第 29 卷第 4 期 2010 年 8 月 华中农业大学学报 JournalofHuazhongAgriculturalUniversity Vol.29 No.4 Aug.2010,527~532 葡萄糖酸钠对光滑球拟酵母 CCTCC M202019 能量代谢和丙酮酸积累的影响 * 周景文董志姚刘立明堵国成陈坚 ** 江南大学食品科学与技术国家重点实验室 / 工业生物技术教育部重点实验室, 无锡 214122 摘要 在好氧条件下, 光滑球拟酵母 (Torulopsisglabrata)CCTCC M202019 能够利用葡萄糖酸钠为唯一 碳源生长并积累少量丙酮酸在含有 90g/L 葡萄糖的培养基中,16h 时添加 10g/L 葡萄糖酸钠, 与 100g/L 葡萄糖作为唯一碳源的对照组相比, 细胞质量浓度 葡萄糖消耗速率 丙酮酸生产强度分别提高 7.96% 13.04% 和 32.81%; 其原因在于葡萄糖酸钠的添加, 使胞内 NAD + 浓度提高了 29.73%,NADH/NAD + 比值和 ATP 含量分别下降 26.89% 和 8.50%, 此变化显著缓解了 NADH 和 ATP 对于糖酵解途径的抑制作用, 从而显著加快糖酵解速率 关键词 光滑球拟酵母 ; 丙酮酸积累 ;NADH;ATP 中图分类号 Q754 文献标识码 A 文章编号 1000-2421(2010)04-0527-06 一些单糖的衍生物, 如山梨醇和葡萄糖酸, 具有 与葡萄糖类似的结构, 但氧化还原态不同微生物 可以利用这些单糖衍生物作为碳源和能源生长, 参 与氧化还原代谢过程所产生的 NADH 的量与葡萄 糖不相同, 导致胞内 NADH/NAD + 比例发生变化, 迫使微生物改变依赖于 NADH NAD + 以及 ATP 代谢途径的通量分布, 以维持细胞内的氧化还原平 衡 [1] 与葡萄糖相比, 还原态较高的底物, 如山梨醇 等, 可以产生更多 NADH; 而氧化态较高的底物, 如 葡萄糖酸盐等, 会降低胞内 NADH 含量 [2] NADH 是氧化磷酸化的重要原料, 是好氧微生物 合成 ATP 的主要能量来源 [3] NADH 和 ATP 水 平的提高均对中心代谢途径, 特别是糖酵解途径 具有显著的抑制作用调控底物的氧化还原状 态, 可以有效释放 NADH 和 ATP 对中心代谢途径 的抑制, 加速糖酵解途径, 促进产物的快速积 累 [4] [5] San 等在大肠杆菌 (Escherichiacoli) 的好氧 发酵中, 分别使用葡萄糖 山梨醇和葡萄糖酸作为碳 源调节胞内 NADH/NAD + 比例, 并研究 NADH/ NAD + 的比例变化对 E.coli 氧化还原代谢及其副产物形成的影响与葡萄糖为底物的糖酵解过程相比, 以山梨醇作为底物时, 每分子山梨醇会生成多一个分子的 NADH, 并进一步产生更多的还原态产物 ; 而当以葡萄糖酸作为碳源时, 因为葡萄糖酸有一半直接转化为丙酮酸, 产生的 NADH 的量比以葡萄糖为底物时少因此, 通过改变培养基中碳源的类型来调控微生物胞内 NADH/NAD + 的比例, 从而对 ATP 进行调控, 可以实现对碳代谢流的速度 流向及通量大小的调控假丝酵母是重要的真核微生物, 在农业和食品 [6] 行业中有广泛的应用 在本研究中, 通过在发酵培养基中添加与葡萄糖结构类似, 但氧化态较高的葡萄糖酸钠作为辅助碳源, 调控光滑球拟酵母 Torulospsis glabrata CCTCC M202019 胞内 NADH/NAD + 比例和 ATP 水平, 改变 T ġlabrata 的胞内代谢, 提高丙酮酸生产强度 ; 通过研究氧化还原状态对胞内辅因子代谢水平的调控机制, 为真核微生物培养基优化过程评估底物的氧化还原状态对发酵过程的影响提供参考 收稿日期 :2009-09-10; 修回日期 :2010-01-20 * 国家 863 高技术研究计划 (2006AA02Z201) 和国家自然科学基金 (30670066,20706025) 资助 ** 通讯作者.E-mail:jchen@jiangnan.edu.cn 周景文, 男,1982 年生, 博士. 研究方向 : 工业微生物.E-mail:zhoujw1982@jiangnan.edu.cn
