与转录因子的结合情况, 或者染色质与其它蛋白的相互作用情况, 组蛋白突变的情况以及核小体位置信息等 使用 DNA 酶 I 高度敏感试验 (DNase I hypersensitivity-based assay) 来研究染色质的结构也可以帮助我们了解表观遗传学状态与染色质亲和性 (chromatin accessibility) 之间的关系 基因组的表观遗传学状态很有可能会影响到染色质的高级结构, 各种分析染色质高级结构的技术, 比如 Hi-C 技术 末端配对标签测序染色质相互作用分析技术 (chromatin interaction analysis using paired-end tag sequencing) 等都能为我们提供很多有价值的染色质结构信息, 借助这些信息能够更好地理解表观遗传学状态对染色质结构的影响作用 对各种表观基因组图谱的分析工作原本就是相互联系的, 因此要想了解表观遗传的功能和作用机制就需要研究各种表观遗传现象和相关生理进程之间的关系 使用各种表观遗传修饰酶调控药物或者修饰酶的效应因子可以对表观基因组从整体上进行调节 同样地, 基因敲除技术或基因缺失技术和基因过表达技术也能用于调控蛋白表达 现在, 位点特异性的表观遗传操控技术 (locus-specific epigenetic manipulation) 就包括融合蛋白表达技术, 在此基础上还可以发展出更多的技术, 这将为表观基因组学功能研究提供强有力的科研手段 3.4 表观基因组学数据处理大规模表观基因组学研究能够获得海量数据, 因此我们迫切需要开发出相应的技术, 能够有效地存储并处理这些数据 而且还需要开发出有效的工作流程, 处理各种不同类别的数据, 比如 ChIP-seq 数据 MethylC-seq 数据 基因表达数据和 DNA 酶 I 高度敏感数据等, 以对数据进行质量控制, 及为对多次试验的数据进行比对提供恰当的统计学标准化分析工具等 更进一步的数据分析还包括基因组数据比对和数据库管理等工作 各种非公共的数据库比如基因型及表型数据库 (Database of Genotypes and Phenotypes, entrez?db=gap) 或欧洲基因型档案数据库 (European Genotype Archive, ac.uk/ega/page.php) 等被用来存储合作单位提供的 DNA 序列信息, 而且也只会开放这些信息 这些比对数据 (aligned data) 和质控数据 (quality-controlled data) 可以用于各种分析研究工作 各种表观遗传标志物在一个细胞或一种组织里的同一基因位点同时出现这种巧合现象可以被用于基因群组分析, 了解这些基因之间在表观遗传特征方面相互互补的关系 进行这种分析主要目的是要发现同时出现的表观遗传学现象, 从而揭示各种表观遗传调控通路之间的相互作用关系 各种不同细胞的表观基因组图谱之间也可以互相比对, 以此了解同一基因位点的不同表观遗传学情况, 从而判断不同表观遗传修饰对应哪种组织或细胞 同样也可以比较正常组织的表观基因组图谱和患病组织的表观基因组图谱, 从而发现与疾病或外部环境致病因素有关的表观遗传特征 还可以将表观基因组数据与表型 各种遗传变异现象 ( 比如 SNP 霍拷贝数变异等等 ) 基因表达水平 染色质可接近性或者其他各种数据联系起来进行分析 最近开展的联合研究就已经开始进行这方面的尝试, 试图揭示表观遗传标志物对上述各种现象 ( 比如组织或细胞来源 患病状态或外部环境等 ) 的评价价值 同时还有人在开发计算机技术, 帮助 8

12 科研人员对表观基因组数据进行分析 除了复杂的计算机分析技术之外, 开发数据可视化工具 (visualization tools) 也同样重要, 因为有了可视化工具就能更好的展示表观基因组数据, 让更 多非专业人士也能看懂这些数据, 利用这些数据进行他们自己的研究 4. 总结 大规模表观基因组图谱构建工作意义非常重大, 它能从整体的角度为我们提供综合了各种不同细胞状态的完整信息 这种信息几乎就可以提供一种全新的生物学研究视角, 足以影响到科研的各个领域, 尤其对基因调控基础研究领域 细胞分化和重编程研究领域和表观遗传病理调控研究等领域的影响意义更是异常深远 我们相信, 对表观遗传作用的理解越深入, 我们就越能把握疾病的发生发展机制, 提高疾病的诊疗水平, 增强预防措施, 甚至能够开发出全新的治疗手段 原文检索 : John S Satterlee, Dirk Schübeler & Huck-Hui Ng. (2010) Tackling the epigenome: challenges and opportunities for collaboration. Nature Biotechnology, 28(10) 筱玥 / 编译 附录 : 简介当下正在开展的几个大规模表观基因组学研究项目 亚洲的研究项目 来自韩国首尔延世大学 (Yonsei University) 日本国立癌症中心 (Japanese national cancer center) 中国上海癌症研究所 (Shanghai cancer Institute) 和新加坡基因组学研究所 (Genome Institute of Singapore) 的科学家每年都会齐聚一堂, 召开会议, 促进彼此间的交流和协作 随着表观基因组学研究工作逐步走到聚光灯下, 亚洲的科学家们也将在这个领域里做出他们自己的贡献 加拿大和澳大利亚的研究项目 加拿大健康研究院 (Canadian Institutes of Health research) 正在积极开展一项广泛的研究项目, 他们的研究主题是 表观遗传学 环境与健康 澳大利亚是好几个表观遗传学研究项目的举办地和会议召开地点 2008 年, 澳大利亚的科研工作者组建了澳大利亚表观遗传学联盟 (Australian alliance for epigenetics), 参见 欧洲的表观基因组研究项目 欧盟目前还没有专门的表观基因组学研究计划, 但是有好几个从事这方面研究的课题组都得到了欧盟科研基金的大力支持 这些项目包括关注小鼠干细胞和已分化细胞表观基因组学的 HEROIC 计划 ( 和最早采用新一代测序技术的关注肿瘤表观遗传学的 EPITRON 计划 ( 等 ; 还有关注开发染色质修饰酶小分子抑制剂的 SMARTER 计划 ( 以及在国际上引起广泛关注的表观基因组优质网络计划 (epigenome network of excellence), 该计划旨在为欧洲培育出一个表观基因组研究小社会, 其主要工作包括支持低年资科研工作者的工作 ; 组织各种专题会议, 比如表观基因组相关技术会议等 ; 开发各种工具, 比如各种数据库, 例如 或 WWW/researchtools/protocols.php 等 ; 还有为业外人士建立普及性网站, 例如 等 这个表观基因组优质网络计划充分说明了网络的重要性, 同时这项计划积累的工作经验还有助于将来开展更大规模的国际表观基因组学合作研究 续下 9

13 生命奥秘 接上 ENCODE 项目和 ICGC 项目 DNA 元件百科全书计划 (ENCODE) 是由美国国家人类基因组研究院 (US national Human Genome research Institute) 启动的一项研究计划 ENCODE 的主要目的是, 发现人类基因组中所有的功能元件 ; 与之相对应的 modencode 则主要针对各种模式生物, 找出各模式生物基因组中所有的功能元件 这两个项目都使用了多种检测技术, 当然也包括表观基因组学研究技术, 不过表观遗传学不是他们的主要研究目的 ( 国际癌症基因组协会 (ICGC, 的主要目标是调查各种癌症细胞里的基因组突变情况, 具体要选取 50 种不同的肿瘤细胞来研究基因组 转录组和表观基因组的整体突变情况 由于 ICGC 项目会对同一肿瘤采集很多样本进行研究, 因此可以得到大量详尽的信息, 以用于研究基因组和表观基因组之间的相互作用关系 NIH 表观基因组路线图项目 美国 NIH 的表观基因组路线图项目 (NIH Roadmap Epigenomics Program, roadmapepigenomics.org) 开始于 2008 年, 他们已经在 自然生物技术 杂志里发表了一篇论文 该文介绍了一份非常详细的表观基因组图谱 简短来说,NIH 的表观基因组路线图项目的目的就是为几种比较重要或常见的人体细胞构建详细的表观基因组图谱 本项目会利用 ChIP-seq 技术对 30 多种组蛋白表观遗传学修饰情况进行检测, 也会利用精确度达到单个碱基水平的 methylc-seq 技术在全基因组范围内对 DNA 甲基化情况进行检测 最近他们刚刚发表了 H1 Hesc 细胞和 IMR90 成纤维细胞这两种人体细胞的 DNA 甲基化组 (methylomes) 信息 为了弄清楚各种细胞表观基因组方面的差距到底有多大,NIH 的表观基因组路线图项目组还会用更精细的方法对 100 种以上的人体细胞和组织进行表观基因组学研究 他们准备用 ChIP-seq 技术对 6 种意义重大的组蛋白修饰特征进行检测 还将对这些组织或细胞基因组内的部分区域进行分辨率达到单碱基水平的约化表示重亚硫酸盐测序方法 (reduced-representation bisulfite sequencing) 或类似的方法进行 DNA 甲基化研究 此外, 他们还会对材料来源充足的组织样品进行 DNA 酶 I 高度敏感试验, 以发现基因组中对 DNA 酶 I 高度敏感的区域 同时也会利用 RNA 测序技术或芯片技术了解基因的表达信息 NIH 的表观基因组路线图项目组从一开始就建立了一整套试验标准和操作规范, 用来规范对各种不同形式的数据开展独立研究和整体研究的工作, 这样得到的研究结果才能在将来让整个表观基因组学研究界的同行们参考 该项目组获得的数据在 9 个月的封闭期 ( 为了用于有关全基因组分析工作的论文发表 ) 结束之后就会马上公布, 并且永远储存在 NCBI 的 GEO 数据库 ( gov/epigenomics) 中 该路线图计划的工作还包括为表观基因组学研究工作开发新技术, 发现新的表观遗传学修饰现象, 调查表观遗传学在各种人体疾病和环境影响条件下的作用等等 ( epigenomics/fundedresearch.asp) 国际人类表观基因组协会计划 (IHEC) 该计划希望依靠 NIH 在表观基因组学研究方面的工作, 最终做成一个真正全球性的表观基因组学研究项目 ( 即使是目前规模最大的 NIH 表观基因组路线图项目也只能对少数几种大家感兴趣的细胞构建表观基因组图谱 虽然国际人类表观基因组协会最终的计划还没有确定, 但是可以肯定他们的野心一定很大, 会为更多的细胞和组织构建表观基因组图谱, 而且还会对 NIH 的表观基因组路线图项目中没有包括的非人类细胞和组织进行表观基因组学分析 IHEC 项目还会在表观基因组学数据获取和分析工作的流程和标准化开发方面开展一定的工作, 发现问题, 并找到解决问题的方法, 积累经验, 帮助科研人员更快 更好地开展表观基因组数据分析工作 10

14 二 表观遗传学修饰与人体疾病的关系 在发现 DNA 是遗传分子之前, 研究人员就已经知道在生物体内的每一个基因并不是随时 随地 ( 在每一个细胞内 ) 都能够表达的 但是, 生物体内的每一个细胞却都携带了同样的遗传信息 所以,Conrad Waddington 发明了 表观遗传学势能 (epigenetic landscape) 一词来形容细胞将遗传学信息转换成各种表型性状的分子机制 在很多时候, 虽然没有发生 DNA 序列的变化, 但是细胞的表观遗传学基因表达模式与相关的细胞表型都会随着细胞有丝分裂, 甚至是减数分裂遗传下来 现在, 大家普遍认为表观遗传学修饰机制是一种可遗传的基因表达调控机制 最近, 研究人员又发现表观遗传学与人体疾病的发生 发展有关, 所以大家对该研究领域的兴趣就更加浓厚了 从分子水平来说, 胞嘧啶和组蛋白的共价修饰以及核小体位置的改变等都是公认的 非常常见的表观遗传学修饰机制 这些表观遗传学修饰机制可以对许多细胞进程进行根本的调控, 这些受调控的细胞进程包括基因表达和 microrna 表达 DNA 与蛋白质间的相互作用 转座元件移动抑制 细胞分化 胚胎发生 X 染色体失活以及基因组印记等等 在多细胞生物体内, 表观遗传学修饰机制能够随着生物体的发育一直保持, 甚至伴随生殖细胞遗传给下一代的能力是保证生物体在同一套遗传信息的基础之上展现出各种不同表型的关键 比如, 源自同一 DNA 的克隆动物就和它们的供体动物不完全相同, 而且它们患上各种疾病的外显率 (penetrance, 即在特定环境中某一基因 ( 常指杂合子 ) 显示出相应表型的频率, 以百分比表示 ) 也会有所差异 同卵双胞胎 (monozygotic twin) 这种天然的人体克隆的 DNA 序列是完全一样的, 但是 DNA 甲基化以及组蛋白修饰的情况却有所不同, 所以他们患上肿瘤或自身免疫性疾病等的外显率也会不一样 这种情况同样也发生于单细胞水平, 比如干细胞是如何分化成各种不同的终末细胞的? 为什么一个肝细胞又老是通过细胞分裂变成两个肝细胞? 表观遗传学机制似乎就能回答上述这些问题, 因为它在细胞分化过程中就是关键调控因素之一 研究表明, 很多疾病的发生 发展都与表观遗传学修饰标志类型出错或者修饰的时间或地点出错有关, 这更加说明该修饰机制对于细胞正常的发育有多么重要 比如,DNA 甲基化就与肿瘤有着明确的因果关系, 在肿瘤发生早期就可以观察到 p16ink4a p14arf 以及 MGMT 等基因的超甲基化现象, 还可以发现与各种不同类型肿瘤相对应的肿瘤特异性的甲基化现象等等 下文将对近几年来表观遗传学研究领域里取得的成果进行一个总结, 并展望未来表观遗传学研究可能会取得的突破 1. 表观遗传学修饰机制及其相关因子 为了阐述的方便, 我们首先将表观遗传学修饰机制分为三大类, 分别是 DNA 甲基化 (DNA methylation) 组蛋白修饰(histone modifications) 以及核小体定位 (nucleosome positioning) 需要强调的是, 这些修饰机制 ( 因子 ) 之间是能够发生相互作用的, 它们之间存在各种正向和负向的反馈调控途径, 我们所观察到的实际上都是各种修饰机制之间相互作用后得到的总结果 11

15 生命奥秘 DNA 甲基化 在人体细胞中被研究得最充分的表观遗传学现象就是胞嘧啶的甲基化修饰现象 DNA 甲基化修饰 发生于 CpG 双核酸位点的 DNA 甲基化修饰 DNA 甲基化修饰几乎只会发生在 CpG 双核酸位点, 这些 CpG 双核酸位点又比较喜欢聚集在名为 CpG 岛的区域里 所谓 CpG 岛指的是细胞基因组里那些长度超过 200bp,GC 含量至少在 50% 以上的基因区域, 该区域里 CpG 比例与正常统计学预计比例之间的比值至少在 0.6 以上 在哺乳动物基因组里,CpG 双核酸的比例非常低, 一般只在 1% 左右 各种 DNA 甲基化修饰模式 大约有 60% 的人类基因启动子与 CpG 岛有关, 这些启动子在正常细胞里通常都处于低甲基化状态, 只有大约 6% 的启动子会在发育早期以组织特异性的方式被甲基化修饰, 或者在已分化组织中被甲基化修饰 ( 图 1a) 一般而言,CpG 岛甲基化修饰都与基因表达沉默有关 DNA 甲基化在基因组印记 (genomic imprinting) 过程里扮演了非常重要的角色 分别源自父母双方的一对等位基因的当中某一个如果发生了超甲基化修饰, 那么就会导致单等位基因表达 (monoallelic expression) 在雌性哺乳动物的 X 染色体失活现象当中, 也可以见到同样的基因表达量降低现象 DNA 发生甲基化修饰之后, 会通过各种不同的途径抑制基因的表达 甲基化修饰的 DNA 会促进甲基化 CpG 结合结构域 (methyl-cpg-binding domain, MBD) 蛋白的招募 这些 MBD 家族蛋白接下来又会将组蛋白修饰复合体 (histone-modifying complex) 和染色质重构复合体 (chromatin-remodeling complex) 招募到甲基化位点 DNA 甲基化修饰还可以通过抑制 DNA 结合蛋白与其靶点结合, 从而直接抑制基因转录 与此相反, 未发生甲基化修饰的 CpG 岛则可以招募 Cfp1 蛋白, 形成有利于基因表达的染色质结构,Cfp1 蛋白能够与组蛋白甲基转移酶 (histone methyltransferase)setd1 结合, 促进组蛋白甲基化标志物三甲基化组蛋白 H3 赖氨酸 4(H3K4 trimethylation, H3K4me3) 中非常多见的结构域的形成 12

16 图 1 各种 DNA 甲基化修饰模式 a: 基因启动子区域里的 CpG 岛在正常情况下都是未甲基化修饰的 ( 图左侧 ), 所以基因可以正常转录 异常的超甲基化修饰会导致基因失活 b: 位于 CpG 岛上游 2kb 的 CpG 岛海滩的甲基化修饰情况与 CpG 岛一样 c: 正常情况下, 基因小体发生甲基化修饰之后会促进基因转录, 抑制虚假的转录起始 病理情况下基因小体会去甲基化, 基因会从错误的起始位点起始转录 d: 重复序列一般都是超甲基化修饰, 可以防止因为内部寄生序列激活出现染色体失稳 转座现象和基因破坏现象 在病理情况下重复序列的甲基化修饰模式也会出现异常 13

