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镇彭
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1 第卷第期年月西安交通大学学报医学版!"#$## %&'&! 临床研究不同分期溃疡性结肠炎结肠黏膜血清素再摄取转运体的表达分析秦燕王进海徐艳丽刘娟李新红刘素蓉西安交通大学第二附属医院消化内科陕西西安 #$ 兵器工业卫生研究所老年病科陕西西安 #% 摘要目的检测血清素再摄取转运体 &' 在不同分期溃疡性结肠炎结肠黏膜中的表达情况探讨炎症性肠病患者肠易激综合征 & 样症状的发病机制方法纳入年至年名患者其中男性 # 名女性 $ 名平均年龄 $#( 岁活动期患者名缓解期患者名收集病史资料及常规结肠镜检查检测患者分期 ) 成像进行黏膜分型常规非常规血管型 *' 染色评估黏膜 +,- 组织学分级免疫组织化学方法和. / 检测 &' 色氨酸羟化酶./*. 及炎性因子的表达高通量 / 分析系统检测炎症及成血管相关基因表达谱分析 &' 表达与 & 症状炎症因子及成血管相关基因表达的相关性周龄 #%0 雄性小鼠共 $ 只分为模型组和对照组利用右旋葡聚糖苷钠 1&& 构建结肠炎模型动态检测不同时间点 &' 和炎症基因在小鼠结肠黏膜的表达结果缓解期患者黏膜 &' 基因相对浓度和组织学表达强度显著高于活动期黏膜 &' 基因表达水平与 & 样症状呈负相关性活动期黏膜. ) 相对表达水平显著高于缓解期黏膜 +,- 组织分级结果. ) 相对浓度与 &' ) 的相对浓度呈负相关 /*. ) 的表达与黏膜. ) 表达无显著相关性常规血管型黏膜 &' ) 表达高于非常规血管型组织学分级及 /*. ) 表达低于非常规血管型.. 在非血管型黏膜组织中显著增高小鼠结肠炎模型组 &' 表达显著低于对照组结论 &' 在患者活动期黏膜中表达下调在非常规血管型缓解期黏膜中表达下调 &' 下调参与溃疡性患者 & 样症状形成的病理过程该过程与炎症以及成血管机制相关关键词血清素再摄取转运体溃疡性结肠炎结肠黏膜炎症肠易激综合征中图分类号 #$ 文献标志码 #%!"!!#!$% 2) 3," 4)506".,6 3,".76 0," 6".8"9 &.:8"9 1,:"8;5,-:8": ,--&!8" ;676, *8-6,78; 6,"06,88"9"6:-66,"#$1,:"8;5:,8789 *8-6,78;6"-4,8"-"-6-8;*,76,"#%6", &'& "# $( )# *##+"",,*") -.$+&/"+#)"$))& *$#&(& "&*#")& /##" """### *#")"+& +#)#)#",""""#, *,")&!" *", 0&$(10 ")) # * "#", ()1+("-00&))""##)# *"*"#", 1+()& 收稿日期 ## 修回日期 # 基金项目陕西科技发展重点项目 '&#!$$% $", 1#$$##"# 1'&#!$$% 通信作者王进海主任医师 &) *)&#) 优先出版 &#&#)"%&&(&$&&$&)$!"

