大肠杆菌生产琥珀酸的工程菌种研究进展

Size: px

Start display at page:

Download "大肠杆菌生产琥珀酸的工程菌种研究进展"

樽彭
5 years ago
Views:

1 大肠杆菌生产琥珀酸的工程菌种研究进展作者 : 戴昊上海交通大学生命学院研究生学号 : 摘要 : 琥珀酸是一种用途非常广泛的工业原料, 但传统以石油产品为原料的化学合成方法带来了高价格和高污染, 通过微生物发酵法生产琥珀酸正越来越引起人们的关注大肠杆菌是目前研究的较多的产琥珀酸菌种, 具有基因组和蛋白质组的信息了解完全, 代谢途径也基本清楚, 易操作生长速率快易培养及利用碳源广等诸多优点, 目前, 人们正通过将基因工程与发酵工艺结合的方法, 使大肠杆菌大规模发酵琥珀酸成为可能关键词 : 大肠杆菌, 琥珀酸, 工业微生物 1. 引言琥珀酸 (succinic acid) 又名丁二酸, 分子式为 HOOC-CH 2 -CH 2 -COOH, 分子量 , 常温下为无色结晶, 味酸, 可燃 ; 可溶于水乙醇丙酮甘油乙醚, 但几乎不溶于苯二硫化碳四氯化碳和石油醚在生物体内是三羧酸循环的中间产物, 广泛存在于各种生物中, 在琥珀中含量可达 7.8%, 在当归藤桔夜关门半边莲草珊瑚等植物的某些部位含量丰富琥珀酸可用于食品和药品, 并已被美国 FDA 认定为 GRAS( 一般认为安全 ) 琥珀酸也可作为工业原料而广泛应用于农药染料香料油漆塑料等行业, 还可以作为 C4 平台化合物, 合成一些重要的化工产品如丁二醇四氢呋喃 γ- 丁内酯 n- 甲基吡咯烷酮 (NMD) 2- 吡咯烷酮等, 用途十分广泛另外, 琥珀酸还可用来合成可降解的生物聚合物, 如聚丁烯琥珀酸酯 (PBS) 和聚酰胺, 使其成为最具潜力的大宗生物化学品之一传统的化学合成方法以石油化工产品丁烷为原料, 通过顺式丁烯二酐生产得到琥珀酸,

2 这种方法不仅会因为石油价格上涨而导致成本上升, 还会造成环境污染, 抑制了该产品的发展潜力和应用范围, 因此微生物发酵法生产琥珀酸的研究越来越引起人们的兴趣, 早在 20 世纪 90 年代初美国能源部就投资 700 万美元进行琥珀酸的发酵和提取研究, 目前的发酵工艺已经能使琥珀酸的销售价格降为 2.20 美元 /kg, 随着产量扩大和发酵工艺的不断改进, 可以预期, 琥珀酸的发酵法生产将逐步从食品行业扩展到各个工业领域琥珀酸是一些厌氧和兼性厌氧微生物代谢途径中的共同中间物, 很多细菌能生产并分泌琥珀酸, 但天然菌株往往不能产生过量的琥珀酸, 产量很低, 且产物多种多样, 对糖或琥珀酸的耐受性也很差, 因而, 要使这些菌种应用于发酵生产, 必须运用发酵工程和基因工程对现有的菌种进行改造, 目前研究的较多的主要是产琥珀酸厌氧螺菌 (Anaerobiospirillum succiniproducens), 产琥珀酸放线杆菌 (Actinobacillus succinogenes) 和大肠杆菌 (Escherichia coli) 等菌种 2. 大肠杆菌生产琥珀酸大肠杆菌在氧气缺乏的情况下, 通过发酵糖或其衍生物, 产生甲酸乙酸乳酸琥珀酸乙醇等物质 [1] 通常情况下, 大肠杆菌不会过量合成琥珀酸, 因此其琥珀酸的产量很低, 通常为每 100 mol 葡萄糖产 12mol 琥珀酸, 但大肠杆菌作为典型革兰氏阴性细菌, 其基因组和蛋白质组的信息了解完全, 代谢途径也基本清楚, 且具有易操作生长速率快易培养及利用碳源广等诸多优点, 因而正受到越来越多的重视人们正通过将基因工程与发酵工艺结合使大肠杆菌大规模发酵琥珀酸成为可能许多代谢工程策略已经用于提高大肠杆菌琥珀酸的产量 [2-8] 2.1. 改变关键酶基因的表达 PEP 在 E.coli 的代谢中占据重要位置, 它是糖酵解途径的最后一步反应的中间物, 又是琥珀酸生物合成途径中第一步羧基化反应的底物目前,E.coli 为 PEP 羧化酶和 PEP 羧化激酶 [9] 编码的基因 ppc 和 pck 已被克隆 Millard 等人将这 2 个基因分别克隆在表达型质粒 pjf118eh 中, 并置于 tac 启动子的控制下重组质粒转化至大肠杆菌 JCL1208 株, 发酵时以 37g/L 的葡萄糖为碳源, 经诱导后,PEP 羧化酶和羧化激酶的表达水平比受体菌提高 50~100 倍产物分析结果表明,PEP 羧化酶的过量表达导致琥珀酸大量积累, 由受体对照株的 3.0g/L 提高到