17 生命奥秘 不过,DNA 甲基化修饰也不仅仅局限于 CpG 岛内 CpG 岛海滩 (CpG island shores) 一词就是专门用来描述最近发现的, 在基因组中紧邻 CpG 岛 ( 距离不超过 2kb),CpG 密度较低的区域 发生于 CpG 岛海滩里的 DNA 甲基化修饰现象也与基因转录抑制有着密切的关系 ( 图 1b) 绝大部分组织特异性的 DNA 甲基化修饰现象似乎都发生在 CpG 岛内, 而不是 CpG 岛海滩里 这种 CpG 岛海滩甲基化差异现象足以用来对不同的组织进行鉴别, 而且这种 CpG 岛海滩甲基化模式在人类和小鼠基因组里都是非常保守的 另外, 在细胞重编程过程中, 甲基化出现差异的区域中有 70% 的区域都与 CpG 岛海滩有关 DNA 发生甲基化修饰也不总是与基因转录抑制有关, 比如在基因小体 (gene body) 上发生的甲基化修饰就不是如此 ( 图 1c) 基因小体甲基化修饰比较常见于广泛表达的基因, 该甲基化修饰与基因表达呈正相关关系 有人认为基因小体甲基化修饰可能与提高转录延伸效率有关, 也有可能会抑制虚假的转录起始过程 DNA 甲基化修饰以及 DNA 甲基化相关蛋白不仅能够以顺式的方式对基因转录过程进行调控, 而且还可以发挥反式作用, 参与核组织 (nuclear organization) 和染色体的构建过程 基因印记区域可以与同一染色体上的远隔序列甚至是其它的染色体发生相互作用 这种反式的相互作用也能调控基因转录过程, 比如 H19 印记控制区域 (H19 imprinting control region) 和 Osbpl1a/Impact 位点 (Osbpl1a/Impact loci) 都能发挥这种调控作用 DNA 甲基化酶, 比如 DNA 甲基化转移酶 1(DNA methyltransferase 1, DNMT1) 能够维持核仁的结构 ; 甲基化 CpG 结合结构域蛋白 MeCP2 与 Dlx5-Dlx6 位点的沉默染色质环 (silent chromatin loop) 的形成有关, 这些与表观遗传学相关的因子都能够导致基因组发生三维结构重排, 从而对基因表达进行调控 DNA 甲基化不仅与基因转录调控有关, 在基因组重复序列里也发现了非常明显的深度甲基化 CpG 位点 ( 图 1d) 这种 DNA 甲基化修饰机制与维持染色体的完整性作用有关, 这是因为这种甲基化修饰作用可以防止基因组内部 寄生 序列复活所导致的染色体失稳 转位和基因破坏等现象出现 发生于其它非 CG 位点的 DNA 甲基化修饰虽然 DNA 甲基化修饰主要发生于哺乳动物细胞的 CpG 双核苷酸位点, 但最近也有研究发现, 在人类基因组中的其它非 CG 位点, 比如 CHG 和 CHH 位点 (H 可以是 A C T 任何一个 ) 同样能够发生甲基化修饰 CHG 位点和 CHH 位点的甲基化修饰可见于干细胞基因组当中, 主要发生在直接与基因表达相关的基因小体上, 在蛋白结合位点和增强子上则不太多见 在细胞分化时, 这种非 CpG 位点的甲基化水平会降低, 在 ips 细胞里它们的甲基化水平又会恢复性上升, 说明这种修饰方式与细胞的多潜能状态关系密切 不过, 它们具体的作用机制目前还不清楚 除了 5 甲基胞嘧啶 (5-methylcytosines) 之外, 科学家又发现了 5 羟甲基 2' 脱氧胞苷酸 (5-hydroxymethyl-2'-deoxycytidine) 到目前为止, 已经有人报道在浦肯野细胞 (Purkinje cell) 和颗粒细胞 (granule cell) 中发现了 5 羟甲基 2 脱氧胞苷酸, 其含量分别占整个细胞内核苷酸的 0.6% 和 0.2% 但是, 还没有人在肿瘤细胞中发现 5 羟甲基 2' 脱氧胞苷酸的踪迹 对于这种新的 DNA 修饰机制还需要进行深入的研究, 弄清楚它在正常和病理情况下的表观遗传学调控作用 14

18 1.1.2 DNA 甲基化转移酶 DNA 甲基化修饰是由 DNA 甲基化转移酶家族蛋白催化完成的,DNMT 酶可以将 S 腺苷甲硫氨酸 (S-adenosyl methionine) 上的甲基团转移到 DNA 分子上 人们已在哺乳动物体内发现了 5 种 DNA 甲基化转移酶, 它们分别是 DNMT1 DNMT2 DNMT3a DNMT3b 和 DNMT3L 不过, 其中只有 DNMT1 DNMT3a 和 DNMT3b 具有甲基转移酶的活性 这些具备催化活性的 DNMT 蛋白被人为的分成了两大类, 分别是 DNMT3A 和 DNMT3B 这两种从头开始的 DNMT 酶 (de novo DNMT) 和 DNMT1 这种维持的 DNMT 酶 (maintenance DNMT) DNMT3A 和 DNMT3B 蛋白主要负责在胚胎发育期打下甲基化的基础, 所以它们在胚胎干细胞中的表达量很高, 到了已分化细胞里表达量就会出现明显下调 DNMT3 家族还有第三个成员 DNMT3L, 该蛋白虽然缺乏催化活性, 但它主要与建立母本基因组印记有关 DNMT3L 蛋白主要在配子形成期表达, 此时正是基因组印记建立的时期 DNMT3L 蛋白是 DNMT3a 和 DNMT3b 的刺激因子, 它们能够在核内发生相互作用并且共定位 DNMT1 这种维持 DNMT 蛋白对半甲基化的 DNA 位点的亲和力高达 30~40 倍, 而且它也具有从头开始的 DNMT 酶活性 DNMT1 蛋白是细胞内含量最为丰富的 DNMT 蛋白, 主要在细胞周期的 S 期转录表达 DNMT1 蛋白的主要作用是对基因组发生半保留复制之后产生的半甲基化 DNA 位点进行甲基化修饰 ( 图 2) 在细胞中,DNMT1 蛋白对新合成 DNA 的亲和力会随着它与 PCNA 蛋白发生相互作用而增加, 因为借助 PCNA 蛋白可以将 DNMT1 蛋白定位到复制叉处 泛素蛋白样植物同源结构域与含有环指结构域蛋白 1(ubiquitin-like plant homeodomain and RING finger domain-containing protein 1, UHRF1) 也能起到与 PCNA 相似的作用, 将 DNMT1 蛋白定位到半甲基化 DNA 处, 这是因为 UHRF1 蛋白含有 SET 结构域和 RING 相关结构域, 这两个结构域与半甲基化的 CpG 位点之间都具有极高的亲和力 ( 图 2a) 不过, 这两大类 DNMT 酶之间的分工有时也并不一定是那么的明确, 所以最近 Jones 和 Liang 又在原来分类的基础之上提出了新的修订模型 这种新模型依旧认为在分裂细胞中主要是由 DNMT1 蛋白与 UHRF1 和 PCNA 一起对细胞 DNA 进行甲基化修饰, 不过 DNMT3A 和 DNMT3B 这两种如图 2a 所示能够与含有甲基化 DNA 的核小体紧密结合的从头开始 DNMT 蛋白也能结合到甲基化区域, 给复制叉上那些 DNMT1 蛋白遗漏的位点 补上 甲基化修饰 最后来介绍一下 DNMT2 蛋白, 虽然它含有所有传统 DNMT 蛋白应该具备的催化基序, 但是却没有表现出丝毫的催化活性, 不过也有人报道 DNMT2 蛋白也可以甲基化修饰 trnaasp DNMT 蛋白和其它表观遗传学修饰因子之间的相互作用在 DNA 甲基化研究领域里最吸引人的问题之一, 就是 DNA 甲基化修饰机制是如何定位到基因组中特定的区域 ( 序列 ) 上的 现在已经提出了好几种机制, 主要都涉及 DNMT 蛋白和其它表观遗传学修饰因子之间的相互作用 ( 图 2) 最近又发现了 sirna 介导的依赖 RNA 的 DNA 甲基化修饰机制 (sirna-mediated RNA-directed DNA methylation) 在植物细胞里, 这种 RNA 介导的 DNA 甲基化过程是分步式的, 第一步反应是双链 RNA 将 DNMT 酶招募到基因组的特定区域 ( 不仅是启动子区域, 还包括重复序列等 ), 从头开始催化 DNA 甲基化 虽然植物细胞里发生的这一步骤已经被研究清楚了, 而且也在哺乳动物细胞里发现了一些保守的 RNA 介导的 DNA 甲基化因子, 但我们还是不知道在哺乳动物细胞里是否存在类似的甲基化修饰机制 到目前为止还没有发现 lincrna 是否参与了 DNA 甲基化修饰作用 开发研究和分析 DNA 甲基化组的工具为保证表观遗传学研究能够继续发展, 我们迫切需要开发出新的研究技术手段和高效率的 15

19 生命奥秘 分析工具 大规模平行测序技术 (Massive parallel sequencing) 可以为我们提供大量的序列数据信息, 但是该技术目前还存在精确度的问题 数据解析问题以及费用昂贵的问题, 所以还不太能够用于要求单碱基精确度高的 DNA 甲基化组研究工作当中 除了这些以测序技术为基础的研究手段之外, 最近又出现了精密的甲基化芯片 (refined methylation arrays), 该产品也可以帮助科研人员解决一部分基因组问题 图 2 图示介绍了各种表观遗传学修饰机制以及各种表观遗传学修饰因子之间的相互作用关系 表观遗传学标志物是由各种不同的表观遗传学修饰复合体作用形成的, 图中介绍了各个复合体的组成单位 a-c 分别介绍了依赖于各种不同修饰机制的表观遗传学调控作用 :a:dna 甲基化修饰机制,b: 各种组蛋白修饰机制,c: 核小体定位机制 各种不同的修饰因子相互作用之后得到了总的表观遗传学修饰结果 图中展示了几种表观遗传学修饰因子之间可能存在的相互作用机制 1.2 组蛋白修饰组蛋白是表观遗传学领域里非常活跃的一员 几种重要的组蛋白 H2A H2B H3 和 H4 互相组合可以形成 H2A-H2B 二聚体和 H3-H4 四聚体, 两个 H2A-H2B 二聚体和一个 H3-H4 四聚体组成了核小体 147bp 长的 DNA 链围绕核小体这个组蛋白八聚体缠绕 1.65 圈, 平均每两个核小体之间 16

20 距离 50bp 长的 DNA 片段 这些组蛋白除了没有具体结构的 N 末端之外, 大部分都形成了球形蛋白 组蛋白 H1 又被称作链接组蛋白 (linker DNA), 它不参与核小体的组成, 与两个核小体之间的链接 DNA 相结合, 主要负责封闭 DNA 进出核小体的部位 所有的组蛋白都会发生转录后修饰 有好几种转录后修饰都发生在组蛋白的末端, 比如乙酰化修饰 甲基化修饰 磷酸化修饰 泛素化修饰 苏素化修饰 ADP 核糖基化 (ADPribosylation) 修饰等 ( 图 3) 组蛋白修饰在基因转录调控 DNA 修复 DNA 复制 可变剪接以及染色体压缩等众多细胞事件中都起到了非常重要的作用 人类基因组按照转录状态可以大致分为积极转录的常染色质和不积极转录的异染色质 常染色质有一个非常明显的特征, 那就是乙酰化修饰程度以及 H3K4 H3K36 H3K79 三甲基化修饰程度较高 与此相反, 异染色质的乙酰化修饰程度较低, 不过 H3K9 H3K27 和 H4K20 甲基化修饰的程度较高 最近有研究表明, 可以根据组蛋白的修饰水平来预测基因的表达水平 积极转录的基因其启动子内 H3K4me3 H3K27ac H2BK5ac 和 H4K20me1 等表观遗传学修饰的程度都很高, 同样积极转录的基因小体中 H3K79me1 和 H4K20me1 甲基化修饰的程度也很高 ( 图 4) 图 3 各种组蛋白修饰方式图示 图中以不同的颜色分别表示了几种最常见的修饰方式, 乙酰化修饰 ( 蓝色 ) 甲基化修饰 ( 红色 ) 磷酸化修饰 ( 黄色 ), 泛素化修饰 ( 绿色 ) 图中每一个氨基酸下面灰色的数字表示这些氨基酸在组蛋白中的位置 17

21 生命奥秘 图 4 核小体定位模式图 核小体的位置在基因转录调控机制中也起到了重要的作用 在转录活化基因启动子的 5 端和 3 端非翻译区中都是不含核小体的, 这样就为转录装置的组装和拆解提供了充足的空间 如果在 TSS 的上游没有核小体出现, 那么该基因就是活化的, 相反, 如果有核小体出现, 那么该基因的表达就被抑制了 由于 DNA 甲基化作用也能调控基因转录, 因此这会干扰核小体的位置效应 甲基化的 DNA 似乎与 关闭的 染色质结构域有关, 因为这些区域的 DNA 都会紧密压缩成核小体, 所以都是无法进行转录的 与此相反, 未发生甲基化修饰的 DNA 则与 开放的 染色质结构域有关, 这些区域都是可以进行转录的 M: 甲基化修饰 A: 乙酰化修饰 现在, 有关异染色质的观念又有了新突破, 按照传统的定义, 异染色质应该是不发生转录的, 不过最近发现其实有很多非编码 RNA(ncRNA) 都源自异染色质区域 比如, 稷酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe) 的着丝粒区域就能够表达 sirna 这种 sirna 可以与 RNA 诱导的转录沉默复合体结合, 特异性地发挥基因表达沉默作用 这种 RNA 诱导的转录沉默复合体参与了着丝粒重复片段的 H3K9 甲基化修饰过程, 也参与了组蛋白甲基化酶 Clr4( 该酶是异染色质结构域扩散所必须的 ) 的招募过程 这种着丝粒 sirna 并不是唯一参与组蛋白表观遗传学修饰过程的非编码 RNA 在人体中还有其它几种 ncrna 也都具有这种作用, 比如 XIST 和 HOTAIR XIST 与女性 X 染色体的失活作用有关, 它可以招募具有甲基转移酶活性和组蛋白泛素酶活性的多梳蛋白抑制复合体 (Polycomb-repressing complexes, PRC) HOTAIR 是转录自 HOXC 簇的 lincrna, 它可以招募组蛋白甲基转移酶 PRC2 抑制 HOXD 簇中基因的转录 我们上面介绍的都是转录后共价修饰方式 最近又发现了一种新型的修饰方式 组蛋白 H3 的尾部从 21 位丙氨酸处就被切断了, 去掉了 N 末端的 21 个氨基酸以及这段序列上的转录后修饰物 这种修饰方式是第一个被报道的大规模清除组蛋白修饰标志物的机制 H3K4me 似乎可以抑制这种 H3 蛋白剪切机制 组蛋白可以自动地在好几个位点发生转录后修饰 构成核小体的每一种核心组蛋白都能进行好几种修饰, 这样, 不同修饰物之间就能够发生相互作用了 这些修饰物间的相互作用可以发生在同一位点处, 同一组蛋白的末端, 也可发生于不同组蛋白的末端之间 ( 图 2b) 因此, 一个组蛋白修饰分子并不能决定这个组蛋白最后的作用, 这是一个核小体内或一段区域里所有修饰物共同作用的最终结果 最近发表的一篇论文介绍了多达 51 种 染色质状态, 这么多的 18