2 期秦燕王进海徐艳丽等不同分期溃疡性结肠炎结肠黏膜血清素再摄取转运体的表达分析 # $(")) ##)#*"#"")# ") ))"#, $$&2" *" *$1$$&&## $("##)#*# * #)#&&$( * #"*-.$ ))& ##-3)('2##)#*# #)#&&##$( )('2 * " ##-3)('2"!#&&&&& 10)('2"-3 )('2 *# #" &&&!#" 10)('2 **#)##*$( #)#*& "++3* # #")#&$($$)#**# && $("*",##)##+ " )##&$("-.$ )) + "))"#)#)& ( $(####)#)),,*") 肠易激综合征 6::6,787-":8& 以排便习惯和大便性状异常为主要症状在溃疡性结肠炎 7!:,6!8766- 患者中较为常见但其. 产生的原因尚未明确研究提示胃肠运动功能紊乱应激反应内脏反应肠道固有免疫及肠道微生. 物基因多态性等因素均参与 & 的发病过程. 羟色胺.:8:,6".* 为单胺类神经递质由色氨酸羟化酶.:8,":87,-. /*. 参与合成在肠道系统广泛表达调节肠道运动功能.* 代谢异常与 & 发生密切相关其受体也是 & 治疗药物的靶点 $ 血清素再摄取转运体 -:88"6":,:,"-. 8::&' 可以通过重吸收.* 调节其活性 %.# &' 基因启动子多态性可以影响转运体在结肠黏膜中表达在 & 的致病过程中起到重要作用动物实验结果提示 &' 基因在结肠炎模型中表达降低另外炎性因子水平提高可以下调 &' 基因的表. 达目前关于 &' 是否在不同疾病分期患者结肠黏膜中有所差异尚存在争议而缓解期患者结肠黏膜中 &' 表达的相关研究更为罕见本研究选择患者作为研究对象结合动物实验检测 &' 基因在活动期和缓解期患者结肠黏膜及动物模型中的表达情况并利用内镜窄带成像术 ",:8," 6,96"9) 检查分类缓解期黏膜分析 &' 表达与内镜检查结果炎症因子及血管形成相关基因表达的相关性探讨疾病中 & 样症状发生的机制为炎症性肠病的诊疗提供依据 ) 材料与方法 )) 主要试剂 *' 染色试剂盒免疫组织化学检测试剂盒武汉博士德 1 显色试剂盒 1'/ :687 试剂 &69, 公司美国所有一抗辣根过氧化酶标记羊抗兔二抗 &,",: 公司美国逆转录试剂盒 8! 公司美国 &3 &7!+,-: 美国其他试剂为实验室常备 )* 研究对象与资料收集研究对象均系西安交通大学第二附属医院消化内科及兵器工业卫生研究所收治患者纳入标准根据临床病史症状体征以及内镜检查结果诊断为活动期或者缓解期排除标准合并其他肠道疾病合并肿瘤感染等重大疾病或者其他系统影响研究结果的疾病具有内窥镜检查或者活检检查禁忌证收集研究对象门诊及住院就诊医疗记录本研究方案经机构伦理委员会批准同意相关方案获得患者和家属知情同意自年至年间共有名患者纳入研究其中男性 # 名女性 $ 名平均年龄 $#( 岁患者病变累及全结肠共 % 例左半结肠例直肠 % 例平均患病时间 % 年平均腹泻次数 ( 次名患者按照罗马标准诊断为 & 腹泻型名便秘型名不定型 % 名根据临床病史体征结合内镜检查结果共有名患者诊断为活动期名患者诊断为缓解期 )+ 内镜检查与标本收集使用 ) 检查进一步将缓解期黏膜分为常规血管型型和非常规血管型型由名医师独立评估分型型定义为 ) 图像显示黏膜具有腺窝开口伴随常规血管网环绕型定义为结肠黏膜图像与型表现差异较大使用内窥镜活检术取出活检标本用于组织!"

西安交通大学学报医学版第卷学评估及 ) 检测每位患者采集至多个样本对于全部黏膜处于缓解期患者取出型和型样本对于活动期患者取出活动期黏膜样本活检标本部分快速冰冻液氮保存部分 $9 多聚甲醛固定用于组织学评估 ),- 实时定量. 检测将上述部分肠黏膜标本于 ) 贮存专用试管抽提总 ) 测定 ) 浓度利用!1) 合成试剂盒反转录 ) 选择 5/.

黏膜糜烂隐窝脓肿伴有炎性细胞全层浸润级溃疡出血黏膜坏死伴有上述细胞浸润 )1 免疫组织化学染色石蜡包埋标本切片后脱蜡至水按照 &/ 法行免疫组织化学染色利用血清封闭内源性过氧化物酶活性使用兔抗人 &' 抗体以及 /*. 抗体孵育过夜检测 &' 及 /*. 的表达镜下观察细胞膜细胞质及细胞外基质中出现棕黄色反应产物判定为阳性 ), 高通量.

