第 卷第 期 年 月 西安交通大学学报 医学版!"#$## %&'& '& 临床研究 非多重耐药及多重耐药鲍曼不动杆菌外排泵及其表达 刘泽世 呼 瑞 张 毅 陈正立 耿 燕 薛 丽 西安交通大学第二附属医院检验科 陕西西安 # 西北妇女儿童医院妇产科重症监护室 陕西西安 河北医科大学第一医院检验科 河北石家庄 $ 摘要 目的 探讨多重耐药鲍曼不动杆菌 %!&'!"'()* 及非多重耐药鲍曼不动杆菌 +,%!&'!"'-,()* 的外排泵表型 基因型和外排泵基因表达情况 方法 应用.,* 法将 株临床分离的鲍曼不动杆菌 分成 ()*/ 株和 -,()*# 株两组 参照 0&1' &"" 方法检测鲍曼不动杆菌的外排泵表型 即采用微量肉汤稀释法 观察加入泵抑制剂羰基氰氯苯腙 前后其 值的变化 筛选出加入泵抑制剂后 值比原值降低 # 倍或以上的菌株为 )* 外排泵表型阳性 ( 法扩增外排泵蛋白基因并测序进行序列分析 结果 / 株 ()* 对, 内酰胺类 头孢菌素类 碳青霉烯类 氨基糖苷类 喹诺酮类 四环素类 磺胺类 多黏菌素类抗菌药物的耐药率分别为 # // // ##/ /2//$ /2//2//# 株 -,()* 对头孢菌素类, 内酰胺类 碳青霉烯类 氨基糖苷类 喹诺酮类 四环素类 磺胺类 多黏菌素类抗菌药物的耐药率分别为 $ #$$22#/#2/$ 外排泵抑制检测结果显示 / 株 ()* 有 # 株外排泵阳性 外排泵基因检测有 株 "* 株 "( 株 "0 株 "3 株 "4 和 株 " 检出阳性率分别为 //#///# 株 -,()* 未检测到外排泵阳性菌株 但外排泵基因检测有 株 "* 株 "( 株 "02 株 "3 株 "4 和 株 " 检出阳性率分别为 $2$ 对 "*"("0"3" 基因进行测序 经比对 所测序列与 5" *6 中序列同源性为 结论 外排泵基因广泛存在于 ()* 中 但在 -,()* 中亦可以发现主动外排泵基因的存在 关键词 鲍曼不动杆菌 多重耐药 外排泵 羰基氰氯苯腙 基因型 表型中图分类号 (2// 文献标志码 ) $/! "#$!%&"#%$ %#"#%$% 789",' :8 (!' 9:)-5 ;' :4-9",&' 54-5 ; 847' "%"+"'&&''&7++"0"+ )'&'":+'&+' 3'++ 8 '1"'' #"%"+"'1""8 ''"'+%" '&":+'&' "%"+&''&7++ "':+'&+:""'"'&8 '1"'0''!$' '' " "!()*"+" '+!()*&,+* "-""##"/""# +"&."#"" "" + " -/ #" "/ ""#/#" #/0 "0/-$%"0"&$-!1"#"# -&###-""/ ( #"#&#/# /+# ##/ #" ####" 收稿日期 ++/ 修回日期 +#+/ 通讯作者 耿燕 &+--2/$2&# 优先出版 ---&#&#"&//&(&&2#&#&++!"!
