中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2016Apr;32(4) 549 mm, 深 4 5mm 将带有 GFP 的空白质粒 真核表达质粒 (160mg L -1 ) 注射至大鼠侧脑室内, 一次注射总量为 4μL, 速度为 0 3μL min -1, 留针 5m

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1 548 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2016Apr;32(4):548~53 网络出版时间 : :22 网络出版地址 :htp:// CRMP2 可通过改善神经细胞凋亡减轻缺血 / 再灌注大鼠神经功能缺损 幸享凤, 王恬竹, 秦新月 ( 重庆医科大学附属第一医院神经内科, 重庆市神经病学重点实验室, 重庆 ) doi: /j.isn 文献标志码 :A 文章编号 : (2016) 中国图书分类号 :R 332;R322.81;R329.25;R 摘要 : 目的探讨 CRMP2(colapsinresponsemediatorprotein 2) 对大鼠脑缺血 / 再灌注损伤后神经细胞凋亡的影响及其可能的机制 方法 192 只 成年 SD 大鼠分成 4 组 : 假手术组 (sham) 脑缺血 / 再灌注组 (MCAO) 脑缺血 + 质粒对照组 (MCAO+GFP) 脑缺血 +CRMP2 真核质粒干预组 (MCAO +CRMP2/GFP) 大鼠 MCA 阻塞手术前 1d 将真核质粒注射入脑内, 缺血 / 再灌注后 48h 1 周, 采用 RT PCR 检测各组大鼠脑组织 CRMP2 BCL2 p53 Caspase 3 和 Caspase 8 的 mrna 的表达 ;Westernblot 检测脑组织 CRMP2 蛋白的表达 ;TUNEL 染色检测凋亡细胞 ; 免疫组化检测脑源性神经营养因子 (brainderivedneurotrophicfactor,bdnf) 的表达 ;TTC 染色检测脑梗死体积并进行神经功能缺损评分 结果脑缺血 / 再灌注 48h 及 1 周, 与 sham 组比较,MCAO 组及 MCAO+GFP 组 CRMP2 和 BCL2 的表达水平明显降低 (P< 0 01), 而 Caspase 3 Caspase 8 及 p53 的 mrna 表达升高 (P <0 01),TUNEL 阳性细胞数量明显升高 (P<0 01) MCAO+CRMP2/GFP 组 CRMP2 和 BCL2 较 MCAO 及 MCAO +GFP 组明显增高 (P<0 01), 同时该组 p53 Caspase 3 及 Caspase 8 表达明显降低 (P<0 01) 过表达 CRMP2 使 TUNEL 阳性细胞数明显减少 (P<0 01) 脑缺血 / 再灌注后 BDNF 表达升高 (P<0 01), 而脑内过表达 CRMP2 使 BDNF 的水平上调更明显 (P<0 01) TTC 染色显示,MCAO+ CRMP2/GFP 组脑梗死体积较 MCAO 组及 MCAO+GFP 组明显减小 (P<0 01), 且神经功能缺损明显减轻 (P<0 01) 结论过表达 CRMP2 可能通过对线粒体凋亡通路的调控减少了脑缺血 / 再灌注损伤后的神经细胞凋亡 减少脑梗死体积而起到神经保护作用 关键词 :CRMP2; 脑缺血 / 再灌注 ;BDNF; 凋亡 ; 神经功能评分 ;TUNEL 收稿日期 : , 修回日期 : 基金项目 : 国家自然科学青年基金资助项目 (No ) 作者简介 : 幸享凤 (1989-), 女, 硕士生, 研究方向 : 脑血管病,E mail:xingxiangfeng5@163.com; 秦新月 (1963-), 女, 博士后, 教授, 博士生导师, 研究方向 : 脑血管病, 通讯作者,E mail:qinxy20011@sina.com 缺血性脑损伤的病理过程极其复杂, 其发病机制涉及脑组织能量代谢紊乱 兴奋性氨基酸毒性 细胞内钙超载 氧化应激损伤 炎症反应等诸多环节 最后, 由于激活细胞凋亡基因导致细胞程序性死亡, 使缺血半暗带区及梗死区融合 已经证实, 在 MCAO 模型中, 线粒体 p53 可通过转录依赖的机制来激活细胞的凋亡 [1] 此外, 脑缺血时钙离子在细胞内的大量聚集, 引起大量兴奋性氨基酸及神经递质的释放, 并且会激活大量的磷酸化酶, 例如凋亡蛋白酶 (caspase) [2], 加速了神经细胞的凋亡 CRMP2(colapsinresponsemediatorprotein2) 是胞质磷酸化蛋白 CRMP1 5 家族成员之一, 