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1 : 中南大学学报 医学版 B>/ 骨髓多能间质干细胞系多向分化潜能的检测 杨 晶 / 谢祁阳 张 翼 / 向红霞 / 郭 赞 / % 河北医科大学生理学教研室 石家庄 / % 海南医学院海南省干细胞研究所 海口 / % 中南大学湘雅医学院生理系 长沙 / 摘要 目的 检测 B>/ 骨髓间质干细胞系在体外向脂肪细胞 软骨细胞 成骨细胞 心肌细胞 血管内皮细胞和神经细胞分化的能力 方法 选用第 代 B>/ 骨髓间质干细胞系 分别用成脂培养基 成软骨培养基 成骨培养基 氮胞苷 血管内皮生长因子 神经细胞培养液 诱导液 / 为 /!< 巯基乙醇 诱导液 为 二甲基亚砜和 /!< 地塞米松 对其进行定向诱导分化 采用染色法 免疫组化法 7 法鉴定分化后的细胞 结果 在成脂培养基培养 / ( 左右出现大量含脂滴的脂肪细胞 苏丹 染色法检测脂肪细胞胞浆呈桔红色 在成软骨培养基培养 / ( 左右有软骨结节形成 阿尔新蓝染色法将软骨结节染为深蓝色 在成骨培养基培养 ( 6! 染色法显示有黑色矿化结节形成 在 /!< 氮胞苷诱导液中能出现自发性搏动的心肌细胞和肌管样结构 免疫组化法显示心肌特异性的表面抗体 横纹肌肌动蛋白 心肌连接蛋白 表达阳性 7 法检测有心肌特异性因子 肌球蛋白重链表达 在含有 < 血管内皮生长因子的诱导液中能出现呈直线排列的血管内皮细胞和血管内皮细胞网状结构 免疫组化法显示血管内皮特异性表面抗体 $/ 因子表达阳性 神经诱导液 / 处理组出现神经元 免疫组化法显示胶质纤维酸性蛋白表达阴性 神经元特异性核蛋白表达阳性 神经诱导液 处理组出现神经胶质细胞 免疫组化法显示胶质纤维酸性蛋白表达阳性 神经元特异性核蛋白表达阴性 结论 本研究证实 B>/ 骨髓间质干细胞系细胞具有分化为脂肪细胞 软骨细胞 成骨细胞 心肌细胞 血管内皮细胞 神经元和神经胶质细胞的潜能 提示 B>/ 骨髓间质干细胞系具有向多个胚层 个方向分化的多向潜能 关键词 B>/ 骨髓间质干细胞 多向分化 脂肪细胞 软骨细胞 成骨细胞 神经元 神经胶质细胞 中图分类号 / % 文献标识码 文章编号 /: : 收稿日期 %- -" & / / 作者简介 " % +$ 杨晶 /88 女 湖北安陆人 硕士研究生 主要从事干细胞组织工程学研究 通讯作者 &"& %!-+ 谢祁阳 " 5" % 基金项目!&%-" &"-. 教育部留学归国人员科研启动基金 湖南省杰出中青年专家科技专项计划项目 /# >/ 海南省教育厅高校科研重点资助项目 + 海南省卫生厅科研重点资助项目 / 海南省自然科学基金资助项目 /: ".!+.!( ( "!! "& " 7!! (!-7% 7!," " & " (!!! " (">! & ""! ( /# >/ " 7!," " ( "!! "!! ( + % " 7!," " 7 " $!! ( / " 7!," " ; & "! ( /:

2 B>/ 骨髓多能间质干细胞系多向分化潜能的检测 杨 晶 等 :8 (! " -&-"%(" &-"%-" & 7/ / &.%. &+$.%( -. (("& >; #" / B" ; >" / ;! " / / %# &!& $! % & / #! %!! / %# &!& &! %! % & / / - %- /5-"!! ""!-B>/!!. & "!("-" "! ("!!(!!! ("!, (! " ( ","!% -+ B>/. (." ("!" ("!(!" (" (!!" (" "(", (! "!. -! ( (", /. /!<!!,. (" -!"( ( /!< (! " ", ","!% ("-" (."("-"( "" "! "! " ( 7 %#!(- ("-" ( "( ( ("!" (" -! ( ("! (! "( - " "( (!. ". "(!"",." & ( -/ (!- % ("-" ( "( (!