3 西安交通大学学报医学版第卷学评估及 ) 检测每位患者采集至多个样本对于全部黏膜处于缓解期患者取出型和型样本对于活动期患者取出活动期黏膜样本活检标本部分快速冰冻液氮保存部分 $9 多聚甲醛固定用于组织学评估 ),- 实时定量. 检测将上述部分肠黏膜标本于 ) 贮存专用试管抽提总 ) 测定 ) 浓度利用!1) 合成试剂盒反转录 ) 选择 5/. 1* ) 作为内参计算各基因相对浓度检测结肠炎症对黏膜 &' 表达的影响使用 ) 7,-887 及 /:6: 进行引物设计 ),/0 染色进行标本组织学评估标本置于 $ 9 多聚甲醛固定逐级脱水二甲苯透明石蜡包埋切片片厚行 *' 染色按照炎性活动评分 +,- 进行组织学分级级基本正常级黏膜或黏膜下层有单核或者多核粒细胞浸润级结肠全层糜烂伴有炎性细胞浸润 $ 级黏膜糜烂隐窝脓肿伴有炎性细胞全层浸润级溃疡出血黏膜坏死伴有上述细胞浸润 )1 免疫组织化学染色石蜡包埋标本切片后脱蜡至水按照 &/ 法行免疫组织化学染色利用血清封闭内源性过氧化物酶活性使用兔抗人 &' 抗体以及 /*. 抗体孵育过夜检测 &' 及 /*. 的表达镜下观察细胞膜细胞质及细胞外基质中出现棕黄色反应产物判定为阳性 ), 高通量. 分析成血管通路基因表达利用 /:8;67/ 分析系统检测成血管通路相关的 $ 个关键性基因即疾病相关通路表达谱同上述提取总 ) 检测 ) 浓度按照第序列试剂盒操作说明进行 ) 反转录 / 仪参数设定为 6"$ 个循环变性 -. 退火 % 6". 延长 %6" 根据与 5/1* ) 测定值的比例计算 ) 的相对浓度 ) 动物模型的构建及相关基因检测采用右旋葡聚糖苷钠 1&& 诱导结肠炎模型周龄清洁级 #%0 雄性小鼠共 $ 只体质量 9 由西安交通大学实验动物中心提供相关实验按照西安交通大学动物伦理标准进行实验前适应性喂养周实验动物随机分为两组模型组只饮水中加入 < 1&& 持续对照组只饮水中加入等浓度葡萄糖造模后 #$%$ 采集结肠标本检测相关基因变化部分标本甲醛固定后石蜡包埋切片行组织学评估 ) 统计学处理采用 &/&& 统计软件进行分析计量资料以均数 ( 标准差表示两组间比较采用校正检验计数资料采用卡方检验使用 &,:," 秩和检验分析指标间相关性为差异有统计学意义 * 结果 *,) 患者的表达及其与 ' 样症状发生的相关性活动期患者 & 发生率为 %$< $ 缓解期患者 & 发生率为 $< 常规结肠镜活检共取出有效标本个其中例由活动期黏膜取出例由缓解期黏膜取出 &' 免疫组化结果提示缓解期结肠黏膜肠上皮细胞 &' 表达呈现强阳性活动期黏膜 &' 阳性程度较低图./ 结果提示缓解期黏膜 &' 基因相对浓度高于活动期黏膜经校正检验差异具有统计学意义 &,:," 秩和检验分析结果提示 &' 基因的表达与 & 症状表达呈负相关图 ) 溃疡性结肠炎结肠黏膜组织表达情况 =69':--68"8;&'6"7!:,6!878"6!!8-, 肠上皮细胞 &' 表达缓解期肠上皮细胞 &' 表达活动期 *,* 患者的表达与结肠炎症的相关性 +,- 组织分级级例标本级例标本级 # 例标本 $ 级例标本级例标本 +,- 组织分级结果与 &' ) 的相对表达量呈负相关活动期黏膜.) 相对量高于缓解期黏膜经校正检验差异具有统计学意义图. ) 相对量与 &' ) 相对量呈负相关图 * 溃疡性结肠炎结肠黏膜和 #2& 表达 =69':--68"-8;&',". )6"7!:,6!878"6!!8-, &' ) 表达.) 表达 *,+ 患者结肠黏膜.0) 表达及其与结肠炎症!"

期秦燕王进海徐艳丽等不同分期溃疡性结肠炎结肠黏膜血清素再摄取转运体的表达分析的相关性免疫组化染色结果显示 /*. 主要在上皮细胞中表达在活动期黏膜和缓解期黏膜组织中均有表达活动期黏膜 /*.

!8-, 肠上皮细胞 /*. 表达缓解期肠上皮细胞 /*. 表达活动期 /*.) 表达 *,- 型和型缓解期黏膜中.

!8-,8;6::97,:,:"," :97,:--7,:" 型黏膜 ) 成像型黏膜 ) 成像组织学评分对比 1&' ) 表达 '/*.

