8 *' 9+%,-.,.- & : & ; 论著粪菌移植对诱导的结肠炎小鼠内脏敏感性的影响陈立王承党福建医科大学附属第一医院消化内科消化系病研究室!" 基金项目福建省自然科学基金资助项目 "9 背景粪菌移植 >52 能减轻炎症性肠病 = 患者肠黏膜炎症改善临床症状但具体作用

Size: px

Start display at page:

Download "8 *' 9+%,-.,.- & : & ; 论著粪菌移植对诱导的结肠炎小鼠内脏敏感性的影响陈立王承党福建医科大学附属第一医院消化内科消化系病研究室!" 基金项目福建省自然科学基金资助项目 "9 背景粪菌移植 >52 能减轻炎症性肠病 = 患者肠黏膜炎症改善临床症状但具体作用"

纱邮姜
4 years ago
Views:

1 8 *' 9+%,-.,.- & : & ; 论著粪菌移植对诱导的结肠炎小鼠内脏敏感性的影响陈立王承党福建医科大学附属第一医院消化内科消化系病研究室 " 基金项目福建省自然科学基金资助项目 "9 背景粪菌移植 >52 能减轻炎症性肠病 = 患者肠黏膜炎症改善临床症状但具体作用机制尚未明确目的探讨 >52 对葡聚糖硫酸钠 << 诱导的结肠炎小鼠内脏敏感性的影响方法小鼠饮用 << 溶液制备结肠炎模型将 8 只 *"=6 小鼠随机分为正常对照组组模型对照组 = 组双歧杆菌三联活菌组 * 组粪便滤液组组分别给予 ;%*& 溶液 ;%*& 溶液双歧杆菌三联活菌液粪便滤液灌肠计算小鼠疾病活动指数结肠组织病理学评分测定不同结直肠扩张 *4 容积时腹壁肌电幅值变化免疫组化法测定腰骶髓物质 < 降钙素基因相关肽 *+4 表达结果 = 组小鼠结肠组织病理学评分和腰骶髓 < 表达明显高于组 * 组和组 1? " 而 * 三组相比差异无统计学意义 1B " 扩张容积为 8 $6 时 = 组腹壁肌电幅值显著高于组 * 组和组 1? " 且与 < 表达之间存在正相关关系 1? " 四组小鼠腰骶髓 *+4 表达相比差异无统计学意义 1B " 结论 >52 可改善结肠炎小鼠的内脏敏感性减少腰骶髓 < 表达其降低内脏敏感性的作用可能与抑制脊髓背角 < 表达有关关键词粪菌移植内脏敏感性结肠炎物质降钙素基因相关肽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现工作单位福建省莆田市第一医院消化内科 " 本文通信作者 #$% & % 0'& % $ *%&, +..4.&%,.0.), 0.