(!" (" -! (!(!"!(. ". "(!" ", " / % -/ (!- % ("-" ( "( (!!" (" -! (!!"!(. ". 6! "" - (!- ( "!!- "-"( " +!(.!,(% ("-" ( (." /!< "("! (!! ( -! (!. "."("-"(!"","! "! " ""." "! " "!( ( " "!( % "!!-!", ".!!,( 7 % ("-" ( (." <, (! "!. -!! ( -!, (! " (, (! ". "+. ". "("-"(!"","! "! " ""." $/ (!@ % ("-" ( "( (, /.!""," "! "! " ""."! "-"!". " "!!-" -"" "("!". ",% ("-" ( "( (,.!""," "! "! " ""." " -"" "("!". " "!!-! "-"!". ",% &(! " & B>/!!. " ""!("-" "! ("!!(!!! ("!!, (! "! ( " ","!%!!. " ("-" "!!-. "! -!!( (!( % $ B>/!!. "!" " ("!!(!!!! " :

3 中南大学学报 医学版 此前的研究表明 &$ 大白鼠骨髓间质干细胞!!. & B>/ 细胞系是纯的 可长期传代 扩增并保持未分化状态的 生物学稳定的细胞系 并且在体外特定条件下具有分化为心肌细胞和血管内皮细胞的能力 / 虽然骨髓间质干细胞是一种较原始的细胞 常维持在低分化状态 但骨髓间质干细胞除了参与构成造血微环境 支持造血细胞生长外 还可能具有多向分化潜能 最初只发现骨髓间质干细胞具有生成成骨细胞 软骨细胞 脂肪细胞等间质组织细胞的能力 7" 等在 /888 年成功建立了人的骨髓间质干细胞系 但这个细胞系也只能向成骨细胞 软骨细胞 脂肪细胞等间质组织细胞分化 因而 细胞能否向成骨细胞 软骨细胞 脂肪细胞等间质组织细胞分化成为鉴定是否是间质干细胞的 金标准 近年来研究发现 骨髓间质干细胞在特定条件下还可以向心肌细胞 神经细胞 血管内皮细胞等分化 // 为证明作者所建立的 &$ 大白鼠 & B>/ 细胞系是否具有上述所有的分化能力 即同时向多个胚层 多个方向分化 本研究分别选用特殊的培养体系 如成脂培养基 成软骨培养基 成骨培养基 氮胞苷 血管内皮生长因子 神经细胞培养液 诱导液 / 为 /!< 巯基乙醇 诱导液 为 二甲基亚砜和 /!< 地塞米松 对 B>/ 细胞系进行定向分化诱导 旨在检测该细胞系是否具有多向分化潜能 材料与方法 / %/ 材料 / %/ %/ 主要试剂 $ 培养基为美国! 产品 标准胎牛血清为天津灏洋生物有限公司产品 批号为 / 胰蛋白酶为美国 &" 公司产品 诱导剂地塞米松 异丁基 / 甲基黄嘌呤 胰岛素 甲状腺素 磷酸甘油 抗坏血酸 氮胞苷 血管内皮生长因子皆为 &" 公司试剂 吉姆萨染色液 苏丹 染色液 阿尔新蓝染色液按常规方法配置 抗体 兔抗人 大鼠 " 多克隆抗体 武汉博士德生物工程有限公司 兔抗人 大鼠!" 多克隆抗体 武汉博士德生物工程有限公司 兔抗大鼠神经元特异性核蛋白 ; ; 单克隆抗体 "! "! % 兔抗人 因子 福建迈新生物有限公司 兔抗人 大鼠 $/ 多克隆抗体 > $ 公司 $ 显色试剂盒 $6 公司 兔抗大鼠 人胶质 纤维酸性蛋白 7 单克隆抗体 > $ 公司 > 标记羊抗兔 红色荧光 &" ("! % 标记山羊抗兔 绿色荧光 武汉博士德生物工程有限公司 标记羊抗兔 绿色荧光 武汉博士德生物工程有限公司 / %/ % 实验细胞 &$ 大白鼠 & B>/ 细胞系的生长状态良好的 7 代细胞 / / % 方法 / % %/ B>/ 细胞系细胞向脂肪细胞 软骨细胞 成骨细胞诱导分化和鉴定 培养 7 代细胞 后 分别用特殊的培养体系如成脂培养基 /!< 地塞米松 %!< 异丁基 / 甲基黄嘌呤 ::!< 胰岛素 每 ( 换液 / 次 维持 / ( 左右 成软骨培养基 /!< 地塞米松 < 甲状腺素!