期何勇李战宁耿希刚依达拉奉对缺氧复氧损伤诱导心肌细胞凋亡的影响缺血性心脏病是临床上常见的疾病之一心肌缺血再灌注损伤 "025""56!821 2!5.** 是缺血性心脏病常见的一种病理生理改变缺血后的再灌注不仅可以引起心肌能量代谢障碍同时再灌注还可以引起活性氧 -

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礼灵宫
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1 第卷第期年月西安交通大学学报医学版!"#$## %&'& & 依达拉奉对缺氧复氧损伤诱导心肌细胞凋亡的影响何勇李战宁耿希刚西安交通大学医学院第一附属医院心脏外科陕西西安 # 武警陕西总队医院心脏外科陕西西安 $ 摘要目的观察依达拉奉 %&' 对缺氧复氧损伤诱导的原代培养的新生大鼠心肌细胞凋亡的影响方法用原代培养的新生大鼠心肌细胞在体外建立心肌缺血再灌注损伤模型分为正常组组和 %&' 预处理组应用 ( 比色法检测细胞存活率 &')* 染色法和流式细胞仪 )* 标记法检测细胞凋亡率同时检测乳酸脱氢酶 +& 肌酸激酶和超氧化物歧化酶,-& 的活性以及丙二醛.&' 活性氧 -, 和还原型谷胱甘肽氧化型谷胱甘肽 /,/,,/ 含量结果组心肌细胞存活率明显下降凋亡率明显升高 $ 01+ 的 %&' 预处理明显抑制处理诱导的细胞存活率下降和凋亡率升高 $ 同时组 +& 和的活性以及.&'-,/, 含量和 /,/,,/ 比值显著升高 $ 而,-& 的活性明显下降 $ 与组相比 %&' 预处理后 +& 与的活性.&'-,/, 含量和 /,/,,/ 比值明显降低 $,-& 的活性明显升高 $ 结论 %&' 预处理可以减少诱导的心肌细胞凋亡可能与其抗氧化作用有关关键词依达拉奉心肌细胞缺血再灌注损伤凋亡氧化应激超氧化物歧化酶,-& 丙二醛.&' 活性氧 -, 中图分类号 # 文献标志码 ' 文章编号 #($$!!" %1 +*2 /%3/ 42 &"50"1652,!5"5"7258'622"182."2, :211 ; 2" #&"50"1652,!5"5 /""518216'50")12"715"816,2)512"429 $2 #$%&'#&#""#" () #"#"#&! #"#)*+, ))#-" ) #"#"# (+ &#,""") ("./0 (&1,"#" #)), 11 *(&1, "#"/0",#) &!,#" "/# -1""")$/#,#)"" "!/0"# #($""#""" 2$2$$2,"&1,# "#"(,#"&$&*),",##)#"# "##"# &$&1)") /"1##!/0($"2$,2$2$$2,# #" ( &$&,$/#,"#" (#)",) &$&./0( /"1##!/0($"2$, 2$2$$2,# "#"#)"( &$,# #$/#&$&."*)#"# *"#") #"#"#,#*") ) "& '% " #"##)*"$/!/0($ 收稿日期修回日期 ( 通讯作者耿希刚教授博士生导师 %02"2#10 作者简介何勇男汉族主治医师研究方向心肌缺血 %02$#$$#10 网络出版时间 ( 网络出版地址 2"08"2#(0!"!

