776 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2015Jun;31(6) GAPDH mrna 序列,Neun 引物上游序列 5 GGGTTTTGGGTTTGTAACTTTTGAA 3 ; 下游序列 5 AGACTGCTCCTACCACAGGGTTTAG 3,P

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1 ChinesePharmacologicalBuletin 2015Jun;31(6):775~ 网络出版时间 : :36 网络出版地址 :htp:// 红景天苷对大鼠局灶性脑缺血 / 再灌注损伤的神经保护作用 赖文芳 1,2, 张小琴 1, 洪海棉 1, 谢秀利 1 1, 洪桂祝 ( 福建中医药大学 1 药学院 2. 中西医结合研究院, 福建福州 ) doi: /j.isn 文献标志码 :A 文章编号 : (2015) 中国图书分类号 :R 332;R284.1;R322.81;R 摘要 : 目的探讨红景天苷 (salidroside,sal) 对大鼠局灶性脑缺血 / 再灌注损伤的神经保护作用及其机制 方法健康成年 SD 大鼠 36 只, 随机分为 3 组 : 假手术组 (sham) 模型对照组 (MCAO 组 ) 红景天苷给药组 (MCAO+Sal 组 ) 通过线栓法制作大鼠局灶性脑缺血 / 再灌注损伤模型,Longa 评分法对大鼠神经功能损伤评分, 焦油紫染色法对神经细胞内尼氏 (Nisl) 小体染色,RT qpcr 技术检测大鼠缺血侧脑组织 Neun Nogo A 与 NgRmRNA 的表达,Westernblot 法检测大鼠缺血侧脑组织 Bcl 2 Neun BDNF NGF Nogo A 与 NgR 蛋白的表达 结果与 MCAO 组比较, 红景天苷能明显降低神经功能损伤, 增加 Nisl 阳性细胞的数量, 促进 Bcl 2 Neun NGF BDNF 的蛋白表达, 降低 Nogo A 及其受体 NgR 的 mrna 及蛋白表达 结论红景天苷能够降低 MCAO 模型大鼠神经功能损伤, 增加 Nisl 阳性细胞数目, 提高 Neun 的表达, 具有神经保护作用, 此作用是通过促进抗凋亡因子 Bcl 2 及神经营养因子 NGF BDNF 的蛋白表达, 下调轴突生长抑制因子 Nogo A 及其受体 NgR 的蛋白表达所实现 关键词 : 红景天苷 ; 局灶性脑缺血 / 再灌注 ; 轴突生长抑制因子 ; 神经生长因子 ; 神经保护 ; 细胞凋亡脑卒中, 俗称脑中风, 是脑血管疾病最严重的并发症 过去的 30 年, 全球共有将近 200 个治疗脑卒中药物进入临床试验, 只有组织型纤维蛋白溶活剂 (tpa) 获得美国 FDA 的临床应用批件 然而, 由于 tpa 只能用于脑血栓病人的缺点, 该药物仅对 3% ~ 5% 的脑中风病人有治疗的效果 [1-2] 专家们普遍认为, 选择具有神经保护作用的候选药物进行研发, 可提高脑卒中药物研发成功的机会 [3-4] 收稿日期 : , 修回日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金资助课题 (No ); 福建省科技厅重点项目 (No2014Y4004); 福建省自然科学基金项目 (No2015J01328); 福建中医药大学校管课题 (No X ) 作者简介 : 赖文芳 (1985-), 女, 博士生, 助理研究员, 研究方向 : 药理学,E mail: @163.com; 洪桂祝 (1966-), 女, 博士, 教授, 研究方向 : 心脑血管药效药理学, 通讯作者,E mail:guizhuhong@yahoo.co.uk 红景天是景天科红景天属植物高山红景天 (RhodioldroseaL.) 的干燥根茎, 其性寒 味甘涩, 根据中国药典 2010 版, 红景天的功能与主治为 益气活血, 通脉平喘 用于气虚血瘀, 胸痹心痛, 中风偏瘫, 倦怠气喘 红景天苷 (salidroside,sal) 是红景天的主要有效成分, 在局灶性脑缺血 / 再灌注大鼠模型中, 红景天苷可减少大鼠局灶性脑缺血 / 再灌注 (MCAO) 大脑的梗死体积和降低脑缺血大鼠神经功能缺损评分 [5-6], 但其确切机制还不清楚 本研究旨在观察红景天苷对 MCAO 模型大鼠脑组织内抗凋亡基因 Bcl 2 神经元特异核蛋白抗原 (neuronal nuclei/neuron specificprotein,neun) 神经生长因子 (nervegrowthfactor,ngf) 脑源性神经营养因子 (brain derivedneurotrophicfactor,bdnf) 及轴突生长抑制因子 (Nogo A) 