22 状态就是各种组合的组蛋白修饰物共同作用的结果 每一种染色质状态都会形成一种生物学作用 在胚胎干细胞里还发现了一种有趣的情况, 那就是组蛋白修饰物的共存现象 (co-existing histone modification) 这是一种 二价结构域 (bivalent domain), 在与发育相关的基因启动子里既存在促进表达的 H3K4me3 修饰物又存在抑制表达的 H3K27me3 这种二价结构域让胚胎干细胞能够严密地调控细胞发育基因的表达, 可以在各个不同的发育阶段快速启动相关基因表达, 当细胞分化成熟之后又能迅速地关闭这些基因 正如前面提到的那样, 所有的表观遗传学修饰因子之间都会发生相互作用 比如, 组蛋白修饰物和 DNA 甲基化修饰物之间就存在着有趣的相互作用, 这就是 DNMT3L 蛋白和 H3K4 之间的相互作用 DNMT3L 蛋白可以特异性地与组蛋白 H3 的末端发生相互作用, 招募 DNMT3A 蛋白对 DNA 发挥从头开始的甲基化修饰作用 不过, 这种相互作用会受到 H3K4me 的强烈抑制 另外, 几种组蛋白甲基转移酶也能够招募 DNMT 蛋白到基因组中特定的位点, 指导 DNA 的甲基化修饰作用, 以这种方式来实现抑制性组蛋白修饰物 (repressive histone mark) 的基因表达抑制作用 此外, 组蛋白甲基转移酶和去甲基酶也能控制 DNMT 蛋白的稳定性, 这也是一条控制 DNA 甲基化水平的途径 ( 图 2b) 另一方面,DNA 甲基化也能影响组蛋白的修饰过程 比如, 甲基化的 DNA 可以通过招募 MeCP2 的方式影响 H3K9me 的修饰过程 前面已经介绍了许多催化共价修饰的转录后修饰酶 因为表观遗传学修饰过程是一个动态的过程, 所以还需要了解一些去除转录后修饰作用的酶 不过, 组蛋白修饰酶和去修饰酶的数目总在增加, 似乎看不到尽头 组蛋白甲基转移酶 去甲基化酶和激酶是组蛋白亚单位和位点高度特异性的几种酶 而绝大部分的组蛋白乙酰转移酶 (histone acetyltransferases, HAT) 和组蛋白脱乙酰基酶 (histone deacetylases, HDAC) 的特异性可就没那么高了, 这些酶能够对多个位点进行修饰 据报道, 许多转录共激活因子 (transcriptional co-activator), 比如 GCN5 PCAF CBP p300 Tip60 和 MOF 等都具有 HAT 酶活性, 而很多转录共抑制复合体 (transcriptional co-repressor complex), 比如 msin3a NCoR/SMRT 和 Mi-2/NuRD 等组成的亚单位则具有 HDAC 酶活性 令人惊讶的是, 最近发现 HDAC 和 HAT 都靶向被磷酸化 RNA 聚合酶 II 所激活基因的转录区域 在人类基因组中, 绝大多数的 HDAC 都会去除活化基因位点上的乙酰化修饰, 使染色质 复位, 而 HAT 的作用刚好相反, 它们主要负责激活基因的转录 1.3 核小体定位核小体是基因转录的障碍, 因为它可以阻止转录活化因子和转录因子与 DNA 靶位点结合, 还可以 占据 聚合酶, 抑制转录产物的延伸 DNA 包装成核小体的过程会对基因转录的各个阶段造成影响, 从而影响基因的表达 其中核小体的在转录起始位点 (transcription start sites, TSS) 附近的定位对基因转录起始的影响作用尤其巨大 在基因组中的任何位点都有可能会出现核小体 核小体哪怕只置换掉 TSS 中 30bp 的片段也会彻底改变 RNA 聚合酶 II 的活性 另外, 基因的 5 端和 3 端中都有不含核小体的区域, 这些区域为转录装置的组装和解离提供了空间 在 TSS 的上游如果没有核小体存在, 那么该基因就会被激活, 如果 TSS 被核小体封闭, 那么该基因的表达就会被抑制 ( 图 4) 核小体的位置不仅决定了转录因子是否能够进入 DNA 靶位点, 也决定了 DNA 的甲基化修饰情况 ( 图 4) 除了转录调控作用之外, 核小体定位机制还直接影响了减数分裂重组事件 19

23 生命奥秘 核小体的功能会受到各种组成核小体的组蛋白变异体的影响 这些组蛋白变异体与核心组蛋白不同, 因为这些变异体是在 S 期外表达的, 所以它们掺入染色质是与 DNA 复制无关的 而且这些突变体的末端 结构域的结构以及少数几个关键的氨基酸也都与正常的核心组蛋白不同 组蛋白变异体能够调控核小体的位置和基因表达水平 比如 H2A.Z 突变体的掺入可以阻止基因 DNA 被甲基化修饰 因此, 各种表观遗传学修饰因子间相互作用的影响力就更大 核小体重构机制也受到了 DNA 甲基化过程的影响, 同时也与几种组蛋白修饰过程有关 ( 图 2c) mirna 也能够调控组蛋白变异体的置换过程, 还能与染色质重构复合体发生相互作用, 介导复合体的组成亚单位发生交换 现在已经知道有好几种大分子复合物可以借助水解 ATP 的方式对核小体进行移动 重构 解离或者使其失稳 我们将这些复合体称为染色质重构复合体 (chromatin remodeling complex) 它们可以分为四大类, 分别是 SWI/SNF ISWI CHD 和 INO80, 所有的染色质重构复合体都含有相似的 ATP 水解酶结构域, 只是构成复合体的其它亚基有所差异, 每一种复合体都含有自身特有的组成亚单位 在 SWI/SNF 家族中所有的成员都具有 BRM 催化亚单位或者 BRG1 催化亚单位, 这两种亚单位有 75% 的相似度, 只不过在前 60 个氨基酸上有所差异 SWI/SNF 复合体是最主要的基因表达调控因子, 它可以对 FOS CSF-1 CRYAB MIM-1 p21( 又名 CDKN1A) HSP70 VIM 以及 CCNA2 等基因的表达进行调控 另外, 还有报道称 SWI/SNF 复合体可以调控可变剪接过程 在 ISWI 家族成员中有很多都能促进染色质的组装, 抑制基因转录, 比如 ACF 复合体和 CHRAC 复合体等等 不过, 同属于 ISWI 家族的 NURF 复合体却能够激活 RNA 聚合酶 II, 促进基因的转录 在 CHD 家族中, 有一些成员参与了核小体的移动和脱离过程, 所以能够促进基因转录, 还有一些复合体, 比如 Mi-2/NuRD 等因为含有 HDAC 酶活性和 MBD 蛋白组份, 所以能够抑制基因转录 ( 图 2c) 最后再来介绍一下 INO80 家族, 该家族成员参与了多个细胞事件, 比如基因转录激活 DNA 修复 端粒调控 染色体分离以及 DNA 复制等等 不过, 其中的 SWR1 复合体具有一项特有的功能, 即核小体重构功能, 它可以以 H2A.Z-H2B 二聚体取代核小体中的 H2A-H2B 二聚体 ( 图 2c) 2. 肿瘤细胞中的表观遗传学修饰情况 在肿瘤细胞里除了存在经典的基因突变情况之外, 现在又发现了非常明显的表观遗传学修饰方面的紊乱情况 ( 表 1) 肿瘤表观基因组学(cancer epigenome) 的一大特点就是 DNA 甲基化 组蛋白修饰模式以及染色质修饰酶的表达情况全都发生了整体性的改变, 这些表观遗传学方面的改变在肿瘤的发生和发展过程中也都起到了非常重要的作用 20

24 表 1 各种人类疾病与表观遗传学修饰作用的关系 发生改变的表观遗传学修饰标志物 肿瘤类疾病 出现的变化后果受影响的基因以及所导致的疾病 CpG 岛超甲基化修饰 基因转录抑制 MLH1 基因 ( 结肠癌 子宫内膜癌 胃癌 ) BRCA1 基因 ( 乳腺癌 卵巢癌 ) MGMT 基因 ( 多种肿瘤 ) p16ink4a( 结肠癌 ) DNA 甲基化修饰 CpG 岛去甲基化修饰 基因转录激活 MASPIN 基因 ( 前列腺癌 ) S100P 基因 ( 前列腺癌 ) SNCG 基因 ( 乳腺癌 卵巢癌 ) MAGE 基因 ( 黑色素瘤 ) CpG 岛海滩超甲基化修饰 基因转录抑制 HOXA2 基因 ( 结肠癌 ) GATA2 基因 ( 结肠癌 ) 重复序列去甲基化修饰 基因组位点转座 重组, 基因组失稳 L1 基因 IAP11 Sat2 基因 H3 组蛋白和 H4 组蛋白去乙酰化修饰 基因转录抑制 p21waf1 基因, 又名 CDKN1A 基因 组蛋白修饰 H3K4me3 修饰缺失基因转录抑制 HOX 基因 H4K20me3 修饰缺失 丧失了异染色质结构 Sat2 D4Z4 基因 出现 H3K9me 和 H3K27me3 修饰 重构亚单位发生突变或转录抑制 基因转录抑制 通过各种作用导致细胞发生致癌性转化 CDKN2A RASSF1 基因 BRG1 CHD5 基因 核小体位置 神经系统疾病 重构因子招募异常基因转录抑制 PLM-RARa103 招募 NuRD 突变组蛋白替换正常组蛋白 具有各种作用, 比如加快细胞周期, 使染色体边界失稳等等 H2A.Z 蛋白过表达或缺失 CpG 岛超甲基化修饰基因转录抑制 NEP 基因 ( 阿兹海默症 ) DNA 甲基化修饰 CpG 岛去甲基化修饰基因转录激活 PADI2 基因 ( 多发性硬化症 ) 重复序列发生异常甲基化修饰 基因组位点转座 重组, 基因组失稳 亚端粒重复序列 (ATRX 综合症 ) 续下 21

25 生命奥秘 接上 发生改变的表观遗传学修饰标志物 出现的变化后果受影响的基因以及所导致的疾病 异常的乙酰化修饰多种作用帕金森氏症 亨廷顿氏舞蹈症 组蛋白修饰 异常的甲基化修饰多种作用亨廷顿氏舞蹈症 Friedreich 氏共济失调 异常的磷酸化修饰多种作用阿兹海默症 核小体位置 三核苷酸重复序列位置错误 使染色质结构域关闭 先天性肌强直营养不良 自身免疫性疾病 CpG 岛超甲基化修饰基因转录抑制 DR3 基因 ( 类风湿性关节炎 ) DNA 甲基化修饰 组蛋白修饰 CpG 岛去甲基化修饰 重复序列发生异常甲基化修饰 异常的乙酰化修饰 基因转录激活 基因组位点转座 重组, 基因组失稳 多种作用 PRF1 CD70 CD154 AIM2 基因 ( 系统性红斑狼疮 ) Sat2 Sat3 基因 ( 血管内凝血及纤维蛋白溶解综合征 ) L1 基因 ( 类风湿性关节炎 ) CD154 IL10 IFN-γ 基因 ( 系统性红斑狼疮 ) 异常的甲基化修饰多种作用 CLTA4 IL6 基因 (I 型糖尿病 ) 异常的磷酸化修饰多种作用 NF-κB 靶基因 ( 系统性红斑狼疮 ) 核小体位置 17q12-q21 区域里的 SNP 在核小体分布上表现出等位基因特异性的差异 CLTA4 IL6 基因 (I 型糖尿病 ) 突变组蛋白替换正常组蛋白 干扰正常的重构过程 NF-κB 靶基因上出现组蛋白突变体 macroh2a 蛋白 ( 类风湿性关节炎 ) 2.1 DNA 甲基化改变情况肿瘤细胞的一大特点就是基因组 D N A 发生了大量的去甲基化修饰, 大约 损失了 20%~60% 的 5 甲基胞嘧啶 与此同时, 在某一些启动子里又会出现 CpG 岛特异性的超甲基化现象 ( 图 1a) 在肿瘤细胞里整体性的去甲基化修饰主要发生在重复片段区域里, 因此出现了转座 基因破坏 内部寄生序列激活等等一系列的染色体失稳现象 ( 图 1d) 比较明确的例子就是 LINE 家族成员 L1 在包括乳腺癌 肺癌 肝癌 膀胱癌等多种肿瘤细胞里都会出现去甲基化的情况 某些启动子内的去甲基化修饰会激活癌基因, 使其异常表达, 还会使某些基因位点失去基因印记作用 (loss of imprinting, LOI) 比如,MASPIN( 又名 SERPINB5) 基因就是一个抑癌基因, 它在乳腺癌和前列腺上皮细胞癌中都会发生超甲基化修饰, 但在另一些肿瘤细胞里却又 22

26 发生了去甲基化修饰 MASPIN 基因的去甲基化修饰程度以及随之升高的基因表达水平是与肿瘤细胞去分化的程度相适应的 前列腺肿瘤细胞里的 S100P 基因, 乳腺癌细胞核卵巢癌细胞里的 SNCG 基因以及黑色素瘤细胞里的黑色素瘤相关基因 (melanoma-associated gene, MAGE) 与二肽基肽酶 6(dipeptidyl peptidase 6, DPP6) 等都是目前已经被研究得非常清楚的在肿瘤细胞中会发生去甲基化修饰的基因 最常见的由胰岛素样生长因子 2 基因 (insulin-like growth factor 2, IGF2) 去甲基化而导致的基因印记缺失事件就可见于多种肿瘤细胞里, 比如乳腺癌 肝癌 肺癌和结肠癌等等 与基因组 DNA 整体呈现低甲基化水平的情况不同的是, 在某些 CpG 岛上也能发现超甲基化位点 ( 图 1a) 这些启动子超甲基化后会抑制基因转录, 受其影响的基因涵盖了各个主要的细胞通路, 比如 DNA 修复通路中的 hmlh1 MGMT WRN 和 BRCA1 基因 ; 维生素反应通路中的 RARB2 CRBP1 基因 ;Ras 信号通路中的 RASSFIA NOREIA 基因 ; 细胞周期调控通路中的 p16ink4a p15ink4b 和 RB 基因 ;p53 网络中的 p14arf p73( 又名 TP73) HIC-1 基因以及凋亡通路中的 TMS1 DAPK1 WIF-1 和 SFRP1 基因等等 这些超甲基化的启动子也被看做为一大类生物标志物, 它们在临床实践中具有很大的诊断价值和预后疗效估计价值 不过, 即便大家都把关注的焦点放到了启动子中的 CpG 岛上, 最近还是有人发现, 在肿瘤细胞里绝大多数的异常 DNA 甲基化都发生在 CpG 岛海滩上 ( 图 1b) 值得注意的是, 在这些发生在 CpG 岛海滩上的异常甲基化中, 有 45~65% 的改变似乎都与正常组织分化过程中出现超甲基化的区域有关, 比如 TGFB1 基因和 PAX5 基因区域等 这种 DNA 甲基化改变情况出现分化的现象似乎与 CpG 岛海滩上基因的表达有关, 就像 CpG 岛基因一样 人体肿瘤还有一个特点那就是 mirna 的表达会整体下调, 这通常也是因为 mirna 启动子发生超甲基化修饰导致的 比如,miR-124a 基因就是被超甲基化抑制的实例, 该基因产物能够介导 CDK6 基因的激活和 Rb 蛋白磷酸化 有趣的是, 这种因为超甲基化导致的 mirna 表达失活不仅与肿瘤发生发展有关, 还与肿瘤的转移有关 mir-148 mir-34b/c 和 mir-9 等基因同样也会因为启动子超甲基化修饰被抑制, 它们也同样与肿瘤原发灶的转移有关 每一种肿瘤都有各自特异性的超甲基化模式, 不过我们现在还不清楚为什么只在那些特定的区域里会发生超甲基化修饰, 在其它的区域则不会 有一种可能就是某一些基因的失活会让肿瘤细胞获得生长优势, 即克隆选择优势 在某些情况下, 异常的 CpG 岛甲基化修饰是因为 DNMT 蛋白和 HDAC 蛋白被 PML RARA( 该蛋白在白血病肿瘤细胞里表达 ) 等融合蛋白招募到特定基因位点作用的结果 还有一种可能, 就是甲基化修饰作用会从高度甲基化修饰的序列向周围扩散, 这在肿瘤细胞里也是非常常见的一种情况 有报道称 DNA 甲基化修饰导致的基因表达沉默作用可以在染色体上扩散, 其范围可以覆盖 1Mb 的区域, 这有点像人体肿瘤细胞中常见的杂合性消失的情况 这种 DNA 甲基化模式整体紊乱的情况也有可能是 DNMT 酶表达失控导致的 比如,DNMT1 蛋白和 DNMT3b 蛋白在许多肿瘤细胞里都会过量表达 另外,DNMT 蛋白的表达还会受到 mirna 分子的调控 比如,miR-29 家族成员就能够直接下调 DNMT3A 蛋白和 DNMT3B 蛋白的表达, 间接调控 DNMT1 蛋白的表达 ( 图 2a) 2.2 组蛋白修饰的改变情况 在肿瘤细胞中最明显的组蛋白修饰改变情况就是单乙酰化修饰的 (monoacetylated) H4K16 大量减少 这种去乙酰化作用是 HDAC 蛋白介导的, 该蛋白在多种肿瘤细胞里都会过表 23