2 期何勇李战宁耿希刚依达拉奉对缺氧复氧损伤诱导心肌细胞凋亡的影响缺血性心脏病是临床上常见的疾病之一心肌缺血再灌注损伤 "025""56!821 2!5.** 是缺血性心脏病常见的一种病理生理改变缺血后的再灌注不仅可以引起心肌能量代谢障碍同时再灌注还可以引起活性氧 -, 的大量产生钙超载炎症因子的损伤心肌细胞凋亡和血管内皮功能障碍等病理改变心肌损伤进一步加重目前临床上针对.** 的治疗措施主要有药物治疗介入治疗和动脉搭桥术等其中针对.** 的药物主要有硝酸酯类药物受体阻滞剂钙拮抗剂心肌代谢药抗血小板药物和中药这些药物都是针对缺血再灌注损伤的各种机制而发挥治疗作用但均未取得理想的治疗效果近年来研究发现依达拉奉 "5 1"%&' 对心肌缺血性损伤具有一定的保护作用 %&' 是一种新型的自由基清除剂目前已被广泛应用于脑梗死等缺血性脑血管疾病的治疗并取得了良好的临床治疗效果其主要机制有增强脑组织中超氧化物歧化酶,-& 活力降低脂质过氧化产物丙二醛.&' 含量从而清除氧自由基抗脂质过氧 ( 化减轻再灌注损伤保护脑细胞本实验通过对体外培养的新生大鼠心肌细胞缺氧复氧处理模拟.** 进而观察 %&' 预处理对诱导的心肌细胞凋亡的影响为 %&' 在.** 治疗的临床应用奠定实验基础 ( 材料与方法 (( 实验动物和试剂出生第天的,5!" &",& 新生大鼠雌雄不限由西安交通大学医学院实验动物中心提供 &.%. 培养基美国 /21 公司胎牛血清兰州民海公司型胶原酶美国 /21 公司 &98 液美国 1" 公司 %&' 注射液南京先声东元制药有限公司 ( 试剂盒日本 &121 公司 &')* 美国,2 0 乳酸脱氢酶 +& 和肌酸激酶检测试剂盒北京中生生物工程高技术公司,-& 和.&' 检测试剂盒南京建成生物工程研究所 -, 还原型谷胱甘肽氧化型谷胱甘肽 /,/,,/ 检测试剂盒江苏南通碧云天生物技术研究所 () 大鼠心肌细胞原代培养将,& 新生大鼠心脏开胸取出后置于预冷的 &98 液中用眼科剪将心脏组织剪成约 00 的小块加入 + 的型胶原酶孵育 02 后用含 0++ 的胎牛血清的 &.%. 培养基终止消化加入 + 的 &3' 酶反复吹打用目的不锈钢滤网过滤收集单细胞悬液经 502 离心 $02 后弃上清用含 0++ 胎牛血清和双抗青霉素链霉素的 &.%. 培养基将细胞重悬接种于培养瓶中置于含有 $0++- 的孵箱中孵育 02 后去除贴壁的成纤维细胞将细胞接种于新的培养瓶或者培养板中继续孵育后换液对细胞进行鉴定接着后续实验 &')* 染色实验中将细胞接种于多聚赖氨酸包被的玻璃盖玻片的培养板中 (*+ 心肌细胞,' 损伤模型的建立参照程何祥等的缺氧制作方法首先用高纯度的氮气 $ 0++ 饱和 &98 液即为缺氧液用纯氧 $ 0++ 饱和含有 0++ 胎牛血清的 &.%. 培养液通气时间 02 即为复氧液心肌细胞培养后用缺氧液置换正常培养液且用高纯度的氮气冲洗培养瓶将其中的气体充分置换然后培养瓶置于厌氧工作站内含 $0++ 的 3 和 $0++ 的 - 孵育即为心肌细胞缺氧缺氧处理后用复氧液置换缺氧液并置于含 $0++ 的 - 孵箱内孵育即为心肌细胞复氧 (- 实验分组分为正常组组 %&' 组其中正常组常规培养 #%&' 组用 %&' 预处理后再进行处理各组在干预 # 后收集细胞进行相应实验在用 ( 试剂盒检测损伤时 %&' 对心肌细胞存活率的影响时 %&' 浓度选用 01+ 筛选出有效作用浓度其他实验中 %&' 用筛选出的其中一个有效浓度 01+ (. 细胞存活率的检测将心肌细胞接种于 # 孔培养板中 + 孔在相应的处理完成后每孔加入 + 的水浴预热的 ( 溶液孵箱中孵育用酶标仪记录 $ 0 波长处的吸光值每组设置个复孔计算细胞存活率 < 处理组正常对照组 = 重复次 (/ 心肌细胞凋亡检测分别用 &')* 染色法和 )* 标记流式细胞仪检测法检测 &')* 染色法用预冷的 01+ )>, 将细胞爬片清洗次 + 的多聚甲醛固定 $02 后再用 )>, 清洗爬片次每次 $02 0+ 的 &')* 避光孵育 02 后用 )>, 清洗次 $0++ 的甘油缓冲液封片置于荧光显微镜下用 $ 0 波长的激发光进行观察每组取张爬片每个爬片取个随机视野 = 计算出每个视野下的细胞凋亡率 < 凋亡细胞数细胞总数 = )* 标记流式细胞仪检测法用 $+ 的胰蛋白酶分别消化各组心肌细胞并用含 0++7>, 的 &.%. 培养基终止消化重悬细胞后取 0+ 的细胞!"!