及其受体 NgRmRNA 及蛋白表达水平的影响, 进一步探讨红景天苷对 MCAO 模型大鼠神经保护的作用机制 1 材料 1.1 实验动物健康成年,SD 大鼠 36 只,SPF 级, 体质量 g, 购于上海斯莱克实验动物有限公司, 合格证号 : , 许可证号 :SCXK ( 沪 ) , 由福建中医药大学实验动物中心饲养 1.2 主要仪器与试剂凝胶成像分析系统 (Bio Rad, 型号 :ChemiDocXRS+),PCR 仪 (Bio Rad, 型号 :C1000), 荧光定量 PCR 仪 (AppliedBiosystems, 型号 :7900HT), 高速台式冷冻离心机 (ThermoFish er, 型号 :PrimoR) Bcl 2 多克隆抗体 (SantaCruz, sc 492),Neun 单克隆抗体 (CelSigaling,#12943), NGF 多克隆抗体 (SantaCruz,sc ),BDNF 多克隆抗体 (SantaCruz,sc 546),Nogo A 多克隆抗体 (SantaCruz,sc 25660),NgR 多克隆抗体 (Santa Cruz,sc ),β actin 抗体 ( 碧云天生物技术研究所, 货号 :H015),RNeasy MiniKit(QIAGEN, 货号 :74106),RT 试剂盒 (Fermentas, 货号 :K1622), 荧光定量 PCR MasterMix(AppliedBiosystems, 货号 : R11022),PCR 引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成, 参照 GenBank 中大鼠 Neun Nogo A NgR

2 776 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2015Jun;31(6) GAPDH mrna 序列,Neun 引物上游序列 5 GGGTTTTGGGTTTGTAACTTTTGAA 3 ; 下游序列 5 AGACTGCTCCTACCACAGGGTTTAG 3,PCR 扩增片段长度为 188 bp Nogo A 引物上游序列 5 GGAGAACAACTTGGACGGCTATG 3 ; 下游序列 5 GCATCTCACGCTTGACCCAG 3,PCR 扩增片段长度为 128bp NgR 引物上游序列 5 GATGATGCTCT TAGTGGACCTGTG 3 ; 下游序列 5 CGATACT CAAAAGTCACACGGTTCA 3,PCR 扩增片段长度为 129bp GAPDH 引物上游序列 5 CAACGGGAAAC CCATCACCA 3 ; 下游序列 5 ACGCCAGTAGACTC CACGACAT 3,PCR 扩增片段长度为 96bp 红景天苷由北京大学提供, 纯度为 98% 尼氏(Nisl) 染色液 ( 碧云天生物技术研究所, 货号 :C0117) 2 实验方法 2.1 MCAO 动物模型制作大鼠经适应性喂养后, 腹腔注射 10% 水合氯醛 (3ml kg -1 体质量 ) 麻醉动物 将甲聚硅氧烷涂层的尼龙单丝从左颈总动脉插入到大脑中动脉的起始端 栓塞后 2h, 将尼龙单丝拔出 假手术动物不栓塞中脑动脉 在操作过程中, 连续监测动物的温度, 并把温度保持 37 参照 Longa 评定法, 进行神经功能损伤程度的评价, 3~4 级为模型制作成功, 可用于实验 2.2 实验分组与处理实验大鼠分为假手术组 (sham), 把成模的动物随机分为模型对照组 (MCAO) 和红景天苷给药组 (MCAO+Sal), 每组 12 只 MCAO+Sal 组在栓塞 2h 后立即腹腔注射红景天苷 (50mg kg -1 ), 连续给药 6d, 于末次给药 4h 后, 每组实验动物断头取脑, 用于实验 2.3 评价神经功能损伤参照 Longa 评定法, 每天对大鼠进行神经功能损伤程度的评价 :0 级, 无缺陷 ; 1 级, 不能伸展对侧前肢 ;2 级, 对侧前肢屈曲 ;3 级, 轻度向对侧转圈 ;4 级, 严重的转圈 ;5 级, 对侧瘫痪 2.4 Nisl 染色脑组织以福尔马林液固定, 充分水洗后, 以石蜡包埋, 切片厚度为 10μm; 将切片脱蜡后至 50% 酒精内, 放入 37 温箱 12h; 切片由酒精中取出, 放入 0 06% 焦油紫液, 将切片放置 56 温箱内染色 1h; 用蒸馏水洗去浮色, 放入 70% 酒精分化, 至显微镜下观察时见背景无色, 细胞及尼氏小体有明显的轮廓为度 ; 以无水酒精急速脱水 5s, 入氯仿 5s, 二甲苯透明, 香胶封固 ; 尼氏小体呈紫色 2.5 荧光实时定量 PCR 检测大鼠脑组织 Neun Nogo A NgRmRNA 表达按照 QIAGENRNeasy