中国农学通报 2015,31(1):239-246 Chinese Agricultural Science Bulletin 生物质谱技术研究进展及其在蛋白质组学中的应用 杨倩, 王丹, 常丽丽, 孙勇, 靳翔, 王旭初 ( 中国热带农业科学院热带生物技术研究所, 海口 571101) 摘要 : 随着蛋白质组学的快速发展, 生物质谱技术在蛋白质组学中的应用不断深入, 逐渐成为这一领域的核心技术 为系统揭示生物质谱技术在蛋白质组学中的具体应用, 综述了生物质谱仪器的快速发展和其在蛋白质鉴定 翻译后修饰和蛋白质定量分析等方面的应用和研究进展 生物质谱技术的进步加快了蛋白质组学研究的进程, 但样品的复杂性和庞大数据的处理是生物质谱技术面临的不可避免的挑战 相信随着生物质谱技术的不断完善和改进, 它必将会在蛋白质组学研究中发挥更加重要的作用 关键词 : 质谱技术 ; 生物质谱仪 ; 蛋白质组学 ; 应用中图分类号 :Q-94 文献标志码 :A 论文编号 :2014-0018 Progress in Mass Spectrometry and Its Application in Proteomics Yang Qian, Wang Dan, Chang Lili, Sun Yong, Jin Xiang, Wang Xuchu (Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology, CATAS, Haikou 571101) Abstract: With the rapid development of proteomics, biological mass spectrometry technology had provided the profound application in proteomics, it was gradually becoming the core technology in this field. In order to reveal the specific application of biological mass spectrometry technology systems in proteomics. In this paper, we reviewed the development of biological mass spectrometers and the applications of biological mass spectrometry technology in protein identification, posttranslational modifications and quantitation of proteins. Biological mass spectrometry technology promoted the process of the proteomics, but the complexity of the sample and the tremendous of data analysis was inevitable challenge for the technology. We believe that with the consummation and evolution of biological mass spectrometry technology, it would play a greater role in the proteomics. Key words: mass spectrometry technology; bio-mass spectrometry; proteomics; application 0 引言蛋白质组学研究的目的是利用生物学最先进的仪器和方法进行细胞或亚细胞中蛋白质的鉴定和在不同生命周期过程中蛋白质丰度的变化, 来揭示细胞或者组织的生物学过程和功能 双向凝胶电泳技术 (2-DE) 及在此技术上发展而来的荧光差异凝胶技术 (DIGE) 曾是蛋白质组学分析中蛋白质分离和定量的重要手 段 随着电喷雾电离和基质辅助激光解吸电离 2 种软 电离技术的出现 [1], 生物质谱技术在蛋白质组学中的 应用越来越广泛深入 位点和蛋白质相互间作用的功 [2] 能层次上的研究 Shevchenko 等结合 2- D SDS- PAGE 分离和胶内酶解技术, 应用 MALDI 质谱仪成功 