27 生命奥秘 达或者发生突变 Sirtuin 家族的 HDAC 蛋白是参与肿瘤细胞去乙酰化作用的主要蛋白 在好几种肿瘤细胞里 SirT1 蛋白的去乙酰化活性以及促进基因表达的作用都有所上调 SirT1 蛋白能与 DNMT1 蛋白发生相互作用, 从而影响 DNA 的甲基化修饰模式 HDAC 蛋白的表达会受到 mirna 分子的调控, 比如在前列腺癌细胞中,miR-449a 因子可以抑制 HDAC-1 蛋白的表达, 调控肿瘤细胞的生长和活性 ( 图 2b) 除了 HDAC 的表达情况会有所改变之外, 在结肠癌 肺癌 白血病以及子宫癌等好几种肿瘤细胞里还会导致与 HAT 基因或与 HAT 相关的基因出现转座的情况, 形成异常的融合蛋白, 或者导致基因突变 缺失等情况, 这些改变最终都会导致组蛋白乙酰化修饰整体水平失衡的情况出现 除了单乙酰化修饰的 H4K16(H4K16ac) 大量减少之外, 肿瘤细胞还会大量缺失活性标志物 H3K4me3 以及抑制性标志物 H4K20me3, 同时另一些抑制性标志物, 比如 H3K9me 和 H3K27me3 会大量出现 肿瘤细胞里这些组蛋白甲基化标志物发生改变的现象主要是组蛋白甲基转移酶和组蛋白去甲基酶异常表达的结果 最近发表的一篇论文报道, 在肾癌细胞中, 组蛋白甲基转移酶 SETD2 会出现失活突变, 组蛋白去甲基酶 UTX 和 JARID1C 也会出现同样的突变 另一个例子与组蛋白甲基转移酶 EZH2 相关 该蛋白是 PRC2 和 PRC3 复合体的亚基, 它在好几种肿瘤细胞里都会过表达, 促进细胞的增殖和肿瘤灶的形成 在乳腺癌原发灶和转移灶细胞里, lincrna 编码基因 HOTAIR 的过表达就会重新靶向 PRC2 复合体, 改变 H3K27me3 的水平 另外,EZH2 蛋白的表达水平在很多肿瘤细胞里都会上调, 这是因为这些肿瘤细胞基因组中 mir- 101 基因缺失的缘故 EZH2 蛋白除了具有组蛋白甲基转移酶活性之外, 还能够与 DNMT 蛋白发生相互作用, 直接控制 DNA 的甲基化修饰过程 NSD1 蛋白也是组蛋白甲基转移酶, 据报道, 该蛋白在成神经细胞瘤细胞里会遭受启动子 DNA 甲基化依赖性的抑制 DOT1L 蛋白是主要的 H3K79 组蛋白甲基转移酶, 它对于常染色质的形成非常重要, 所以可以帮助抑癌基因的表达 在白血病肿瘤方面, 混合性白血病 (mixed lineage leukemia, MLL) 癌蛋白融合的情况 (fusion oncoprotein) 会导致 H3K79 和 H3K4 出现异常的甲基化修饰, 改变 MLL 细胞基因的表达水平 在前列腺癌和鳞癌等好几种肿瘤细胞里还发现有一些组蛋白去甲基酶, 比如 GASC1 LSD1 mjc 和 UTRX 等的表达水平也会上调或者增高 虽然目前有关组蛋白磷酸化的研究还不够深入, 但是我们可以初步认定组蛋白磷酸化修饰也与肿瘤有关 组蛋白磷酸化修饰主要在 DNA 损伤修复 染色体稳定性和凋亡反应中发挥作用 最近, 有人发现 JAK2 这种非受体酷氨酸激酶 ( 该激酶可以激活胞质信号通路级联反应, 调控多个细胞事件 ) 也会出现在核内, 对 H3Y41 进行磷酸化修饰, 如 ( 图 2b) 磷酸化 H3Y41(H3Y41ph) 的水平是受到细胞因子信号调控的 H3Y41ph 能够阻止异染色质蛋白 1α (heterochromatin protein1α, HP1α) 与 H3Y41ph 所在区域的 H3 蛋白结合, 增加该区域内基因的表达量 比如, 有人曾报道过在 lmo2 基因启动子内发现过这种现象 在血液系统肿瘤细胞里,JAK2 蛋白经常会被染色体转座或点突变激活 2.3 核小体位置的改变情况虽然我们现在还不清楚具体的分子作用机制, 但是可以肯定所有的染色质重构分子都与肿瘤的发生和发展有关 比如,BRG1 和 BRM 蛋白都是 SWI/SNF 复合体中的 ATP 水解酶亚单位, 现在发现这两个蛋白都是肿瘤抑制因子, 但是它们的表达在 15~20% 的原发性非小细胞肺癌中都会被抑制 令人吃惊的是,BRG1 蛋白还具有致癌作用, 它可以使著名的抑癌因子 p53 蛋白失 24

28 稳 SNF5 蛋白也是构成 SWI/SNF 重构复合体的亚单位, 在散发的肾杆状肿瘤 (sporadic renal rhabdoid tumors) 以及脉络丛肿瘤和髓母细胞瘤或中枢性原发神经外胚层肿瘤等细胞中都发现了该蛋白突变的情况 核小体位置发生改变也与启动子超甲基化途径的基因转录抑制有关 ( 图 4) 启动子超甲基化修饰会导致 TSS 被核小体占据, 在结肠癌肿瘤细胞的 MLH1 基因启动子上就能观察到这种现象 在肿瘤细胞中, 编码染色质重构复合体亚单位的基因, 比如 CHD5 基因等也会发生超甲基化修饰, 所以表达水平会下调, 影响正常的染色质重构过程 ( 图 2c) 除了核小体位置发生改变之外, 组蛋白的突变也与肿瘤发生和发展有关 比如, MacroH2A 蛋白的表达量增加就与细胞老化有关 所以高表达 MacroH2A 蛋白的肺癌预后就比较好, 这种肿瘤细胞的增殖速率较慢, 复发率也较低 3. 表观遗传学修饰作用与神经发育紊乱的关系 中枢神经系统是人体内最复杂的一个系统 这不仅是因为在中枢神经系统里每一个不同的区域都会有不同的基因表达模式, 还因为哪怕是不同区域里的同一种细胞也会因为位置的不同而存在不同的转录调控机制 在有丝分裂结束之后, 神经细胞会失去多向分化潜能, 这是神经系统发育过程中最为关键的一个步骤, 需要非常精细的转录调控机制来进行操控 表观遗传学修饰因子就是这个调控机制里关键的调控因子 表观遗传学基因如果发生基因突变就会导致相应的神经系统发育紊乱 接下来, 我们将根据表观遗传学修饰机制突变的情况分类进行介绍 3.1 DNA 甲基化的改变情况 Rett 综合症是一种 X 染色体连锁的神经系统疾病, 该症主要是 MBD 蛋白 MeCP2 发生了点突变导致的 在大脑中,MeCP2 蛋白的表达不论是上调还是下调都会导致神经发育缺陷 传统观点都认为,MeCP2 蛋白是一种基因沉默子, 它可以招募 HDAC 蛋白对 DNA 进行甲基化修饰 ( 图 2b) 不过, 最近的研究发现,MeCP2 蛋白与染色质的结构也有关系, 它可以调控 mrna 的剪接过程, 并且能激活 Sst Gprin1 等基因的转录 虽然许多基因, 比如 Fkbp5 Mobp Ddc 和 S100a9 等以及基因印记区域内的基因, 比如 DLX5 基因或者 mirna 编码基因 mir-184 基因的转录水平都会因为 MeCP2 蛋白而发生改变 然而, 细胞内缺乏 MeCP2 蛋白却并不会让整个基因组的转录水平发生大幅度的改变 现在还不清楚这些基因的转录水平发生改变是不是真的与 MeCP2 蛋白有关 3.2 组蛋白修饰作用改变的影响 Rubinstein-Taybi 综合症是一种常染色体显性疾病 (autosomal dominant disorder) 该疾病与 HAT 蛋白功能障碍有关 Rubinstein-Taybi 综合症是一种病因复杂的疾病, 大约有 55% 的患者会携带 CBP 基因突变, 有 3% 的患者体内 EP300 基因会发生突变, 还有 42% 的患者则根本找不到明显的病因 CBP 蛋白和 EP300 蛋白除了具有 HAT 酶活性之外, 还都是转录共激活因子 在 Cbp+/ 小鼠体内,H2B 蛋白的乙酰化修饰水平会降低 30% 多, 这说明长期记忆形成障碍可能是因为染色质中一个或几个控制记忆存储功能的位点发生表观遗传学改变造成的 另一种神经系统发育疾病 Coffin-Lowry 综合症 是一种非常罕见的 X 染色体连锁疾 25

29 生命奥秘 病, 该疾病主要是由于 RSK2 蛋白发生突变, 丧失了丝氨酸 / 苏氨酸激酶活性造成的 RSK2 蛋白参与了 MAP 激酶信号通路, 可以促使一系列的基因进行短暂的转录 RSK2 蛋白还能够直接介导 H3S10 位点发生磷酸化修饰, 改变染色质的结构, 促进染色质域 CBP 蛋白结合, 从而使 H3 蛋白发生乙酰化修饰 所以,RSK2 蛋白能够通过开放染色质结构的方式促进基因的转录 3.3 核小体位置改变带来的影响作用 ATRX 综合症是一种 X 染色体连锁疾病, 是因为染色质重构因子之一的 Snf2 家族成员 ATRX 蛋白发生突变导致的 ATRX 蛋白能够与组蛋白甲基转移酶 EZH2 的 SET 结构域发生相互作用, 还能够与 Daxx 转录辅助因子 MeCP2 蛋白以及 HP1 蛋白的 chromoshadow 结构域发生相互作用 ATRX 蛋白还参与了众多细胞事件, 比如异染色质组装过程 减数分裂时期纺锤体上的染色体校对过程 (chromosome alignment) 体细胞染色体聚集过程以及女性 X 染色体失活状态的维持过程等 因为在 ATRX 综合症患者体内没有观察到 DNA 修复缺陷或者基因组失稳的现象, 所以 ATRX 蛋白可能具有对某些基因的转录进行调控的作用 虽然在 ATRX 综合症患者体内也没有发现基因组 DNA 整体甲基化水平发生改变的情况, 但有人发现在这类患者体内有一些重复序列发生了异常的甲基化修饰 4. 表观遗传学修饰与神经变性疾病和神经系统疾病的关系最近的研究成果还发现表观遗传学修饰的改变与神经变性疾病 (neurodegenerative diseases) 或神经系统疾病 (neurological diseases) 都有关联 这些发现主要都集中在 DNA 甲基化改变和组蛋白修饰改变这两方面 ( 表 1) 4.1 DNA 甲基化改变的影响作用在许多种神经系统疾病里都能观察到 DNA 甲基化模式发生改变的现象, 主要是 DNA 位点发生超甲基化改变或者低甲基化改变 比如, 在脆性 X 染色体综合征患者体内就能观察到 FMR1 基因启动子超甲基化的现象 脆性 X 染色体综合征是由于 FMR1 基因 5 非翻译区里的 CGG 三核苷酸重复序列大量扩增所致 这些重复序列的拷贝数超过了 200 个, 所以 FMR1 基因发生甲基化修饰, 基因表达被抑制 还有人在阿兹海默症患者体内发现了 NEP 基因 ( 又名 MME 基因 ) 启动子超甲基化的现象, 在 Friedreich 氏共济失调患者体内发现了 FXN 基因启动子超甲基化的现象, 在脊髓性肌萎缩患者体内发现了 SMN2 基因启动子超甲基化的现象 同样, 也发现了很多低甲基化修饰的 DNA 位点 比如, 帕金森氏症患者大脑黑质区里肿瘤坏死因子 α 因为其编码基因启动子低甲基化修饰发生过表达的情况, 所以正常的黑质神经细胞大量凋亡 再比如, 多发性硬化症患者体内的 PADI2 基因启动子区域也会发生低甲基化修饰 ; 在年幼时就遭受应激刺激的小鼠体内 Avp 增强子也会发生低甲基化修饰 这种 DNA 甲基化模式的改变不仅能够影响基因的启动子, 还能够导致基因印记丢失 最经典的基因印记丢失案例就是 Prader-Willi 综合症和 Angelman 综合症, 这两种疾病都是因为染色体 15q11-q13 区域上的基因印记区发生了异常的 DNA 甲基化修饰 Prader-Willi 综合症是因为在该区域的父系基因表达缺失, Angelman 综合症则是因为在该区域的母系基因 UBE3A 表达缺失 26

30 4.2 组蛋白修饰改变的影响作用在神经系统疾病里组蛋白修饰模式也会发生改变, 其中组蛋白低乙酰化 (hypoacetylation) 是最常见的改变形式 肌萎缩性脊髓侧索硬化就是典型的组蛋白低乙酰化修饰的例子 肌萎缩性脊髓侧索硬化患者的胞质中聚集了大量的 FUS 蛋白, 这些 FUS 蛋白能够与 CBP 结合, 对 HAT 酶活性有极强的抑制作用, 负向调控 CREB 靶基因的表达 因此,FUS 蛋白过表达能够导致组蛋白发生低乙酰化修饰 在帕金森氏症 亨廷顿氏舞蹈症和 Friedreich 氏共济失调患者中也都能见到这种组蛋白发生低乙酰化修饰的情况 除了组蛋白低乙酰化修饰之外, 其它类型的组蛋白修饰异常也与神经系统疾病有关 比如, 组蛋白乙酰化和磷酸化修饰改变在阿兹海默症和癫痫症中都是非常常见的,H3K9 超三甲基化修饰 (hypertrimethylation) 也可见于亨廷顿氏舞蹈症和 Friedreich 氏共济失调, 组蛋白去甲基酶 PHF8 则与 X 染色体连锁的精神发育迟缓疾病有关 4.3 核小体位置的影响作用有人认为先天性肌强直性营养不良患者基因组里 CTG 重复序列大量扩增的现象是一个非常强烈的核小体定位信号, 可以促使染色质结构域关闭 不过, 这一观点还需要进一步实验证据的支持 目前还没有多少证据表明核小体位置或者组蛋白突变体与神经系统肿瘤有直接的联系 5. 表观遗传学修饰与自身免疫性疾病之间的关系自身免疫性疾病是因为机体自身抗原的免疫耐受机制被打破而产生的疾病, 研究发现, 各种不同类型的表观遗传学修饰机制也都与自身免疫性疾病有关 ( 表 1) 5.1 DNA 甲基化与自身免疫性疾病之间的关系几乎所有关注表观遗传学与自身免疫性疾病之间关系的研究都会把重点放在 DNA 甲基化修饰异常方面 实际上, 最著名的自身免疫性疾病 免疫缺陷 着丝粒失稳和面部畸形综合症 (immunodeficiency, centromeric instability and facial anomalies syndrome, ICF) 就是因为 DNMT3B 蛋白发生了杂合型突变导致的 ICF 患者在着丝粒旁卫星 2 和 3 重复序列 (pericentromeric satellite 2 and 3 repeats) alpha 卫星序列 (alpha satellite sequences) Alu 序列以及 D4Z4 重复序列和 NBL2 重复序列里都会发生标志性的 DNA 去甲基化修饰 不过, 从整体 DNA 甲基化水平来看,ICF 患者又没有发生明显的改变, 不过与发育 神经发生和免疫功能调控有关的几个基因的表达的确出现了异常 另一种自身免疫性疾病, 比如系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎等的发生虽然与 DNA 甲基化修饰装置的突变无关, 但是基因组仍旧呈现出整体去甲基化的现象 现在还没有确定这些疾病基因组中究竟是哪些区域出现了去甲基化修饰, 只是有几个研究发现了去甲基化修饰的位点 在系统性红斑狼疮患者体内,PRF1 CD70 CD154 IFGNR2 MMP14 LCN2 CSF3R 和 AIM2 基因以及 18S 28S 核糖体 RNA 基因启动子等区域会出现 DNA 去甲基化修饰的现象 最近的研究成果开始逐渐能够解释为什么会发生如此大范围的去甲基化修饰现象了 有人对系统性红斑狼疮进行研究发现,miR-21 基因和 mir-148a 基因能够直接和间接地作用于 27

31 生命奥秘 DNMT1 基因, 这可能对基因组去甲基化起到了一定的作用 在类风湿性关节炎患者体内, 不仅 能够见到去甲基化修饰的位点, 还能发现超甲基化修饰的位点 5.2 组蛋白修饰与自身免疫性疾病之间的关系现在有关组蛋白修饰与自身免疫性疾病之间关系的研究发现还不太多, 只有少数几个项目刚刚开始进行相关方面的研究 在系统性红斑狼疮患者的 T 细胞里,HDAC 抑制因子曲古抑菌素 A(trichostatin A) 可以恢复 CD154 基因 IL10 基因以及 IFN-γ 的异常表达 在类风湿性关节炎患者体内也发现了组蛋白修饰机制的作用 因为转录因子 NF-κB( 它同时也是非常重要的免疫调控因子 ) 能够与核小体 DNA 发生非常松散的结合, 同时组蛋白修饰机制又能够促使 NF-κB 与其靶因子组蛋白 H3K9 和 S10( 又名 PSMD6) 磷酸乙酰化修饰 (phosphoacetylation) 位点有效结合, 所以能够降低 H3K9 的甲基化修饰水平, 增加 H3 H4 蛋白的乙酰化修饰水平 因此, 在类风湿性关节炎患者体内,HDAC 酶活性降低这一现象就对 NF-κB 介导的基因表达机制起到了非常关键的调控作用 I 型糖尿病患者也表现出了特征性的组蛋白修饰异常现象, 在这类患者中淋巴细胞 ( 不是单核细胞 ) 内部分与自身免疫及炎症信号通路相关基因, 比如 CLTA4 基因和 IL6 基因的 H3K9me2 修饰水平会上升 不过, 组蛋白修饰机制也不光是在基因转录调控过程中发挥作用 对于系统性红斑狼疮患者来说, 核小体就是一种非常重要的自身循环抗原, 这是因为细胞凋亡增加以及清除不够导致的 在凋亡过程中组蛋白会发生各种修饰, 比如 H2BS14 位点磷酸化修饰 H3T45 磷酸化修饰 H3K4 位点三甲基化修饰 H4K8 K12 K16 位点三乙酰化修饰以及 H2BK12 位点乙酰化修饰等等 有观点认为, 在细胞凋亡阶段发生的组蛋白修饰会使释放出的凋亡核小体更具有免疫原性, 激活抗原呈递细胞, 导致自身抗体生成 5.3 核小体位置与自身免疫性疾病之间的关系现在还没有研究能够将核小体位置与自身免疫性疾病联系起来 不过, 最近有研究发现, 在 17q12-q21 染色体区域里的 SNP 会促使核小体分布出现等位基因特异性的差异, 这种 SNP 多态性与多种自身免疫性疾病有关, 比如哮喘 I 型糖尿病 原发性胆汁性肝硬变以及克隆氏病等等 此外, 在类风湿性关节炎里, 组蛋白突变体 macroh2a 掺入核小体中也会影响核小体与转录因子 NF-κB 的结合, 阻碍 SWI/SNF 复合体依赖的重构过程 6. 结论及展望在最近这 10 年里, 表观遗传学研究领域取得了飞速的发展, 已经走上了科学发展的成熟道路, 仅仅用 表观遗传学 作为关键词在 PubMed 数据库里搜索一下就可见一斑 在 1999 年只发表了大约 200 篇论文, 可到了 2009 年这个数字猛增到 2500 之多 这种论文数量上爆炸性的增长就能很好地表明这些年在表观遗传学研究领域取得的成绩 很大一部分工作都是有关正常组织和病理组织中表观遗传学修饰的 到目前为止, 在表观遗传学研究领域里最受关注的还是肿瘤与表观遗传学的关系, 但是随着表观遗传学研究的进展, 也有人开始把目光转向其它疾病, 尤其是神经系统疾病和自身免疫性疾病 在其它疾病当中也能发现表观遗传学修饰发生改变的情况, 比如心血管系统疾病 代谢性疾病 肌病 28