528 华中农业大学学报第 29 卷 1 材料与方法 ln Xt 1.1 试验材料由 ln Xt X0 =μt 得到比生长速率 μ= X0 t, 其中 1) 菌株光滑球拟酵母 (T ġlabrata)cctcc X0 为接种后 0h 时的细胞质量浓度,Xt 为发酵 th M202019, 烟酸 生物素 硫胺素 盐酸吡哆醇 4 重维的细胞质量浓度生素营养缺陷型, 丙酮酸脱羧酶活性组成型降低, 为 1.5 NADH NAD + 和 ATP 测定 [7] 笔者所在实验室保藏, 主要用于发酵生产丙酮酸 取 10mL 发酵液, 于 4 下,10000r/min 离心 2) 斜面和种子培养基 (g/l) 葡萄糖 30, 蛋白 10min, 去除上清液, 菌体放入液氮中处理 1 min, 胨 10,KH2PO41,MgSO4 7H2O0.5, 琼脂 20 ( 斜使其代谢瞬间停止,-80 保存于冰箱用于面用 );ph5.5 NADH NAD + 和 ATP 的测定 3) 发酵培养基 (g/l) 葡萄糖 100, 氯化铵 7, 1)NADH 和 ATP 测定向菌体中加入 20mL KH2PO45,MgSO4 7H2O0.8,CaCO340 ( 摇瓶时预冷的含有 50 mmol/l KOH,30% (V/V) 乙醇和添加 ); 微量元素母液 10 ml, 维生素母液 10 ml, 22mmol/L 硼酸 (ph10) 溶液冰浴 30 min 后, 剧 ph5.0, 重蒸水定容依据试验要求, 将葡萄糖替烈搅拌, 用 3 mol/l 的 HCl 调节 ph 值到 9.0~ 换成不同质量浓度的葡萄糖酸钠作为发酵培养基, 9.4 10000r/min,4 离心 10min, 迅速测定上清以 100g/L 葡萄糖为碳源的培养液为对照, 每组进 2)NAD + 测定菌体中加入 20 ml 预冷的含行 3 组平行实验有 70% (V/V) 乙醇的 10 mmol/lph 值为 6.5 的 4) 微量元素母液 CaCl2 2H2O2g,FeSO4 7H2O 2 g,zncl2 0.5 g,mncl2 4H2 O 12 g, 0.5 mol/l 的 HCl 调节 ph 值低于 7.0;10000 CuSO4 5H2O0.05g,2mol/LHCl 溶解后定容至 1L 5) 维生素母液烟酸 80mg, 硫胺素 0.15 mg, 吡哆醇 40mg, 生物素 4mg, 核黄素 10 mg, 重蒸水 定容至 1L [7] 1.2 培养方法 1) 种子培养将培养好的新鲜斜面种子接种至 装有 50mL 种子培养基的 500 ml 摇瓶中培养, 摇 床转速 200r/min, 温度 30, 培养时间 24h 2) 摇瓶发酵发酵培养基装液量为 50 ml, 以 10% (V/V) 接种量接种, 温度为 30, 转速 200 r/min, 发酵时间为 60h, 每隔 12h 取样进行 1 次检 测分析 1.3 葡萄糖 细胞质量浓度和有机酸的测定 细胞质量浓度 (DCW) 采用吸光度法测定, 葡萄 糖的测定按参考文献 [7] 进行有机酸采用 Agilent 1100 系列高效液相色谱仪进行测定, 色谱条件为 : 色谱柱,AgilentZorbax SB-Aq (250 mm 4.6 1.4 比生长速率计算 K2HPO4 缓冲液, 室温放置 30 min 此过程中, 用 r/min,4 离心 10min, 迅速测定上清 3) 色谱分析条件色谱柱 AgilentZorbaxSB- Aq(250 mm 4.6 mm), 磷酸盐缓冲液 (10.93g NaH2PO4 和 3.04gNa2HPO4 溶于纯水中, 加入四 丁基溴化铵 3.22g, 调节 ph 值为 6.5, 真空抽滤后 定容至 1L) 和乙腈配比为 86 14, 流速 1mL/min, 检测波长 254nm, 柱温 35 所有样品和标准品 均用 0.22 μm 滤膜过滤后进样 10 μl 分析 [9] ATP NAD + NADH 在 20 min 内可以得到分离 胞内 ATP NADH 和 NAD + 浓度至少是 3 次独立 提取过程的平均值 2 结果与分析 2.1 葡萄糖酸钠为唯一碳源对 