前言本标准按照 GB/T 给出的规则编写本标准附录 A-F 为规范性附录本标准由中国实验动物学会归口本标准由全国实验动物标准化技术委员会 (SAC/TC281) 技术审查本标准由中国实验动物学会实验动物标准化专业委员会提出并组织起草本标准起草单位 : 广东省实验动物监测

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泗俞
5 years ago
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1 ICS B 44 T/CALAS x-201x 实验动物人肿瘤坏死因子 α 转基因关节炎小鼠模型饲养繁育规范 Specification for feeding and breeding of human tumor necrosis factor alpha transgenic arthritic mouse model ( 征求意见稿 ) 201x-xx-xx 发布 201x-xx-xx 实施发布

2 前言本标准按照 GB/T 给出的规则编写本标准附录 A-F 为规范性附录本标准由中国实验动物学会归口本标准由全国实验动物标准化技术委员会 (SAC/TC281) 技术审查本标准由中国实验动物学会实验动物标准化专业委员会提出并组织起草本标准起草单位 : 广东省实验动物监测所本标准主要起草人 : 李舸张钰贾欢欢彭育才黄韧吴玉娥刘书华李韵峰

3 实验动物人肿瘤坏死因子 α 转基因关节炎小鼠模型饲养繁育规范 1. 范围本规范规定了人肿瘤坏死因子 α 转基因关节炎小鼠模型的饲养繁育规程本规范适用于人肿瘤坏死因子 α 转基因关节炎小鼠模型产品的推广应用 2. 术语和定义 2.1 人肿瘤坏死因子 α 转基因小鼠 human tumor necrosis factor alpha transgenic mouse 人肿瘤坏死因子 α 转基因小鼠是广东省实验动物监测所自主研发的一种与人类风湿性关节炎临床病理特征高度相似的具有 FVB 近交系小鼠背景的疾病动物模型产品, 是人肿瘤坏死因子 α 阻断治疗药物研发和评价的重要模型 2.2 超数排卵 superovulation 给供卵雌性注射促性腺激素, 使其排出比自然情况下多几倍到十几倍的卵子, 用于配种或者人工授精需要 2.3 体外受精 in vitro fertilization 将卵子与精子取出, 在人为操作下进行体外受精, 并培养成胚胎 2.4 胚胎玻璃化冷冻 vitrification of embryo 利用体积微小的冷冻承载工具, 在极快速降温 (>2000 /min) 过程中, 使高浓度的冷冻保护液由液态转变为黏度很高的类似玻璃样的固态, 避免胚胎内冰晶的形成, 达到冷冻保护的作用, 从而实现胚胎在液氮中长期保存的目的 2.5 精子冷冻 cryopreservation of sperm 在有冷冻保护剂存在的采用液氮将精液贮藏于 -196 时, 精子能良好地贮藏很长时间, 需要时可溶化供人工授精

4 3. 饲养环境小鼠饲养于符合 GB 实验动物环境及设施要求的屏障环境, 笼具及垫料经高压灭菌后使用 4. 饮水根据 GB 实验动物环境及设施中对小鼠饮水的要求, 所有饮用水均高压灭菌后供小鼠饮用 5. 饲料近交系基础群繁殖小鼠采用生长繁殖饲料, 其余小鼠均采用维持饲料, 所有饲料营养成分符合 GB 实验动物配合饲料营养成分要求, 卫生符合 GB 实验动物配合饲料卫生标准要求 6. 基因型鉴定人肿瘤坏死因子 α 转基因阳性小鼠最早于出生 3 周开始应用, 因此, 在小鼠出生 10 天时, 通过剪脚趾编号, 并采用碱裂解法提取总 DNA, 利用基因组 PCR 检测小鼠是否为阳性 (PCR 检测详见附录 A ) 7. 临床表现人肿瘤坏死因子 α 转基因阳性小鼠出生 3 周左右即出现四肢关节轻微红肿和滑膜增生, 表现为轻度关节炎 ; 出生 10 周时, 四肢畸形, 运动能力下降, 进展至中度关节炎 ; 出生 20 周, 四肢严重畸形, 运动机能严重受限, 发展至重度关节炎同时, 利用关节炎评分标准, 可以对关节炎临床症状进行定量评价 ( 详见附录 B ) 8. 近交系基础群维持 8.1 种鼠选择同一对种鼠产生的子代小鼠经鉴定为阳性后, 于 3 周离乳时, 分别挑选体质强壮活泼被毛紧披而有光泽尾肥嫩粉红血管明显外生殖器发育良好的雄性和雌性同胞兄妹作为种鼠 8.2 种群维持同胞兄妹种鼠于 6 周开始正常配种至 20 周, 严格按照 GB 实验动物哺乳类实验动物的遗传质量控制中规定的近交系动物基础群繁育要求进行繁殖在必要的情况下, 可以考虑对种鼠每周腹腔给予人肿瘤坏死因子 α 单抗药物 Adalimumab(0.6mg/kg), 以抑制关节炎症状出现, 确保小鼠自然交配成功 8.3 种群保存