32 (myopathies) 以及通过人工生育技术辅助诞生的婴儿等等 最近几个月我们迎来了一系列的新发现, 比如人类及病毒 DNA 甲基化组图谱诞生 提出存在非 CpG 甲基化的可能性 CpG 岛海滩的发现 在肿瘤之外的疾病当中发现异常 DNA 甲基化修饰情况 发现了新的组蛋白修饰机制及其相关作用 发现了组蛋白突变体及其相关作用 发现了 DNA 去甲基酶 Tet1 蛋白和组蛋白激酶 JAK2 蛋白等新的表观遗传学修饰因子 发现了新的表观遗传学修饰因子突变情况以及发现了 RNA 介导的表观遗传学调控机制等等 不过, 仍旧存在许多重要的问题等待我们解决, 比如在人体细胞里非 CpG 甲基化以及 5 羟甲基胞嘧啶的作用是什么? 还会不会发现新的 DNA 修饰或者组蛋白修饰方式? 所谓的组蛋白密码 (histone code, 该假说认为组蛋白末端的共价修饰方式也是一种遗传密码, 它对于染色质结构 基因表达等都能起到调控作用 ) 的编码规则是什么?ncRNA 的作用是什么, 扮演了哪种角色? 还有多少种 ncrna 没有被发现? 表观遗传学标志物的排布是怎么样的, 相关的调控机制又是怎么样的? 我们该如何区分哪些表观遗传学修饰作用的改变是起到决定性作用的, 哪些又只是次要的 旁观者? 我们是不是一直都能很清楚的进行这样的区分, 知道哪些改变是 因, 哪些改变是 果? 在众多的问题当中, 最吸引人的就是各种表观遗传学因子之间是如何发生相互作用, 又是什么机制赋予这些修饰因子序列特异性的? 接下来, 科学家将针对上述这些问题开展深入的研究, 只有解决了这些问题才能帮助我们更好地认识表观遗传学调控机制 科学技术的进步使得表观遗传学分析领域也步入了大规模研究时代 第一份全基因组 高分辨率的表观遗传学修饰图谱已经诞生, 但我们绝不能够满足于这么一点点的成就, 就此止步不前 我们还需要为健康组织和病理组织构建出更详细的人类 DNA 甲基化组图谱 组蛋白修饰图谱以及核小体位置图谱 从这个目的出发, 人们已经成立了好几个国际性的研究项目, 其中包括 NIH 的表观基因组路线图项目 ENCODE 项目 AHEAD 项目以及表观基因组 NCBI 浏览器项目等等 这些表观遗传学图谱对于基础研究以及应用研究都有着不可估量的巨大价值, 也可以帮助我们针对最有潜力的表观遗传学位点进行药物开发 未来研究中一个关键的主题就是通过什么样的机制, 如何将全基因组甲基化图谱和组蛋白修饰图谱纳入到公共数据库当中 原文检索 : Anna Portela1 & Manel Esteller. (2010) Epigenetic modifications and human disease. Nature Biotechnology, 28(10): YORK/ 编译 29

33 生命奥秘 为了及时收集生命科学最新资讯 提高 生命奥秘 办刊质量, 现 面向从事生命科学或对这学科有浓厚兴趣的科研人员 学生诚聘特约编 辑 ( 兼职 ) 职位职责 : 独立完成 生命奥秘 专题的策划 : 对基因组学 蛋白组学 生物信息学和细胞生物学等学科的发展以及生物医学领域相关技术 ( 例如基因诊断技术 干细胞和克隆技术 生物芯片技术等 ) 的应用进行翻译及深入评述 选题要求内容新颖 评述精辟 注重时效和深入浅出 尤其欢迎以自身系统研究为基础的高水平译述与评论, 结合所从事的科研工作提出自己的见解 今后设想或前瞻性展望 要求 : 1. 具备基因组学 蛋白组学 生物信息学 细胞生物学等生命科学学科背景 ; 2. 具备良好的生命科学前沿触觉 ; 3. 具备较高的外文文献翻译 编译水平 ; 4. 具备较强的选题策划 资料搜集 组织能力, 以及专业稿件撰写能力 ; 5. 具有高级职称 ; 或者拥有 ( 正在攻读 ) 该领域的最高学位 有意者请将个人简历发送至 editor@lifeomics.com 联系人 : 蔡小姐 30 30

34 三 表观基因组学研究意义探讨 基因组功能及常见疾病诠释新方法 基因组水平的表观遗传学研究颠覆了传统的基因组科学, 因为它证明了基因组的组成结构对于基因功能是至关重要的, 犹如著名解剖学家 Vesalius 所证实的 解剖学系统的构成赋予了各器官相应的功能 此外, 新兴的表观遗传学工具与传统遗传学相结合, 再加上连接两者的一门新型数学语言, 将有望在我们认识人类疾病方面, 产生五百年前 Vesalius 的解剖学成果同样大的影响 2014 年的新年除夕将是一个特殊的日子, 那是著名解剖学家 Vesalius 诞辰 500 周年的日子 Vesalius 是 人体之结构 (De humani corporis fabrica ) 的作者, 该著作在当时的影响力就如同 300 年后的 物种起源 (On the Origin of Species) 在科学发展史上所具有的意义 Vesalius 是人体解剖学领域的先行者, 他将实验观察引入医学教育中, 取代了之前以经验作为基础的医科教学 已故的 Victor McKusick 教授 曾参与启动人类基因组计划 (Human Genome Project) 并绘制出了第一个人类常染色体基因图谱 还曾将基因图谱称作 neo- Vesalian, 意为将基因图谱比作对基因组的解剖, 犹如 Vesalius 对身体的解剖 当然, Vesalius 不仅仅是一位图谱绘制者, 他勇于挑战权威, 推翻了 Galen( 古罗马医生 ) 和 Aristotle ( 古希腊哲学家, 科学家, 柏拉图弟子 ) 关于血液循环系统解剖学的定论, 并正确推断出系统各部分的功能 与之类似的是, 染色体上基因的具体位置以及染色体自身的结构具有重要的生物学意义, 而不仅仅是一张图谱, 也是最近才被发现的 1. 表观基因组学 : 基因组功能的解剖学 表观基因组学的研究结果已经令人吃惊地揭示出一些基因与非基因片段之间在生物学功能上的关系, 其实,β- 珠蛋白基因簇 (β-globin cluster) 早就暗示了这一点 即大片基因组区域 ( 几十至几千碱基对 ) 对基因表达的调节功能 尽管人们对 β- 珠蛋白基因簇的研究已经进行了数十年, 也证实了进行性染色质改变与 β- 珠蛋白基因簇启动有关, 但是, 只有在大规模表观基因组学图谱研究工作开展之后, 才了解了多基因染色质结构域的大小和功能 随着我们发现的印记基因 (imprinted gene) 越来越多, 科研人员逐渐意识到这些印记基因都是成簇存在的, 通常一群印记基因会拥有一个共同的调控元件, 比如 CCCTC 结合因子结合位点 (CCCTC binding factor binding site) 等 随着全基因组组蛋白修饰图谱的诞生, 我们还将发现更多大片段的异染色质修饰情况 (heterochromatin modification), 比如与失活 X 染色体有关的特殊修饰情况等 此外, 还在 Hox 基因簇上发现有大段的常染色体区域也发生了异染色质修饰, 这种情况非常保守 ( 比 DNA 序列更加保守 ), 而且这种修饰并不仅仅局限于外显子区域 由此看来, 表观基因组学研究对于帮助我们了解基因组功能的作用远远超出了大家的预期, 它起的作用至少要比基因 31

35 生命奥秘 组序列分析多出 10 倍 表观基因组研究对于基因组功能诠释的意义就相当于 500 年前 Vesalius 对解剖学做出的贡献一样巨大 另一种出乎我们预料的大规模基因组关系 (large-scale genomic relationship), 就是非常常见的由染色质蛋白介导的染色体内以及染色体间的相互作用 (intra- and interchromosomal interactions) 这种相互作用是通过染色质捕获技术(chromatin-capture method) 发现的 染色质捕获技术主要用来发现远隔染色质介导的相互作用 DNA 环结构 (DNA loop structure) 就是由染色质介导的一种结构 该结构高度动态化, 而且常常会出乎意料地与某种功能相关 比如, 在小鼠基因组中长达 200kb 的 TH2 细胞因子基因位点上存在着好几个白介素基因, 当这些基因被转录激活时, 基因位点就会与一种特殊的 专门与富含 AT 碱基序列结合的蛋白 (special AT-rich sequence-binding protein,satb) 结合, 然后折叠形成大量的环状结构 很明显, 染色体间的反式相互作用与某些序列有关 这些序列会对印记基因, 如 H19 差异性甲基化区域 (differentially methylated region,dmr) 进行表观遗传调控, 并会通过基因转应作用 (transvection)( 文后小词典 ) 对基因进行反式调控 最近发现的一种由染色质介导的大规模基因组组织就是通过长 RNA 连接的异染色质修饰与基因活性 2005 年 5 月 11 日至 15 日在美国纽约冷泉港召开的一次名为 基因组生物学 (Biology of Genomes) 的会议上, 来自冷泉港实验室的 Tom Gingeras 曾经就人类基因组中最终被确认的基因数目发表过预言, 他认为在人类基因组里被认为是非编码 RNA 的编码序列中, 大约有一半将会被证实是有功能的 目前有越来越多的证据证明 RNA 具有介导染色质结构的功能 比如, 反义 RNA 似乎能够不依赖 Dicer 和翻译后 microrna 机制在哺乳动物基因里建立异染色质 这些区域可能会长达 100kb, 影响多个基因, 同时会有 Argonaut 家族蛋白参与 最近, 有一项激动人心的发现, 那就是长基因间非编码 RNA(long intergenic noncoding RNA,lincRNA) 对建立异染色质发挥作用 比如,HOTAIR 是一种 lincrna, 它能够通过 HOX 结构域重新靶定 RRC2 蛋白, 导致与肿瘤进展有关的基因表达水平出现大幅度的变化 最后, 有证据表明大规模染色质赖氨酸修饰 (large organized chromatin lysine modifications,lock) 机制能够将长达数百 kb 至数千 kb 的基因组组织成紧密的大块结构, 这其中就包括分化特异性的片段, 也包括核纤层蛋白相关结构域 (lamin-associated domains, LAD) 这些大片段基因组结构改变可能就是一种基因组功能调控的动态机制, 它在肿瘤发病过程中会出现改变 大规模表观基因组图谱构建工作还可以提供其它一些线索帮助我们理解大规模的表观遗传学网络对细胞发育和基因组功能起到的深远影响 比如, 介导 H19 印记的 CTCF 似乎在界定功能基因区域之间的界限方面起到了一定的作用 同样, 被认为与基因稳定沉默状态有关的多梳蛋白的靶基因也会在活化与沉默这两种状态之间交替 这样一些调控网络都会在基因组功能调控方面发挥一些作用, 比如确定染色体的区域或者富含基因染色体间的空间关系等等 2. 表观基因组研究会取代单基因的表观遗传学疾病研究模式 就好像表观基因组图谱可以帮助我们了解正常基因组的功能一样, 在全基因组范围里进行表观遗传学疾病研究也会帮助我们更好地了解表观遗传病理学 (epigenetic pathology) 由于癌症是开展表观遗传学研究最热门的基因特异性疾病, 因此毫无疑问地在进行全基因组表观遗传学研究时它依旧会是大家研究的焦点 最终, 通过全基因组表观遗传学研究得到的遗传病理学成果要远远多过单基因研究方法得到的成果 比如, 甲基化修饰水平的改变可以对与肿瘤相 32

36 关的大段基因组产生影响 广泛的甲基化改变远远不止我们通常检测的 CpG 岛范围, 还会包括基因体 (gene body) 等 同样, 当在肿瘤里发现组蛋白乙酰化水平和甲基化水平出现广泛改变是一种非常普遍的现象时, 我们大吃了一惊 干细胞也是一大研究热点, 不论是疾病基础研究领域, 还是应用研究领域都对干细胞表现出了极大的热情 从全基因组水平上来看, 干细胞和体细胞相比也存在非常普遍的甲基化差异, 尤其需要注意的是在非 CpG 位点上的差异 这些在甲基化修饰方面存在差异的位点刚好又能够与细胞的生理学状态对应上, 而且具有非常明显的统计学意义, 比如正常细胞和肿瘤细胞相比, 干细胞和已分化细胞相比, 源自不同胚层的组织相比等都是这种情况 因此, 表观基因组学的组织语言似乎是一种 国际性 语言, 既适用于正常情况, 也适用于病理情况, 这就好像解剖学知识不论是对于正常生理结构还是异常生理结构全都适用一样 由于大家逐渐意识到大规模表观遗传学调控机制可以对细胞基因功能产生重要的影响作用, 于是科研人员对于以疾病为基础的基因组研究模式也开始做出了调整 虽然目前已经发表的基因组研究数据只占到所有肿瘤表观遗传学数据的 2%, 但是在最近这 5 年里, 肿瘤表观基因组学研究的增长速度惊人, 其成果远远超过了传统的以基因研究为基础的肿瘤研究 ( 图 1) 这种飞速发展的情况同样出现在新生的非肿瘤人体疾病表观遗传学研究领域, 比如心血管疾病 免疫系统疾病 神经精神系统疾病等 这种差异一部分是由于新技术的推广带来的, 还有一部分原因就是大家也逐渐意识到 DNA 甲基化和染色质结构方面的变化在整个基因组里是非常普遍的, 而且这些修饰作用能够形成大块的基因组结构域 (genomic domain) 还有一个重要因素对于推动疾病表观基因组学研究的开展也起到了非常重要的作用, 那就是传统的以 SNP 为基础的遗传学研究方法至今也没能在解释常见人体疾病方面取得什么突破 早在十几年以前, 整个科学界以及公共媒体都在欢欣鼓舞地期盼基因分析可以成功预测罹患某种疾病的风险, 结果到今天也没有取得成功 那么表观基因组学研究是如何帮助人们发现常见人体疾病的遗传病因的呢? 许多人认为环境因素对表观遗传学的影响是导致人体患病的重要因素, 尤其是它可以代替基因突变的影响作用 ( 表 1) 图 1 近几年来和肿瘤研究有关的基因组水平研究论文数量的增长速度要远远超过使用传统的单基因遗传学手段对肿瘤开展研究发表论文的增长速度 不过, 这些已发表的基因组水平研究成果只占到整个肿瘤表观遗传学论文数量的 2%, 过去 5 年肿瘤表观基因组学研究的增长速度要比传统方法高出了一倍 图中列举的论文数目只是一个大概值, 数据源自 Pubmed 引文分析, 图中 2010 年的数据是推测值 图中左侧和右侧的比例尺是不同的 33