可参与调解多种神经生理活动, 如 : 微管动力学 轴突出芽及回缩 神经分化 树突 / 轴突特化 依赖驱动蛋白的轴突转运 钙离子内态稳定性 神经介质释放等 [3-5] 研究证实,CRMP2 可抑制凋亡前体基因 p53 的表达, 调节 Sema3A 诱导的细胞凋亡 [6-7] 它还可调节 NMDA 受体的功能, 与 N 型电压门控钙离子通道的 α1b 亚单位相互作用, 稳定了钙离子内流 [8-9] 因此, 我们推测 CRMP2 可能是一个通过调控凋亡反应起到脑缺血后神经保护作用的蛋白 本实验采用立体定位方式向颅内注射 CRMP2 真核表达质粒, 使大鼠缺血侧脑组织过表达 CRMP2, 再进一步观察 CRMP2 对大鼠缺血 / 再灌注损伤后神经细胞凋亡及神经功能的影响 1 材料与方法 1.1 实验动物及材料 Sprague Dawley 大鼠 192 只 ( 重医大动物实验中心提供 ), 体质量 220~270 g,(20~25) 室温饲养, 自然进水和食物 RT PCR 试剂盒 (TaKaRa 公司 ); 兔抗 CRMP2( 美国 CST); 山羊抗兔二抗 (ProteintechGroup,Inc);TTC ( 美国 Sigma); 兔抗 BDNF( 美国 Abcam); 山羊抗兔二抗试剂盒 ( 博士德 ) 1.2 方法 真核表达质粒立体定位注射右侧侧脑室注射 : 以前囟为坐标 0 点, 向右 1 5mm, 向后 1 2

2 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2016Apr;32(4) 549 mm, 深 4 5mm 将带有 GFP 的空白质粒 真核表达质粒 (160mg L -1 ) 注射至大鼠侧脑室内, 一次注射总量为 4μL, 速度为 0 3μL min -1, 留针 5min MCAO/ 再灌注模型制作与分组采用随机数字的方法将 192 只大鼠随机分为 sham 组 MCAO 组 MCAO+GFP 组 MCAO+CRMP2/GFP 组, 每组 6 只 脑立体定位注射后 1d, 参照本课题组前期的实验方法 [10], 采用 Longa 评分,1~3 分的模型纳入实验, 其余剔除, 并从同批次实验模型大鼠中随机补齐 Westernblot 检测将各组大鼠脑缺血区域皮质取下, 液氮速冻,-80 保存 参照碧云天蛋白提取试剂盒提取蛋白用于检测 蛋白样品在浓度分数为 0 1 的 SDS PAGE 凝胶中分离并转移至 0 45 的 PVDF 膜上, 浓度分数为 0 05 的脱脂奶粉封闭 90 min,crmp2(55~65ku) 一抗 (1 1000)4 过夜, 山羊抗兔二抗 (1 2000)37 孵育 1h, 采用 fusion 软件检测与分析 RT PCR 检测灭酶器械取组织标本, 参照 RNA 提取及逆转录试剂盒说明书处理得组织 cd NA,-80 保存 引物序列如下 :CRMP2 上游 (21 bp)5 TCCGGTCTGTTCTGGCTTTTTC 3, 下游 (21 bp):5 AGGGTCCGCTCAGGCTGTGTC 3 ;p53 上游 (19bp)5 CTGGACGACAGGCAGACTT 3, 下游 (19 bp)5 CAGCGTGATGATGGTAAGGA 3 ;BCL2 上游 (19bp)5 GGTGGACAACATCGCTCT 3, 下游 (20 bp) 5 CAGCCAGGAGAAATCAAACA 3 ;Caspase 3 上游 (20bp)5 AAAGGAATGACTGGGAGTGG 3, 下游 (20 bp)5 AATGACGACCTGGAACATCG 3, Caspase 8 上游 (20bp)5 AGCCCA TCTTCACAC TACGG 3, 下游 (22bp)5 AGCACACATCAGTTAG GACACA 3 用 SYBRGREEN 进行扩增反应 免疫组化及 TUNEL 染色各组大鼠缺血 / 再灌注后 48h 及 1 周,PBS 加多聚甲醛 ( 体积分数 0 04) 经升主动脉灌注取脑, 固定 24h, 脱水, 冰冻切片 (10μm/ 片 ) 切片微波修复后进行 BDNF 一抗及相应的二抗孵育, 中性树胶封片 ; 用于检测 TUNEL 的组织, 固定脱水后石蜡包埋切片, 切片脱蜡后按照 TUNEL 染色试剂盒说明书进行染色, 中性树胶封片 光镜 400 倍下, 每个脑组织随机选取 3 个脑片, 每个脑片的缺血半暗带随机选取 5 个区域, 计算平均数 TTC 染色及神经功能评分各组大鼠缺血 / 再灌注 48h 后断头取脑, 脑组织纵向切成 2mm 厚度的脑片,TTC 浸泡染色 20min, 拍照, 软件分析脑梗死体积百分比 神经功能评估采用评分者单盲的方法, 