MiniKit 试剂盒提取总 RNA, 用 RT 逆转录试剂盒逆转录成 cdna, 以 cdna 为模板, 建立 qpcr 体系为 20μl, 反应条件为 50 2min,95 预变性 10min, 95 变性 15s, 退火 60 30s,40 个循环 以 GAPDH 为内参, 校正每个样品的 Ct 值 ( 每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数 ), 得 ΔC t 值 以 2 -ΔΔCt 法计算各组间 mrna 的表达量 ΔΔC t = 各组 (Ct 目的基因 -Ct GAPDH )- 对照组 (Ct 目的基因 -Ct GAPDH ),2 -ΔΔCt = 各组基因表达量 / 对照组基因表达量 2.6 Westernblot 检测大鼠脑组织 Bcl 2 Neun NGF BDNF Nogo A NgR 的蛋白表达提取总蛋白, 采用 SDS PAGE 垂直板全湿法电泳, 总蛋白经 SDS PAGE 分离后, 将凝胶中的蛋白转移至 PVDF 膜, 用封闭液封闭 2h 后加入稀释的一抗 (Bcl 2 多克隆抗体 1 600,Neun 单克隆抗体 1 500,NGF 多克隆抗体 ,BDNF 多克隆抗体 ,No go A 多克隆抗体 1 800,NgR 多克隆抗体 , β actin 单克隆抗体 ),4 下孵育过夜, 次日 TBS 洗 3 遍, 每次 10min, 加入 稀释 HRP 标记的第二抗体, 室温下孵育 2h 后 TBS 洗膜 之后加 ECL 显色剂经凝胶成像分析系统检测, 分析目标条带的灰度值, 以目标蛋白与 β actin 的灰度值比值作为目标蛋白的相对量, 并统计各组之间的差异 2.7 统计学分析用 SPSS18 0 统计软件进行分析, 数据以 x±s 珋表示, 除了神经损伤评分分析 ( 非参数检验,Mann Whitneytest), 其余各组数据间的差别用 ANOVA 方法分析 3 结果 3.1 红景天苷对 MCAO 大鼠神经功能损伤的影 响与 MCAO 组比较,MCAO+Sal 组在 d4 开始能够有效降低神经功能损伤 (n=12), 且差异具有显著性 (Fig1) 3.2 红景天苷对 MCAO 大鼠脑组织 Nisl 阳性细胞数目及 bcl 2 蛋白表达的影响 Nisl 染色显示红景天苷给药 d6 后, 能够增加 Nisl 阳性细胞数目, 即完整神经细胞的数目 (Fig2);Westernblot 结果表明红景天苷能够上调 bcl 2 的蛋白水平 (Fig3), 这些结果提示着红景天苷能够抑制细胞凋亡 3.3 红景天苷对 MCAO 大鼠脑组织 NeunmRNA 及蛋白表达的影响与 sham 组比较,MCAO 组 Ne unmrna 及蛋白表达明显降低 ; 与 MCAO 组比较, 红景天苷给药 d6 后, 能够提高 NeunmRNA 及蛋白表达, 且差异具有显著性 (Fig4) 3.4 红景天苷对 MCAO 大鼠脑组织 NGF BDNF 的蛋白表达的影响与 sham 组比较,MCAO 组大鼠

3 ChinesePharmacologicalBuletin 2015Jun;31(6) 777 Fig1 Efectsofsalidrosidetreatmentonneurological scoreinmcao rats(n=12) ## P<0.01vssham; P<0.05, P<0.01vsMCAO. Fig2 Nisl stainedcelsinischemicbrain( x±s,n=6) 珋 sham(a);mcao(b);mcao+sal(c).d:salidrosdidein creasedthenumberofnisl stainedcelsinthecortexsignificantly.the averagenumbersofnisl stainedcelsacrosfiverandomvisualfieldsper sectionwereusedforthestatisticalanalysis; ## P<0 01vssham; P< 0 01vsMCAO. Fig3 EfectsofsalidrosidetreatmentonBcl 2protein inischemicbrain(n=3) Fig4 EfectsofsalidrosidetreatmentonNeunmRNA(A) # P<0 05, ## P<0 01vssham; P<0 05vsMCAO. 