3 西安交通大学学报医学版第卷悬液细胞密度大于 = +502 离心 $02 弃上清用预冷的 01+)>, 将细胞清洗后用预冷 0++ 的乙醇重悬细胞并置于固定上流式细胞仪进行检测前离心取出固定液并用预冷的 01+)>, 将细胞清洗次收集细胞加入 $0+ 的 )* 染液和 3' 酶各 + 室温避光孵育 02 用流式细胞仪进行检测 &3' 组方图中二倍体前面出现的一个明显的亚二倍体峰即为凋亡峰用此部分所占的百分比来反映心肌细胞凋亡的百分率每组设置个复孔重复次 (*01,% 活性以及 '%#%, 和 %% 含量的测定处理完成后收集细胞培养上清液 $502 离心 02 收集上清以酶动力学法测定 +& 和活性黄嘌呤氧化酶法测定,-& 活性硫代巴比妥酸法测定.&' 含量 /, 和 /,,/ 含量在收集细胞后用内 &?3> 法检测细胞内 -, 含量用荧光探针 &7&' 法检测 ( 统计学处理用,),, 软件对数据进行分析和处理表示各组资料运用单因素方差分析并进行 +,& 检验以 $ 为差异具有统计学意义 ) 结果 )( 依达拉奉对抗缺氧复氧诱导的心肌细胞损伤 ( 结果显示处理组心肌细胞存活率明显下降 (@## 与正常组相比差异具有统计学意义 $ 与组相比 01+ 的 %&' 预处理可以明显对抗引起的细胞存活率降低 ($(@ 差异具有统计学意义 $ 但 01+ 或 01+ 的 %&' 预处理对引起的细胞存活率降低无显著影响 $ 图图 ( 依达拉奉预处理对,' 诱导的心肌细胞损伤的影响 72%6"816"51"5"5"0"1 125"1 "212!"2!516521"8 与正常对照组相比 $ 与组相比较 $ )) 依达拉奉减少缺氧复氧诱导的心肌细胞凋亡 &')* 染色结果显示正常细胞核被染成均匀蓝色荧光凋亡的细胞由于核浓缩或碎裂核染色质呈新月形圆形小体或者不规则形状且染色加深呈现出不均一的蓝白色荧光统计结果显示与正常对照组相比组心肌细胞凋亡率明显升高达 #@($ $ 而与组相比 01+ 的 %&' 预处理组心肌细胞凋亡率明显降低 $@ 差异具有统计学意义 $ 图 ' 图 & 流式细胞仪凋亡检测结果同 &')* 染色法图 % )*+ 各组心肌细胞 1,#% 和 '% 含量活性的变化组心肌细胞与正常对照组比较 +& 和的活性以及.&' 和 -, 的含量显著升高而,-& 的活性明显下降差异均具有统计学意义 $ 与组相比 01+ %&' 预处理后 +& 和活性以及.&' 和 -, 含量均明显下降 $ 而,-& 的活性明显升高差异具有统计学意义 $ 表 )*- 各组心肌细胞 %,%% 的代谢变化心肌细胞经损伤后 /, 含量和 /,/,,/ 比值明显下降与正常组相比差异有统计学意义 $ 而 /,,/ 含量明显上升与正常对照组比较差异有统计学意义 $ 与组相比 01+ %&' 预处理后 /, 含量和 /,/,,/ 比值均明显升高 $ 而 /,,/ 含量明显下降差异均具有统计学意义 $ 表 + 讨论 %&' 是一种新型的临床公认的使用有效的自由基清除剂目前还没有其他自由基清除剂药物能够超越其自由基清除功能在临床上 %&' 主要应用于神经系统疾病其可以清除机体内活性氧分子减少脂质过氧化物产生抑制血管内皮细胞受损抑制脑水肿和迟发性神经细胞死亡等并能改善神经症 ( 状此外由于 %&' 可清除自由基和减轻缺血再灌注损伤其适应症可以扩大到肺肝脏肾脏小 # 肠和心肌缺血再灌注等 '/* 等在大鼠研究中发现 %&' 可以通过抗脂质过氧化阻止.** 后心脏功能衰退和致命性心律失常的发生 *%/'.* 等研究发现 %&' 可以通过抗坏死作用减轻蒽环类抗生素诱导的心肌细胞毒性 -3-/* 等研究发现 %&' 可以通过减少兔心肌过氧化物和羟基以及增加一氧化氮 3- 进而减少.** 后心肌梗死体积促进心脏功能恢复和左心室重构在.** 过程中心肌细胞凋亡是一个非常重要的环节但是 %&'!"!