37 生命奥秘 表 1 表观基因组学研究帮助人们发现常见人体疾病的遗传病因的方法 表观基因组学注释可能与疾病发生相关的因素对常见人体疾病开展研究的新方法 环境因素导致表观遗传学改变 在没有发生 DNA 序列改变的情况下出现表观基因组学改变 甲基化组芯片技术 (methylome arrays) 捕获重亚硫酸盐测序技术 (capture bisulfite sequencing) 染色质免疫沉淀并测序技术 (chromatin immunoprecipitation with sequencing) 调控位点或表达非编码 RNA RNA 测序及上述方法 关键的疾病序列与靶基因无关 染色体内或染色体间的相互作用 染色体网络图谱构建技术 调控序列远离靶基因 确定序列的甲基化修饰 共调控基因簇 序列变异控制表观基因组 基因组水平甲基化分析技术 染色体图谱构建技术 关联 GWAS 技术 表观基因组研究技术 新 VMR 序列变异控制表观基因组变异新的重新检验统计学方法 集成 GWAS 方法 结构域破坏 锚定蛋白 LOCK 和 LAD 天然染色质全基因组分析技术 但是, 研究人员也应该在利用表观遗传学手段对常见疾病进行研究时考虑另外一种可能, 这是一种相对不受重视的可能 因为现有的对疾病进行基因组学解析的目标 ( 需要解析的范围大约占到整个基因组一半以上 ) 可能会远远超出科研人员最初的设想, 同时对这些基因组正常功能的理解也需要借助表观基因组学的帮助, 所以很有可能那些从遗传关联的角度来看是阴性的结果对于表观基因组学研究来说却意义重大 ( 表 1) 比如, 大多数全基因组范围关联研究 (genome-wide association studies, GWAS) 都不能发现致病基因, 但却能够发现临近的区域或基因间的 荒漠 (intergenic desert) 这些区域在一般情况下都会含有甲基化程度不同的区域, 可以借此判断出基因组的组织来源或者区分是肿瘤细胞基因组还是正常细胞基因组 同时, 这些区域还可以帮助建立染色质结构和正常基因功能的 lincrna 的最标准的编码区域 另外, 基因荒漠也能够通过表观遗传学调控的方式促进染色体间的反式联系 与疾病相关的 DNA 序列变异可能还会通过另一种方式来影响机体患病的风险, 这就是通过变异序列与调控 DNA 甲基化 染色质修饰或结合因子之间的联系来发挥的调控机制 最近发现的 SNP 位点与 DNA 甲基化之间的联系就是一个很好的实证 研究人员还提出了另外一种可能途径, 那就是 DNA 序列变异体 (DNA sequence variant) 自身可能就会对受到环境因素影响或自身就能随机发生改变的表观基因组产生影响 按照这种理论, 复杂物种 (complex specie) 里的个体会获得进化优势, 因为它们能够挑选出能自发增加表观遗传学变异活动的等位基因 这就好像是一种进化上的双保险机制, 可以提供一种进化优势, 让基因在环境出现重大改变 ( 比如出现充足的食物和水源 ) 时也能很好的适应 对生 34

38 长在同一环境下的近亲交配的小鼠进行研究就能发现数百个甲基化程度异变的区域 (variably methylated region, VMR), 这些区域里充满了各种功能注释信息, 可以解释与机体发育及胚胎模式形成机制有关的关键基因的功能 因此受到表观遗传学机制调控的生物发育事件本身可能就包含了大量的表观遗传学信息 基因变异事件又增加了发育事件的可塑性, 比如某个基因发生突变可能会让机体获得一种进化优势, 但是当环境出现重大变化时 ( 比如现代的西方饮食习惯等 ) 这种突变可能又成了一种有害因素 有趣的是最近刚好就有人发现, 有几个 VMR 区域的确与体重指数有关 最后需要提及的是, 科研人员们仅仅只开始了解 LOCK 和 LAD 在基因组功能组织方面的作用 至于 LOCK 和 LAD 与疾病的关系, 则还需要进行大量深入的基因组水平研究 对天然染色质的研究以及对临床样本的分析才能弄清楚 ( 表 1) 3. 未来的技术发展 未来的技术发展会对表观基因组学研究起到什么样的推动作用呢? 当然, 就像非表观遗传学基因组研究一样, 所有的方法归根结底都会指向测序技术, 包括对 DNA 甲基化情况进行分析的全基因组重亚硫酸盐测序技术 廉价 全面 高通量 单分子测序技术的推出较最开始承诺的时间有所延迟, 现有的第二代测序技术 ( 除了 padlock 探针等捕获测序技术之外 ) 也仍然还不太适合用于大规模的 ( 数千人 ) 流行病学研究 不过, 捕获测序技术也处于进退两难的窘境之中, 一方面虽然该技术在处理能力 分辨率 ( 达到单碱基水平 ) 和等位基因特异性等方面具有巨大优势, 但是却无法显示甲基化修饰程度不同的区域, 这是利用该技术开展表观基因组学疾病研究最大的障碍 与此同时, 高通量测序技术用于检测染色质修饰相对比较便宜, 但是这仅仅是针对研究工作而言, 比如对经过染色质免疫沉淀操作纯化后的基因组小片段进行染色质修饰测序分析 对于 LOCK 一类的大片段基因组研究就不存在成本优势了, 那将会和全基因组重亚硫酸盐测序一样昂贵 重大的突破可能会来自试剂耗材研究方面, 比如 Illumina 等公司的芯片产品就非常便宜, 也比较适合典型的大学实验室使用 Illumina 公司马上就会推出一款甲基化检测芯片, 它能对 45 万个位点进行检测, 其中就包括 CpG 岛和 CpG 海滩 (CpG shores) DNA 酶超敏感位点和其它一些经过加拿大蒙特利尔 McGill 大学的 Tom Hudson 组织成立的实验室协会确认并注释过的甲基化修饰区域 虽然这款产品可能不会成为今年或者明年最全面的一款产品, 但 45 万个检测位点已非常不错, 而且这种产品设计思路很好, 它可以让每一个普通的实验室都能开展表观基因组学研究, 这可是一个激动人心的进步 其它一些让人兴奋的技术创新还包括显微切割样品, 甚至是单细胞样品的表观基因组学分析技术和用于染色质生化分析的小染色体片段富集技术等 还需要建立新的表观遗传学流行病学 (epigenetic epidemiology) 将来的疾病研究不能再仅仅孤立的考虑基因变异 对于目前正在开展以及将来要开展的大规模研究的样品一定要保留下来, 以便开展 DNA 甲基化分析和染色质分析等表观遗传学研究 不过, 回过头来看, 其实现在也可以对以前的样品开始进行一部分表观遗传学研究工作了, 因为 DNA 甲基化是可以稳定存在数十年的 如果补充了这些表观遗传学数据, 那么现有的遗传学数据也会变得更加容易理解 新的研究样品还应该包括标准的来源, 比如淋巴细胞, 当然如果可能的话还需要包括受疾病所累的组织样品 此外, 要研究疾病表观基因组学, 我们还需要开发新的统计学方法和流行病学技术, 同时 35

39 生命奥秘 也得加上传统的遗传学分析手段 比如表观遗传学变异和 SNP 位点不同, 它是一种内在的数量性状, 又如 DNA 的甲基化数量水平或多梳蛋白复合体成员的数量等, 因此就不能像等位基因那样进行简单的命名 表观遗传学变异情况的这种数量特性可以用于解释一些和少量基因位点有关的复杂性状, 因为它们不需要很多其它诸如 R.A. Fisher 提出的附加信号 已经开始有人使用这种方法进行研究工作了, 如分析与 VMR 区域有关的数量性状 表观基因组学很明显会给遗传学增加复杂性, 这看起来好像很恐怖 但是,Vesalius 当年也没有被吓到, 所以我相信胜利一定是属于我们的 原文检索 : Andrew P Feinberg. (2010) Epigenomics reveals a functional genome anatomy and a new approach to common disease. Nature Biotechnology, 28(10): 筱玥 / 编译 小 词 典 基因转应作用基因转应作用 (transvection) 是基因表达的一种方式, 这种方式是由等位基因配对及其相互作用所介导的 基因转应作用的现象已在果蝇的多种基因中发现 这种作用可产生正负两种效应 而且, 在其它物种中, 也逐渐发现了类似的现象 例如, 在植物中的基因现象 (gene silencing) 以及在小鼠中的基因转激活作用 (transactivation) 等 因此, 阐明基因转应作用的机理, 将有助于了解基因表达调节及增强子调控活动的分子基础 本文用果蝇 yellow 基因为模式来探讨基因转应作用的分子机制 ( qk/83863x/199802/ html) 36

40 四 促进表观基因组学数据比对工作早日开展 对各种表观基因组数据进行比较可以了解到许多信息, 帮助我们理解细胞分化过程 基因 突变的作用以及各种疾病的发病机理等等 但是, 庞大的表观基因组数据规模加之数据高度的 不均一性给计算机分析造成了不小的麻烦 由于高通量测序技术以及芯片等技术的发展, 科研人员们已经得到了大量的表观遗传学信息, 但是由于这些数据极其庞杂, 因此到目前为止只对少数几种细胞的表观基因组学数据进行了比较 最近, 该领域获得的最新成就是通过组蛋白标志 (histone mark) 对染色质状态 (chromatin state) 进行计算机推断分析的技术 由于高通量测序技术和基于高通量测序技术建立的芯片等技术的发展, 以及测序费用的大幅度降低, 所以现在对各种细胞进行系统分析变得越来越容易了, 已经可以针对某些疾病开展小规模的研究项目了 于是, 各种大大小小的研究项目如雨后春笋般涌现出来, 表观基因组学数据变得越来越多, 这也给我们提供了一个极好的机会, 可以对这些表观基因组学数据进行比对, 找出其中的差异 表观基因组数据的特点 表观基因组学数据不是数字化数据, 这与 DNA 序列不同 ; 表观基因组学数据的精确程度各不相同 ; 表观遗传学信号是全基因组分布的, 不太可能通过表观遗传学数据发现特异性基因序列信息 每个个体 每种细胞 甚至同一种细胞里的两个细胞的表观基因组学数据都会各不相同 ; 表观基因组数据受多种细胞生理过程的影响, 比如转录调控过程 转录体剪接过程以及 DNA 的复制 修复和重组过程等 ; 表观基因组数据在不同时段各不相同, 比如记忆形成过程和细胞分化过程等短期生理过程与衰老 变异等长期生理过程的表观基因组数据就不一样 ; 表观基因组数据受遗传因素 环境因素 患病情况以及实验条件误差等的干扰 ; 对表观基因组学数据进行比对可以发现很多与生理过程相关的有用信息 而且这种比对方法已经在基因组 DNA 研究和基因表达谱研究方面取得了成功 随着对表观基因组学差异性数据处理技术的提高, 现在已能够以更精细的水平对这些数据开展比对工作了, 这将帮助我们发现更多有用的信息, 如单个个体相关的表观遗传学信息与具有重要生物学意义的表观遗传学信息进行比对 下文将向读者介绍两个表观基因组学比对技术的应用实例及其遇到的计算问题和信息基础设施 ( 文后小词典 1) 困难 37

41 生命奥秘 1. 表观基因组学比对技术的应用实例 实例一 : 通过表观基因组比对了解细胞分化过程早在 1939 年,Waddington 就提出表观遗传学的概念 按照 Waddington 的理论, 细胞分化可能会有两种不同的模式 我们现在对表观遗传学的理解就是细胞按照胞内抽象的多维度空间分布的分子状态的指引, 沿着某条特定的轨道进行分化的过程 这些分子状态就包括本文里提到的表观基因组学状态 将来自好几个彼此相关的细胞系的表观基因组数据综合起来就能得到足够的信息, 推测出几种不同的表观遗传学分化模式 通过对由 Polycomb-Trithorax 系统 ( 文后小词典 2) 介导的细胞分化过程的研究证实, 通过对相近的细胞表观基因组学数据进行比对的方法来研究细胞分化过程是可行的 在胚胎干细胞里,Polycomb/Trithorax 反应元件能够对甲基化修饰的启动子进行调控 受到这类启动子操纵的基因通常都会有两种状态 (bivalent state), 或者说是处于一种动态平衡状态 (poised state) 之中 基因到底处于何种状态主要取决于组蛋白 H3 第 4 位赖氨酸和第 27 位赖氨酸是否发生了三甲基化修饰 (trimethylated) 组蛋白 H3 第 4 位赖氨酸如果发生了三甲基化修饰 (H3K4me3), 那么基因就会被激活 ; 组蛋白 H3 第 27 位赖氨酸如果发生了三甲基化修饰 (H3K27me3), 那么基因就会失活 在细胞发育分化过程当中, 基因会受到这种染色质状态 (chromatin state) 的调控, 决定是激活还是失活 最近有研究发现, 在两种胰腺细胞系 胰腺 β 细胞系和胰腺腺泡细胞 (acinar cell) 系中都有明显的 H3K27me3 现象, 这与胰腺 β 细胞系和胰腺腺泡细胞系有着相同发育过程的现象非常吻合 该研究还有一个重大发现, 那就是尽管 H3K27me3 标志明显的胰腺 β 细胞表观基因组信息和源自内胚层的胰腺细胞非常相似, 但是胰腺 β 细胞的基因表达模式却和源自外胚层的神经细胞一样 随后的研究发现, 胰腺 β 细胞的这种神经细胞样基因表达模式是在胰腺细胞分化晚期才出现的, 这主要归功于少数几个转录调控因子 这个例子表明, 表观基因组信息可以提供出基因表达模式无法提供的细胞谱系信息 通过遗传分类法 (cladistic method) 可以重建不同的细胞分化模式, 该方法已经在物种形成 (speciation) 模式重建方面取得了成功 与将一种类型的数值全部加起来的纯粹数学方法不同, 遗传分类法会从用于重建进化树的众多繁杂的数据当中有重点 有选择地提炼出有用的数据 通过将进化树上的 树杈 ( 即进化分支 ) 看做基底结构 (underlying structure) 的方法, 就能够将分子数据和古生物学数据 (paleontological data) 有效地结合起来 以细胞分化进程为例, 通过类比的方法, 就能将某个部分分化细胞的试验数据和完全分化细胞的重建数据很好地结合起来 实例二 : 通过表观基因组比对了解遗传变异情况对两个表观基因组学数据进行比较还能够了解因为各自基因组序列变异所导致的遗传差异情况 比如, 在比对表观基因组数据时发现的差异可能会与同一基因位点序列的差异相吻合 科学界还只是刚刚开始研究基因变异对于表观基因组的影响作用, 到目前为止只对几个与人类疾病相关 并且研究得比较透彻的基因突变位点有所了解 比如,Rett 综合症是由于与甲基化 CpG 岛相结合的 MeCP2 蛋白发生突变所致, 这种基因突变起到的是反式作用 (in trans), 单个基因位点的突变就能够改变整个基因组的表观遗传学模式 不过也不全都如此, 比如最近 38

42 进行的高通量人体全基因组 DNA 甲基化和单核苷酸多态性比对研究 (high-resolution genomewide comparison of DNA methylation and single-nucleotide polymorphisms) 就发现, 基因突变也能起到顺式作用 (in cis), 即只改变临近基因的表观遗传学状态 该研究发现, 在人类基因组中至少有 3.5 万个基因位点存在等位基因特异性 (allele-specific) 的甲基化水平异常现象, 这说明基因突变对表观遗传学的影响是非常普遍的 在脆性 X 染色体综合征 (fragile X) 和面肩臂肌营养不良症 (facioscapulohumeral muscular dystrophy) 等患者中, 都能发现基因突变影响基因组中局部位点表观遗传标志 (epigenetic mark) 的现象 不过, 究竟是哪一段基因序列发生突变而明显影响了表观遗传学水平, 带来表型改变现在还不得而知 有人建议先通过全基因组关联研究 (genome-wide association studies) 发现热点区域, 然后在该区域中利用等位基因特异性的表观遗传学信息来发现有意义的 SNP 位点 表观基因组比对技术还能够发现有意义的结构变异信息 Cahan 等人最近发现了间接的证据证明基因拷贝数变异也能对表观基因组造成影响, 而且这种影响的范围非常广 根据他们的研究, 基因拷贝数变异不仅能够影响到变异基因的表达水平, 同时还能够影响其它远隔基因的表达, 于是 Cahan 他们猜想这种局部的结构变异可能会改变整个染色质的结构, 从而影响到其它基因 要证实这个假设, 表观基因组比对就是一个非常好的方法 2. 计算问题和技术难题 要想对各种表观基因组学数据进行比对可不是一件容易的事情, 因为首先使用各种方法得到的表观基因组学数据各自的分辨率就不同, 所以彼此 不兼容 比如, 使用重亚硫酸盐测序法 (bisulfite sequencing) 得到的 DNA 甲基化数据就能精确到单个碱基水平, 但是使用甲基化 DNA 免疫共沉淀技术 (MeDIP 法 ) 只能达到 100 个碱基对的精度 要解决这个问题可以有多种方案 比如, 在整个基因组内固定一个窗口尺度, 或者只固定检测外显子 内含子或增强子等区域, 将这些区域里的信号平均处理 或者逐个分析表观基因组学信号 不过, 这种方法只适合对具体的单独信号进行分析, 比如 H3K4me3 信号等, 不适合对受到其它因素影响的表观基因组信号, 比如 H3K36me3 信号等进行分析 当然, 还有许多其它方法可以将全基因组信号转换成可供比对的表观基因组学数字信号, 每一种方法都适合进行某一种特定的应用 还可以通过寻找相似或差异的方法对表观基因组学数据进行比对 寻找相似处的方法其实就是从全基因组比对 (whole-genome comparison) 方法发展而来的 在比对表观基因组数据时常常会用到全局或局部序列比对的方法 不过, 基因组序列比对只是在一维的碱基坐标系里对每一个碱基的坐标进行比对, 表观基因组学比对则要在三维坐标系里对一系列不连续的坐标进行群体分析, 只有这样才能匹配核内立体的染色体结构数据或者广泛分布在全基因组内受到发育主调控子 (master regulators of development) 共同调控的几千个基因位点数据 我们可以根据是否具有能够与某一种发育主调控子结合的特征, 或者是否与某条发育分化通路相关, 或者是否含有启动子等基因调控元件等条件对基因组区域进行分类, 然后分区域地得到这种表观基因组数据集 要想弄清楚两组表观基因组学数据之间独特的差异还需要了解信号的背景噪声差异 以 DNA 序列比对为例, 我们需要弄清楚在特定基因位点上有哪些保守的表观遗传学标记 (epigenomic mark, 比如甲基化修饰 乙酰化修饰等等 ), 在同一基因位点上还有哪些不是那 39