脑组织 NGF BDNF 的蛋白达明显降低 ; 与 MCAO 组比较, 红景天苷给药 d6 后, 能够提高大鼠脑组织 NGF BDNF 的蛋白表达, 且差异具有显著性 (Fig 5) 3.5 红景天苷对 MCAO 大鼠脑组织 Nogo A 及其受体 NgR mrna 及蛋白表达的影响与 sham 组比较,MCAO 组大鼠脑组织 Nogo A 及其受体 NgR mrna 及蛋白表达明显升高 ; 与 MCAO 组比较, 红景天苷给药 d6 后, 能够降低大鼠脑组织 Nogo A 及其受体 NgRmRNA 及蛋白表达且差异具有显著性 (Fig6,7) 4 讨论本研究发现红景天苷能够促进 MCAO 模型大鼠 Bcl 2 Neun NGF BDNF 的蛋白表达水平 Bcl 2 是细胞死亡的负调因子, 在细胞受到外界刺激时能保护细胞免于凋亡 NeuN 是一种稳定而敏感的成熟神经细胞特异抗原的标记物, 是神经组织特异的蛋白, 参与神经系统的发育 分化和功能, 在局灶性

4 778 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2015Jun;31(6) Fig5 EfectsofsalidrosidetreatmentonBDNF(A),NGF(B)inischemicbrain(n=3) Fig6 EfectsofsalidrosidetreatmentonNogo AmRNA(A) Fig7 EfectsofsalidrosidetreatmentonNgRmRNA(A) 脑缺血的研究中应用较多 [7] 同时, 神经细胞的存活及维持其正常功能依赖于神经营养因子, 而 NGF,BDNF 是神经营养因子家族中的重要成员 [8], NGF 是神经营养因子中最早被发现, 具有神经细胞营养和促突起生长双重生物学功能的一种神经细胞生长调节因子, 它对中枢及周围神经细胞的发育 分

5 ChinesePharmacologicalBuletin 2015Jun;31(6) 779 化 生长 再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用 ;BDNF 是在脑内合成的一种蛋白质, 它广泛分布于中枢神经系统内, 在中枢神经系统发育过程中, 对神经细胞的存活 分化 生长发育起重要作用, 并能防止神经细胞受损伤死亡 改善神经细胞的病理状态 促进受损伤神经细胞再生及分化等生物效应, 也是成熟的中枢及周围神经系统的神经细胞维持生存及正常生理功能所必需 脑内促进与抑制神经生长因子共同调控着轴突的生长 Nogo A 是目前已知主要的轴突生长抑制因子, 具有最强的抑制神经生长的作用, 而 Nogo A 受体 NgR 介导了这一作用 [9] 近年来, 人们对 No go A 及其受体 NgR 的结构及功能进行了大量研究, 有了更为深入的了解 有研究表明 [10], 调控 Nogo A 及其受体 NgR 可影响脑缺血的发展和结果 本研究发现, 红景天苷能够抑制 Nogo A 及其受体 NgR 的基因和蛋白表达, 改善轴突生长的微环境 综上所述, 红景天苷能够降低 MCAO 模型大鼠神经功能损伤, 增加 Nisl 阳性细胞数目, 提高 Neun 的表达, 具有神经保护作用, 此作用是通过促进抗凋亡因子 Bcl 2 及神经营养因子 NGF BDNF 的表达, 下调轴突生长抑制因子 Nogo A 及其受体 NgR 的表达所实现 ( 致谢 : 本实验在福建省中药学重点实验室完成, 感谢实验室的老师对本实验的帮助与指导 ) 参考文献 : [1] GoldsteinLB.Acuteischemicstroketreatmentin2007[J].Cir culation,2007,116(13): [2] SmithW S.Pathophysiologyoffocalcerebralischemia:athera peuticperspective[j].jvascintervradiol,2004,15(1pt2):s3 -S12. [3] MuresanuDF,BuzoianuA,FlorianSI,vonWildT.Towardsa roadmapinbrainprotectionandrecovery[j].jcelmolmed, 2012,16(12): [4] FisherM,FeuersteinG,HowelsDW,etal.Updateofthestroke therapyacademicindustryroundtablepreclinicalrecommendations [J].Stroke,2009,40(6): [5] ChenSF,TsaiHJ,HungTH,etal.Salidrosideimprovesbehav ioralandhistologicaloutcomesandreducesapoptosisviapi3k/akt signalingafterexperimentaltraumaticbraininjury[j].plosone, 2012,7(9):e [6] ShiTY,FengSF,XingJH,etal.NeuroprotectiveefectsofSali drosideanditsanaloguetyrosolgalactosideagainstfocalcerebral ischemiainvivoandh 2 O 2 inducedneurotoxicityinvitro[j].neu rotoxres,2012,21(4): [7] 马勋泰, 冯占辉, 吕洋, 等. 