< 磷酸甘油 每 ( 换液 / 次 维持 / ( 左右 成骨培养基 /!< 地塞米松 /!< 磷酸甘油 < 抗坏血酸 每星期换 次液 维持 ( 左右 对 B>/ 细胞进行向脂肪细胞 软骨细胞 成骨细胞的定向诱导分化 每天注意在相差显微镜下观察细胞变化 并用苏丹 染色法检测脂肪细胞 6! 染色法检测矿化结节 / / / % % B>/ 细胞系细胞向心肌细胞的诱导分化和鉴定 将 / % F/ 个 7 代细胞种入 孔 / 板中培养 参考 +"! 等的诱导方案 并稍加改进 在接种培养 后加入 /!< 的 氮胞苷 诱导 后换为正常培养液培养 以后每 ( 换液 / 次 / ( 时进行第 次诱导 每天注意在相差显微镜下观察细胞变化 用免疫组化法检测分化后的细胞是否有 横纹肌肌动蛋白抗体和心肌连接蛋白 抗体表达 胞浆内有棕黄色颗粒为阳性 用 7 法检测分化后的细胞是否表达 心肌特异性的肌球蛋白重链基因 计算诱导率 / % % B>/ 细胞系细胞向血管内皮细胞的诱导分化和免疫组化鉴定 取 7 代细胞 在含 胎牛血清和 < 血管内皮生长因子的 $ 培养液中培养 周 培养液每 ( 换液 / 次 对照组为不加诱导剂的正常细胞 每天注意在相差显微镜下观察细胞变化 用免疫组化法检测分化后的细胞是否有兔抗人 因子 兔抗人 大鼠 $/ 多克隆抗体表达 胞膜呈棕黄色则为 $/ 阳性 因子

4 B>/ 骨髓多能间质干细胞系多向分化潜能的检测 杨 晶 等 / 阳性 / % % B>/ 细胞系细胞向神经细胞的诱导分化和免疫组化鉴定 / % % %/ B>/ 细胞系细胞向神经细胞的诱导分化 取 7 代细胞 诱导前细胞维持在含 胎牛血清 /!< 巯基乙醇的 $ 预诱导液中培养 换掉预诱导液 7 & 清洗细胞 分别用两种不同的诱导液进行诱导 诱导液 / 为含 /!< 巯基乙醇的无血清 $ 培养基 诱导液 为含 二甲基亚砜和 /!< 地塞米松的无血清 $ 培养基 对照组为不加诱导剂的正常细胞 相差显微镜下注意观察细胞变化 8// / % % % 免疫组化鉴定 为确定 B>/ 细胞系细胞是否分化为神经细胞以及分化为何种神经细胞 采用神经元标志物神经元特异性核蛋白 ; ; 星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白 7 进行鉴定 在诱导 : 后参照试剂盒 武汉博士德生物有限公司 的操作方法进行免疫组化实验 细胞爬片用 7 & 清洗 次 多聚甲醛固定 " 7 & 漂洗 次 用 % 的甲醇液封闭 / " 以消除内源性过氧化物酶 用山羊非免疫血清工作液室温孵育 " 去血清后每组分别加入兔抗大鼠神经元特异性核蛋白 ; ; 单克隆抗体 / / 和兔抗大鼠 人胶质纤维酸性蛋白 7 单克隆抗体 / / 于 过夜 用 7 & 清洗 次后 分别加生物素标记的山羊抗兔 二抗工作液或 > 标记羊抗兔 红色荧光 和 标记羊抗兔 绿色荧光 二抗工作液 经 孵育 7 & 清洗 次 再经辣根过氧化酶标记的抗生物素蛋白结合 $ 试剂显色 胞浆内有棕黄色颗粒为阳性 或在黑暗环境中用荧光显微镜观察 ; ; 阳性的神经元核标记为红色荧光 7 阳性的神经胶质细胞核标记为绿色荧光 / % 统计学处理 用 &7&& 进行统计分析 实验数据取 次以上结果 以 ;A 表示 多个均数比较用单因素方差分析 两个均数比较用 检验 组间两两比较用 检验 用 软件作图 = % 为差异有统计学意义 结 果 %/ B>/ 细胞系细胞向脂肪细胞 软骨细胞 成骨细胞分化的相关结果及鉴定 在成脂培养基中维持培养 / ( 左右 细胞之间出现含有大量脂滴的脂肪细胞 图 / 苏丹 染色后脂肪细胞的 胞浆呈桔红色 图 在成软骨培养基中维持培养 / ( 左右 出现软骨结节样结构 图 阿尔新蓝 " 染色后软骨结节样结构呈深蓝色 图 在成骨培养基中维持培养 ( 左右 出现明显高于周围细胞表面的骨结节样结构 6! 