2 胃肠病学年第卷第期 8 炎症性肠病 /&%$$%, - 1.&0.%. = 常表现为反复腹痛腹泻黏液脓血便等部分缓解期 = 患者也常出现腹痛排便异常等肠易激综合征 =< 样症状内脏高敏感被认为是 = 和 =< 患者相关疼痛症状的主要病理生理机制处于缓解期甚至黏膜已愈合的 = 患者出现 =< 样症状是提示还存在炎症活动还是合并 =< 这一问题目前仍不明确临床上需一种治疗措施既可拮抗肠道炎症又能减轻处于疾病活动期或缓解期患者的临床症状无论是由炎症活动还是合并功能性疾病引起粪菌移植 /. %&$ - 1,%,-%)&%,%, >52 是一种将健康人的粪便以混悬液方式通过一定途径输入至患病个体肠道内以恢复或补充正常肠道菌群从而实现疾病治疗目的的治疗手段 8 >52 可用于治疗 = 但具体作用机制仍处于研究探讨中本研究通过葡聚糖硫酸钠 0.,-% &/%,. 0 $ << 建立小鼠结肠炎模型并给予粪便滤液灌肠治疗旨在探讨 >52 对内脏敏感性的影响及其可能机制从而为 = 的临床诊治提供一定的依据一实验材料材料与方法实验动物雄性清洁级健康 *"=6 小鼠 " 只体质量购于上海斯莱克实验动物有限公司用混合配方饲料由上海斯莱克实验动物中心提供喂养自由进食饮水每日更换饮水饲料定期更换垫料保持小鼠生活环境通风和清洁卫生主要试剂与器材 << 购自 5 = $.0 %& 双歧杆菌三联活菌胶囊购自上海信谊药厂有限公司尿粪隐血试验试剂购自南京建成生物工程研究所浓缩型兔抗小鼠物质 < 降钙素基因相关肽 *+4 多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司工作浓度分别为 " 免疫组化检测试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司多道生理信号采集系统 45 8= 成都仪器厂数字显微摄像系统 & $) 公司二实验方法 " 小鼠粪便滤液的制备参照 * 等的研究方法制作粪便滤液实验动物分组和处理随机选取只小鼠作为粪便供体组余 8 只小鼠按的比例随机分成正常对照组组和模型组模型组小鼠参照 *'%% 等的方法自由饮用 <<565 6 蒸馏水溶液 0 诱导急性结肠炎然后改饮用蒸馏水组小鼠自由饮用蒸馏水实验第天将模型组随机分为模型对照组 = 组双歧杆菌三联活菌胶囊组 * 组粪便滤液组组每组各只实验第天 = 组小鼠给予 ;%*& 溶液灌肠 $6* 组给予双歧杆菌三联活菌液灌肠 $6 "" 组给予粪便滤液灌肠 $6 " 次 0 " $6 次间隔 0 总共次灌肠治疗结束 0 后参照 6% 等和刘玮等的方法行结直肠扩张 *4 扩张容积为 8 $6 时测定小鼠腹外斜肌肌电疾病活动指数每天观察并记录小鼠进食饮水精神活动排便等情况称重体质量计算评分 8 结肠组织病理学评分 *4 实验结束后用水合氯醛腹腔内注射麻醉小鼠剖腹取病变明显的远端结肠行病理学检查并进行评分正常肠黏膜分黏膜层轻度炎症和水肿基底部隐窝消失分黏膜层中度炎症基底部隐窝消失分黏膜层中度炎症隐窝完全消失但上皮层尚完整分黏膜层黏膜下层肌层中度炎症隐窝和上皮层消失 8 分每张切片随机选取个高倍视野组织病理学评分取均值 " 腰骶髓免疫组化染色取腰膨大以下 6 < 脊髓节段经甲醛固定石蜡包埋连续 8 $ 厚切片采用免疫组化 < 法检测 < 和 *+4 表达具体步骤参照试剂盒说明书操作每张切片随机选取个高倍视野采用图像分析系统进行计算取均值三统计学分析应用 < << 统计软件所有数据用 7F 表示用 6... 检验进行方差齐性检验各组比较采用单因素方差分析组间两两比较用 6<$ 方差齐或 2%$'%. 2 方差不齐法用.%- 相关分析进行相关性检验 1? " 为差异有统计学意义结果一一般情况和评分

$B9/ 1 WC7 0 D < F 1D F < 8 # "#$# X< 8 *%# Y< Z##,V$ M组小鼠在整个实验中毛色光整#反应灵活#活本规则( 给予灌肠后#B组和 '组肠组织损伤减轻动'进食'排便均正常# 体质量增加$ 模型组小鼠饮 % 图 #& $ M组'B组''组组织病理学评分均显著低 "\ '`` 溶液后逐渐出现毛色不光整# 反应迟用 * "4&$