2 西安交通大学学报 医学版 第 卷 -&//&/&#/&#&#&/&/2&//&$/2&//2&/ /&"& ##-&$ &#& $&$&22&&#&/#&2/&$"&-# /"#""*"( "$""/!-"#/&/#&/& /&"/&# & -"#"# " /"*"("$2"" "/! -"#$2&&$"& # &* ### "*"("$""/! - 2/& / ""+" & ( ) "# #/#"#/0 "0 鲍曼不动杆菌 ) 是一种临床常见的非发酵革兰阴性杆菌 其可以广泛分布于医院环境 医务人员和患者的皮肤表面 属于 常见的院内感染条件致病菌 近年来随着免疫抑制剂 广谱抗生素的广泛使用和侵入性的医疗操作的, 常规开展 使 ) 的感染率呈逐年上升的趋势 中国鲍曼不动杆菌感染与防控专家共识 将多重耐药鲍曼不动杆菌 %!&'!"' ()* 定义为对 $ 类抗菌药物中至少 类抗菌药物耐药的菌株 其中包括 含有 内酰胺酶抑制剂的复合制剂 包括哌拉西林 他唑巴坦 头孢哌酮 舒巴坦 氨苄西林 舒巴坦 抗假单胞菌碳青霉烯类抗生素 抗假单胞菌头孢菌素 氨基糖苷类抗 # 生素 氟喹诺酮类抗菌药物 笔者以往研究表明 在体外实验中外排泵的存在使 ) 对头孢菌素类, 内酰胺类 碳青霉烯类 氨基糖苷类 喹诺酮类 四环素类 磺胺类 多黏菌素类等抗菌药物呈现不同程度的耐药 而在体外实验中加入泵抑制剂羰基氰氯苯腙 后 泵抑制剂与外排泵相互作用 通过逆转质子的主动转运 提高药物对 (,)* 的抗菌活 $ 性 )(:)- 和 :)8 发现外排泵基因 "*"("0"3"4" 与 ) 的耐药密切相关 但是 目前尚无明确研究表明非多重耐药鲍曼不动杆菌 +,%!&'!"' -,()* 是否存在有上述外排泵基因的表达 本研究通过对 ()* 及 -,()* 表型和基因型检测 探讨外排泵对 ) 耐药性的影响 * 材料与方法 ** 材料 药敏纸片 哌拉西林 片 亚胺培南 片 阿米卡星 ). 片 庆大霉素 54- 片 氨苄西林 舒巴坦 0) 片 环丙沙星 $ 片 复方新诺明 0<$ 片 头孢吡肟 ( 片 头孢曲松 (= 片 四环素 < 片 多黏菌素 **8 片 头孢哌酮 舒巴坦 0$ 片 哌拉西林 他唑巴坦 <9 片 美罗培南 ( 片 左氧氟沙星 74$ 片 头孢噻肟 < 片 法国生物梅里埃公司产品阴性杆菌的 5- 鉴定卡 英国 = 公司的.,* 法药敏纸片 大肠埃希菌 )<$/ 及鲍曼不动杆菌 )</ 为质控菌株 购自 +%" 公司 "& "&74-)!'''+.' 试剂盒提取 -) 购自美国 +%" 公司 5+<> 5"" "'5+<> +&+&" " ' 试剂盒进行 ( 扩增 购自北京赛百盛公司 5+&1'" 进行 -) 染色剂 购自北京赛百盛公司的 -) 7" 6" 购自上海生工生物工程技术服务有限公司的琼脂糖,& 羰基氰氯苯腙 和泵抑制剂溶解试剂二甲亚砜均购于河北博世林公司 *+ 菌株来源与保存 # 年 # 月至 $ 年 月从河北医科大学第一医院和西安交通大学第二附属医院分离到的不重复菌株 株作为实验菌株 标本类型包括痰液 分泌物 尿液 血液 脓液 引流物 胸腹水 使用 : 培养基将收集的菌株进行纯培养 挑取单个菌落接种于营养肉汤中 待增菌后 将增菌液与 $ 甘油肉汤? 混匀 置于 @ 冰箱保存 *, 细菌鉴定 根据临床分离的 株不重复菌株的菌落形态和革兰染色结果 经法国梅里埃公司 '"6 全自动微生物检测仪鉴定为 ) *- 药敏实验 按照 年,) 临床实验室标准研究所 &''&7++0'!, "70 推荐的.',*!" 法 进行哌拉西林 亚胺培南 阿米卡星 庆大霉素 氨苄西林 舒巴坦 环丙沙!"!