3 10.7g/L, 但 PEP 羧化激酶却没有明显的作用与此同时, 发酵液中其他副产物如乳酸丙酮酸等均比对照菌略有减少这一结果证明,PEP 羧化酶作为糖代谢途径的重要调控节点, 在 E.coli 中过量表达能够改变发酵产物的分配比例 [10] Kim 等在对 PEP 羧化激酶 (PEPCK) 进行研究后, 利用基因重组技术, 将其分别在野生的大肠杆菌 K12 和敲除 ppc 基因的突变菌株大肠杆菌 K12 ppc 中过量表达, 结果表明过量表达 PEPCK 对大肠杆菌 K12 产生琥珀酸没有作用, 而大肠杆菌 K12 ppc 最终的琥珀酸产量提高了 6.5 倍这一结果比过量表达 PEP 羧化酶的结果 (3.5 倍 ) 更高, 似乎表明了 PEPCK 比 PEP 羧化酶更适于琥珀酸的生产这是因为 PEPCK 能再生 ATP, 节省了来自糖酵解途径的能量, 而 PEP 羧化酶途径则是一个耗能的过程, 其具体机理有待进一步研究 [11-14] [15,16] Rice 大学 San 研究组最近连续发表多篇论文及专利论述了一系列大肠杆菌产琥珀酸研究由于有氧条件下大肠杆菌具有高代谢速度和产物生成的优点, 首先他们对大肠杆菌进行了基因工程改造以适应有氧发酵的条件此基因工程菌是通过敲除编码琥珀酸脱氢酶的基因 (sdhab) 编码丙酮酸氧化酶的基因 (poxb) 编码 pta-ack 和 acebak 操纵子阻遏物的基因 (iclr) 及编码磷酸转移酶系统的基因 (ptsg), 构建出了包含乙醛酸循环和 TCA 循环氧化支路的琥珀酸合成途径以 sdhab poxb pta-ack iclr 四个基因敲除菌为平台, 进一步通过 ptsg 基因敲除和 PEP 羧化酶的表达将有氧发酵产琥珀酸的得率提高到了理论值 1mol/mol 葡萄糖 [14], 从而显示了大规模有氧生产的潜力厌氧情况下, 其主要采取的策略为通过基因缺失来消除代谢副产物的生成首先发现在 adhe ldha 双缺失菌 SBS110MG 中表达丙酮酸羧化酶能够大幅度提高琥珀酸的得率到 1.2mol/mol 葡萄糖 [13] ; 他们通过进一步引入 arca pta-ack iclr 基因缺失构建一系列菌株, 发现在以上 5 个基因缺失菌 SBS660MG 中共同表达柠檬酸合成酶和丙酮酸羧化酶可以将厌氧琥珀酸的得率提高到接近理论值的 1.7mol/mol 葡萄糖 [11], 同时可以在 24h 内完全利用 18g/L 的葡萄糖其在厌氧条件下的实验设计具有很高的理论价值, 但在所有的实验中均采用了一种大接种量的接种方法 (OD 600 = 20) 在比较高的接种量下可以部分克服基因工程菌生长缓慢的缺点, 但具体到工业化可能还需要做很多的工作 2.2. 与高产菌进行基因组比较