3 B9/ 1 WC7 0 D < F 1D F < 8 # "#$# X< 8 *%# Y< Z##,V$ M组小鼠在整个实验中毛色光整#反应灵活#活本规则( 给予灌肠后#B组和 '组肠组织损伤减轻动'进食'排便均正常# 体质量增加$ 模型组小鼠饮 % 图 #& $ M组'B组''组组织病理学评分均显著低 "\ '`` 溶液后逐渐出现毛色不光整# 反应迟用 * "4& #而这三组之间无明显差异 % If 于 a组% Ic 钝#活动'进食减少# 粪便呈糊状# 且次数增多# 粪便 "4& % 表 #& $ 隐血试验阳性#第 4 天开始出现不同程度的体质量三'小鼠腹壁肌电变化下降# 停用 '`` 后体质量仍继续下降( 实验第 #" 各组小鼠腹壁肌电幅值随着扩张容积的升高天#即灌肠前 # 天 B组和 '组各有 # 只小鼠死亡# " 6T时# 四组小鼠腹壁肌而增高$ BR'容积为解剖发现结肠明显充血'水肿'溃疡$ 造模后#a组' 电幅值无明显差异 % )^$#V#I^4"" & $ BR' B组''组之间 'M)相比差异无统计学意义 % If "V' ",' "$ 6T时#a组腹壁肌电幅值容积为 "4& $ 灌肠后#M组'B组''组 'M)均显著均低于显著高于 M组'B组''组 % Ic"4& # 而后三组之 a组 % Ic"4 & # 而这三组之间无明显差异 % If "V' ", 6T的腹壁肌电幅值相比间扩张容积为 "4& % 表 #& $ "4& % 表 & $ 差异无统计学意义% If & 表 $各组小鼠 ',%和结肠组织病理学评分比较 % U "p3 组别例数治疗前 'M) 治疗后 'M) M组 #" "" p "" #3 p $ a组 #" #* +3 p $# #* 43 p +% B组 '组 + + * #V p,% * 3 p 4 组织病理学评分 %% p 4 4V p V% V, p V% &&#*脊髓背角 `表达"`阳性神经元集中分布于脊髓背角浅层# 呈细胞质内褐色颗粒或细丝状# 对称分布$ M组'B组和 '组 `表达均显著低于 a #*,% p 3V &&四'小鼠腰骶段脊髓背角 `'BCR表达 U X,3 p 4 """#I^ "#"#I^ "%4& #而这三组之间组% I^ 43 p 4% "4& % 图 '表 %& $ 无明显差异% If BI &&*脊髓背角 BCR表达"BCR阳性神经元表 "4 与 a组比较#ic 达于脊髓背角#呈细胞质内棕黄色颗粒$ 四组小鼠 &&二'结肠组织病理学评分 BCR表达无明显差异 % )^#*4%"#I^4& % 图 A '`` 诱导的小鼠结肠炎组织学表现为肠黏膜上皮细胞间断坏死脱落# 大量炎症细胞浸润# 多为中 H C I 性粒细胞'淋巴细胞# 间质有轻微水肿# 腺体排列基 %'表 %& $ && 五 '脊髓背角 `'BCR表达水平与腹壁肌电幅 W 图 $各组小鼠结肠组织病理学结果 -.染色$ /"##"

4 胃肠病学 "#$ 年第 % 卷第 ## 期,V+ # (X& 表 "不同扩张容积时各组小鼠腹壁肌电幅值比较 % U "p3 组别例数 " 6T "V 6T M组 3 "" p +, #* %$ p#* a组,, p,3 #V*,+ p#* #V ", 6T #3* $+ p#* #, #* %" p 3+ B组, %% p,3 #%* #" p#*,% '组, %4 p V, #* V$ p ++ #3* V" p#* #" "4# Ic "#( m 与 M组比较#Ic "4 与 a组比较# Ic A #* %3 p $3 V* +# p 3, #$* " p V+ BI "$ 6T U X H C I 图 "各组小鼠脊髓背角 )0表达情况免疫组化染色$ /1##" W 图 *各组小鼠脊髓背角 &230表达情况免疫组化染色$ /1##" * #3 p#* "# *,4 p +, m