期 刘泽世 呼 瑞 张 毅 等 非多重耐药及多重耐药鲍曼不动杆菌外排泵及其表达 2 星 复方新诺明 头孢吡肟 头孢曲松 四环素 多黏菌素 * 头孢哌酮 舒巴坦 哌拉西林 他唑巴坦 美罗培南 左氧氟沙星 头孢噻肟等 种抗菌药物药敏实验 对 $ 类抗菌药物中至少 类抗菌药物耐药的菌株为 ()* 类同时耐药的菌株为 -,()* *./' 外排泵表型的检测 应用 0&1'&"" 方法 比较加入 泵抑制剂前后其 值的变化 筛选出加入泵抑制剂后 值比原值降低 # 倍或以上的 ) 菌株 外排泵表型检测的抗菌药物选用四环素 庆大霉素 头孢噻肟 左氧氟沙星 具体步骤如下 用分析天平称取 #2% 抗菌药物溶解于 #%7 的无菌生理盐水 使其原液的质量浓度为 $ %7 取 只无菌试管 第 个无菌试管加入 %7 营养肉汤以及 #%7 抗菌药物原液 其余无菌试管加入 %7 营养肉汤 将第 个无菌试管中液体混匀后吸取 %7 加入第 管 混匀再吸取 %7 加入第 管 依次倍比稀释至第 管 再吸取第 管中 %7 混合物弃去 第 管为阳性对照 不含抗菌药物 这样第 管至第 管的药物质量浓度依次为 $2# 2#$$%7 从每个无菌管中取 7 抗菌液加入至 / 孔微量肉汤药敏板中 用表 * 外排泵耐药基因引物 <<"'%"+"&!!%!,"'"" 分析天平准确称取 # % 粉剂 完全溶解于 %7 二甲亚砜 取 只无菌试管 每个管中加入 %7 无菌生理盐水 再分别向每个无菌试管中加入 $$$#$#$$$ $%7 溶液 此时质量浓度依次为 $$$ #$#$$$$%7 分别取 7 溶液至 / 孔微量肉汤药敏板 并同时每孔加入 /7 菌悬液 此时 第 孔至第 孔 溶液质量浓度分别为 $$$#$$$ $%7 第 孔作为仅加入菌悬液的阳性对照 最终确定 溶液的工作浓度 采用微量肉汤稀释法测定加入泵抑制剂 后 # 种抗菌药物 四环素 庆大霉素 左氧氟沙星 头孢噻肟 对 / 株 ()* 和 # 株 -,()* 的 值 同时使用加入泵抑制剂和空白孔作为生长对照 对照管中 ) 生长良好 值为抑制细菌生长的最低药物稀释浓度 参照 70 年标准进行结果判读 单位为 %7 *0 目的基因的扩增 *0* 引物设计 参考文献 2 设计引物 包括 "*"("0"3"4" 和 0(-) 见表 引物 引物序列 +! '" 5" *6 "'+ -+ "* "( "0 "3 "4 " 0(-) 前后前后前后前后前后前后前后 $A,<<))5)<)55<<5<)),A $A,<5)5)5)))<55))<)5<,A $A,)<)5)<)<<555))<<,A $A,55<)5)<<))5))5)<<,A $A,<<55<<)5)<5<<)<<,A $A,)5<55)5<<)55<))5<<,A $A,)<<5))))5<)),A $A,<)5<55)<))5)5)<),A $A,5)5<5)55)<<<<)<5<,A $A,)5<5<5<))<)<)5<,A $A,5<)55<5<)55<<)<55),A $A,5<)5))5<5)<5)))<, $A,55)55))55<5555)<5)5,A $A,)<55<5<5)55555<5<5,A $# ## )22$ );#// $## );#// #$ $# # );// B/ );#2 0(-) 作为管家基因保证每个基因转录的正确性 *0+-) 提取及扩增 使用 "& "& 74 -)!'''+.' 试剂盒提取 -) 按说明书操作 ( 总反应体系为 $7 其中 C5+, <> 5"" "'$7 引物 )7 引物 *7-) 模板 #7(-","" 水 $ 7 反应条件 /#@ 预变性 $%' /#@ 变性 %' $$@ 复性 $@ 延伸 %' 个循环 最后 @ 延伸 $%' *0, 琼脂糖凝胶电泳 将配制 C<*4 的电泳液稀释成为 $C<*4 的缓冲液 分别加入 27 的上样标本量和 -) 分子量 6" 在电压 作用下 电泳 $%' 在紫外凝胶成像系统和全自动凝胶图像成像仪上观察电泳结果 阳性的判定标准为凝胶上出现与目的基因片段分子相当的条带!"!