染色法显示有黑色矿化结节形成 图 : 用中性红复染后明显可见向成骨细胞分化的黑色矿化结节 周围未分化的细胞胞浆呈红色 图 % B>/ 细胞系细胞向心肌细胞分化的相关结果 诱导前的细胞呈典型的成纤维样细胞形态 细胞形态均一 诱导后 细胞形态随着培养时间的延长开始发生变化 ( 时发现部分细胞逐渐变得更为细长 形态多样 折光性好 ( 时出现可自发性搏动的细胞 并有肌管样结构形成 至 ( 可见大量肌管样结构形成出现 部分区域形成融合层 免疫组化检测发现心肌特异性的表面抗体 横纹肌肌动蛋白 心肌连接蛋白 表达阳性 7 检测有心肌特异性因子 肌球蛋白重链表达 诱导率达 8 % A % : % B>/ 细胞系细胞向血管内皮细胞分化的相关结果 加入诱导剂血管内皮生长因子培养 后 出现呈直线排列的血管内皮细胞 ( 后 有部分区域细胞相互连接呈血管内皮细胞网状 / ( 时免疫组化检测 发现诱导后的细胞 $/ 因子表达阳性 % B>/ 细胞系细胞向神经细胞分化的相关结果 B>/ 细胞系细胞在加入两种不同的诱导液后 / 细胞形态发生变化 即由原来呈成纤维样形态的骨髓 & 胞质向核收缩 呈典型的核周体形态 诱导 : 后大多数细胞伸出轴突样结构和树突样结构 图 8 简单的双极细胞或复杂的多极细胞在显微镜下均清晰可见 并可见部分细胞连成网状 超过 : 后小部分细胞从培养瓶底脱落 但继续培养 细胞仍能存活 对照组细胞仍然保持成纤维样细胞形态 用诱导液 / 诱导 : 的大多数细胞表现为 ; ; 染色阳性 胞核呈红色荧光 图 / 7 染色阴性 说明用诱导液 / 诱导的细胞分化为神经元 用诱导液 诱导 : 的大多数细胞表现为 7 染色阳性 胞体和突起呈棕黄色 $ 显色法 图 // 并且用带有荧光的二抗处理后 胞体和胞核呈绿色荧光 图 / ; ; 染色阴性 说明用诱导液 诱导的细胞为神经胶质细胞 对照组无阳性细胞出现

5 中南大学学报! 医学版" #"##$#%"!""! "$" 图!"成脂培养基中培养 后出现含大量脂滴的脂肪细胞! pg##"!j (: ( ( ( > + /<<8J G" M M染色浆呈桔红 图 #"诱导后生成的脂肪细胞胞浆用苏丹 M 色! pw##" #I = F + 8,@(M M M! ( (@ = ( pg##" 图 $"成软骨培养基中培养 后出现的软骨结节样结构! pw##" $P ( + (@ ( pw##" 图 ("成骨培养基中维持培养 后出现的骨结节样结构! pw##" (P A ( + ( pw##" 图 %"诱导后生成的软骨结节样结构用阿尔新蓝染色后呈深 蓝色! pw##" ( + + (@ = A, A:P ( A,! pw##" ( T -染色法呈黑 图 "诱导后生成的骨结节样结构用 d 色! p";#" / C ( A:d ( T! p";#"

6 fbg 骨髓多能间质干细胞系多向分化潜能的检测!杨!晶#等 图 &"诱导后生成的骨结节样结构用中性红复染后仍呈黑 色#周围未分化细胞胞浆呈红色! p";#" &/ C ( F + (# F+ p";#" 图 +"用诱导液 " 诱导 X + 后的大多数细胞伸出轴突样结构 和树突样结构! p";#" "$% 图 "用诱导液 G 诱导 X + 后的大多数细胞伸出轴突样和树 突样结构! p";#" 8=+ (@ ( A:, (G X +,! p";#",y免疫荧光染 图!"用诱导液 G 诱导 X + 的大多数细胞 Y 色阳性光! pw##" +8=+ (@ ( A:!U >>,(, ( ( (F + Y,Y (, (" X +,! p";#" 图!!"用诱导液 " 诱导 X + 后的大多数细胞 ^&PU染色阳性! p";#" A:, (G! pw##" 图!#"用诱导液 " 诱导 X + 后的大多数细胞用 ^&PU免疫荧 光染色阳性! pw##"!!j A:, ("# F+ A: +!#J A:, ("# F+ A: + = >>,( ( (F + ^&PU! p";#" = >>,(, ( ( ( F + ^&PU! p W##"