鉴定酵母中大量表达蛋白 这种基于凝胶法质谱鉴定 所需样品量少 时间短 仪器准确度高, 现已成为蛋白 基金项目 : 国家自然科学基金项目 蛋白质磷酸化在乙烯促进小橡胶粒子合成天然橡胶中的作用 (31270712); 国家自然科学基金青年基金项目 橡胶粒子在天然橡胶前体生物合成过程中的作用 (31000291); 国家自然科学基金项目 小橡胶粒子膜蛋白 SRPP 在天然橡胶生物合成和调控中的作用 (31370681); 海南省重大科技项目子课题 热带生物种质与基因资源研究项目 (ZDZX2013023-1) 第一作者简介 : 杨倩, 女,1985 年出生, 陕西宝鸡人, 研究实习员, 硕士, 主要从事植物蛋白质组学研究 通信地址 :571101 海口市龙华区学院路 4 号中国热带农业科学院热带生物技术研究所,Tel:0898-66987460,E-mail:yangqianhaikou@163.com 通讯作者 : 王旭初, 男,1977 年出生, 湖南湘西人, 副研究员, 博士, 主要从事植物发育生物学和蛋白质组学研究 通信地址 :571101 海口市龙华区学院路 4 号中国热带农业科学院热带生物技术研究所,Tel:0898-66987460,E-mail:xchwanghainan@163.com 收稿日期 :2014-01-02, 修回日期 :2014-06-16
240 中国农学通报 http://www.casb.org.cn 质组鉴定普遍方法 但是由于 2-DE 技术对特殊蛋白 低丰度蛋白 分辨率与重复性的局限性, 所以基于色谱 技术的 LC-MS 技术成为这一领域不可取代的重要补 [3] 充 Gygi 等比较了 2-DE-MS 和 LC-MS 2 种分离方法 鉴定酵母中的蛋白质, 结果表明 :LC-MS 不仅能采集 复杂混合物中高丰度蛋白并且能够有效检测到低丰度 的蛋白, 弥补了 2-DE 分离分辨率低重复性差的缺陷 ; [4] Wells 等比较了 2D DIGE cicat 和 itraq 3 种技在 蛋白质定性和定量分析中的应用, 表明这些方法具有 互补性 蛋白质翻译后修饰常常表现为低丰度, 加上 质谱仪器自身限制, 采用质谱技术对蛋白质磷酸化做 定性定量分析仍具有挑战 从目前来看生物质谱技术 在蛋白质定性和定量分析中做出来巨大贡献, 并具有 良好的应用前景, 但还存在一定的不足和缺陷, 相信随 着技术的不断发展, 质谱技术将会不断完善并在蛋白 质组学研究领域发挥更加重要的作用 本文综述当前 不同生物质谱仪器的原理和该技术及在翻译后修饰及 定性定量的方法和应用, 揭示其在蛋白质组学研究中 的重要作用 1 生物质谱技术 质谱技术随着质谱仪的诞生和发展, 由早期应用 于无机化合物分析转向有机物的定性和定量分析, 并 迅速发展, 广泛应用在生物学 医药 化学 环境和食品 科学等各个领域 到了 20 世纪 80 年代末, 电喷雾电离 (Electrospray Ionization,ESI) 和基质辅助激光解吸电 离 (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization, MALDI)2 种软电离技术出现, 使生物大分子的离子化 成为可能, 质谱技术也由此扩展到了生物大分子研究 领域, 成为蛋白质组学的主要研究手段 1.1 离子化技术 实现分子的离子化是质谱技术的第一步, 所有分 子只有经电离形成带电离子才能在电场或磁场中被按 质荷比分离后检测 质谱技术中常应用到的电离方式 有 : 电喷雾离子源 (ESI) 大气压化学电离源 (APCI) 基 质辅助激光解析电离 (MALDI) 和大气压光电离源 (APPI) 根据生物大分子的特性, 生物质谱中主要应 [5] 用到 ESI 和 MALDI 离子源电离技术 电喷雾离子源 (Electrospray Ionization,ESI) 与高效液相色谱联用, 在 色谱毛细管出口处施加的电压能产生高电场, 使流出 的样品雾化成细小的带电液滴, 细小液滴进一步去溶 剂后实现离子化, 形成大量带一个电荷或多个电荷的 离子, 使分析物以气相形式进入质量检测器 由于 ESI 源产生的为多电荷离子, 使质荷比降低, 大大扩展 [6] 了分子量的分析范围 基质辅助激光解吸电离 (Matrix- Assisted Laser Desorption/iIonization,MALDI) 技术是将待测样品与基质混合, 样品均匀的分散在基质中并形成结晶, 