4 据报道 [17] [18],M.succiniciproducens 能够高效地发酵生产琥珀酸 Lee 研究组最近发表了一篇采用将大肠杆菌和 M.succiniciproducens 基因组进行比较, 从而识别提高大肠杆菌琥珀酸产量的关键基因的方法他们首先选择了仅存在于 E.coli 中的 pstg pykf mqo sdha 和 aceba 五个基因, 接着将它们依次破坏, 检验各自对发酵的影响因为 E.coli 中存在许多代谢回路和异构酶, 它们会阻碍某些扰乱对代谢流的影响, 所以结果发现, 基于上述 5 个基因的操作并没有对 E.coli 发酵有明显的影响随后, 该研究组又利用基因组水平上的 E.coli 代谢模型, 通过计算机进行模拟实验计算机模拟实验的结果表明, 敲除 E.coli 中的 pstg,pykf 和 pyka 基因, 对于提高琥珀酸的产量最有效这一结果同样在实验中得到了验证 : 基因敲除后, 琥珀酸的产率可以提高 7 倍, 其他副产物的产量也明显减少经过分析发现,E.coli 中的 pstg, pykf 和 pyka 三种基因都直接与丙酮酸的形成有关, 分析表明,E.coli 中丙酮酸的代谢流对于琥珀酸的生成是不利的 2.3. 改造代谢途径 [19] 以野生型大肠杆菌 W1485 为出发菌株,Clark 等人通过插入抗性基因的方法构建了丙酮酸甲酸裂解酶 pfl 和乳酸脱氢酶 ldha 的插入失活菌株 NZN111(F-pflA : :Cam; ldha : :Kan) NZN111 不能以葡萄糖为碳源发酵生长, 但可以以乳糖果糖甘露糖和海藻糖等为碳源, 发酵生成琥珀酸乙酸和乙醇 [20,21] Stols 等人发现, 在大肠杆菌突变株 NZN111 中, 表达 Ascaris suum 苹果酸酶能够使其生长恢复, 琥珀酸的得率提高到 0.39mol/mol 葡萄糖, 琥珀酸是主要的发酵产物 ; 进一步的研究发现, 在 NZN111 中表达 NAD + 依赖的大肠杆菌苹果酸酶后几乎进行单一的琥珀酸发酵, 最优条件下发酵琥珀酸的得率能够达到 1.2g/g 葡萄糖 2.4. 筛选产物缺陷型菌株 [22] Pan 等人以大肠杆菌 W3110 作为受体菌株, 构建了乙酸和乳酸形成缺陷的双重突变株 SS373 (W3110 pta : :Tn10 ldha : :Kan) SS373 大肠杆菌能够在葡萄糖培养基上厌氧条件下生长, 因为它可以产生乙酰辅酶 A, 而大肠杆菌 NZN111 却不能在两步法培养中, 琥珀酸和丙酮酸是主要的发酵产物当使用非 PTS 糖类发酵时, 可以发酵产生几乎纯的琥珀酸 2.5. 研究发酵条件的影响