7 中南大学学报 医学版 讨 论 目前 鉴定骨髓 & 的方法并无统一标准 最常用的方法一种是用流式细胞仪法检测骨髓 & 的表型 还有一种是看骨髓 & 能否向脂肪细胞 软骨细胞 成骨细胞分化 由于迄今为止还没有发现骨髓 & 特异性的表面标志 而且它同时兼有间质细胞 上皮细胞和内皮细胞的特点 骨髓 & 表达整合素家族成员 $8 黏附分子 $ $/ $/:: 但不表达淋巴细胞表面抗原 / $// 和 / $// 也不表达造血前体细胞标志抗原 $ 和泛白细胞标志抗原 $ 等 例如 一般鉴定骨髓 & 表型时常用的指标是 $ 和 $ 阴性 说明不是造血细胞 $/:: 和 $ 阳性 说明有间质细胞标志 $ 和 $/ 阳性 说明有干细胞标志 阳性 $ 阴性 说明骨髓 & 的免疫特性 所以 用流式细胞仪法检测骨髓 & 表型的方法属特异性不高的排除法 而且操作复杂 成本高 在本实验中作者采用了第 种方法 因 为 7" 等认为判定骨髓间质干细胞的 金标准 是能在适宜的条件下向脂肪细胞 软骨细胞 成骨细胞分化的就是骨髓间质干细胞 这种鉴定方法简单 经济 实用 有效 本实验证实作者建系的大鼠骨髓间质干细胞在特定的诱导培养条件下具有向脂肪细胞 软骨细胞 成骨细胞分化的能力 符合骨髓间质干细胞的判定标准 目前鉴定神经元的特异性标志物很多 比如神经丝蛋白 ; 神经元特异性烯醇化酶 ;& 巢蛋白 " 微管联合蛋白 7 生长相关蛋白 7 神经元特异性核蛋白 ; ; 等 而鉴定神经胶质细胞的特异性标志物主要是胶质纤维酸性蛋白 7 8// 在本实验中作者利用两种不同的抗氧化剂 巯基乙醇 二甲基亚砜 诱导骨髓 & 通过免疫组化鉴定 发现用 巯基乙醇诱导的骨髓 & ; ; 表达阳性 7 表达阴性 说明细胞分化为神经元 而用二甲基亚砜和地塞米松联合诱导的骨髓 & 7 表达阳性 ; ; 表达阴性 说明细胞分化为神经胶质细胞 这一实验结果和以往文献中报道的结果有所不同 因为以往用抗氧化 剂诱导骨髓 & 后 细胞主要分化为神经元 很少能向神经胶质细胞分化 为何联合应用二甲基亚砜和地塞米松后就能使骨髓 & 向神经胶质细胞分化 究竟诱导剂是如何起作用的 有待以后进一步研究 而 巯基乙醇的诱导机制可能是其能与 & 表面的某些特异性受体结合 从而启动某一条或多条信号传导途径 如 76 或 6/ < 等信号途径 / /: 最终使其向神经元分化 作者已经证实 B>/ 细胞系细胞具有心肌细胞 血管内皮细胞分化的能力 本文研究表明 B>/ 细胞系还具有向脂肪细胞 软骨 骨分化的能力 并且还能分化为神经元和神经胶质细胞 鉴于脂肪细胞 软骨 骨 心肌和血管内皮细胞是由中胚层细胞形成的 神经元和神经胶质细胞是由外胚层细胞形成的 因此 B>/ 细胞系属于能同时向多个胚层分化 至少可以生成 种组织细胞的多能间质干细胞系 有关 B>/ 细胞系是否还具有向其他细胞分化的能力有待于进一步研究 致谢 衷心感谢本室王绮如教授 谭梦群教授和黄艳红老师的关心和大力支持 参考文献 / 谢祁阳 杨晶 秘祖霞 %&$ 大白鼠骨髓多能间质干细胞 B>/ 细胞系的生物学稳定性分析 # % 中南大学学报 医学版 : / // % B" >; #" " % "!!" "" "!-B>/ "!" "-! & $.!!. # %# &! ", ( & " : / / / % 杨晶 谢祁阳 向红霞 %B>/ 骨髓多能间质干细胞系向心肌细胞和血管内皮细胞分化 # % 中南大学学报 医学版 / 8 8 % >; #" B" ;! " %$"-" "!!-B>/!!. "!" " "! ("!! (, (! " ","! # %# &! ", ( & " / 8 8 % 7" + # ". & % ""!"!- ( # %& " / // / / % &! & % ("-" "!!"!- (",( -!!!. # %&

8 B>/ 骨髓多能间质干细胞系多向分化潜能的检测 杨 晶 等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本文编辑 傅希文

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