参照 Garcia [10] 的评分标准进行评分, 最低 3 分, 最高 18 分, 得分越低表示神经功能缺损越严重 1.3 统计学分析采用 SPSS22 0 对数据进行分析, 结果以 x±s 珋表示, 多组间比较运用 AVONA 分析, 两两比较行 LSD 检验 2 结果 2.1 脑缺血 / 再灌注后各组大鼠 CRMP2mRNA 及蛋白的表达脑缺血 / 再灌注 48h 及 1 周后, 检测 CRMP2 的表达, 结果提示 : 缺血 / 再灌注 48h CRMP2 的表达较假手术组降低 (P<0 01),1 周后 CRMP2 的表达较 48h 时降低更明显 (P<0 01) 真核表达质粒使缺血侧脑组织 CRMP2 的表达在两个时间点均明显上调, 与 MCAO 和 MCAO+GFP 组比较差异具有统计学意义 (P<0 01)(Fig1) 2.2 过表达 CRMP2 对神经细胞凋亡的影响 缺血 / 再灌注 48h 和 1 周各组大鼠 p53 Caspase 3 Caspase 8 及 BCL2mRNA 的表达脑缺血 / 再灌注 48h 及 1 周, 与 sham 组比较, 缺血 / 再灌注后 BCL2 的 mrna 的表达水平明显降低 (P< 0 01), 而同时 Caspase 3 Caspase 8 以及 p53 的 mr NA 表达升高 (P<0 01); 与 MCAO 及 MCAO+GFP 组比, 真核质粒干预脑缺血组织后升高了 BCL2 的 mrna 水平 (P<0 01), 同时明显降低了 p53 Caspase 3 Caspase 8 的 mrna 水平 (P<0 01)(Fig 2) TUNEL 染色观察凋亡细胞在假手术组, 缺血侧皮质有少量的凋亡细胞, 而在缺血 / 再灌注 48h 后, 可见有大量的 TUNEL 阳性细胞存在 与 MCAO 及 MCAO+GFP 组比较, 给予过表达 CRMP2 干预后, 该部位 TUNEL 阳性细胞有所减少 (P< 0 01)(Fig3) 2.3 过表达 CRMP2 使 BDNF 表达升高大鼠缺血 / 再灌注之后 48h 及 1 周, 各组 BDNF 的表达均较假手术组升高 (P<0 01); 过表达 CRMP2 使该组 BDNF 的表达较另外两组明显升高 (P<0 01)(Fig 4) 2.4 过表达 CRMP2 对脑梗死体积及神经功能的影响再灌注后 48h,MCAO 组及 MCAO+GFP 组大鼠缺血侧可见明显的梗死灶, 并伴有严重的神经功能缺损 (P<0 01); 真核质粒干预后梗死灶明显缩小 (P<0 01), 神经功能缺损明显减轻 (P<0 01)

3 550 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2016Apr;32(4) 生理过程有重要的作用, 导致大量神经细胞及传导束的损害 [12] 脑缺血后大量神经细胞死亡, 对神经功能产生严重的不良影响, 而缺血半暗带区大部分神经细胞死亡以凋亡为主 [13] Tab1 Neurologicalscoreoffourgroups( x±s,n=6) 珋 Group 48h 1wk Sham 14.9± ±0.168 MCAO 6.10± ±0.166 MCAO+GFP 5.97±0.147 ## 8.86±0.211 ## MCAO+CRMP2/GFP 9.97± ±0.135 P<0 01vsshamgroup; ## P<0 01vsMCAO+CRMP2/GFP group; P<0 01vsMCAOgroup Fig1 ExpresionofCRMP2at48hand1wk inischemiapenumbraoffourgroups A~B:WesternblotasayofCRMP2expresion.C:Thebargraph reflectedcrmp2mrnaexpresion; P<0 01vsshamgroup; ## P< 0 01vsMCAO+CRMP2/GFPgroup; P<0 01vsMCAOgroup;1: sham group;2:mcao group;3:mcao +GFP group;4:mcao + CRMP2/GFPgroup 1 周后, 缺血各组大鼠的神经功能均有所恢复, 但 MCAO+CRMP2/GFP 组的神经功能评分明显高于其他两组 (P<0 01)(Fig5 Tab1) 3 讨论脑缺血或者脑缺血 / 再灌注损伤的病理过程极为复杂, 包括兴奋性氨基酸毒性 离子不平衡 氧化应激 炎症反应 自噬 凋亡及细胞坏死等 [11] 研究证实, 细胞程序性死亡在大鼠局灶性脑缺血的病理 大鼠脑缺血之后神经细胞的死亡通过坏死和凋亡两种机制进行 [14] 