T. glabrata 生长和 发酵生产丙酮酸的影响 T ġlabrata 利用葡萄糖酸钠 (10 20 和 30 g/l) 为唯一碳源生长和积累丙酮酸的情况如图 1 所示 T ġlabrata 以 30g/L 葡萄糖酸钠作为唯一 碳源进行菌体生长时, 细胞质量浓度为 3.5g/L( 图 mm); 流动相,1% 乙腈 /99% Na2HPO4 缓冲液 (20 1A) 是对照组 (30g/L 葡萄糖, 细胞质量浓度为 8.3 mmol/l),ph 值 2; 进样体积,5mL; 流速,1mL/min; g/l) 的 42.20%, 丙酮酸产量 (1.2g/L) 是对照组的柱温,35 ; 检测波长,210nm [8] 13.60%( 图 1B) 继续提高葡萄糖酸钠的质量浓度
第 4 期周景文等 : 葡萄糖酸钠对光滑球拟酵母 CCTCC M202019 能量代谢和丙酮酸积累的影响 529 图 1 T ġlabrata 利用葡萄糖酸钠进行细胞生长 (A) 和丙酮酸生产 (B) Fig.1 Thegrowth(A)andpyruvateproduction(B) oft ġlabrata withsodiumgluconate 并不能有效地增加细胞质量浓度和丙酮酸积累量, 此结果表明,T ġlabrata 能利用葡萄糖酸钠进行生 长并积累少量丙酮酸 2.2 混合碳源对 T. glabrata 发酵生产丙酮酸的 影响 以 100g/L 葡萄糖为单一碳源作对照, 在含有 90g 葡萄糖的培养基 (1L) 中添加 10g 葡萄糖酸 钠, 在含有 80g 葡萄糖的培养基 (1L) 中添加 20g 葡萄糖酸钠, 在含有 70g 葡萄糖的培养基 (1L) 中 添加 30g 葡萄糖酸钠, 作为混合碳源,T ġlabrata 发酵生产丙酮酸的结果如图 2 和图 3 所示利用 90g/L 葡萄糖和 10g/L 葡萄糖酸钠作为混合碳 源, 能有效地促进细胞生长, 提高丙酮酸积累速度 ( 图 2A) 葡萄糖酸钠质量浓度增加到 10g/L 以上 时, 随着质量浓度增加, 细胞生长的延滞期越长, 如 添加 30g/L 葡萄糖酸钠, 细胞生长的延滞期由 8h 延长到 12h 当菌体生长进入对数生长期后, 添加 10g/L 葡萄糖酸钠的混合碳源能明显加快耗糖速 率, 发酵进行到 44h 时碳源消耗完毕, 此时, 对照组 培养液中碳源剩余为 4.2g/L 添加 10g/L 葡 未添加葡萄糖酸钠时的细胞质量浓度 DCW withoutgluconate; 添加葡萄糖酸钠时的细胞质量浓度 DCW withgluconate; 未 添加葡萄糖酸钠时的碳源消耗 Carbonsourceconsumptionwithoutgluconate; 添加葡萄糖酸钠时的碳源消耗 Carbonsourcecoṉ sumptionwithgluconate. 图 2 不同质量浓度混合碳源 (A.10g/L,B.20g/L,C.30g/L 葡萄糖酸钠 ) 对 T ġlabrata 的细胞生长和碳源消耗的影响 Fig.2 ThegrowthandglucoseconsumptionbyT ġlabrata with10g/l (A),20g/L (B), 30g/L (C)sodiumgluconateassupplementcarbonsource 萄糖酸钠使 T ġlabrata 发酵生产丙酮酸的周期从 48h 降为 44h; 丙酮酸产量 (32.47g/L,10g/L 葡萄糖酸钠 ) 比对照组提高了 7.37%, 丙酮酸的生产强度比对照组提高了 17.14% 菌体生长的延滞期延长为此, 研究了葡萄糖酸钠 (10g/L) 添加时间 (0 12 16 20h) 对细胞生长和丙酮酸积累的影响, 结果如图 4 所示, 相关发酵参数比较列于表 1 中发酵进行到 16h 时添加葡萄糖 2.3 葡萄糖酸钠添加时间对丙酮酸生产的影响前期研究发现, 利用 90g/L 葡萄糖和 10g/L 酸钠, 菌体生长迅速, 与未添加葡萄糖酸钠的对照组相比, 菌体比生长速率提高了 59.6% 16h 添加葡 葡萄糖酸钠组成混合碳源能有效地提高细胞质量浓度, 加快葡萄糖消耗速率, 提高丙酮酸产量然而, 在发酵初始阶段添加葡萄糖酸钠会抑制细胞生长, 萄糖酸钠使发酵周期从 48h 降为 40h, 随着葡萄糖酸钠的添加, 菌体耗糖速率明显加快,16h 添加葡萄糖酸钠, 与对照组相比较, 菌体耗糖速率提高了