5 除选定作为种鼠的阳性小鼠外, 其余同代阳性雌性小鼠经超排获得卵子, 与同胞雄性小鼠进行体外受精获得 2 细胞胚胎并进行玻璃化冷冻保存 ; 雄性小鼠留种用于模型应用时的扩大繁育, 同时进行精子冷冻保存玻璃化冷冻复苏胚胎经体外受精获得的 2 细胞胚胎, 在 1M DMSO( 见附录 C) 中脱水 2 分钟后, 将脱水后的胚胎放入冻存管中, 冰上放置 5 分钟, 加入提前冰上预冷的 DAP213 冷冻保护液 ( 见附录 D), 继续冰上放置 5 分钟, 之后直接将含有胚胎的冻存管放入液氮中冷冻保存冷冻胚胎从液氮罐中取出后, 倒去管中液氮, 常温放置 30 秒, 加入 37 预热的 0.25M 蔗糖溶液 ( 见附录 E), 反复轻轻吹吸后, 将胚胎吸入培养皿中, 收集复苏 2 细胞胚胎, 在 37,5% CO2 环境下培养 10 分钟, 完成复苏过程精子冷冻复苏处死雄鼠取双侧附睾尾去除脂肪, 在 37 预热的精子冷冻保护液 ( 见附录 F) 中刺穿附睾尾, 待精子自动游出后, 将精子吸入预热的精子冷冻麦管中, 置于液氮蒸汽上预冷 10 分钟, 之后直接投入液氮中进行冷冻保存精子冷冻麦管从液氮中取出后, 置于 37 预热的水浴中平衡 10 分钟, 之后进行体外受精 8.4 遗传稳定基础群动物代数达到 5 代 (F5) 后不再使用, 之后将 F1 代的冷冻胚胎复苏后经过胚胎移植重新建立基础群, 最大限度降低近交系代数更迭速度, 减少遗传漂变几率, 确保模型表型的稳定 9. 扩大繁育 9.1 雄鼠来源及选择用于扩大繁育的雄性种鼠来源于人肿瘤坏死因子 α 转基因小鼠基础群繁殖的后代小鼠用于一次试验扩大繁育的雄鼠应为同代同胞阳性雄鼠, 年龄大于 10 周且不超过 6 个月 9.2 雌鼠来源及选择雌性 FVB 近交系小鼠购买于有较好信誉的生产单位, 雌鼠年龄为 4-6 周 9.3 扩大繁育根据单次试验需要, 购买足够量雌性 FVB 近交系小鼠, 经超数排卵获取足够量卵子, 与人肿瘤坏死因子 α 转基因阳性雄鼠进行体外受精, 得到 2 细胞胚胎后通过胚胎移植, 基因型鉴定, 最终获得同期大量的阳性小鼠, 以满足模型应用需要

附录 A 引物序列正义引物 (5 3 ) GAΑCTCCCTCGATGTTAACCA 反义引物 (5 3 ) TTCAATCCCCAAATCCTAGCC PCR 反应条件 1. 94 C, 变性 4 分钟 ;2.

