! 中国生物工程杂志 2,! 图大肠杆菌色氨酸的合成途径及相关调控!"#$"%&# ', ' 邻氨基苯甲酸 3 +4/ " 0 磷酸 0 0 脱氧核酮糖 0 0 邻羧基苯胺 0 $ $ ( "$797 -' 分支酸 398 +'-/ 0 脱氧 $+$ 阿拉伯庚酮糖

Size: px

Start display at page:

Download "! 中国生物工程杂志 2,! 图大肠杆菌色氨酸的合成途径及相关调控!"#$"%&# ', ' 邻氨基苯甲酸 3 +4/ " 0 磷酸 0 0 脱氧核酮糖 0 0 邻羧基苯胺 0 $ $ ( "$797 -' 分支酸 398 +'-/ 0 脱氧 $+$ 阿拉伯庚酮糖"

堂保
5 years ago
Views:

1 中国生物工程杂志! "# 微生物发酵法生产色氨酸的代谢工程研究赵志军陈晟吴丹吴敬陈坚江南大学食品科学与技术国家重点实验室无锡 # 江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室无锡 # 摘要 )$ 色氨酸作为人体内的一种必需氨基酸广泛应用于医药食品与饲料等行业工业上采用的色氨酸生产方法有化学合成法转化法及微生物发酵法近年来随着代谢工程在色氨酸菌种选育中的成功运用微生物发酵法逐渐成为主要的色氨酸生产方法系统综述了微生物发酵法生产色氨酸所涉及的代谢工程策略包括生物合成色氨酸的代谢调控机制以及途径改造的措施和效果此外还探讨了 )$ 色氨酸未来的发展前景关键词 )$ 色氨酸代谢工程微生物发酵法中图分类号 *%& )$ 色氨酸对人和动物的生长发育新陈代谢具有重要的生理作用被广泛应用于医药食品与饲料等行业目前全世界对色氨酸需求每年达到一万吨以上而实际产量只有多吨良好的市场前景使色氨酸生产技术研究受到了广泛的关注 )$ 色氨酸的生产方法有化学合成法转化法和微生物发酵法化学合成法由于存在工艺复杂产品成分复杂等原因已逐渐被淘汰而转化法酶转化法和微生物转化法虽然已经实现了工业化但仍然存在原料昂贵低转化率等问题 $# 以葡萄糖等廉价原料来生产色氨酸的微生物发酵法是最早开发的色氨酸生产方式但这种方法在很长的一段时期内都无法实现工业化究其原因主要是在早期的研究中研究者单一依靠传统的化学或物理诱变方式选育色氨酸生产菌株但是色氨酸的生物合成途径存在极其复杂的调控机制仅通过诱变方式无法根除其所有的代谢调控作用因此在这种情况下研究者无法获得优良的菌株用于 )$ 色氨酸生产近年来随着 +,' 重组技术的快速发展特别是代谢工程育种方式的兴起研究者逐渐选育出一批高产的色氨酸生产菌株大幅提高了微生物发酵法生产色氨酸的效率使其成为工业上主要的色收稿日期 $ $ 修回日期 $ $# 国家 %! 计划 &'' # 国家杰出青年基金! "!& 资助项目通讯作者电子信箱 ( 氨酸生产方法 "$% 本文系统综述了微生物发酵法生产 )$ 色氨酸所涉及的代谢工程策略并探讨了其未来的发展趋势 )$ 色氨酸的微生物合成机制微生物合成色氨酸的代谢途径目前主要用于生产色氨酸的微生物种类是大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌此外还有黄色短杆菌枯草杆菌酵母等其他菌种 & 各种微生物的色氨酸合成机制略有差异以大肠杆菌为例色氨酸合成途径分为中心代谢途径芳香族氨基酸共同途径和色氨酸分支途径三个部分中心代谢途径指以葡萄糖为起始物经磷酸戊糖 -./ 途径的赤藓糖 0# 0 磷酸 1#/ 和糖酵解 1./ 途径中的磷酸烯醇式丙酮酸 /1/ 二者缩合形成 0 脱氧 $$ 阿拉伯庚酮糖酸 $ $ 磷酸 +'-/ 的过程共同途径指从 +'-/ 开始经莽草酸 - 到达分支酸 -' 的过程余下的从 -' 至色氨酸部分则称为色氨酸分支途径图目前关于色氨酸的代谢工程研究大多集中在共同途径和色氨酸分支途径的改造上微生物合成色氨酸的调控机制色氨酸的微生物合成代谢存在复杂的调控机制从而严格控制着色氨酸的合成限速酶的反馈抑制色氨酸的合成代谢中存在两个明显的限速酶 +'-/ 合成酶和邻氨基苯甲酸 ', ' 合成酶图 +'-/ 合成酶催化中心代谢途