530 华中农业大学学报第 29 卷 13.64%;16h 添加葡萄糖酸钠, 发酵 40h 丙酮酸产量为 34.29g/L, 比对照组发酵 48h 的丙酮酸产量高 10.05%;16h 添加葡萄糖酸钠, 丙酮酸生产强度提高了 32.81% 未添加葡萄糖酸钠 Withoutgluconate; 添加 10g/L 葡萄糖酸钠 With10g/Lgluconate. 图 3 混合碳源对 T ġlabrata 发酵生产丙酮酸的影响 Fig.3 ThepyruvateproductionofT ġlabrata onmixedcarbonsource 2.4 添加葡萄糖酸钠对 T. glabrata NADH 代谢的影响与葡萄糖为唯一碳源的对照组相比较, 在发酵进行到 16h 添加 10g/L 葡萄糖酸钠能有效提高细胞质量浓度和丙酮酸生产强度, 加快葡萄糖消耗和缩短发酵周期取对数生长中期细胞, 测定胞内 NADH NAD + ATP 含量, 结果如表 2 所示添加 10g/L 葡萄糖酸钠, 使 T ġlabrata 胞内 NADH 含量降低 5.14% ( 与未添加葡萄糖酸钠的对照组比较 )与葡萄糖比较, 葡萄糖酸钠有更强的氧化能力, 微生物利用葡萄糖酸钠, 使得胞内 NAD + 含量比对照组提高了 29.73%,NADH/NAD + 比例降低 26.89%; 同时由于 NADH 含量的降低, 并使得 ATP 含量下降 8.50% 总之, 葡萄糖酸钠的添加, 降低了细胞内 NADH/NAD + 比例, 引起代谢流的改变, 缩短了丙酮酸的生产周期, 提高了丙酮酸产量 0h; 12h; 16h; 20h A. 细胞质量浓度 Drycelweight;B. 比生长速率 Specificgrowthrate;C. 碳源 ( 葡萄糖 / 葡萄糖酸钠 ) 消耗 Carbonsourceconsumption;D. 丙酮酸积累 Pyruvicacidproduction. 图 4 不同葡萄糖酸钠添加时间对发酵过程的影响 Fig.4 EfectsofaddingtimeonpyruvatefermentationofT ġlabrata
第 4 期周景文等 : 葡萄糖酸钠对光滑球拟酵母 CCTCC M202019 能量代谢和丙酮酸积累的影响 531 表 1 不同葡萄糖酸钠添加时间的 T ġlabrata 发酵参数 发酵时间 Fermentationtime/h 最大细胞质量浓度 Maximum DCW/(g/L) 总碳源消耗 Table1 EfectsofaddingtimeonfermentationpaternsofT ġlabrata 参数 Paterns 0h (A) 12h (B) 16h (C) 20h (D) 变化 Change/% (C/A-1) 100 Totalconsumedcarbonsource/(g/L) 最大丙酮酸质量浓度 Maximumpyruvateconcentration/(g/L) 碳源转化率 Thepyruvateyieldoncarbon/% 碳源消耗速率 Thecarbonconsumptionrate/(g/(L h)) 丙酮酸产率 Pyruvateproductivity/(g/(L h)) 表 2 胞内 NADH NAD + 和 ATP 浓度 Table2 TheintracelularconcentrationofNADH,NAD + andatp 参数 Parameters 对照 (A) 葡萄糖酸 (B) Control(A) Gluconate(B) 48 48 44 48-8.33 10.93 11.20 11.80 10.74 7.96 88.39 91.11 91.50 87.60 3.52 30.83 28.83 34.27 28.41 11.16 34.88 31.64 37.45 32.43 7.37 1.84 1.90 2.08 1.83 13.04 0.64 0.60 0.85 0.592 32.81 变化率 