6 附录 A 引物序列正义引物 (5 3 ) GAΑCTCCCTCGATGTTAACCA 反义引物 (5 3 ) TTCAATCCCCAAATCCTAGCC PCR 反应条件 C, 变性 4 分钟 ;2. 95 C, 变性 30 秒, 57 C, 退火 30 秒, 72 C, 延伸 40 秒, 步骤 2 重复 35 次 ;3. 72 C, 延伸 10 分钟阳性产物大小 376bp 人肿瘤坏死因子 α 转基因小鼠基因型 PCR 鉴定方法

附录 B 人肿瘤坏死因子 α 转基因小鼠临床表现 3 周人肿瘤坏死因子 α 转基因阳性小鼠关节出现轻微肿胀和变形, 表现为轻度关节炎 (A, 对照,B, 转基因小鼠 );10 周人肿瘤坏死因子 α 转基因阳性小鼠出现中度关节炎症状 (C, 对照,D, 转基因小鼠 );20 周人肿瘤坏死因子 α 转基因阳性小鼠因严重关节炎导致后肢丧失运动能力, 发展为重度关节炎 (E, 对照,F, 转基因小鼠 )

7 附录 B 人肿瘤坏死因子 α 转基因小鼠临床表现 3 周人肿瘤坏死因子 α 转基因阳性小鼠关节出现轻微肿胀和变形, 表现为轻度关节炎 (A, 对照,B, 转基因小鼠 );10 周人肿瘤坏死因子 α 转基因阳性小鼠出现中度关节炎症状 (C, 对照,D, 转基因小鼠 );20 周人肿瘤坏死因子 α 转基因阳性小鼠因严重关节炎导致后肢丧失运动能力, 发展为重度关节炎 (E, 对照,F, 转基因小鼠 ) 关节炎临床评分标准根据 Williams, R. O., Feldmann, M. and Maini, R. N. (1992). Anti-tumor necrosis factor ameliorates joint disease in murine collagen-induced arthritis. Proc. Natl. Acad.Sci. USA 89, 制定四肢评分后相加取平均数即为小鼠临床关节评分评分症状 0 分所有关节无红肿 1 分关节轻微的红和 ( 或 ) 肿 ( 轻度关节炎 ) 2 分明显红肿 ( 中度关节炎 ) 3 分关节僵硬并且肢体活动受限 ( 重度关节炎 )

8 附录 C 1M DMSO 配置方法 ml/100ml DMSO PB1* 92.2 *PB1 溶液配置方法 mg/100ml NaCl KCl 20.0 CaCl KH 2 PO MgCl 2 6H 2 O 10.0 Na 2 HPO Na-Pyruvate 3.6 Glucose Penicillin 7.5 Streptomycin 5.0 BSA 300.0

9 附录 D DAP213 冷冻保护液配置方法溶液 A ml/10ml PB1* DMSO Propylene glycol (PG) 溶液 B mg/ 定容于 10ml PB1 中 Acetamide (AA) DAP213 为溶液 A 和溶液 B 在使用前等体积预混后配制形成 *PB1 溶液配置方法 mg/100ml NaCl KCl 20.0 CaCl KH 2 PO MgCl 2 6H 2 O 10.0 Na 2 HPO Na-Pyruvate 3.6 Glucose Penicillin 7.5 Streptomycin 5.0 BSA 300.0

10 A A 附录 E 0.25M 蔗糖溶液配置方法 Sucrose mg/ 定容于 20ml PB1* 中 *PB1 溶液配置方法 mg/100ml NaCl KCl 20.0 CaCl KH 2 PO MgCl 2 6H 2 O 10.0 Na 2 HPO Na-Pyruvate 3.6 Glucose Penicillin 7.5 Streptomycin 5.0 BSA 300.0

11 B B 附录 F 精子冷冻保护液配置方法 mg/10ml mg/20ml mg/40ml Raffinose pentahydrate 1,800 3,600 7,200 Skimmed Milk ,200 L-glutamine

附件2：

附件2：中国实验动物学会团体标准实验动物肿瘤坏死因子 α 转基因关节炎小鼠模型饲养繁育规范编制说明联系人 : 李舸联系电话 :15011983691 编制单位 : 广东省实验动物监测所时间 : 2016 年 10 月 25 日中国实验动物学会团体标准人肿瘤坏死因子 α 转基因关节炎小鼠模型饲养繁育规范编制说明 GB/T1.1 2009 1 2011A081401005 2013B040400007