2 ! 中国生物工程杂志 2,! 图大肠杆菌色氨酸的合成途径及相关调控!"#$"%&# ', ' 邻氨基苯甲酸 3 +4/ " 0 磷酸 0 0 脱氧核酮糖 0 0 邻羧基苯胺 0 $ $ ( "$797 -' 分支酸 398 +'-/ 0 脱氧 $+$ 阿拉伯庚酮糖 0 0 磷酸 $( 6 $($35$ 79 $ 脱氢莽草酸 $((39:8 1#/ # 0 磷酸赤藓糖 3 39 #$797 ;)' 叶酸!/! 0 磷酸葡萄糖 9!$797 -// #$ ( # 0 羟苯基丙酮酸 / 吲哚 0 0 甘油磷酸 ( $ )$/ )$ 苯丙氨酸 )$7 )$ 37 )$ 色氨酸 )$3 77 )$3 )$ 酪氨酸 )$ 39.'*, 甲萘醌 8 /1/ 烯醇式丙酮酸 //' 预苯酸 73 7 // 苯丙酮酸 /4'' 磷酸核糖基邻氨基苯甲酸 / 葡糖磷酸转移酶系统 / 4 丙酮酸莽草酸 9:8 / 莽草酸 0 0 磷酸 9:8 $797 * 泛醌 5 径中的 /1/ 和 1#/ 生成 +'-/ 严格控制着由中心代谢途径进入芳香族氨基酸共同途径的碳流量大肠杆菌的 +'-/ 合成酶由基因和编码的个同工酶组成且这个同工酶的酶活性分别受到酪氨酸苯丙氨酸和色氨酸的反馈抑制而在谷氨酸棒杆菌里只存在两种 +'-/ 合成酶分别由和编码 ', ' 合成酶则负责催化共同途径的末端产物 -' 生成 ', ' 从而进入色氨酸分支途径 ', ' 合成酶由基因编码酶活性受到终端氨基酸色氨酸的反馈抑制关键酶的转录调控除酶活性受到反馈抑制作用外一些关键酶的转录表达水平同样受到终端氨基酸的调控大肠杆菌中从分支酸到色氨酸的合成是由色氨酸操纵子完成的在色氨酸操纵子的上游存在一个基因其编码阻遏蛋白参与色氨酸操纵子的转录调控当胞内色氨酸的浓度高于某一阀值时在阻遏蛋白的作用下操纵子的转录则受到阻遏此外色氨酸操纵子的转录还受到衰减子序列的调控色氨酸操纵子序列中在结构基因之前有一段由! 核苷酸组成的前导序列在转录过程中当胞内色氨酸达到一定浓度时这段核苷酸序列的二级结构则发生变化进而阻止操纵子的继续转录转运途径调控培养液中的色氨酸被微生物转运至胞内进行吸收利用是由特定的转运系统进行控制的在大肠杆菌中个色氨酸转运基因和调控着色氨酸由胞外向胞内的转运图其中和基因分别编码色氨酸的高亲和性和低亲和性色氨酸通透酶均专一性调控色氨酸由胞外向胞内的吸收而由基因编码一种跨质膜双向运输芳香族氨基酸通透酶除调控色氨酸的吸收外还参与调控苯丙氨酸和酪氨酸的吸收但在谷氨酸棒杆菌中色氨酸的吸收则仅由基因蛋白调控 # 其它调控机制除上述调控机制外色氨酸合成代谢还存在一些其它的重要调控机制例如微生物还通过色氨酸降解反应以及众多竞争途径来调节色氨酸的合成大肠杆菌的基因编码色氨酸酶虽然在高浓度的丙酮酸和氨条件下该酶能有效地催化丙酮酸吲哚和氨合成色氨酸但在正常情况下它只发挥降解色氨酸生成丙酮酸吲哚和氨的作用阻碍色氨酸的积累因此失活基因有利于大肠杆菌积累更多的色氨酸 # 此外在色氨酸合成途径的关键节点还存在众多的竞争途径进一步削弱流向色氨酸合成途径的碳流量例如对于共同途径的末端产物 -' 除参与色氨酸的合成外还是另外两种芳香族氨基酸苯丙氨酸和酪氨酸的共同底物此外它还参与叶酸甲萘醌和泛醌等的生物合成 &