5 E.coli AFP111 是 NZN111 经过自发染色体突变的变异菌株, 与 NZN111 不同的是, [23] AFP111 能够在厌氧环境下生长 Charterjee 等发现 AFP111 能够发酵葡萄糖产生琥珀酸乙酸和乙醇 ; 并且能够利用外源氢为还原剂当使用两阶段发酵, 即先在好氧环境下生长, 然后在 CO 2 环境下合成产物后, 琥珀酸的产量可以增加到 45g/L, 生产能力可以达到 1.6g/(L h), 得率可达到 0.99mol/mol 葡萄糖 [24] Vemuri 等进一步将编码 Rhizobium etli 丙酮酸羧化酶基因的质粒转移到 AFP111 中 ( AFP111/pTrc99A-pyc ), 研究了两阶段发酵的转换时间 (Transition time ) 对 AFP111/pTrc99A-pyc 发酵产琥珀酸的影响, 根据细胞在不同时间的生理特征, 选择了 6 个不同的转换时间, 最终发现好氧阶段的细胞浓度对下一阶段产物合成的影响较大当 E.coli 细胞浓度达到最大时, 最终发酵琥珀酸的浓度为 99.2 g/l, 对葡萄糖的得率为 1.10mol/mol, 生产强度为 1.3g/(L h) [25] 3. 展望大肠杆菌作为一种重要的工业微生物, 其基因组序列已完全公布, 这为代谢工程的研究提供了可能另外, 大肠杆菌有较好的遗传背景, 且有相应的表达或整合载体, 这些都给代谢工程的设计带来了方便作为目前最有潜力的产琥珀酸发酵菌株, 研究也取得了上述的众多进展目前唯一公开报道的进行产琥珀酸中试的发酵菌株就是大肠杆菌但大肠杆菌同样面临许多的问题最主要的就是大肠杆菌厌氧发酵比琥珀酸生成效率相对较低, 通常进行混合酸发酵, 以及不能耐高浓度糖发酵等为了获得发酵菌株的全面性能改进, 可以预计单独依赖对某个具体基因或途径进行考察的传统还原论方法很难获得更大的进展, 而必须通过以各种组学的合理联用, 以及计算机辅助的菌株设计为特征的系统生物学的方法目前已经有了许多基于组学规模的代谢关键途径 [18,26 或靶点识别的研究进展 ], 可以预计系统生物学方法必将在琥珀酸菌株的改良中发挥更重要的作用参考文献 [1] Gottschalk G. Bacterial metabolism, 2nd ed. New York : Springer Verlag, 1985.

6 [2] Chatterjee R, Millard CS, Champion K, Mutation of the ptsg gene results in increased production of succinate in fermentation of glucose by Escherichia coli. Appl Environ Microbiol, 2001, 67(1): [3] Gokarn RR, Eiteman MA, Martin SA, Production of succinate from glucose, cellobiose, and various cellulosic materials by the ruminal anaerobic bacteria Fibrobacter succinogenes and Ruminococcus flavefaciens, Appl Biochem Biotechnol, 1997, 68(1-2): [4] Hong SH, Lee SY, Metabolic flux analysis for succinic acid production by recombinant Escherichia coli with amplified malic enzyme activity. Biotechnol Bioeng, 2001, 74(2): [5] Lin H, Bennett GN, San KY, Chemostat culture characterization of Escherichia coli mutant strains metabolicallv engineered for aerobic succinate production: a study of the modified metabolic network based on metabolite profile, enzyme activity, and gene expression profile. Metab Eng, 2005, 7(5/6): [6] Sanchez AM, Bennett GN, San KY, Efficient succinic acid production from glucose through overexpression of pyruvate carboxylase in an Escherichia coli alcohol dehydrogenase and lactate dehydrogenase mutant. Biotechnol Prog, 2005a, 21(2): [7] Sanchez AM, Bennett GN, San K Y, Novel pathway engineering design of the anaerobic central metabolic pathway in Escherichia coli to increase succinate yield and productivity. Metab Eng, 2005b, 7(3): [8] Stols L, Donnelly MI, Production of succinic acid through overexpression of NAD(+)-dependent malic enzyme in an Escherichia coli mutant. Appl Environ M icrobiol, 1997, 63(7): [9] Millard CS, Chao YP, Liao JC, et al. Enhanced production of succinic acid by overexpression of phosphoenolpyruvate carboxylase Escherichia coli. Appl Environ Microbiol,1996,62 : [10] Kim P Laivenieks M, Vieille C, et a1, Effect of Overexpression of Actinobacillus succinogenes Phosphoenolpyruvate Carboxykinase on Succinate Production in Escherichia coli [J]. App1. Environ. Microbio1, 2004, 70(2): [11] Sanchez AM, Bennett GN, San KY. Novel pathway engineering design of the anaerobic central metabolic pathway in Escherichia coli to increase succinate yield and productivity. Metab Eng, 2005, 7 :