期何勇李战宁耿希刚依达拉奉对缺氧复氧损伤诱导心肌细胞凋亡的影响图 ) 依达拉奉预处理减少,' 诱导的心肌细胞凋亡率 72%51"5"5"0""5"8"1182816521"86"5125"1"21 2!

%6"816"51"5"5"0"1 "A0"222"82 521"86"5125"1"21 5"0" @< 组别 +&;+ ;+,-&;0+.

%6"816"51"5"5"0"1 0"128016/,2 521"86"5125"1"21 5"0" @< 组别 /, 01+ /,,/ 01+ /,/,,/ 正常对照组 @# @# $@( 组 $@$ @ (@$ %&'01+ #@ ($@ $@( 与正常对照组相比 $ 与组相比较 $

4 期何勇李战宁耿希刚依达拉奉对缺氧复氧损伤诱导心肌细胞凋亡的影响图 ) 依达拉奉预处理减少,' 诱导的心肌细胞凋亡率 72%51"5"5"0""5"8" "86"5125"1"21 2!5 '>&')* 染色分别为对照组组 %&' 组 = 箭头示细胞凋亡 &&')* 染色统计结果 % 流式细胞仪检测凋亡统计结果与正常对照组相比 $ 与组相比较 $ 表 ( 依达拉奉预处理对缺氧复氧诱导的心肌细胞各种酶活性的影响?%6"816"51"5"5"0"1 "A0"222"82 521"86"5125"1"21 组别 +&;+ ;+,-&;0+.&' 01+ -, 正常对照组 $@ #@ 组 #@$( $@( $#@($ (@$ (#@(# %&'01+ $$@$# (@ ($@# (@ #$@( 与正常对照组比较 $ 与组比较 $ 表 ) 依达拉奉预处理对缺氧复氧诱导的心肌细胞 %, 代谢的影响?%6"816"51"5"5"0"1 0"128016/,2 521"86"5125"1"21 组别 /, 01+ /,,/ 01+ $@( 组 (@$ %&'01+ #@ ($@ $@( 与正常对照组相比 $ 与组相比较 $ 对心肌细胞凋亡的影响尚无定论原代培养的心肌细胞可以保持其结构和功能上的某些特点如自发性节律搏动而且心肌细胞的培养具有简便可定量重复性好和不受神经体液因素影响等特点因此心肌细胞的原代培养技术已经被广泛地应用于心血管疾病发病机制药物治疗和心脏组织工程学等方面的研究因此用原代培养的新生大鼠心肌细胞通过缺氧复氧处理模拟.** 研究 %&' 预处理对诱导的心肌细胞凋亡的影响将对.** 的治疗有非常重要的意义本研究发现 %&' 预处理可以明显减少诱导的原代培养的新生大鼠心肌细胞的凋亡尽管实验对象和.** 模型选择不同但与吕 $$ 云波等的研究报道结果相一致是一种与 '?) 生成密切相关的激酶在肌!"!