3 ! 赵志军等微生物发酵法生产 )$ 色氨酸的代谢工程研究应用代谢工程改造 )$ 色氨酸合成途径抗反馈抑制作用酶的筛选抗反馈抑制作用突变酶的获得是微生物积累色氨酸的先决条件在野生型大肠杆菌的无机培养过程中和同工酶的酶活分别占 +'-/ 合成酶总酶活的 %< 和 < 而同工酶仅占约总酶活的 < 因此在芳香族氨基酸的菌种选育研究中大多数研究者通过筛选抗反馈调节突变的和的基因和来解除 +'-/ 合成酶的反馈抑制作用到目前为止许多抗反馈调节的 +'-/ 合成酶基因已经被报道其中抗反馈抑制的同工酶的突变位点有第 #% 个氨基酸残基脯氨酸突变为亮氨酸 /3 #% ) 第 " 个氨基酸残基谷氨酰胺突变为异亮氨酸 ", 末端第 % 个氨基酸残基天冬酰胺突变为赖氨酸 '9 % ) 9 & " 抗反馈抑制的同工酶的突变位点有第 " 个氨基酸残基脯氨酸突变为亮氨酸 /3 " ) 第 #! 个氨基酸残基天冬氨酸突变为天冬酰胺 '97 #! '9! 在抗反馈调节 ', ' 合成酶的筛选方面 3 等通过化学诱变及序列分析的方法获得了一系列!"#" $%& '&' 来源的抗反馈调节 ', ' 合成酶基因中国军事医学科学院放射与辐射医学研究所的李剑欣依据这一研究成果通过定点突变大肠杆菌 ', ' 合成酶亚基第 # 个氨基酸残基 3 为 / 获得了完全抗色氨酸反馈抑制的 ', ' 合成酶 % 共同途径及色氨酸分支途径的改造芳香族氨基酸共同途径和色氨酸分支途径的改造主要涉及抗反馈调节作用酶 +'-/ 合成酶 ', ' 合成酶和其它关键酶基因色氨酸操纵子 # 等的克隆表达以及基因组上阻遏蛋白基因和色氨酸酶基因的失活等 &% 年 '5 等将含有色氨酸操纵子的组成型质粒 /9 37" 解除反馈调控转化至和双基因失活的宿主菌中通过向培养基中流加 ', ' 发酵菌株可以积累! =) 的色氨酸在此基础上经过多轮化学诱变菌株的产色氨酸能力提高至 =) 通过在发酵中期添加适量的表面活性剂 )! 最终色氨酸产量提高至 "# " =) " 这是目前文献报道中大肠杆菌产色氨酸的最高产量年 +( 等将含有色氨酸操纵子解除反馈抑制解除反馈抑制和 # 基因的质粒 71 转化至和 # 基因失活的抗 ', ' 的突变宿主菌中通过优化发酵过程中葡萄糖的流加速率使色氨酸产量达到 # =) 这是在不添加任何前体物的情况下文献报道的大肠杆菌产色氨酸的最高产量国内开展色氨酸代谢工程育种的研究较晚李剑欣 % 年在质粒 72 中引入解除反馈调控的和 371+ 基因并转化至已敲除和基因的大肠杆菌 $ 中摇瓶发酵后仅产色氨酸!% =) 在谷氨酸棒杆菌的色氨酸菌种选育研究中 & " & 年 - 等获得一个酪氨酸和苯丙氨酸缺陷型菌株 &#"! 通过多次诱变筛选后仅能积累 > 0 # =) 的色氨酸但以此为基础 && 年 9 8 等在菌株中引入质粒 7?&& 共表达已解除反馈调控的 +'-/ 合成酶基因和色氨酸操纵子结果色氨酸的产量大幅提升至 # =) 且伴随吲哚的积累 &&# 年 : ( 等在质粒 7?&& 中进一步扩增了丝氨酸合成代谢中的关键酶基因 # 消除了吲哚的积累将色氨酸的产量进一步提高至 " =) 在国内年西北大学 0 % 产色氨酸 % =) 后经多次诱变获得了酪氨酸和苯丙氨酸双缺陷型菌株 $! 摇瓶发酵 & 产色氨酸 " =) ' 中心代谢途径的改造在共同途径和色氨酸分支途径改造之后优化中心代谢途径从而增加色氨酸前体物 /1/ 和 1#/ 的供应量促进中间关键产物 +'-/ 的生物合成成为进一步研究的重点如图所示中心代谢途径中 /1/ 的消耗主要来源于菌体利用磷酰基转移酶 / 系统转移葡萄糖至胞内时消耗的等量 /1/ 以及 /1/ 通过丙酮酸激酶 $ 和 $ 转化为丙酮酸 / 4 进入 ' 循环或者通过磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶催化合成草酰乙酸直接参与 ' 循环 /1/ 的积累主要通过 /1/ 合成酶催化一部分丙酮酸重新转化为 /1/ 此外研究发现碳贮存调控因子的失活也有助于 /1/ 的积累与 /1/ 相比 1#/ 没有竞争途径分流转醛酶 " 和转酮酶都可以催化 1#/ 的合成反应在大肠杆菌里转酮酶有两个同工酶分别由和编码其中同工酶对 1#/ 的合成反应起主要作用在优化中心代谢途径的相关文献中研究者主要通过分析菌体内 +'-/ 合成量的变化来鉴定途径改造