4 期秦燕王进海徐艳丽等不同分期溃疡性结肠炎结肠黏膜血清素再摄取转运体的表达分析的相关性免疫组化染色结果显示 /*. 主要在上皮细胞中表达在活动期黏膜和缓解期黏膜组织中均有表达活动期黏膜 /*. ) 相对量与缓解期黏膜相比差异无统计学意义 $ /*.) 的表达与黏膜.) 表达无显著相关性图图 + 溃疡性结肠炎患者结肠黏膜.0) 表达 =69':--68"8;/*.6"7!:,6!878"6!!8-, 肠上皮细胞 /*. 表达缓解期肠上皮细胞 /*. 表达活动期 /*.) 表达 *,- 型和型缓解期黏膜中.0) 的表达缓解期型黏膜大体表现与正常黏膜较为一致两种黏膜组织 +,- 组织学分级差异无统计学意义 # 型黏膜 &' 基因 ) 的表达相对量与型黏膜相比差异具有统计学意义两组 &' 基因表达水平与活动期黏膜 &' 基因表达相比差异均具有统计学意义型黏膜 /*. ) 相对表达水平与型黏膜相比差异无统计学意义 $ 图 $ 图 - 常规血管型和非常规血管型缓解期黏膜 2' 成像及表达 =69$)6,9-," :--68"8;&'9"-6"!878"6!!8-,8;6::97,:,:"," :97,:--7,:" 型黏膜 ) 成像型黏膜 ) 成像组织学评分对比 1&' ) 表达 '/*.) 表达 *,/ 型和型缓解期黏膜中炎症成血管通路基因的表达高通量 / 分析结果提示在 $ 个基因中个基因在型黏膜组织中增高图其中.. ) 相对表达水平显著增高上述基因在不同分期不同分型黏膜中表达如图 % 所示与种黏膜 &' 表达水平做相关性分析结果见表 *,1 小鼠结肠炎模型和 3.* 的表达造模后 $ 时 1&& 诱导的小鼠结肠炎模型中结肠组织中巨噬细胞炎性蛋白 +/.) 相对表达水平为 $( 对照组为 ( 经检验差异具有统计学意义提示模型构建成功模型组 &' 基因 ) 的表达相对浓度比为 ($ 对照组为 ( 经检验差!"

5 $ 西安交通大学学报医学版第卷异具有统计学意义对比模型组 &' 基因表达水平在造模后 $ 内持续降低 +/. 表达在造模过程中持续升高停用 1&& 后下降图 / 常规血管型和非常规血管型缓解期黏膜中炎症成血管通路基因的表达 =69':--68"8;6";7,,68".,","9689"-6-.:7, 9"-6"!878"6!!8-,8;6::97,:,:"," :97,: --7,:" 图 1/ 种炎症成血管通路基因在不同分期分型黏膜中的相对表达 =69%':--68"-8;;66"-8;6";7,,68".,","968. 9"-6-.:7, 9"-6"!878"6!!8-,8; 6;:"-,9-," - 表 )/ 种炎症成血管通路基因与表达的相关性分析,8::7,68"8;;66"-8;6";7,,68".,","968. 9"-6-.:7, 9"-," :--68"8;&' ) 基因相关系数.. % % # + 讨论本研究结果提示在活动期患者其结肠黏膜组织 &' 基因表达下调动物实验结果与之一致 &' 基因在缓解期患者结肠黏膜中表达与局部炎症因子表达具有相关性由于局部低程度的炎症持续存在可能导致 &' 基因表达下调未恢复至正常 &' 是.* 的再摄取转运体主要调节黏膜中.* 的浓度 &' 基因水平下调导致.* 水平升高影响胃肠正常运动功能导致肠胃运动亢进或者障碍既往研究多提示异常的 &' 基因水平与 & 的发生密切相关腹泻型 & 患者血小板中 &' 表达量明显减少 &' ) 与十二指肠炎症活动具有负相关性 &' 表达水平下降还可能影响上消化道系统功能 &' 基因启动子区域的多态序列存在 $$ 对基本的缺失或者突变可以形成 & 型等位基因 && 和 & 型基因型与 &') 的低水平转录具有相关性是腹泻型 & 的危险因素还有研究指出 &' 启动子区域多态性与腹泻型 & $ 发生无相关性因此 &' 基因多态性是否是 &' 水平影响胃肠功能的具体机制这一观点还存在较多争议本研究未做相关多态性研究中 &' 表达的相关研究报道不多 >'& 等发现患者结肠上皮细胞 &' ) 的含量 % 与免疫反应程度具有负相关性?)' 等利用和克罗恩病患者活检组织检测 &' ) 结果提示克罗恩病患者活检组织 &' 表达量较高有研究报道了 &' 在缓解期黏膜中的表达水平与 # 炎症的关系文中分型与 &' 表达结果与本研究类似但是该研究中未比较活动期黏膜与不同分型黏膜的 &' 水平差异本研究结果提示在活动期结肠黏膜组织中 &' 的相对表达水平显著低于缓解期不同分型结肠黏膜 &' 表达水平与. 炎性因子表达具有显著相关本研究严格筛选研究对象入选对象经临床病史症状以及内镜检查确诊采用. / 技术检测 &' ) 的表达情况结论较为可靠另外上述相关研究中未分析 & 临床症状与 &' 相关性本研究结论提示患者 & 样症状与 &' 基因表达具有显著相关性组织病理学评估以及免疫组织化学染色结果也支持上述结论在结肠炎动物模型中 &' 在肠上皮细胞表达模型组炎性蛋白 +/. 表达增加在停止 1&& 干预后 +/. 水平回落但是该组 &' 表达持续呈低水平表达在使用细菌制剂或者 )& 等诱导的肠炎中可以观察到类似结果本研究检测了 /*. ) 的相对水平结果显示 /*. 表达在不同疾病分期标本中无显著差异与炎性因子表达无关 /*. 是参与.* 合成的重要物质该结果显示.* 水平改变导致的胃肠功能紊乱可能与 /*. 无关侧面反映了 &' 在上述病!"