大脑皮质发育不良大鼠脑皮质和海马中的 NeuN 和 GFAP 表达研究 [J]. 癫痫与神经电生理学杂志,2012,21(4): [7] MaXT,FengZH,LyuY,etal.ExpresionsofNeuNandGFAP incorticaldysplasiacerebralcortexandhippocampusinrats[j].j ClinElectroneurophys,2012,21(4): [8] 王晶, 路毅, 邢秀荣.APP17 肽对心肺复苏大鼠海马神经元 NGF BDNF 表达的影响 [J]. 中国药理学通报,2007,23 (5): [8] WangJ,LuY,XingXR.TheefectofAPP17peptideonNGFand BDNFinhippocampalneuronsofratsaftercardiopulmonaryresus citation[j].chinpharmacolbul,2007,23(5): [9] ZhongYH,LiM,LiuJ,PengFH.ExpresionofNogo AandNgR anditssignificanceintheambystomamexicanumbraintisue[j]. JTropicalMed,2014,14(1):4-9. [10] 焦义明, 王金兰, 娄季宇, 白宏英. 脑缺血预处理对大鼠脑内 Nogo AmRNA Nogo A 及其 NgR 蛋白表达的影响 [J]. 西安交通大学学报 ( 医学版 ),2013,34(4): [10]JiaoYM,WangJL,LouJY,BaiHY.Efectsofischemicprecon ditioningontheexpresionsofnogo AmRNA,Nogo AandNgR proteinafterfocalcerebralischemia reperfusioninjuryinadultrats [J].JXi anjiaotonguniv(medsci),2013,34(4): Neuroprotectiveefectsofsalidrosideagainstfocalcelebral ischemia/reperfusioninjuryinrats LAIWen fang 1,2,ZHANGXiao qin 1,HONGHai mian 1,XIEXiu li 1,HONGGui zhu 1 (1.ColegeofPharmacy,2.AcademyofIntegrativeMedicine,FujianUniversityof TraditionalChineseMedicine,Fuzhou ,China) Abstract:Aim ToinvestigatetheefectofSalidroside onthefocalcelebralischemia/reperfusioninjuryinrats anditsunderlyingmechanism.methods Adultmale Sprague Dawleyrats,weighing g,wereran domly divided into three groups: sham, MCAO, MCAO+salidroside(Sal)groups.Theratsweresub jectedtolocalcelebralischemiareperfusionwithsu ture occludedmethod.theratsofmcao+salgroup weretreatedintraperitonealywithsalidroside(50mg kg -1 )for6days.neurologicaldeficittestingwas performedwithlonga sscale.themrnaexpresions ofneun,nogo A,andNgRweredetectedbyRT qpcr inischemicbrain.theproteinexpresionsofneun, NGF,BDNF,Nogo AandNgRweredeterminedby

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