5 " *' 9+%,-.,.- & : & ; 表各组脊髓背角表达 7F 组别例数 < 表达 *+4 表达组 F " F 88 = 组 8 F " " F "" * 组 " F 8 F " 组 F 8 " F 8 与 = 组比较 1? " 值的相关性分析 *4 扩张容积为 8 $6 时脊髓背角 < 表达与腹壁肌电幅值之间呈正相关关系 % 8 1 % " 1 % "1 扩张容积为 $6 时两者之间无明显相关性 % 1 *4 扩张容积为 8 $6 时脊髓背角 *+4 表达与腹壁肌电幅值之间无相关性 1B " 讨论本研究结果提示粪便滤液灌肠治疗可改善 << 诱导的结肠炎小鼠结肠组织病理学改变降低腹壁肌电幅值下调脊髓痛觉相关分子 < 表达说明 >52 可改善结肠炎小鼠的内脏敏感性 >52 因用于治疗艰难梭菌相关性肠炎疗效显著且能改善 = 病情而成为近年研究热点 >52 可使 * 患者恢复肠道菌群结构和功能减轻肠道炎症甚至可逐渐达到完全性黏膜愈合现有观点认为疾病的改善与接受 >52 后患者肠道细菌组成的长时间改变和粪便混悬液中供者细菌产物的 8 调节作用有关但也有研究发现经 >52 治疗后 * 患者肠道菌群的转变与临床症状之间无相关性提示 >52 的作用可能不仅仅是通过改变肠道菌群组成而实现的本研究中 << 诱导的结肠炎小鼠在经粪便滤液灌肠后和结肠组织病理学评分均较模型对照组改善提示炎症缓解 *4 实验中 $6 扩张容积下各组间腹壁肌电水平差异无统计学意义考虑此压力可能尚未达到小鼠疼痛阈值而在 8 $6 扩张容积下粪便滤液组腹壁肌电幅值明显低于模型对照组而与正常对照组无明显差异说明 >52 可降低结肠炎小鼠内脏敏感性因此当有适应证的患者进行 >52 治疗时不仅可控制肠道炎症而且还可通过降低内脏高敏感来减轻疾病活动期或缓解期可能出现的腹痛腹泻等症状但本研究的动物模型是急性肠炎模型急性炎症时因 >52 治疗而得到控制的内脏高敏感是否能长期维持尚不明确仍需行 >52 长程疗效的观察研究以明确其是否能对内脏敏感性产生远期影响 < 是脊髓水平传递伤害性信息的重要神经递质其升高与炎症引起的腹痛程度密切相关 < 在肠道炎症引起的脊髓背角神经元敏感化中起重要作用 " 本研究结果显示经粪便滤液干预治疗后小鼠结肠炎症减轻 < 表达显著低于模型对照组且与扩张容积为 8 $6 时的腹壁肌电幅值之间存在正相关关系说明内脏敏感性增高与 < 表达水平有关 >52 可降低结肠炎性刺激引起的脊髓背角神经元敏感化并通过抑制 < 释放来阻断痛觉信号的转导 *+4 是外周感觉传入神经元中与 < 共存的一种神经肽不仅可直接产生伤害性作用还参与炎症诱导的内脏伤害性感觉本实验中经灌肠干预后的各组 *+4 表达无明显差异提示 >52 可能并非主要通过影响脊髓中 *+4 表达来发挥作用此外本研究中 << 诱导的结肠炎模型的炎症程度较轻从而未能引起脊髓背角 *+4 表达明显增加是否更严重的炎症情况下 >52 可降低 *+4 表达仍有待进一步研究双歧杆菌三联活菌胶囊是由双歧杆菌乳酸杆菌和肠球菌组成的活菌制剂可补充肠道有益菌调节肠道微生态平衡以及黏膜免疫功能抑制有害微生物的生长繁殖一项 $.,% 分析表明益生菌治疗有益于 * 患者的诱导缓解其维持缓解的效果与 " 氨基水杨酸相当本实验中粪便滤液组和双歧杆菌三联活菌组之间评分结肠组织病理学评分腹壁肌电幅值以及腰骶髓 < *+4 表达均无明显差异且两组与正常对照组之间亦无明显差异理论上而言 >52 为原生态肠道菌群重建效果应优于双歧杆菌三联活菌单独治疗的效果导致两者疗效无差异可能的原因包括本实验中粪便滤液制作技术条件有限粪便收集过程不能达到理想的无菌无氧等状态 << 诱导的小鼠结肠炎模型炎症程度较轻加之实验周期长小鼠结肠炎有一定的自愈倾向综上所述本研究中 >52 可减轻 << 诱导的结肠炎小鼠肠道炎症降低腹壁肌电幅值和腰骶髓 <

6 胃肠病学年第卷第期 " 表达提示 >52 具有降低内脏敏感性的作用这种作用可能与抑制脊髓背角 < 表达有关这为 >52 在 = 的治疗中提供了实验基础参考文献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谭建良张学泉李华象培菲康保留灌肠在胃肠道术后肠道菌群失调中的诊疗体会 9 实用临床医学 8 8 " " + ' # <'% ' ( 5%. 4 <,.$%, -.. /,., %&$ - 1,%,-%)&%,%, /. %&1%,.-,'.-%) / &,- 0 $0 / &. /., 9 *& /., " 8 6%9( < 2< C $ (9.,%&.- )'.-%& -,,- ) -.&.% ' -$. $.0 %,. ), /&%$$%, -.-%& ' ).-.,, -%, 9 7 -&0 9+%,-.,.- & 8 " 刘玮王承党结肠黏膜低度炎症对小鼠结肠 4 活化和内脏感觉过敏的诱发作用 9 世界华人消化杂志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收稿修回

福建农业学报材料与方法试验菌株引物主要仪器主要试剂细菌培养模板的制备反应条件扩增产物的检测特异性试验敏感性试验分离菌株检测产物的克隆及序列测定结果与分析

福建农业学报材料与方法试验菌株引物主要仪器主要试剂细菌培养模板的制备反应条件扩增产物的检测特异性试验敏感性试验分离菌株检测产物的克隆及序列测定结果与分析