激光作用于混合有样品的晶体, 化学基质吸收光子被激活, 激活产生的能量作用于多肽, 样品由固态转变成气态 由于多肽分子倾向于吸收单一光子, 所以多肽离子带单一电荷 MALDI 适于分析简单的肽混合物, 而液相色谱与 ESI-MS 联用适合分析 [7] 复杂样品 1.2 质谱仪的质量分析器经电离后的离子进入质量分析器中进一步分离检测便可得到质谱图 质量分析器的功能就是将离子源产生的离子, 按其质荷比 m/z 进行分离 检测, 得到待分析物特征质量信息 质谱仪的类型主要以质量分析器区分, 应用到生物大分子鉴定和定量的质量分析器主要有高分辨率三重四极杆 (QQQ) 高分辨率飞行管 (TOF) 和超高分辨的静电场轨道阱 (Orbitrap) 等 下面 [8] 简单介绍常见的质量分析器 飞行时间质量分析器 (TOF) 采用了离子延迟引出和反射器等技术, 具备高分辨和高质量准确度, 是目前应用到生物蛋白质组领域中的主要质谱仪器类型 三重四极杆质量分析器 (QQQ) 的 2 个质量分析器能够在不同条件下协同完成多种功能的 MS/MS 分析方法, 如 : 产物离子扫描 (Product Ion Mode) 前体离子扫描 (Precursor Ion Mode) 中性丢失扫描 (Neutral Loss Mode) 和多反应选择检测 (Multiple Reaction Monitoring,MRM) 方式 这几种扫描方式, 可确定各个离子的归属, 研究离子的碎裂途径, 用于分析化合物结构 多反应选择离子检测方式 (MRM), 多用于定量分析 离子阱 (Ion Trap) 质谱不仅能实现全扫描, 还能利用离子储存技术选择任一质量离子进一步碎裂, 实现二级或多级质谱 (MS n ) 分析的功能 离子阱内充有一定量的氦气 ( 约 10-3 Torr), 有利于离子的聚集, 离子聚集得越紧凑, 则离子发射出阱和检测的效率就越高, 因此离子阱具有较高的分辨率和灵敏度 AB Sciex 公司 QTrap 系列线型离子阱和 Thermo Fisher Scentific 的 LTQ-Orbitrap 质谱具有高分辨和高质量测定精度 1.3 串联质谱仪离子源 质量分析器和检测器构成了质谱仪的核心组件 随着科学研究问题的深入, 学者们对研究仪器的要求也越来越高 各种质量分析器的相互杂交出现了串联质谱仪 如 Q-TOF 质谱仪 Q-Trap 质谱仪 Orbi 等质谱仪, 具有不同的灵敏度, 分辨率, 质量精确 [9] 度和产生不同的 MS/MS 谱, 满足各种不同的研究需
杨倩等 : 生物质谱技术研究进展及其在蛋白质组学中的应用 241 要 MALDI-TOF-TOF 仪器, 可以通过肽质量指纹法 (Peptide Mass Fingerprint, PMF) 和肽碎片离子鉴定法 (Peptide Fragments Identification) 进行蛋白质鉴定 TOF-TOF 质谱尤为擅长高能量 CID(Collision Induced Dissociation) 和高速扫描, 其获得 CID 谱图的速度比离子阱或者四极杆质谱高很多, 并且能够自动化进样和高通量应用 将三级串联四极质谱仪的最后一级四极换为 TOF 管就是常见的 Q-TOF 类仪器 Q-TOF 进行 MS/MS 分析时, 先选择一个离子然后加速至一定能量, 再进入碰撞池碰撞碎裂 (CID 过程 ), 生成产物离子后进入 TOF 分析器进行分离 Q-TOF 可以与 ESI 源连接, 也可以与 MALDI 源联用, 如 MALDI-QSTAR, 具有较高的灵敏度, 分辨率和准确度, 而且有效的质谱采集速度能够分析足够复杂的蛋白质样品 LTQ Orbitrap Velos 是由 2 种不同类型的质谱仪组成 前端是二维线性离子阱质谱 LTQ 或 LTQ Velos, 是可独立工作的低分辨率质谱, 能够提供 MS MS/MS MS n 等各种碎片离子 ; 后端是 Orbitrap 高分辨质谱, 进行高分辨检测 ; 两者由 C-trap 连接, 具有离子聚焦和将离子束推入 Orbitrap 的作用 根据样品的复杂程度和分析要求,Orbitrap 的分辨率可以从 7500~100000 在分辨率大于 30000 时, 可设置 LTQ Velos 和 Orbitrap 联动模式, 即在 Orbitrap 进行高分辨率扫描时,LTQ Velos 可同时进行多个数据关联的 MS/MS 或 MS n 的扫 [10] 描, 是真正的高 低分辨率双质谱同时分析 2 