在各种应激及损伤的情况下, 线粒体内膜损伤释放出细胞色素 C 启动内源性线粒体凋亡通路, 细胞色素 C 与凋亡蛋白酶激活因子结合, 可促进 Caspase 9 前体的自身活化, 之后激活 Caspase 3 前体, 从而导致 DNA 降解, 同时破坏维持细胞的完整性的必需物质 [15] 线粒体凋亡途径也可以通过激活细胞膜表面死亡配体 [16], 如干扰素, 诱导 TNF 相关凋亡诱导配体和 Fas/FasL 引起 Fas 相关死亡结构域蛋白的激活, 后者依次激活 Caspase 8 及下游的 Caspase 家族 [17],Caspase 8 的激活使 Bid 裂开, 导致线粒体膜电位瓦解并引起细胞凋亡 [18] 本实验研究发现, 脑缺血 / 再灌注后 48h 及 1 周, 过表达 CRMP2 使缺血侧脑皮质 BCL2 表达升高, 而 Caspase 3 Caspase 8 及 p53 的表达降低 此外, 过表达 CRMP2 使 TUNEL 阳性细胞减少, 减少了脑梗死体积, 并更大程度的减轻了神经功能的缺损 研究表明,p53 能上调 BAX 并下调 BCL2 [15], 而脑缺血组织中 BCL2 的表达升高可以调节线粒体膜上钙离子的内流, 维持线粒体膜的完整性及调控氧化应激反应, 从而改善细胞凋亡 因此, 我们推测 CRMP2 可以通过调节内源性线粒体通路调控细胞凋亡 同时, 本实验还显示,CRMP2 的过表达上调了 BDNF 的表达 已有研究证实, 通过 Slp1/Rab27B/ CRMP 2/Kinesin 1 通路募集 TrkB 传送到轴突终端是 BDNF 信号传输的关键 [19] BDNF 可通过依赖 ERK 方式激活转录因子 CREB 和 NFκB, 从而增加抗凋亡基因 Bcl2 家族的表达, 另一方面,BDNF 可激活 PKC, 进一步调节 GSK3 的磷酸化 而 GSK3 的磷酸化是细胞存活还是死亡的重要平衡因子 [20] 从而, 我们推测 CRMP2 可能通过调节 BDNF/CREB

4 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2016Apr;32(4) 551 Fig2 ExpresionofBCL2,p53,Caspase 8andCaspase 3at48hand1wkinischemiapenumbraoffourgroups A~D:Thebargraphreflectedp53,BCL2,Caspase 8andCaspase 3mRNA expresion. P<0 01vssham group; ## P<0 01vsMCAO+ CRMP2/GFPgroup; P<0 01vsMCAOgroup.Thebargraphrefiectedtheexpresionofp53mRNA(A),BCl2mRNA(B)Caspase 8(C)and Caspase 3(D) Fig3 ExpresionofTUNELpositivecelsat48hand1wkinischemiapenumbraoffourgroups(400 ) TheblackarowforTUNELpositivecels. P<0 01vsshamgroup; ## P<0 01vsMCAO+CRMP2/GFPgroup; P<0 01vsMCAOgroup 通路及 BDNF/PLC/PKC/GSK3 通路来影响细胞凋亡 此外, 大量的钙离子在细胞内聚集, 将激活凋亡蛋白酶 (Caspase), 引起细胞凋亡 [15] 钙离子的内流受 NMDA 受体调控, 而 CRMP2 又可调节 NMDA 受体的功能 [8-9] 因此, 我们还推测,CRMP2 通过 BDNF/NMDA 通路调节细胞内钙离子的内流, 参与了对细胞凋亡的调控 这些假设将在后续的试验中进行论证

5 中国药理学通报 C P m B A 3 4 综上所述过表达 CRMP能够减轻脑缺血 再 灌注损伤后脑组织神经细胞的凋亡反应缩小脑缺 血 再灌注后的脑梗死体积促进神经功能的恢复 这可能与 CRMP参与调节内源性线粒体凋亡通路 及 BDNF 相 关 通 路 如 CRMP BDNF CREB CRMP BDNF PLC PKC GS K3 以 及 CRMP BD NF NMDA 有关 本课题组拟在今后的研究中继续 探索 CRMP的神经保护作用并证实相关机制 致谢 本文实验在重庆医科大学神经病学重点实验室 完成在此表示感谢 参考文献 L J YZH G D m w NS C 37 z m m m 3 N m 4 8 4 8 S CHL XQH XYZ YY P R m B P mb 43 7 8 9 8 m F 4 Ex BDNF 48wk m