4 % 中国生物工程杂志 2,! 图大肠杆菌合成色氨酸的中心代谢途径示意图!" # ""!" " #& "#&!" 1#/ 3 39 #$797 # 0 磷酸赤藓糖 ;!/ 39!$ 797! 0 磷酸果糖 ' / 0 磷酸甘油醛 3 (( $ 797!/! 0 磷酸葡萄糖 9!$797 /1/ 烯醇式丙酮酸 !/$! 0 磷酸葡萄糖酸!$ 797 / 葡糖磷酸转移酶系统 / 4 丙酮酸 7 3 4"/ " 0 磷酸核酮糖 359 "$797 45"/ " 0 磷酸核糖 359 "$ 797 A"/ " 0 磷酸木酮糖 69 "$797 ( / 0 磷酸景天庚酮糖 9 ( 79$797 的效果 ; 3 9 等 &&! 年通过突变失活大肠杆菌 / 系统 / 0 并设法使大肠杆菌采用半乳糖通透酶正常吸收葡糖糖结果使 +'-/ 的合成量提高了 & 倍 9 等 # 在考察丙酮酸激酶对 /1/ 积累的影响时发现单独敲除两个丙酮酸激酶同工酶基因 $ $ 中的任何一个都不会影响 /1/ 的积累但当 $ $ 个基因同时敲除时 /1/ 的代谢流明显增强 +'-/ 的产量较敲除前提高 " 倍在加强关键酶的表达强度方面 &&# 年 ) 等通过过量表达 /1/ 合成酶基因使胞内 +'-/ 浓度! 提高至原来的 & 倍而 /: 等同时过量表达已解除反馈抑制和基因使 +'-/ 的生成量接近了理论产量最大值 : ( 等! &&& 年将转酮酶基因 :' 插入至含有其它色氨酸关键酶基因的低拷贝质粒 7?&& 中并转化至谷氨酸棒杆菌 & % 中进行表达色氨酸产量较对照增加 "< 达到 "% =) 国内 % 年王静等将解除反馈调控的和 371+ 基因串联至载体 7 1 中同时将基因和串联至载体 7 ' 中两载体同时转化至已敲除和基因的大肠杆菌 $ 中摇瓶发酵色氨酸产量为 =) ( 转运途径的改造研究表明微生物体内的色氨酸浓度越高色氨酸 " 合成所受到的调控作用就越强因此通过转运途径将微生物体内合成的色氨酸及时转运至胞外或者阻止胞外积累的色氨酸转运至胞内将有助于色氨酸的生物合成目前已证明在微生物中确实存在将色氨酸转运至胞外的调控系统但其具体基因仍未得到完全确定 % 而在大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌中控制色氨酸吸收的基因已经分别被确定并应用于色氨酸的菌种选育在大肠杆菌方面 9: 等 && 年详细考察了控制色氨酸吸收的个转运基因的失活对菌体吸收色氨酸的影响结果表明将大肠杆菌在酸水解酪蛋白的培养基培养基因的失活对色氨酸的吸收影响最大次之的失活对色氨酸的吸收基本没有影响但当大肠杆菌在缺少 )$ 酪氨酸和 )$ 苯丙氨酸的培养基中培养时的失活则对菌体吸收色氨酸产生重要影响在谷氨酸棒杆菌方面 &&" 年 : ( 等 & 以色氨酸高产菌株 &" 为出发菌株通过诱变获得了株色氨酸吸收能力受损的突变菌经发酵培养色氨酸产量较对照菌分别提高了 < B < ' 色氨酸前体物的代谢工程研究在色氨酸的生物合成途径中存在 0 脱氢莽草酸 +-- 以及 ', ' 等一系列具有重要工业价值的中间产物随着代谢工程在微生物合成色氨酸中的深入研究这些中间产物的代谢工程研究也逐渐得到重视对于 +- 和 - 的生物合成主要是通过中心代谢途径改造增加前体物 /1/ 和 1#/ 的供应以及阻断芳香族氨基酸共有途径中目标产物之后的反应而实现图例如 ) 等通过在失活的大肠杆