应用质谱技术的蛋白质鉴定蛋白质组学中蛋白质的快速有效鉴定, 是连接和贯穿基因组 转录组和代谢组进行生物学分析的重要纽带 传统的蛋白质鉴定如 Edman [11] 降解法, 是在弱碱性条件下与异硫氰酸苯酯反应, 再用酸处理, 使多肽链上氨基末端残基游离出来后进行分析 在对第一个氨基末端残基游离后, 对剩余的多肽链进行同一反应, 则可游离出下一位置的残基 如此反复操作, 可以确定氨基酸序列 但是这种方法费时费力, 无法实现高通量 现在利用生物质谱的蛋白质鉴定主要有 2 种策略 : 一种是基于凝胶电泳系统的自上而下 (top-down) 的策略, 对凝胶电泳分离后的蛋白质胶内酶解, 然后进行 [12] 质谱鉴定 ; 另一种是自下而上 (bottom-up) 的鸟枪法, 即蛋白质复杂混合物不经历电泳分离, 而是先将其酶解为肽段混合物, 然后经色谱分离, 再进入串联质谱进行肽段分析, 最后根据质谱图从检索出蛋白质 2 种方法都能实现高通量分析, 但由于鸟枪法能在更短的时间内获得大量的质谱鉴定结果, 在蛋白质组学研究 中被广泛应用 鸟枪法产生的质谱数据量非常大, 数据分析的复杂性和难度也随之增加, 因此它的缺陷也显而易见, 例如数据库搜索算法的局限性, 较高的假阳性率, 使得这种方法在蛋白质鉴定的质量控制方面问题显得十分突出, 见图 1 图 1 基于质谱技术蛋白质鉴定的 top-down 和 bottom-up 2 种策略基于数据库检索的蛋白质鉴定 : 一种是肽质量指纹谱法 (Peptide Mass Fingerprint,PMF) [13], 即蛋白质被特异性的酶解或化学水解的方法切成多肽片段混合物, 通过质谱检测混合物中各多肽的分子量, 得到具有特征性的多肽分子量实际图谱, 然后在一定的误差允许范围内与数据库中蛋白质的理论酶切结果比对, 将比对到的结果实行打分排序, 实现待测蛋白质的鉴定 每种蛋白质的肽质量指纹图谱 (PMF) 都具有很好的特征性, 但样品前处理中残留的杂质 蛋白质翻译后可变修饰会引起多肽离子质量迁移 多肽的可离子化程度不一致, 导致图谱复杂难以解析, 严重影响检索比对结果, 应用受到一定限制 另一种方法是肽段碎片离子鉴定法 (Peptide Fragments Identification, PFF), 是将特定的多肽片段打碎, 通过分析相邻的同类型峰质量差确定肽段的相应氨基酸残基 分析这种鉴定法产生的图谱时, 需要结合母离子峰来解析 理想上肽段断裂时能产生各种带一个电荷的离子, 可以比较简单的推出目标肽段上的氨基酸序列 ; 但实际上肽段断裂不充分 中性丢失 肽段类型不单一 杂质等因素会让实际的质谱图更加复杂, 给多肽序列的确定带来不利
242 中国农学通报 http://www.casb.org.cn 3 应用质谱技术研究蛋白质翻译后修饰 3.1 蛋白质磷酸化的研究 蛋白质翻译后修饰分为磷酸化 糖基化 甲基化 乙酰化 泛素化等 [14], 磷酸化是最常见 最重要的一种 蛋白质共价修饰方式 蛋白质的磷酸化和去磷酸化几 乎调节着生命活动的所有过程 [15] 真核生物细胞蛋白 质中主要的磷酸化氨基酸为酪氨酸 丝氨酸和苏氨 32 酸 传统的用放射性同位素 P 标记后通过二维凝胶 电泳 (2-DE) 和高效液相色谱分离并检测 检测的蛋白 质可通过全部水解确定磷酸化的含量, 还可以蛋白水 解酶消化同位素标记的蛋白质来确定磷酸化位点 由 于此种方法复杂且具有放射性, 没有得到广泛的应 用 荧光染料染色 (Pro-Q Diamond) 是一种与磷酸化 蛋白质反应的染料, 它对聚丙烯酰胺凝胶中的磷酸化 蛋白质残基具有敏感性, 能够特异的结合磷酸化蛋白 质残基, 可通过荧光扫描仪检测蛋白质的磷酸化程 度 Pro-Q Diamond 染色法与胶内酶切质谱鉴定具有 兼容的特点 Schulenberg [16] 等用 2DE-Pro-QDiamond 染料方法结合 MALDI-TOF 分析了线粒体中磷酸化蛋 白质组, 虽然 Pro-Q Diamond 染色法具有较高的灵敏 度, 但是质谱分析时非磷酸化肽对磷酸化肽的抑制明 显, 因此磷酸化蛋白质或肽段的富集显得尤为必要 3.1.1 磷酸化蛋白质 / 肽段的富集免疫共沉淀是磷酸 化蛋白质富集的一种常用手段 Pandey [17] 利用抗磷酸 化酪氨酸抗体免疫沉淀表皮生长因子 (EGF) 未刺激和 刺激后的 HeLa 细胞总蛋白质, 质谱分析后成功鉴定出 磷酸化蛋白质 而磷酸化的丝 苏氨酸由于抗原决定 簇相对酪氨酸小一些, 