m 4 T k w BDNF P m P MCAO CRMP GFP P MCAO 3 W TWXY C CRMP x w M N RGM 3 4 7 3 9 3 3 4 K RW SMB JM O P m CRMP j m F N 7 7 4 9 7 I JPFAKI NY CRMP m N 4 89 9 8 L SE AM J A C C 3 88 7 W LHS m S A m CRMP x m JN 99 9 97 7 8 B JMC LW SM N m j m JB C m 8 m CRMP 4 3 3 7 77 8 9 9 B JMP RY H D NMDAR CRMP m m m m C A 9 G J C CC CS O x m j m M N D 7 3 9 F T m48 P m P MCAO CRMP GFP F MF GH w DW U k m mm S k 94 44

6 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2016Apr;32(4) 553 [12] LinnikM D,ZobristRH,HatfieldM D.Evidencesupportinga roleforprogrammedceldeathinfocalcerebralischemiainrats [J].Stroke,1993,24(12): [13] 宋修云, 胡金凤, 陈乃宏. 神经细胞凋亡与脑缺血疾病 [J]. 中国药理学通报,2012,28(3): [13] SongXY,HuJF,ChenNH.Neuronsapoptosisandcerebralis chemia[j].chinpharmacolbul,2012,28(3): [14] IsenmannS,StolG,SchroeterM,etal.Diferentialregulationof Bax,Bcl 2,andBcl xproteinsinfocalcorticalischemiaintherat brain[j].brainpathol,1998,8(1): [15]SaadMA,AbdelSalamRM,KenawySA,etal.Pinocembrinat tenuateshippocampalinflammation,oxidativeperturbationsand apoptosisinaratmodelofglobalcerebralischemiareperfusion [J].PharmacolRep,2015,67(1): [16] Ruiz RuizC,López RivasA.Mitochondria dependentand inde pendentmechanismsintumournecrosisfactor relatedapoptosisin ducingligand(trail) inducedapoptosisarebothregulatedbyin terferon gammainhumanbreasttumourcels[j].biochem J, 2002,365(3): [17] deveerm J,HolkoM,FrevelM,etal.Functionalclasificationof interferon stimulatedgenesidentifiedusingmicroarays[j].jleu kocbiol,2001,69(6): [18]ChenQ,GongB,Mahmoud AhmedAS,etal.Apo2L/TRAILand Bcl2 relatedproteinsregulatetypeⅠ interferon inducedapoptosis multiplemyeloma[j].blood,2001,98(7): [19] ArimuraN,KimuraT,NakamutaS,etal.Anterogradetransportof TrkBinaxonsismediatedbydirectinteractionwithSlp1and Rab27[J].DevCel,2009,16(5): [20]OrtegaF,Pérez SenR,MorenteV,etal.NMDAandBDNFrecep torsconvergeongsk3phosphorylationandcooperatetopromote survivalincerebelargranuleneurons[j].celmollifesci,2010, 67(10): CRMP2aleviatesneurologicaldeficitbyreducingneuronapoptosis