5 ! 赵志军等微生物发酵法生产 )$ 色氨酸的代谢工程研究 & 菌 ) 中过量表达和使菌株可以生产!& =) 的 +- 而.3C D 等在 / 系统缺陷但可以正常吸收葡糖糖的大肠杆菌 / 中过量表达和 53 基因发酵结果表明菌株在以葡萄糖和甘油作为混合碳源的培养基中可以同时获得较高的 +- 和 - 产量和得率 (3 等在基因和失活且 / 系统缺陷的大肠杆菌 $ 中共表达大肠杆菌来源的 53 和基因以及 () &"& 来源的 *" 和 *" 基因发酵后莽草酸的产量可达 %=) 此外 # ' 等和 19 等在研究中也进行了类似的基因操作其中 19 等还考察了基因 $ 或 $ 失活对 - 以及其他芳香族化合物生物合成的影响邻氨基苯甲酸是另外一个受到关注的色氨酸中间产 " 物 ( 39 等通过在基因发生无义突变 / 系统缺陷的大肠杆菌? && / 0 中过量表达 *" 和 *" # 个基因发酵 # ', ' 的产量达到 # =) ( 展望代谢工程在色氨酸菌种选育研究中的应用为理性改造色氨酸生物合成途径提供了必要的条件和丰富的手段大幅提升了微生物发酵法的色氨酸生产效率但目前仍存在一定程度的局限性首先代谢工程的作用主要是基于已知的色氨酸合成途径及其调控机制的相关信息理性有效地改造色氨酸的合成代谢但前期的研究表明鉴于色氨酸生物合成的复杂性目前仍存在许多色氨酸合成途径的重要酶及其调控机制未能完全阐明从而影响了代谢工程的途径改造效果其次目前代谢工程应用于色氨酸菌种选育研究的内容和手段仍较为单一在大多数色氨酸高产菌株的选育过程中研究者将代谢工程研究的重点集中在芳香族氨基酸共同途径及色氨酸分支途径中一些关键酶抗反馈调控突变体的筛选及其在质粒中的共表达但值得注意的是色氨酸的合成途径涉及众多的分支途径仅针对特定分支途径中的几个基因进行克隆表达往往不能显著改变整个代谢途径的通量甚至还有可能造成某些中间产物的过多积累进而损伤菌体细胞近年来 +,' 重组技术以及转录组学代谢组学等组学分析技术的飞跃式发展为微生物合成色氨酸的代谢工程研究带来了前所未有的机遇在产色氨酸主要微生物的基因组全序列已经公布的情况下 +,' 重组技术的不断进步使研究者可以着眼于整个色氨酸合成代谢的优化从而在基因组上直接完成诸如抗反馈调节突变酶的构建关键酶表达量的增加旁路竞争途径的阻断等一系列基因遗传修饰将极大提升代谢工程在色氨酸菌种选育研究中的作用效率另一方面高通量的生物信息分析是代谢工程的关键因素之一随着各种组学分析技术的逐渐成熟研究者可以借助高通量的生物信息分析从整个细胞代谢的角度全面理解色氨酸的代谢调控机制准确定位影响色氨酸产量提高的各种限制性因素进而完成更加有效的分子改造循环往复最终得到更加优良的色氨酸生产菌株目前代谢工程在色氨酸菌种选育研究中的应用仍处于初级阶段现有的色氨酸高产菌株在选育过程中除使用理性分子改造的手段外还大量采用了随机诱变的非理性途径改造方式从而不可避免地引起一些不确定的突变甚至是负突变近年来在微生物合成苏氨酸丙氨酸等其他氨基酸的代谢工程研究中借助转录组学等分析技术定位氨基酸合成的限速因素进而完全采用理性分子改造的方式构建了遗传背景确定的氨基酸高产菌株!$ 总之虽然目前代谢工程技术在色氨酸菌种选育中的应用仍然存在许多不足之处但代谢工程确实为发酵法高产色氨酸提供了巨大的推动力随着研究的深入必然会为整个色氨酸产业的发展做出更大的贡献参考文献 )5 33? D 73( 8 (9( ( ( '77(. 35 ( "!& $% ( ' ( '8 3 8 &"" " " $ "& 韦和平吴梧桐以 )$ 半胱氨酸和吲哚酶法合成 )$ 色氨酸药用生物技术 # & $&&? - /?? /38 #& $&& # 张素珍刘英昊用北京鼓棒杆菌细胞转化生产 )$ 色氨酸微生物学报 &&!&$ ) - '. 35 &&!&$ " 'D 8 9: - E: $73( )$ D '77(. 35 ( && &# # $#!! : ( (