结合位点空间有限, 所以导致抗 [18] 体结合力较差, 应用不及抗磷酸化酪氨酸抗体广 泛 Gronborg [19] 选择其中 2 种磷酸化抗体来富集磷酸 酶抑制剂 calyculin A 诱导后的 HeLa 细胞磷酸化蛋白 质, 鉴定出 7 个丝氨酸和苏氨酸发生磷酸化的蛋白 目前, 利用最多最成熟的金属氧化物是 TiO 2, 但特异性 较低 Larsen [20] 2,5- 二羟基苯甲酸 (DHB) 后用 TiO 2 富集 磷酸化肽段, 提高富集磷酸肽的效率 在液质联用时, [21] [22] 缓冲液中加入谷氨酸或者天冬氨酸能降低非特异 性吸附现象, 减少离子源的污染 Li [23] 以 HeLa 细胞全 蛋白为研究对象, 发现样品肽段与 TiO 2 最佳比例在 1:2~1:8 之间, 但这种比例也不是一成不变 Kweon [24] 发现 ph 和离子强度对 ZrO 2 结合磷酸肽的能力有影 响 Wolschin [25] 等使用 Al(OH) 3 对磷酸肽进行富集, 加 入 CHAPS (ph 6.1) 和咪唑以使特异性提高, 缓冲液中 加入天冬氨酸盐和谷氨酸盐, 则能够抑制 Al(OH) 3 对 天冬氨酸和谷氨酸的非特异性吸附 固相金属亲和色 谱技术 (Immobilized Metal Affinity Chromatography, IMAC) 是选择性分离和富集磷酸化肽较为广泛的方 法 Posewitz [26] 和 Stensballe [27] 使用 IMAC 富集磷酸化 多肽段, 结果显示金属离子在磷酸化蛋白质 / 肽段富集 时具有高选择优势 Ficarro [28] 发现利用甲酯化修饰减 少非特异性吸附可以增加 IMAC 富集特异性 Seeley [29] 则采用 Glu-C 酶与天冬氨酸和谷氨酸的 C 端反应, 使 磷酸化肽的富集选择性由 40% 上升为 70% 传统的 IMAC 存在多孔树脂珠在微米级无可避免的 阴影效 应 [30], 即被束缚在小孔里的磷酸化肽段在激光解吸附 过程中无法得以有效释放, 会影响 MALDI 的离子化 效率 Barnouin [31] 采用 1,1,1,3,3,3- 六氟异丙醇作上样 和洗脱缓冲液, 增强了 MALDI-MS 对磷酸化肽段的检 测 Zhang [32] 将铁离子螯合固定在纳米沸石粒子上富 集磷酸化肽段的新方法, 不但提高富集效率, 也增强 MALDI 的离子化效率 磷酸化的丝氨酸和苏氨酸在 碱性条件下发生 β 消除反应, 形成双键成为 Michael 加 [33] 成反应的受体 Oda 等使磷酸化丝氨酸和苏氨酸残 基通过 β- 消除反应去掉磷酸基团与二巯基乙烷 (Ethanedithiol,EDT) 一起反应, 使巯基标签取代磷酸基 团, 再经过巯基反应带入生物素基团, 通过生物素与亲 和素的作用分离富集磷酸化的肽或蛋白质 这种方法 简单, 但不能富集酪氨酸磷酸化的蛋白质和肽段 [34] Zhou 等使磷酸基团发生碳化二亚氨的反应, 再通过 巯基乙胺与碘乙酰树脂柱的共价结合纯化磷酸化肽 磷酸肽的洗脱是通过三氟乙酸切割氨基磷酸键完成 的 这种方法不仅能聚集酪氨酸磷酸化肽, 也能富集 丝氨酸和苏氨酸磷酸化肽段, 但是该步骤繁琐, 纯化过 程可能会有大量样品损失, 并仅限于肽段水平的富集 3.1.2 质谱分析磷酸化蛋白质的位点一般使用 MALDI-TOF MS 的肽指纹谱 (PMF) 鉴定与磷酸酯酶处 理相结合确定磷酸化位点 用磷酸酯酶处理磷酸化的 肽后, 肽段的质荷比会产生特定数量的变化, 通过 MALDI-TOF MS 检测这种质荷比的变化可以确定磷 [35] 酸化位点 但 Larsen 等指出做 MALDI MS 分析蛋 白质磷酸化位点时凝胶条带或者胶粒中至少需要 1pmol 蛋白质 阳离子模式下, 含有磷酸化丝氨酸或 苏氨酸的肽段质荷比会有一个 98 Da (H 3PO 4) 的变化, 酪氨酸肽段质荷比则表现出 80 Da 质量数的变化 Ma [36] 等用 MALDI-TOF MS 的阴离子模式鉴定磷酸 肽, 发现阴离子模式下磷酸肽产生的信号会比阳离子 模式下强 可以通过正负离子结合鉴定, 首先在负离 子模式下观察到磷酸化肽的响应, 然后再在正离子模 式下鉴定