Change/% (B/A-1) 100 NADH/ μ mol 12.83 12.17-5.14 NAD + / μ mol 1.48 1.92 29.73 NADH/NAD + 8.67 6.34-26.89 ATP/mmol 0.647 0.592-8.50 3 讨论 通过调控 NADH 代谢过程, 实现对 ATP 水平 的调控, 从而改变中心代谢途径的代谢通量, 一直以 来都是生化工程领域的一个研究热点 [10-11] 本研究 通过在发酵过程中的适当阶段, 添加适量的氧化态 底物, 调控胞质中的辅因子代谢, 显著提高了 T. glabrata 发酵生产丙酮酸过程的生产强度在真核微生物, 如酵母中, 利用底物的氧化还原状态对糖酵 解途径进行调控并实现发酵过程优化的目标, 目前 还尚未见报道 [12] 本研究的结果表明, 在不同时间添加葡萄糖酸 钠, 对于 T ġlabrata 丙酮酸发酵的影响不同, 原因 主要在于 :12h 时添加, 由于处于生长初期, 细胞质 量浓度较低, 添加葡萄糖酸钠对菌体生长有一定影 响, 因此添加后菌体生长速率提高不大, 耗糖速率也 稍有加快 ;20h 时添加, 菌体浓度过高, 添加葡萄糖 酸钠后, 能快速促进菌体生长与耗糖速率, 但同时葡 萄糖酸钠被菌体迅速利用 ; 发酵到 32h 后添加, 调 节效果减弱 ;16h 添加时, 菌体生长浓度比较适合, 添加葡萄糖酸钠后, 既能迅速促进菌体生长和葡萄 糖的消耗, 加速丙酮酸的生产, 又具有较好的持续调 节能力 在发酵培养基中添加与葡萄糖结构相似但氧化 还原状态不同的葡萄糖酸钠作为混合碳源进行丙酮 酸发酵, 可以有效降低微生物体内 NADH/NAD + 比例和 ATP 水平, 有效加速糖酵解途径, 进而提高 丙酮酸产量通过添加不同氧化还原状态碳源, 改 变胞内辅助因子的浓度和比例, 从而提高葡萄糖代 谢速率的策略, 对进一步提高目标代谢产物的生产 速度具有一定的借鉴作用本研究中利用到的葡萄 糖酸钠可能会增加丙酮酸的发酵成本, 在不同阶段 添加葡萄糖酸钠也会增加发酵工艺的复杂性, 但通 过改变培养基的氧化还原水平, 改变真核微生物胞 内氧化还原状态这一原理, 为后续的代谢工程改造 提供了坚实的理论基础 参考文献 [1] ALAM KY,CLARKDP.AnaerobicfermentationbalanceofEsche- [2] BERRIOS-RIVERASJ,SANCHEZA M,BENNETTGN,etal. richiacoliasobservedbyinvivonuclearmagneticresonancespec- troscopy[j].jbacteriol,1989,171(11):6213-6217. EfectofdiferentlevelsofNADHavailabilityonmetabolitedistributioninEscherichiacolifermentationin minimalandcomplex media[j].applmicrobiolbiotechnol,2004,65(4):426-432. [3] ZHOUJW,LIULM,SHIZP,etal.ATPincurentbiotechnology:regulation,applicationsandperspectives[J].BiotechnolAdv, 2009,27(1):94-101. [4] LIU L M,LIY,SHIZP,etal.EnhancementofpyruvateproductivityinTorulopsisglabrata:increaseofNAD + availability [J].JBiotechnol,2006,126(2):173-185. [5] SAN K Y,BENNETT G N,BERRIOS-RIVERA SJ,etal. Metabolicengineeringthroughcofactor manipulation andits efectsonmetabolicfluxredistributioninescherichiacoli[j]. MetabEng,2002,4(2):182-192.