43 生命奥秘 么保守的表观遗传学标记 当然, 目前最急迫的问题是我们根本不知道在基因位点上哪些表观遗传学标记是保守的 不过, 我们相信随着积累的表观遗传学数据越来越多, 这个问题一定会解决, 但可能不会是像我们想象的那么简单, 因为这种表观遗传学差异不光是位点特异性的, 还是高度的序列特异性的 比如, 在一个谱系的细胞发育过程中出现的表观遗传学差异所代表的含义可能就与不同细胞系之间的差异代表的含义不同, 也会与同一细胞系在衰老过程中出现的表观遗传学差异所代表的含义不同 因此, 随着数据的不断积累, 可能经常会对以前观察到的表观遗传学差异做出完全不同的新解释 对表观基因组学比对结果的解释和分析同样也面临着技术和操作方面的困难, 这主要指信息基础设施方面遇到的困难 这些问题包括标准问题 资源问题 计算机辅助发现工具问题 数据在网络上如何分享和协作的问题等 在现阶段最关键的问题主要是数据的再利用问题 元数据标准 (Metadata standards) 问题 可重复性 (Reproducibility) 问题 数据储存和运算问题等 ( 表 1) 表 2 中详细列举了与表观基因组学研究有关的概念和所需的技术 设备 表 1 表观基因组学研究的信息基础设施方面遇到的主要困难 主要困难 数据再利用问题 (data resuse) 元数据标准问题 (Metadata standards) 可重复性问题 (Reproducibility) 数据储存和运算问题 人类表观基因组数据图谱 (human epigenome atlas) 解决方法 要解决这个问题首先就要为通过测序或芯片等技术得到的各种各样不同精度的信息开发出一套统一的框架标准 癌症基因组图谱项目 (Cancer Genome Atlas) 千人基因组计划 (1000 Genomes Project) 美国国立健康研究院 (NIH) 的表观基因组学路线图计划 (Epigenomics Roadmap) 以及 DNA 元件百科全书项目 (Encyclopedia of DNA Element) 已经合作开发出了一套数据标准 ( 详见表 2 中的 数据级别 ) 按照这套标准, 源自各种技术和检测手段的精度不等的数据被分成了抽象的级别 随着数据和知识多样性的不断增加, 我们将会需要更多 更先进的技术来推广并交换这些信息, 例如在语义网 (Semantic Web) 中用到的资源描述框架 (RDF) 技术等 ; 元数据是表观基因组数据能否在公共媒介中多次重复用于比对分析研究的关键, 因为它包含了非常多的其它信息, 比如这些数据的生物学信息以及它们是通过什么实验方法得到的信息等 例如,NIH 开展的表观基因组路线图项目就已经采用了由美国国家生物技术信心中心 (NCBI) 开发的序列读取档案网页架构 (Sequence Read Archive XML schema) 来处理表观基因组数据 ; 可以将所有的运算分析全都打包处理成工作流形式 (workflow), 然后将这些信息和分析结果一起作为元数据一并保存 ; 表观基因组数据比对以及高水平的解析工作都需要非常强大的数据运算能力做后盾, 借助连接在互联网上的计算机提供的运算能力和数据以及所谓的 云计算 模式和类似 基因组分析工具集 (Genome Analysis Toolkit) 之类的处理流程都可以帮助解决这个问题 ; 图 1 介绍的架构模型包括好几个项目, 可能还会有临床科研人员通过互联网参与其中, 进行数据分析和比对工作 这个非常有前景的模型被称为 软件服务 模型, 因为它对本地资源的要求很少 这种模型架构对于表观基因组学研究尤为重要, 借助该模型可以将表观基因组学研究与基因翻译研究和疾病研究结合起来, 这是仅靠本地的生物信息学资源和生物信息学家做不到的 现在很多项目中都会用到云计算 (cloud computing) 技术, 也会在采集数据 (0 级数据 ) 时, 比如在根据测序结果得到 1~3 级各种水平的表观基因组学信号用到已经非常成熟的包含有质量鉴定步骤的工作流程中 最后, 采集到的数据会与参考数据 人类表观基因组学图谱数据 ( 类似人类参考基因组数据 ) 进行比对 此外, 还可以对这些数据进行可视化处理和其它分析 到数据发表之前, 原始数据和分析结果都可以归档储存起来, 还可以被收入人类表观基因组学图谱或其它的数据库当中 不过, 将科研人员全都拽入不断发展壮大的各种数据库, 例如人类表观基因组学图谱建设当中到底好不好呢? 为了促进小型研究发展, 将数据提交给公共数据库,NIH 的表观基因组学路线图项目协会与 NCBI 合作, 为表观基因组元数据制定了一套标准, 同时还制定了参考工作流程, 帮助大家统一数据操作规范, 评价数据质量 40

44 表 2 表观基因组学研究信息基础设施中关键概念一览表 满足何种应用需要 数据重复利用和整合 工具集 概念 数据级别 (Data level) a 语法 (Syntax) 语义 (Semantics) 语义网 (Web 3.0) 元数据 (Metadata) 流水线 (Pipeline) 工作流 (Workflow) 工作平台 (Workbench) 具体描述和实际应用举例 0 级数据指的是 DNA 序列, 通常都是短片段序列 (short read format, SRF) 或 fastq 格式序列 ; 1 级数据指的是参考数据序列, 通常都是 SAM 格式 BAM 格式或 BED 格式数据 1 级数据即可用于基因组学研究, 也可用于表观基因组学研究 1 级数据还包括参考序列中未收录的重复片段序列 ; 2 级数据指的是原始表观基因组学信号, 比如序列密度信号 (read density plot) CpG 甲基化含量或者其它统计学数据,2 级数据通常都是 UCSC 基因组浏览器格式 ; 3 级数据指的是通过染色质免疫沉淀并测序 (ChIP-seq) 之类的技术获得的分散基因组数据或者通过隐马尔可夫分段模型获得的染色质状态数据 这些数据都是对单个样品的一个或几个表观遗传学标记信息进行分析之后得到的 数据格式根据数据规模不同可以是 GFF 格式也可以是 LFF 格式 ; 4 级数据指的是对表观基因组学信息进行比对之后得到的数据 对这类数据的具体定义工作目前还在进行之中 ; 可以满足各种应用需要的数据格式, 比如满足高效大容量存储需要 ( 如 big-wig) 简单需要 ( 如 tab-delimited) 机器可读性需要 ( 如 JavaScript Object Notation JSON Extensible Markup Language 或 XML) 等 ; 有关含义的理论 所谓语义通常都与控制词汇 (controlled vocabularies) 和本体 (ontologies) 联用, 比如被广泛应用的基因一词和其它生物医学等项目创造出来的词汇 ; 语义网是由万维网协会 (World Wide Web Consortium) 开发出来的新概念 它包括为知识表达 (knowledge representation) 开发的资源描述架构 (Resource Description Framework), 可以借助该架构进行节目交流和网络信息自动分析 ; 所谓元数据就是和数据有关的数据 (Data about data) 元数据是数据重复利用的关键 诸如生物和生物医学调查最低限度信息项目 (Minimum Information for Biological and Biomedical Investigations project) 等各种研究项目中已经推介使用了多种标准 NCBI 与欧洲生物信息学研究所和日本 DNA 数据库合作, 开发出了 SRA-XML 元数据格式 NCBI 随时与 NIH 的表观基因组路线图项目和其它用户保持紧密联系, 随时接受反馈意见, 现在,SRA-XML 元数据格式已经升级到了 1.2 版本 元数据格式的广泛应用可以保证国际表观基因组项目成功开展 ; 前后陆续出现了许多用于数据分析的工具 Galaxy 就是众多的分析软件之一,Galaxy 拥有一个互动界面和在线服务的流水线设计 比较成功的案例是将 Galaxy 软件和用于表观基因组分析的 EpiGRAPH 软件结合, 来发现具有高度多态性的启动子 (SNP-rich promoters) 的表观遗传学修饰情况 ; 正规的 简便的 可执行的数据分析流程 可用于处理元数据或文件等各种信息, 保证数据分析结果具备高度的可重复性 项目开发工作流系统包括 Galaxy GenePattern Taverna 等软件 ; 工作平台就是将各种数据分析工具盒可视化工具以及数据库等集合在一起的工作环境, 如 CLC 基因组工作台和 Genboree 工作台等 ; 续下 41

45 生命奥秘 接上 满足何种应用需要 网络服务和程序互动功能 获得运算资源和服务 互相合作并发表成果 概念 URI 和 URL REST API 云计算 (Cloud computing) 软件服务 (Software as a service) 验证方法 Web 2.0 具体描述和实际应用举例 URI 和 URL 都是网络上的地址系统, 用于唯一性的标识网络上的项目, 比如网页 表观基因组学图谱等 在 HTTP 和其它网络协议的帮助下, 通过网络浏览器和其它计算机程序可以进入这些网络地址 ; REST API 是一种计算机程序接口, 它主要基于一系列设计原则开发而成, 可以有效保证计算机程序在互联网上的交流, 主要用于 HTTP 应用 可以通过 REST API 和各种编程软件, 比如 Pearl Python Ruby 或 JavaScript 等编写程序在网络上获得数据和预算资源 ; 通过网络以按需 易扩展的方式获得所需的数据运算资源和数据存储服务 ; 通过网络获得软件服务, 如图 1 所示的那些表观基因组数据处理服务和比对服务等, 这是 Web 2.0 时代的最大特点 ; 使用 OpenID 一类的验证方法可以让用户或计算机程序在被识别之后再工作 ; 在 Web 2.0 时代, 可以通过网络进行协作, 比如 NIH 的基金审核工作或表观基因组数据处理和比对工作等 ( 图 1); 数据库 知识库和档案库 NCBI 的基因表达汇编 (NCBI Gene Expression Omnibus) SRA 档案 (SRA archives) Ensembl UCSC 基因组浏览器 (UCSC Genome Browser) 和图 1 中所示的人类表观基因组学图谱等其它资源都属于数据库 知识库或档案库 ; a 所谓数据级别就是将各种数据的共同之处提炼出来, 找出的普遍特征, 可以据此设计数据格式, 也可以开发出相应的工 具, 对各种各样的基因组数据和表观基因组数据进行分析 表中给出的例子主要侧重于利用测序结果的分析方法 生命世界无奇不有 42

46 图 1 理想的表观基因组数据分析和比对处理信息基础设施架构模式图 通过这种信息基础设施架构可以将地理上相互分隔的用户和数据资源通过网络紧密地联系起来 比如, 一名从事某项疾病相关的表观基因组学异常研究的临床科研人员就能完全依赖这套信息基础设施而获取世界各地的初始网络资源 ( 比如数据级别分别是 0~3 级的数据 ), 也可以借助人体表观基因组学数据图谱进行数据比对分析 3. 小结 综上所述, 对表观基因组学数据进行比对分析可以为我们提供许多非常有价值的新信息 弄清楚细胞分化的不同模式可以帮助我们更好地了解细胞的发育过程 精确地掌握表观基因组的变动情况可以帮助我们更好地理解基因突变和环境因素对人体发育造成的影响或与人体致病之间的关联 为了达到上述目标, 我们必须开发出更好 更先进的力量和运算工具, 以解决表观遗传学数据异质性 (heterogeneity) 和环境依赖性 (context dependence) 的问题 另外, 我们还需要打造一套高水平的信息基础设施, 包括能够处理空前规模信息并能应付各种需求的共享数据库等 原文检索 : Aleksandar Milosavljevic. (2010) Putting epigenome comparison into practice. Nature Biotechnology, 28 (10): YORK/ 编译 43

47 生命奥秘 小 词 典 1. 信息基础设施 (cyberinfrastructure): 也称信息基础架构, 其目标是利用网络技术将地理上位置不同的计算设施 存储设备 仪器仪表等集成在一起, 建立面向网络服务的通用基础支撑环境, 实现 Internet 上计算资源 数据资源和服务资源的有效聚合和广泛共享, 从而建立一个能够实现区域或全球合作或协作的虚拟科研和实验环境, 支持以大规模计算和数据处理为特征的科学活动 2. Polycomb-Trithorax 系统 : Polycomb-Trithorax 系统 (Polycomb-Trithorax system), 又称 Polycomb/Trithorax 反应元件, 在黑腹果蝇基因组中大约有 100 多个 Polycomb/Trithorax 反应元件, 该系统能够调控细胞基因组转录, 从而保证细胞发育 分化进程的正确性 研究前沿 44

48 热点话题 Hot Topics 计算机能破解 基因组密码吗? 测序技术的进步让 DNA 测序工作变得越来越简单, 越来越便宜, 相比之下, 对测序数据的储存和分析工作则明显滞后 45

49 生命奥秘 1. 基因数据储存的现状 几十年来, 计算机一直都在以超出我们想象的速度飞速发展着 但是, 加拿大多伦多安大略省癌症研究所 (Ontario Institute for Cancer Research, OICR) 的生物信息学家 Lincoln Stein 从事的却是一项发展速度远远超过计算机科学的工作 基因组学研究工作 自人类基因组图谱公布之后的十年来,DNA 测序的费用一降再降, 下降速度简直就如同飞机俯冲一般 到了今天, 平均每 5 个月, 测序成本就会降低一半 因此, 科研人员们手头的测序数据也与日俱增, 现在已经可以用 数据海啸 来形容 今天, 一台测序仪在一天内 生产 的数据量就相当于耗费 10 年时间的人类基因组计划所需要的数据量 Stein 指出, 在数据获取和数据分析工作中, 计算机都发挥了最为关键性的作用, 但是计算机行业的发展速度太慢, 而且成本下降的速度也太慢, 根本无法满足生物信息学工作的需要 2010 年,Stein 曾经在 基因组 - 生物学 (Genome Biology) 上撰文指出,DNA 数据的 洪流 会 冲垮 我们计算机的存储系统, 而我们对数据分析能力的迫切需求也会 压垮 我们的计算机工作站 据 Stein 等人称, 现阶段, 科研资助机构全都忽视了生物信息学研究工作的需求 英国牛津大学 (University of Oxford) 的计算生物学家 Chris Ponting 表示, 历史上, 英国和美国都没有对数据分析工作进行过大规模的投入, 他们主要的资金全都投在了测序工作方面 是时候改变这个状况了 Ponting 估计, 未来几年, 数据分析而不是数据产生 ( 测序 ) 工作将会成为很多基因组研究项目的最大障碍 这意味着, 我们需要大量能够从事数据分析工作的专业人士, 即生物信息学家 但是, 现状是生物信息学家奇缺 最近发表的综述 评论和科学家撰写的博客也全都表露出这种趋势 大家一致认为, 开发新的软件和硬件来应对数据存储问题和数据分析问题是当前最首要的工作 与此同时, 生物信息学家尝试运用新的方法来应对数据大爆炸 有一些人选择了云计算 一种较为便宜的技术 有了它们, 人们就可以用较为低廉的价格临时租用服务器进行运算 这种技术的处理速度甚至要比科学家用一台超级电脑进行数据分析还要快 美国纽约冷泉港实验室 (Cold Spring Harbor Laboratory, CSHL) 的生物信息学家 Michael Schatz 则表示, 只有云计算技术才能在数据的洪灾中幸存下来 2. 铺天盖地的的数据 2005 年以来, 数据生产和数据存储之间的平衡逐渐被打破 自那时起, 甚至今天, 绝大部分在大型 DNA 测序中心里开展的测序工作和基因组数据分析工作使用的都还是个人电脑和运算设备 然后, 这些测序中心获得的数据都会被存储到大型的公共中央数据库, 比如位于英国欣克斯顿的欧洲生物信息学研究所 (European Bioinformatics Institute, EBI) 数据库和美国马里兰州贝塞斯塔的美国国家生物信息技术中心 (National Center for Biotechnology Information, 46