6 # 中国生物工程杂志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李剑欣大肠杆菌色氨酸生物合成分支途径调控研究北京军事医学院科学院放射医学研究所 )@A ( / %#& %& "& ' ( ( 9 4(. ( & - -,: $ # #&' *"' & ' )' 33 ( 893 & " & $ : (.,:9 ; 38 73( $ # #&' *"' & ' 8(( 9 3 $ ( 893 &&# "% #! # 陈俊峰苏丽娜王璋等从土壤中分离 )$ 色氨酸生产菌株及其高产诱变选育的研究食品与发酵工业 ),? ;( ( ; 38 ( 93 9 $# 59, - 48 / ( %#& %& &&" #& &&! ; 39, A@ 3 ' /33 73( 3887 (9 %#& %& "&, 3 &&! #"! $! # 9 3 ' ' ( %#& %& 3 ( ( &&! # $" " )@ -'E /: 4 ' %#& %& "& ' 9, 3: ' ( 8 9 &&# #" $#! /: %#& %& "& ( 3 3( '77( ( &&#! & 王静于金龙张婷等大肠杆菌生物合成中心代谢途径的改造及其对工程菌色氨酸产量的影响中国医药生物技术 % ) 9. ( % & $& % +39 :2 '3 ) 2 9:.,-- 38 %#& %& "& (9 ; )39 " $% & : ( ( $ # #&' *"' & ' ) 9 ( 893 &&" "&%!$! ).:. +39 ; ($ $((39:8( 9 385%#& %& "& &&&!#!$.3C D + '(4-3 ( D D 9 ( ( 38

7 ! 赵志军等微生物发酵法生产 )$ 色氨酸的代谢工程研究 # 87 (9 %#& %& "& 93 : ( ; % +39. / ( :8( /3 & %%$%# ) :8( 73( %#& %& "& ( ( % % # 19 ' ( ( ' ( 9:8( ( %#& %& "& 93 : ( ; & " ( 39$- 3( D2 1 5($489' / %#& %& "&. 35 ; & % &! ) %#& %& "& 3 )$3 73( #& ) %#& %& "& 3 73( )$ 59 ( ( 9 : : 98 /3 ( 9, ' ( 8 9 # & & )"#& *""!# # ) &#&""# -'E $ -1,? -1,@ )533;( 39? 6 # ( )533 ( 39? 6 # + # )$3 77 )$ 37 9 (9 ( ( 8( ( 738 ( ( D 8 = ( (9 3( 93 73( )$ ( ( )$ 37 73( )$ 37 73( 93 ( ( 8( )$ ; )$ 37 73( 9 9(9 9 (," $ )$

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌

! 中国生物工程杂志 2,! 图 大肠杆菌 色氨酸的合成途径及相关调控!"#$"%&# ', ' 邻氨基苯甲酸 3 +4/ " 0 磷酸 0 0 脱氧核酮糖 0 0 邻羧基苯胺 0 $ $ ( "$797 -' 分支酸 398 +'-/ 0 脱氧 $+$ 阿拉伯庚酮糖

! 中国生物工程杂志 2,! 图大肠杆菌色氨酸的合成途径及相关调控!"#$"%&# ', ' 邻氨基苯甲酸 3 +4/ " 0 磷酸 0 0 脱氧核酮糖 0 0 邻羧基苯胺 0 $ $ ( "$797 -' 分支酸 398 +'-/ 0 脱氧 $+$ 阿拉伯庚酮糖