532 华中农业大学学报第 29 卷 [6] 王泽举, 刘延琳, 刘爱国, 等. 新疆葡萄酒自然发酵过程酵母菌的种类和动态变化 [J]. 华中农业大学学报,2008,27(5):664-667. [7] LIULM,LIY,LIHZ,etal.Manipulatingthepyruvatedehydrogenasebypassofamulti-vitaminauxotrophicyeastTorulopsisglabrataenhancedpyruvateproduction[J].LetApplMicrobiol,2004, 39(2):199-206. [8] 李德华, 向春雷, 姜益泉, 等. 低磷胁迫下不同水稻品种根系生理特性的研究 [J]. 华中农业大学学报,2006,6(25):626-629. [9] SATO K,YOSHIDA Y,HIRAHARA T,etal.OṉlinemeasurementofintracelularATPofSaccharomycescerevisiaeand pyruvateduringsake mashing[j].jbioscibioeng,2000,90 (3):294-301. [10]VEMURIG N,EITEMAN M A,ALTMAN E.IncreasedrecombinantproteinproductioninEscherichiacolistrainswith overexpressedwateṟformingnadhoxidaseandadeletedaṟ caregulatoryprotein[j].biotechnolbioeng,2006,94(3):538-542. [11] VEMURIG N,EITEMAN M A,MCEWENJE,etal.Iṉ creasingnadhoxidationreducesoverflow metabolisminsaccharomycescerevisiae[j].proc NatlAcadSciUA,2007,104 (7):2402-2407. [12]VAN-DER-WERF MJ,OVERKAMPK M,MUILWIJKB,et al.comprehensiveanalysisofthemetabolomeofpseudomonas putidas12grownondiferentcarbonsources[j].molbiosyst, 2008,4(4):315-327. EfectofSodium GluconateonPyruvateAccumulation bytorulopsisglabrata CCTCC M202019 ZHOUJing-wen DONGZhi-yao LIU Li-ming DU Guo-cheng CHENJian StateKeyLaboratoryofFoodScienceandTechnology/KeyLaboratoryofIndustrial Biotechnology,MinistryofEducation,JiangnanUniversity,Wuxi,214122 Abstract ThedrycelweightofT ġlabratareachedto3.5g/l when30g/lofgluconatewas presentedintheculturemedium.when10g/lofgluconatewassupplementedtotheculturebrothwith 90g/Lofglucoseat16h,thedrycelweight,therateofglucoseconsumptionandthepyruvateproductionwereincreasedby7.96%,13.04% and32.81%,respectively.theenhancementofglucoseconsumptionandpyruvateproductionratewereduetothefactthattheconcentrationofnad + increasedby 29.73% whiletheconcentrationofatpandtheratioofnadh/nad + decreased26.89% and8.50%, respectively.thedecreaseintheintracelularnadh and ATPleveldecreasedtheinhibitionefectof NADHandATP,thussignificantlyincreasedtheglycolyticratio. Keywords Torulopsisglabrata;pyruvicacidproduction;NADH;ATP ( 责任编辑 : 陆文昌 )