7 [12] Lin H,Bennett GN,San KY. Fed-batch culture of a metabolically engineered Escherichia coli strain designed for high2level succinate production and yield under aerobic conditions. Biotechnol Bioeng, 2005,90 : [13] Sanchez AM, Bennett GN, San KY. Efficient succinic acid production from glucose through overexpression of pyruvate carboxylase in an Escherichia coli alcohol dehydrogenase and lactate dehydrogenase mutant. Biotechnol Prog, 2005,21 (2) : [14] Lin H, Bennett GN, San KY. Metabolic engineering of aerobic succinate production systems in Escherichia coli to improve process productivity and achieve the maximum theoretical succinate yield. Metab Eng, 2005,7 : [15] San KY, Bennett GN, Sanchez AM. High molar succinate yield bacteria by increasing the intracellular NADH availability. US patent [16] San KY,Bennett GN,Sanchez AM. Increasing intracellular NADPH availability in E. coli. 2005,US patent [17] Hong SH, Kim JS, Lee S et a1. The Genome Sequence of the Capnophilic Rum en Bacterium Mannheimia succiniciproducens[j], Nat. Biotechnol, 2004, 22: [18] Lee SJ, Lee DY, Kim TY, et al. Metabolic engineering of Escherichia coli for enhanced production of succinic acid,based on genome comparison and in silico gene knockout simulation. Appl Environ Microbiol, 2005,71 : [19] Clark DP. The fermentation pathways of Escherichia coli, FEMS Microbiol Rev,1989,63 : [20] Stols L,Kulkarni G,Harris BG, et al. Expression of Ascaris suum malic enzyme in a mutant Escherichia coli allows production of succinic acid from glucose. Appl Biochem Biotechnol, 1997,63-65 : [21] Stols L, Donnelly ML. Production of succinic acid through overexpression of NAD+ dependent malic enzyme in an Escherichia coli mutant. Appl Environ Microbiol, 1997,63 : [22] Pan JG,Shin SA,Park CK. Pta ldha double mutant Escherichia coli SS373 and the method of producing succinic acid therefrom. 2002, US patent 6,448,061. [23] Chatterjee R,Millard CS,Champion K, et al. Mutation of the ptsg gene results in increased production of succinate in fermentation of glucose by Escherichia coli. Appl Environ

8 Microbiol,2001,67 : [24] Vemuri GN, Eiteman MA, Altman E, Succinate Production in Dual phase Escherichia coli Fermentations Depends on the Time of Transition from Aerobic to Anaerobic Conditions, [J] J. Ind. Microbio1. Biotechno1, 2002, 28: [25] Vemuri GN,Eiteman MA,Altman E. Succinate production in dual2 phase Escherichia coli fermentations depends on the time of transition from aerobic to anaerobic conditions. J Ind Microbiol Biotechnol, 2002,28 (6) : [26] Wang QZ,Chen T, Chen X, et al. Genome scale in silico aided metabolic flux analysis comparisons for succinic acid production. Appl Microbiol and Biotechnol,2006,73(4) :

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