50 NCBI) 数据库等 世界各地的科研人员们都能从这些公共数据库中下载数据进行研究 到了 2007 年,NCBI 的 GenBank 数据库中已经收录了 1500 亿 bp 的基因数据信息 目前已经有好几家公司陆续宣布即将发售 第二代 (next-generation) 测序仪 这些最新的测序仪测序速度更快 测序价格更低 但是, 这些最新的测序仪测序长度都很短, 一般只有 50bp 至 120bp 左右 如果要用这么短的序列拼接出一个完整的基因组序列, 就需要进行好多轮的测序, 这样就需要更大的计算机存储能力和运算处理能力 我们过去要获得一套准确的基因组数据需要对基因组进行 10 次测序, 而现在运用最新的测序仪却需要进行 40 次, 甚至更多次的重复才能获得同样的准确率 另外, 这种最新的测序仪因为测序速度太快, 会迅速吞噬掉计算机的存储空间和运算能力 现在, 这些测序仪已经都走进了现实 千人基因组计划 (1000 Genomes Project) 是一项大型的人类基因组变异情况调查研究项目, 该计划在开展 6 个月之后产生的 DNA 序列数据量就要比 GenBank 数据库在 21 年里收集的数据量还要多 至于像 ENCODE( 该计划旨在弄清楚人类基因组中每一个 DNA 序列的功能 ) 这种浩大的工程更是对数据处理和存储提出了令人咋舌的高要求 还有的研究项目会对数十种细胞系的基因组进行研究, 从中找出能够与 40 种转录因子相结合的 DNA 序列, 这样就会得到一个二维的数据矩阵, 其中转录因子和 DNA 序列一一对应, 这不仅对数据存储和分析提出了高要求, 还为生物信息学提供了一种新的结果展示手段 据美国加利福尼亚大学旧金山分校 Gladstone 研究所 (Gladstone Institutes of the University of California) 的生物统计学家 Katherine Pollard 估计, 这些更快 更便宜的新一代测序仪大量上市之后, 更多小型的实验室也都会参与进来, 开展自己的基因组研究计划 这样, 各种与 DNA 相关的数据更是会铺天盖地地涌来, 彻底压垮我们的数据库和各种运算分析软件 以加州大学圣克鲁兹分析著名的 Genome Browser 网站为例 该网站上提供的程序能够对 50 种脊椎动物的基因组序列进行比对分析, 从中找出保守区域和非保守区域, 这有助于找出与人类基因组进化相关的研究线索 但是,Pollard 指出, 任何一种基因组分析软件都无法应付数千种基因组数据 小型实验室获得测序能力还会导致数据生产与数据分析工作的分离 Ponting 警告, 这种新技术的出现意味着一种科学上的民主, 大家都能开展基因组测序研究了 但是, 数据分析的能力还是集中在少数大型的基因组研究中心里 虽然这些大型的研究中心从理论上来说能够拓展他人的分析能力, 但是他们还是会首先处理自己的数据 而很多小型实验室在计划开展基因组测序项目时, 都不会考虑到后续的数据分析问题, 这会给他们带来麻烦的,Ponting 提醒道 3. 云计算技术 James Taylor 是美国亚特兰大埃默里大学 (Emory University) 的生物信息学家, 他已经见识过了整个科研领域对数据分析的迫切需求 2005 年,Taylor 和美国宾夕法尼亚州立大学 (Pennsylvania State University) 的 Anton Nekrutenko 一起开发出了好几种计算机基因组应用工具以及一个构建于用户友好框架上的数据库 Taylor 等人还开发出了 Galaxy 软件包, 用户可以下载这个软件包, 然后安装到个人电脑上使用, 或者通过任何一台联网的电脑连接到宾夕法尼亚州立大学的计算机上使用这个软件包 Galaxy 可以让科研人员不借助任何的工作站或者生物信息学家的帮助, 而进行基本的基因组分析工作 Taylor 介绍说, 作为一种公共资源,Galaxy 软 47

51 生命奥秘 件包表现得还不错, 但是作为一种共享资源, 它也会陷入数据的泥潭 因此,Taylor 等人去年开始尝试在 Galaxy 服务中引入云计算技术 云计算技术可以有多重含义, 包括简单的租借计算机进行存储和运算服务 ; 或者租借别人的程序等等 亚马逊公司和微软公司提供的网络服务就是比较知名的重量级云计算服务业务, 市面上还有一些非盈利性质的云计算服务, 比如 Open Cloud Consortium 等等 对于 Taylor 的团队来说, 进入云计算行业就意味着他们需要开发出一种能够利用别人电脑运行的 Galaxy 程序 Taylor 小组为此设置了一台虚拟计算机, 这台虚拟电脑能够在其它电脑上运行 Galaxy 程序, 而且 Galaxy 程序调用的数据也都是临时上传到租借计算机上的数据 为了检验这种方法是否可行,Taylor 等人和宾夕法尼亚州立大学的 Kateryna Makova 开展了合作 Makova 的研究兴趣是同一个体内不同细胞含有的线粒体基因组之间存在哪些差异 他们对三对母子的血液细胞样品和咽拭细胞样品的线粒体基因组进行了测序, 获得了 1.8Gb 的 DNA 序列信息, 这个数据规模相当于第一个人类基因组数据规模的十分之一 2010 年 5 月, 在美国纽约冷泉港实验室举行了一个基因组生物学会议 Taylor 在会上报告说, 如果他们要在宾夕法尼亚州立大学的电脑上分析这些数据, 那么耗费的时间会相当长, 而且花费也很高 但是, 如果他们把数据上传到云存储器里, 那么整个分析工作只需要花费 20 美元, 并且在一个小时之内就能完成 有了云计算服务,Taylor 等人就可以有很多台计算机使用, 而不需要花费巨资, 为自己的实验室购置昂贵的计算机设备 冷泉港实验室的 Schatz 和美国马里兰州巴尔的摩约翰 霍普金斯 布隆伯格公共健康学院 (Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health) 的计算机学家 Ben Langmead 早就开始使用云计算服务了, 而且他们也都计划帮助其他人使用到这项业务 2009 年,Schatz 和 Ben Langmead 就合作发表了一篇论文, 介绍他们将云计算技术和基因组学研究结合之后取得的第一批成果 Schatz 等人想要发现常见的 SNP 位点, 这项工作听起来简单, 实际上却要对相当于 38 个人类基因组序列规模的 DNA 短片段序列数据进行搜索才能完成这项工作 利用云计算技术, 在 320 台计算机的帮助下,Schatz 等人不到 4 小时就发现了 370 万个 SNP 位点, 总共花费才不到 100 美元 Schatz 等人估计, 如果只使用一台计算机进行这项工作, 那至少需要花费数百个小时 在那次基因组生物学会议上,Langmead 和 Schatz 还展示了两个新的云计算业务 Langmead 介绍了 Myrna 程序, 该程序能够根据 RNA 序列数据判断出基因表达上的差异 Schatz 介绍了另一个云计算程序 Contrail, 该软件能够将新一代测序仪得到的基因组片段序列拼接成完成的基因组序列, 并且将结果储存到云系统当中 低花费和高速度并不是云计算技术唯一的两大优势 Langmead 指出, 云计算业务使用者永远都不需要更换硬盘, 不需要更新服务合同, 不需要担心机房的用电情况和室温恒定问题, 不需要担心洪水或者其他自然灾害等等 Schatz 补充, 对于缺乏强大计算机工作站的小型实验室来说, 云计算业务就代表着计算机领域的民主化运动 但是, 美国国家人类基因组研究院的计算生物学及生物信息学程序指导员 Vivien Bonazzi 提醒, 现在云计算业务还不成熟 利用互联网将数据上传到云系统里需要花费数小时甚至好几天, 因此云计算业务提供商和云计算用户们都倾向于选择 sneaker net, 即将储存有数据的硬盘直接快递给云系统服务提供商 除了 Galaxy 程序之外,Myrna 以及其它一些计算机程序, 少数基因组程序都在进行改进, 以适应云计算业务的需要 Langmead 指出, 现在要开发真正方 48

52 便实用的云计算软件还是太难了 当然, 如果某项运算工作能够被分割成好几个部分, 再分别在不同的云系统里进行运算处理, 那么运算速度就会更快 但是,Langmead 指出, 目前不同云系统之间的联络还不太畅通, 所以现在采用这种方式反而速度会更慢 有一些研究人员担心正在开始兴起的云计算业务可能从一开始就不支持不同云系统之间的通信, 这样储存在一个云系统里的数据就无法被其它云系统采用 Bonazzi 评价, 云计算业务非常热门, 但它不是包治百病的灵药 快速下降对飞速增长 图中红线表示测序费用快速下降的情况, 黄色面积表示测序数据飞速增长的情况 数据来源 :NCBI 4. 数据存储问题 云计算还为生物信息学研究领域面临的数据存储和传递问题提供了一条解决途径 因为数据存储成本的下降速度要远远低于测序成本的下降速度, 所以, 人们认为一定存在一个临界点, 一旦突破这个临界点之后, 数据将以指数级的速度增长, 届时数据存储就将成为最主要的问题 到了那个时候, 我们一直以来储存原始数据的惯例将不得不做出调整 新一代测序仪得到的测序结构都是高分辨率的图片数据, 这就将占用大量的计算机存储空间 因此, 在将这些图片信息转换成更方便保存的序列信息之后, 就必须要考虑是否还需要继续保存原始的图片信息 最终肯定会选择更经济的数据存储方式, 放弃原始数据, 在有需要的情况下可以对样品进行再次测序 49

53 生命奥秘 安大略省癌症研究所的 Stein 认为, 将数据储存在云系统里可以部分缓解数据存储的压力 大型云计算服务供应商的经济规模可以帮助他们降低许多成本, 所以在有些情况下, 向他们暂时租用存储服务会经济很多 以亚马逊公司的网络存储服务为例, 他们的收费标准是每 GB 数据每个月收费 14 美分 Schatz 介绍, 相比之下, 在本地计算机上存储同样大小的数据每月需要花费 50 美分至 1 美元不等 但是, 据 NCBI 的 Don Preuss 介绍, 对于他们来说情况则完全不同, 他们自己维护 GenBank 数据库及其它本地数据库的开销会更低 当然, 将数据储存在云系统里还会带来其它的好处 比如现在, 任何人如果想要分析一个基因组, 首先就需要将基因组数据从 GenBank 一类的公共数据库中下载下来 如果这个基因组数据非常大, 那么下载过程就会变得十分的漫长 而且, 如果每个人全都下载一个同样的数据, 有的时候还都是些过时的数据储存到各自的电脑里, 那么就会占用大量的存储资源, 这对于科研预算是一笔极大的浪费 按照 Stein 的观点, 应该在公共云系统里储存一份数据, 供全世界的科研人员使用 不需要再进行下载或者上传数据的工作 NCBI 受到了这个提议的鼓舞, 将一份千人基因组项目的数据储存到了云系统里 美国东海岸 EBI 数据库 Ensemble 的用户们也都自动地采用了云计算业务, 这算是对 Stein 提议的一次响应, 也是一次实战检验 不过, 采用这种云存储方法还存在一个问题, 那就是数据安全问题 与人类健康相关的数据尤其需要特别小心, 这也是让很多科研人员在面对云计算业务时感到犹豫不决的原因 不过在美国, 至少有一家云服务供应商已经开展了这项人类基因组数据存储服务, 他们替客户保存的数据受到了严格的 美国健康信息保护法 (health information protection laws of the United States) 的保护, 所以对数据安全的担忧也可以稍微减少一点了 上述所有这些问题在去年全都暴露了出来 去年, 美国国家人类基因组研究院召开了好几次会议, 专门讨论云计算问题 信息学问题及数据分析问题 去年夏天他们还决定开展更多的生物信息学培训和教育普及推广工作 虽然目前, 美国国家人类基因组研究院还没有这方面的计划, 但是据 Bonazzi 介绍, 他们已经开始着手准备这方面的工作了 原文检索 : ELIZABETH PENNISI. (2011) Will Computers Crash Genomics? Science, 331: YORK/ 编译 50

54 生命百态 Amazing Lives 田螺会睡觉吗? 不可否认, 睡眠是珍贵而实用的东西 任何一位常受失眠之苦的朋友都很清楚, 睡眠障碍会给自身带来多大的损失 最近, 来自加拿大多伦多大学 (University of Toronto) 的 Richard Stephenson 和 Vern Lewis 就做了一项有关睡眠的有趣研究 他们解释说, 人们认为, 睡眠在包括记忆形成等一系列生物学进程中起着关键的作用, 但目前仍有许多相关问题未能得到解答 比如, 我们甚至不知道自己到底需要多少睡眠 不过, 据 Stephenson 和 Lewis 所言, 软体动物, 比如海兔和静水椎实螺 (Lymnaea stagnalis) 就能在记忆形成的神经基础学方面为我们提供大量的启示 那么, 在人们还不清楚它们是否会睡觉的情况下, 它们是否还能在睡眠机制方面给予我们什么呢? 为了解答这个问题,Stephenson 和 Lewis 决定先探明这种静水椎实螺到底会不会睡觉 Stephenson 和 Lewis 承认 : 目前还没有哪一个特征能明确地界定某种动物处于睡眠状态 当人们想确定动物是否进入这种状态时, 需要同时使用几种指标 假设静水椎实螺会睡觉, 那么就需要按照这些指标描述出处于睡眠状态的它们表现如何, 比如会常常处于无反应的 难于清醒的状态, 比如停靠在特定的地方, 等等 为了证明这一点, 两位研究者用一只水箱装满了静水椎实螺, 并开始监测它们的行为, 然后把这些软体动物的活动情况分类, 以期发 51

55 生命奥秘 现它们是否有类似睡眠的行为发生 Stephenson 和 Lewis 观察了静水椎实螺的行为之后, 清楚地发现它们黏附在固体的表面, 保持静止状态达数十分钟 此时, 田螺看上去就像其它会睡觉的动物一样放松 : 它们附着在水箱壁上, 身体悬在壳的外面, 足部显得对称而松弛, 仅有部分触手伸展着 如此看来, 静水椎实螺很有可能在睡觉 当然, 两位研究者只是确认它们具有一种类似睡眠的休息状态 接下来, 他们还要测试田螺的各种反应 两位学者分别在田螺活动时和明显处于 睡眠 状态时轻击它们, 并设法刺激它们的食欲, 观察其表现如何 结果, 他们发现, 处于休息状态的田螺的反应比处于活动期的田螺明显缓慢得多 相对于活动期的田螺而言, 休息状态的田螺在受到轻击后要花两倍的时间才能缩回壳内 ; 而在应对食欲刺激考验时, 后者也需要 7 倍的时间才能作出反应 总之, 静水椎实螺确实像是会睡觉, 不过, 它们的睡眠是否像我们一样有节律呢? 会不会受到昼长的影响呢? 于是, 研究小组进一步监测 8 只静水椎实螺在 79 天内的行为 在这段日子里, 他们不断改变田螺受到的光照射 结果, 这些田螺并没有以 24 小时为一个周期调控自己的睡眠, 而是把几次睡眠集中成一段, 然后每隔 2-3 天再睡上这么一次, 由此循环 而且, 它们似乎不会遭受 睡眠反弹 我们由于睡眠不足而出现的 补眠 行为 的痛苦 根据这样的实验结果,Stephenson 和 Lewis 认为, 尽管静水椎实螺与哺乳动物的休息行为存在着诸多差异, 但他们相信这种田螺确实会睡觉 他们表示说 : 我们认为, 静水椎实螺由于生理解剖简单, 神经生理学方面极易控制, 所以可能有助于我们对睡眠调控和睡眠功能的细胞机制的研究 原文检索 : Stephenson, R. and Lewis, V. (2011). Behavioural evidence for a sleep-like quiescent state in a pulmonate mollusc, Lymnaea stagnalis (Linnaeus). J. Exp. Biol. 214, 文佳 / 编译 52

56 鸽子用右鼻孔嗅出回家之路 鸽子懂得找到回家之路的能力已经使人类着迷了千年之久 起初, 人们只是利用这种鸟儿传递信函 而今, 人类已经运用智慧创造了各种工具, 总算能与鸽子比个高低了 可是, 千年以来的疑问似乎还未能得到较为满意的解答 : 这些卓越的飞行员在陌生的环境下被放飞之后, 是如何锁定回家的路呢? 分别来自于特伦托大学 (University of Trento) 比萨大学 (University of Pisa) 和马克斯 普朗克协会鸟类学研究所 (Max Planck Institute for Ornithology) 的 Anna Gagliardo 等人解释说, 鸽子是利用一种 嗅觉地图 为自己导航的 当它们还窝在鸽房里时, 就已经能够根据气味的来源识别方向了 ; 同时, 鸽子还创建了一幅精确得足以引导它们回家的地图, 这项工作要做到它们能够利用本地的各种标志为自己导航, 并准确返回, 才算大功告成 不过, 在嗅觉方面, 鸽子的两只鼻孔的地位似乎并不相同 Gagliardo 表示 : 鸽子的左右嗅觉系统在处理嗅觉信号时并不同等高效 她补充说, 过去有一些研究把堵住一边鼻孔的鸽子放飞, 其结果强调了它们的嗅觉的不对称性 : 即鸽子的右鼻孔嗅觉更强 Gagliardo 很想弄清这个情况的真实度有多高, 于是照葫芦画瓢, 以饲养在比萨市郊外的具有回归能力的鸽子为研究对象, 分别堵住它们的左边或者右边的鼻孔, 然后在 41.6 公里之外的 Cigoli 放飞它们 接着, 研究小组用 GPS 追踪鸽子的返回路线, 以确认堵住一边鼻孔的做法是否会影响它们回归原地的能力 Gagliardo 等人通过分析鸽子的飞行路径, 发现与只能用右鼻孔呼吸的鸽子相比, 无法用右鼻孔呼吸的鸽子绕的弯儿较大, 停留较频繁, 同时也花更多的时间探寻它们的中途休息站 由此, 研究人员猜测, 被堵住右边鼻孔的鸽子需要用更多的时间进行探索, 从而采集额外的导航信息 并且, 他们还认为, 鸽子的左边鼻孔对气味的敏感度要比右边的低 研究小组总结说 : 右边鼻孔被堵塞的鸽子的行为表明, 当其 导航地图 处于使用阶段时, 这种鸟类的右鼻孔在处理有利于这种操作的嗅觉信息方面起着特定的作用 原文检索 : Gagliardo, A., Filannino, C., Ioalè, P., Pecchia, T., Wikelski, M. and Vallortigara, G. (2011). Olfactory lateralization in homing pigeons: a GPS study on birds released with unilateral olfactory inputs. J. Exp. Biol. 214, 文佳 / 编译 53

57 生命奥秘 54

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