5 西安交通大学学报医学版第卷酸与 '?) 之间的可逆性转磷酰基反应过程中起着关键性的催化作用进而调控细胞内的能量运转 +& 是一种糖酵解酶可以催化乳酸脱氢生成 ( 丙酮酸在心肌发生缺血损伤时机体内磷脂酶激活游离脂肪酸产生大量儿茶酚胺释放以及白细胞释放的自由基均能导致细胞质膜损伤并使膜的通透性增加进而引起心肌酶释放增加在实验室研究和临床应用中和 +& 是公认的对心肌缺血有诊断意义的酶这两种酶既可以作为判断心肌缺血的指标又可以反映损伤程度此外在.** 的病理发生过程中细胞内的有氧氧化呼吸链遭到破坏自由基清除系统如,-& 等活性降低产生大量的自由基如 - - 和 - 等 -, 破坏细胞膜上的不饱和脂肪酸引发脂质过氧化反应产生.&' 因此.&' 值可以间接反映机体各组织中细胞受自由基损伤的程度本实验结果显示心肌细胞经损伤后 +& 和活性及 -, 和.&' 含量明显升高而,-& 活性降低而 %&' 预处理可以降低 +& 和活性及 -, 和.&' 含量并升高,-& 活性与组比较其差异具有统计学意义 $ 还原型 /, 是广泛存在于细胞内的由个氨基酸组成的小分子肽其在抗氧化自由基清除维持细胞蛋白质结构和功能以及抑制细胞凋亡等方面都发挥着重要作用如 /, 与自由基或者重金属结合后可以把机体内有害或有毒物质转化为无毒的物质并排出体外因此 /, 的含量也是衡量机体抗氧化能力大小的重要指标之一 /,,/ 是 /, 的氧化形式在氧化剂作用下 /, 通过 /, ) 氧化成 /,,//,,/ 的量一般占总 /, 量的 /,,/ 通过 3'&) 供氢在 /, ) 和 / 作用下又还原成 /, 二者构成动态平衡从而构成有效的抗氧化系统本实验结果显示处理可以引起心肌细胞内 /, 含量明显减少而 /,,/ 的含量明显升高相应的 /,/,,/ 的比值也增加而 %&' 预处理可以是后心肌细胞内的 /, 含量明显升高并减少 /,,/ 的含量提高了 /,/,,/ 的比值提示 /, 抗氧化系统可能参与了 %&' 减少诱导的心肌细胞凋亡的保护作用目前的实验室和临床研究都表明 %&' 对自由基毒性损伤具有强大的抑制作用其可以减轻自由基引发的级联损伤临床上 %&' 已经应用于急性脑梗死治疗并取得一定的疗效而对于心肌缺血损伤的治疗尚处于动物试验阶段但随着对其机制研究的不断深入其将会在临床上呈现良好的应用前景参考文献 3(0' 04''.5!4''.5 $&! #"* #)+ )#####"" &$)1"#%#0#*& (.( 00&) #"#)* + " &0)1" ##*#(& 纪伟宁杨毅宁 & 心肌缺血 * 再灌注损伤治疗新进展 & 心血管病学进展 *$&.20! (0'4.!&." "## ##*"#" ) #"#" &1#($*(& $ 吕云波曾秋棠 & 依达拉奉对大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡的影响 & 实用医学杂志 (##*##& #502 ('00 $!0$0 &."* """#"##) #"#)* ""&1"* #)#$##*$& '2!'021$1.' &." "#) #"#")#"## ")" &1.)# #$*& ( 吴晋吴婷丁新生 & 依达拉奉对沙土鼠缺血 * 再灌注损伤后的脑保护作用机制的探讨 & 南京医科大学学报自然科学版 ##$#*#& 3.'2$50'28!&."##* )#-&1# /$( 1/& 程何祥张荣庆马颖艳等 & 牛磺酸对新生大鼠心肌细胞模拟缺血再灌注损伤中细胞凋亡的影响 & 心脏杂志 *$& 李彦王永玲李校等 & 改构型酸性成纤维细胞生长因子抑制新生大鼠心肌缺氧复氧模型细胞的凋亡 & 中国组织工程研究 #*#& 700'04.00(0!/$&* "")#""&1"# (#*& 江美芳利显民 & 依达拉奉在不同疾病的临床应用的研究进展 & 黑龙江医药 $*$& $.%.($'&#"#)##&4 ((*& $ 吴云良 & 依达拉奉对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响 & 中国现代医生 (*& # 张永明王禹刘秀华等 & 依达拉奉与缺血后处理对急性心肌缺血再灌注损伤的影响 & 中国康复理论与实践 ( *& 宋祖军马俊清余厚友等 & 依达拉奉预处理对心肌缺血 * 再灌注损伤大鼠的保护作用 & 医药导报 (#(*& ( 蔡小军陈艳俞云等 & 回心草对心肌细胞缺氧损伤的保护作用 & 中国实验方剂学杂志 ($*#& ' $'/ 700 &## "")"#"# "")&1#(*& 3$.(4$6(!0(4&0" #" &1) 4 $(#*& 编辑国荣!"!