杨倩等 : 生物质谱技术研究进展及其在蛋白质组学中的应用 243 丝氨酸 苏氨酸残基上磷酸基团不稳定, 低能量的 CID 碰撞会丢失 H 3PO 4(98 Da) 或 HPO 3(80 Da) 发生去 磷酸化 [37] 酪氨酸磷酸化也会丢失 HPO 3(80 Da), 但是 比丝氨酸, 苏氨酸的磷酸基团要稳定很多 由于发生 母离子中性丢失后的离子会是最主要的离子形式, 它 能抑制碎裂产生的碎片离子, 严重影响磷酸化肽蛋白 质的鉴定和磷酸化位点的定位 多级质谱 (MS n ) 被广 泛使用来克服这个缺点 多级质谱是先选出发生磷酸 化肽中性丢失后的离子, 然后再进行 CID 碰撞, 分析 MS 3 级质谱图特异的 y-,b- 系列离子, 能够有效实现磷 酸化肽段的鉴定 Gruhler [38] 等使用 MS 2 和 MS 3 相结合 的方法鉴定了 724 个磷酸化肽段, 比仅采用 MS 2 多鉴 定到 307 个 由于液相色谱出色的分离效果, 降低了 离子抑制效应, 所以有人开始用 LC-MS/MS 分析磷酸 化位点 [39-40] ETD/ECD 是一种不同于 CID 的裂解技 术, 低能量的自由电子与质子化的多电荷蛋白质或肽 离子在相互作用的过程中由于放热而瞬间产生碎裂, 是 一个非各态历经的过程, 主要产生 c 和 z 类型离子 [41] 与 CID 相比,ETD/ECD 的电子转移只发生在肽段主链 上, 所以保持了不稳定的翻译后修饰状态, 非常有利于 翻译后修饰位点的鉴定 3.2 蛋白质糖基化的研究 一般是通过蛋白酶酶切与糖苷内切酶酶切相结合 的方法, 根据质谱图上的峰位移, 分析出可能连接糖链 的氨基酸, 从而确定其糖基化位点 结合 ESI-MS 或 MALDI-TOF MS,HPLC 以及数据库检索, 确定糖蛋白 位点的灵敏度和准确度都大大提高 Yang [42] 用胰蛋白 酶结合糖苷内切酶, 确定了胎球蛋白上的 4 个 N- 连接 糖基化位点及 3 个 O- 连接糖基化位点 Harmon [43] 等 应用 MALDI-TOF MS 分析了重组人 γ- 干扰素的糖基 化位点及其糖基化的微不均一性 PNGase F 酶切会 使糖基化位点去氨基化并发生 0.98 Da 的质量变化, 以 此作为标签, 在质谱数据检索时天冬酰胺残基上设定 0.98 Da 的可变修饰即可鉴定糖基化位点 利用 18 PNGase F 酶切结合酶促 O 标记技术糖基化位点会发 生 2.98 Da 的质量变化, 不但利于质谱鉴定和数据检 [44] 索, 还能最大限度的降低鉴定错误率 Chen 等利用 蛋白酶酶解,PNGase F 酶切等鉴定技术, 从肝癌病人 癌旁组织中鉴定到 523 个糖蛋白上的 939 个 N- 糖基化 位点 应用生物质谱技术不但可以得到含糖肽段信息还 可以直接得到单糖碎片, 确定糖链结构 Tsarbopoulos [45] 就在此基础上分析了重组人白细胞介素 -4 的糖基化位 点及部分糖链结构 虽然质谱技术可以直接分析糖蛋 白的分子量, 糖基化位点以及糖链结构, 但是糖链质谱 数据的复杂性, 糖链合成造成的不可预测性和不完善 的分析手段, 限制了糖基化修饰研究的发展 因此, 这 些方面的限制还有待突破 4 基于质谱的定量蛋白质组学 在整体水平上研究蛋白质表达和修饰后的动态变 化, 对系统理解蛋白质的功能具有十分重要的意义 [46] 近年来, 基于质谱技术的蛋白质组学的定量方法分为 标记定量和非标记定量两大类 稳定同位素标记和金 属元素标记法等定量的方法为标记定量 由于在鸟枪 法 (shotgun) 的定量分析中, 多肽离子化效率和信号响 应强度受多重因素影响, 无法直接用质谱峰强度或者 面积进行精确定量 而分别用 轻 质和 重 质同位素 13 ( 如 C, 15 N, 18 O) 标记的多肽, 具有相同色谱保留时间 和离子化效率, 可以准确反映原样品中多肽或蛋白质 的比例, 因此被用来精确定量 常用的稳定同位素标 18 记方法有 : 酶促的 O 标记 细胞培养稳定同位素标记 (stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC) 同位素编码的亲和标签 (isotope coded affinity tag, ICAT) 标记和同位素标记相对和绝对蛋白 质定量 (itraq) SILAC 标记分别采用轻 中或重同 位素氨基酸培养细胞, 新合成的蛋白质嵌合了同位素 氨基酸, 蛋白质等量混合后进行分离和质谱鉴定, 根据 一级质谱图中 2 个同位素型肽段的面积比较进行相对 定量 这种标记技术标记效率和灵敏度较高, 且不影 响细胞的功能 Larance [47] 使用一种重型赖氨酸和重 型精氨酸标记的大肠杆菌培养线虫, 结果表明这种方 18 法抑制了精氨酸 - 脯氨酸的转化 酶促的 O 标记是一 18 16 项重要的标记定量技术, 使用时应避免 O 和 O 的回 交现象 Zhao [48] 18 等使用 O 标记生成稳定的肽段, RapiGest SF 和微波加热提高了标记效率, 利用化学修 18 16 饰作用使胰酶失活阻止 O 和 O 的回交, 最后结合质 谱多反应监测技术 (SID-MRM-MS) 策略确认了人肝癌 血清中的候选生物标志物 同位素编码的亲和标签 (ICAT) 的试剂能与蛋白质或者多肽的 L- 半胱氨酸的巯 基反应, 分别使蛋白质带有轻 重标记试剂, 混合后用 抗生物素蛋白亲和层析法分离, 质谱分析同位素峰比 例可以得到相对定量信息 Shiio [49] 使用 ICAT 标记完 成蛋白质序列鉴定和精确定量, 并被应用到蛋白质表 达谱和亚细胞器的蛋白质变化分析 itraq 技术通 过对样品的 LC-MS/MS 分析数据进行基于色谱和保 留时间或者基于质谱的归一化来对蛋白质或者多肽精 [50] 确定量 Zhu 等使用 itraq 鉴定了经脱落酸处理后 芸苔属植物保卫细胞中相对变化的蛋白质和定量信
244 中国农学通报 http://www.casb.org.cn 息 近年来液质联用的定量分析技术发展迅速, 基于色谱和保留时间的归一化方法依赖 LC-MS/MS 色谱 [52] 分离的重现性和质谱的精确性 稳定同位素标记与生物质谱技术的结合是目前定量蛋白质组学中相对成熟的定量技术 在所有定量技术中没有一种技术能够解决所有问题, 采用多种策略和方法联合应用才是正确的选择 5 生物质谱数据分析质谱得到的数据经过数据库检索才能得到解析, 数据库是质谱数据库检索法分析的重要保障 对于模式生物和已知蛋白序列较多的的物种, 质谱数据分析通常会简单一些, 得到的结果可靠且成功率高 如果所研究物种已知蛋白序列较少或者不完整, 通常采用跨物种检索的办法检索近缘物种数据库, 这种方法鉴定效率低且准确度差 SwissProt TrEMBL 是常见和重要的蛋白质数据库, 收录有目前所有已知蛋白的具体信息 而 NCBInr 几乎收录了所有公共数据库中的所有蛋白质序列, 提供大量重要的蛋白质相关数据资源 数据库的选择直接影响蛋白质谱鉴定的得率 不同的检索工具会根据不同的算法对质谱数据进行整理组合, 并对候选蛋白进行打分排列 Mascot 是目前应用最广泛的蛋白质鉴定检索软件, 具有其独特的算法 6 结语随着技术的不断发展, 质谱仪的分辨率和灵敏度被不断提高 色谱质谱联用弥补二维电泳技术对特殊的蛋白无法分离的不足, 成为重要的方法之一, 但在分离复杂蛋白质混合物需要对不同样品摸索和优化洗脱梯度, 还有冗余性和丰度抑制的问题, 限制了进一步应用的范围 虽然增加色谱柱的峰容量和检测动态范围, 但是丰度抑制仍然是目前质谱技术鉴定不容忽视的难题 生物质谱技术在蛋白质翻译后修饰的研究方面提供了很大便利, 但要全面了解有限样品中的提取蛋白的修饰状况仍是一项艰巨的任务 标记定量蛋白质组学是定量组学中的重要手段, 但其昂贵的标记试剂仍然使这项技术的推广受到限制 ; 非标记定量有一定发展, 仍需进一步完善和提高 由于数据库检索利用质谱采集结果与数据库相关性进行分析, 但目前很多研究物种还没有相应的数据库或者数据库不完整, 对蛋白质的鉴定有很大的影响 在多肽鉴定过程中, 样品的复杂性和鉴定数据的冗余性, 为蛋白质的鉴定造成困难 Mascot 由于其算法的限制, 数据库检索时鉴定到很多假阳性蛋白质, 需要有经验的研究者手工验证去除假阳性, 花费时间多, 已经成为限制生物质谱技术广泛应用的一个瓶颈 从最初的蛋白质结构的鉴定到功能层次的蛋白质翻译后修饰和定量的研究, 生物质谱技术不断发展进步, 逐渐成为蛋白质组学研究中的核心技术 不同类型不同品牌的质谱仪以其独有的优势不可替代, 在应用当中应该遵循取长补短综合互补的原则, 充分发挥技术与仪器的优势 生物信息学通过对蛋白质组学数据的分析, 能够揭示生物学过程, 促进蛋白质组学研究发展, 但还待进一步提高 相信随着生物质谱和相关技术的不断完善和改进, 必将会在蛋白质组学研究中发挥更加重要的作用 参考文献 [1] Cho A, Normile D. Nobel prize in chemistry: Mastering macromolecules[j]. Science,2002,298(5593):527-528. [2] Shevchenko A, Ole N J, et al. Linking genome and proteome by mass spectrometry: large-scale identification of yeast proteins from two- dimensional gels[j]. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 1996,93 (25):14440-14445 [3] Gygi S P, Corthals G L, et al. Evaluation of two- dimensional gel electrophoresis-based proteome analysis technololgy[j]. [4] Wells W W, G H Wang, et al. Comparative Study of Three Proteomic Quantitative Methods, DIGE, cicat, and itraq, Using 2D Gel- or LC-MALDI TOF/TOF[J]. Journal of Proteome research, 2006,5(3):651-658 [5] Fenn J B, Mann M, Meng C K, et al. Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecules[j].science,1989,246 (4926):64-71. [6] Vestal M L, Juhasz P, Martin S A. Delayed extraction matrixassisted laser desorption time- of- flight mass spectrometry[j].rapid Communications in Mass Spectrometry,1995,9(11):1044-1050. [7] Tisato F B, Cristina P, Marina F R. Contribution of electrospray mass spectrometry for the characterization, design, and development of nitrido technetium and rhenium heterocomplexes as potential radiopharmaceuticals[j].mass Spectrometry Reviews,2004, 23(5):309-332. [8] 盛龙生, 苏焕华, 郭丹滨. 色谱质谱联用技术 [M]. 北京 : 化学工业出版社,2005:38-42. [9] Bachi A, Bonaldi T. Quantitative proteomics as a new piece of the systems biology puzzle[j].journal of Proteomics,2008,71(3):357-367. [10] 王勇为.LTQ-Orbitrao Velos 双分压线性阱和静电场轨道阱组合式高分辨质谱性能及应用 [J].2010,5. [11] Edman P, Begg G. A protein sequenator[j].european Journal of Biochemistry,1967,1(1):80-91. [12] Yates J R. Mass spectral analysis in proteomics[j].annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure,2004,33:297-316. [13] Mintz P J, Kim J, Do K A, et al. Fingerpringting the circulating repertoire cancer patients[j].nature Biotechnology,2002,21:57-63. [14] Witze E S, Old W M, Resing K A, et al. Mapping protein posttranslational modifications with mass spectrometry[j].nature
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