6 期秦燕王进海徐艳丽等不同分期溃疡性结肠炎结肠黏膜血清素再摄取转运体的表达分析 $ 理过程的重要作用本研究通过 ) 成像技术将缓解期结肠黏膜分为型和型结果显示 &' 表达在患者缓解期黏膜中表达受到抑制在型的缓解期黏膜中下降明显高通量 / 分析结果显示在型的缓解期黏膜中很多炎症及血管相关基因表达上调提示型黏膜存在低程度的炎性活动上述结果提示 &' 在型黏膜中表达下降与低程度的炎症活动存余有关近年来有研究报道胃肠道免疫激活可能参与 & 的发生研究提示低程度的肠道炎症以浆细胞细胞和巨噬细胞浸润为表现以前炎性因子的表达增加以及上皮细胞增生为特征 + 等检测 & 患者十二指肠部位活检标本时发现组织上皮间隙淋巴细胞和浆细胞增多 &' 基因表达下调 &' 基因在 & 发病过程的重要作用已有较多文献报道本研究通过上述检查发现的 &' 基因在炎症性结肠炎患者结肠黏膜的表达程度及规律一方面为患者 & 样症状形成的病理机制提供一定基础另一方面也揭示炎症过程与 &' 基因表达的关系为 & 疾病研究提供证据综上所述本研究发现 &' 在溃疡性患者活动期黏膜中表达下调局部黏膜存在低程度炎症时缓解期黏膜中 &' 表达水平仍然下调提示 &' 参与患者 & 样症状形成的病理过程参考文献 $1-33( (!24( 5&-.$"-. #) &' ( 5 0% %%& $2'-$-+ %6-537!&,*-.$" -.*"*") &(5 0$$& 3- /-7!2&-.$2 "8,#9#&. )#%& $.2(.2(2 5&-.$.)-.$(" )) &'(50& $22+0( 0!-(%-'51!34!(!+&!# )"## " 4!21#-.$&' (50$$%%%& %'2-($!2( 2+02(-&!#) $(, 5"#"$)"*&13$4 ##& #-' !6&( /"5%%#$& 04 +0'$02'57&6 *,,*")-.$ &+- $$##& 1-5'2'-33+%('4++0-1&5)#,","),"#-."-.$ #""""&&-)).* %$#$& 靳继伟王迎寒张晓峰 &0 信号通路在肠易激综合征发病机制中的研究进展 & 承德医学院学报 %$%& $+04'311-!'3!&"$ ", ) -.$))9" &2)1)#$$& (2.!.4+0( 7(33!2''!&$ $( )#"* $(, ",")".!-,,#&'#!"%$& %%-3-.-+!&) #8"2"$( ))&5 $$& $3.712($7(7 0!&+) 2$("!+1),"#)"#"## "&2#+(& +42$!/-33-2!$-'$37 2&$$,##" # ## * ###) 2 )" &5 % $$& %32+'(!53$-502( (& )###)#)"# ##-.$#3,"5- )) &2) 5$ $& #22 7-$0-02(2$2/2$0-!2 &* ##)##)*") )##&5% $$$& 3 7-! /04'5$&+"##, )'.$"#"#2)## )#)"#"&1)# $#%$%& 40!2'3$-!(:'!&1-.$) ))) "))#&'( 50#%#& 32! +2' /3-504'!&4+%!8 )""),,* "),"2 )# ")" #,#"&5$%$$& 编辑卓选鹏,,*")&!"

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