inratsaftercerebralischemia/reperfusioninjury XINGXiang feng,wangtian zhu,qinxin yue (DeptofNeurology,theFirstAfiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity, ChongqingKeyLaboratoryofNeurology,Chongqing ,China) Abstract:Aim Toinvestigatetheinfluenceofthe overexpresionofcrmp2onneuralcelapoptosisafter ischemiareperfusion injuryin ratsand itsposible mechanism.methods A totalof192maleadultsd ratsweredividedintofourgroups:sham group,cere bralischemia/reperfusiongroup(mcaogroup),cere bralischemiawithblankplasmidcontrolgroup(mcao +GFPgroup),cerebralischemiawithCRMP2eu karyotic plasmid group (MCAO + CRMP2/GFP group).onedayafterinjectingeukaryoticplasmid, theratswereoperatedfor120 minischemiathrough MCAocclusionandreperfused.At48hand1wk,the expresionofcrmp2,p53,caspase 3,Caspase 8and BCL2inbraintisuewastestedbyRT PCRandWest ernblot. Apoptoticcelswereobserved bytunel test.ttcstainingwasusetodetectcerebralinfarction volume.theneuralfunctionoftheratswerealsoeval uated.results Comparedwiththesham group,the expresionlevelsofcrmp2andbcl2inmcaogroup andmcao+gfpgroupweresignificantlydecreased (P<0 01),whilep53,Caspase 3,Caspase 8and TUNELpositivecelswereelevated(P<0 01).Inter ventionofcrmp2eukaryoticplasmidresultedinthe increasedexpresionofcrmp2andbcl2(p<0 01) andthedecreasedp53,caspase 3andCaspase 8ex presion.intunel test,overexpresionofcrmp2 obviouslydecreased thenumberoftunel positive cels(p<0 01).TheexpresionofBDNFwasupregu latedaftercerebralischemicinjury(p<0 01),while overexpresionofcrmp2increasedbdnfmoresignif icantly(p<0 01).TTCstainingshowedcerebralin farctionvolumnofmcao +CRMP2/GFPgroupwas obviouslydecreased(p<0 01),andneurologicdefi citsweresignificantlyimproved(p<0 01).Conclu sion TheoverexpresionofCRMP2reducesnervecel apoptosisposiblybyregulatingthemitochondrialap optosispathwayaftercerebralischemia/reperfusionin jurytoprotectnervoussystem. Keywords:CRMP2;cerebralischemia/reperfusion; BDNF;apoptosis;neurologicalscore;TUNEL

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