22 西安交通大学学报 医学版 第 卷 *0- 产物核苷酸序列的测定 由上海生工生物工程技术服务有限公司进行 ( 产物核苷酸序列测定 测得的核苷酸序列应用 -)0 软件中的 4', "> 和 "&' 进行分析 参比序列选取正反向双向测序结果一致的序列 比对序列应用 *7)0< 程序 *1 统计学处理 所得数据均采用细菌耐药性监测中心推行的 :=-4< 统计软件和 000 进行数据处理 ()* 及 -,()* 对 种抗菌药物的耐药率及外排泵基因型表达阳性率进行卡方检验 检验 以 $ 为差异具有统计学意义 + 结 果 +.*0 株 ' 和 +- 株 &' 对 *1 种抗 菌药物的耐药情况 / 株 ()* 对阿米卡星 庆大霉素 氨苄西林 舒巴坦 哌拉西林 环丙沙星 头孢哌酮 舒巴坦 哌拉西林 他唑巴坦 诺氟沙星 左氧氟沙星 头孢噻肟 复方新诺明 头孢吡肟 头孢曲松 四环素等 # 种抗菌药物耐药率在 $ 以上 对亚胺培南 美罗培南抗菌药物耐药率分别为 #$# 对多黏菌素 * 无耐药发生 # 株 -,()* 对阿米卡星 庆大霉素 氨苄西林 舒巴坦 哌拉西林 环丙沙星 头孢哌酮 舒巴坦 哌拉西林 他唑巴坦 诺氟沙星 左氧氟沙星 头孢噻肟 复方新诺明 头孢吡肟 头孢曲松 四环素等 # 种抗菌药物耐药率在 以下 对亚胺培南 美罗培南 多黏菌素 * 抗菌药物无耐药发生 表 表 +0 株 ' 和 +- 株 &' 对 *1 种抗菌药物的耐药情况 <("!&+!"''1'"+/ ()*#-,()* 抗菌药物 ()* D/ -,()* D# 耐药率 中介率 敏感率 耐药率 中介率 敏感率 阿米卡星 2/ / / 2# ## 2$# 庆大霉素 /$// / / $# ## 2# 氨苄西林 舒巴坦 2#/ 22/ #$/#/ $# 2# //# 哌拉西林 2/// // #/ 2# ## 2$# 亚胺培南 #$/ #/ $$/ ## 环丙沙星 22$#2$/ /2// 2/ $# ## 2# 头孢哌酮 舒巴坦 $/ 22/ #$/ 2# 2# 2## 哌拉西林 他唑巴坦 // 22/ 2$2/ $# ## 2# 美罗培南 $##/ ##/ #$2/ ## 诺氟沙星 22$#2$/ // ##/ 2# 2# 2## 左氧氟沙星 22/ $/ #/ 2# 2# 2## 头孢噻肟 /$// ##/ 2/ $# ## 2# 复方新诺明 // $/ #$2#/ 2# 2# 2# # 头孢吡肟 #/ 22/ $$/ $# ## 2 # 头孢曲松 2$2/ // #/ 2# 2# 2# # 四环素 /2// 2/ $$/ 2# 2# 2# /# 多黏菌素 * // ## +.+ 抗菌药物加入外排泵抑制剂 前后的药物敏感试验结果 / 株 ()* 在 # 种抗菌药物加入 后 四环素 左氧氟沙星 庆大霉素 头孢噻肟的 范围分别由 2#22#2 变为 2 #2#22 表 # 株 -,()* 在 # 种抗菌药物加入 后 四环素 左氧氟沙星 庆大霉素 头孢噻肟的 范围未发生明显变化 +, 外排泵阳性菌株检出结果 / 株 ()* 在加入泵抑制剂 后 四环素的药敏结果中 值降低 # 倍及以上共有 株 降低 倍的共有 2 株 没 有变化的共有 $ 株 左氧氟沙星的药敏结果中 值降低 # 倍及以上共有 # 株 降低 倍的共有 株 没有变化的共有 # 株 庆大霉素的药敏结果中 值降低 # 倍及以上共有 $ 株 降低 倍的共有 / 株 没有变化的共有 # 株 头孢噻肟的药敏结果中 值降低 # 倍及以上共有 / 株 降低 倍的共有 株 没有变化的共有 $ 株 筛选出 # 株 ) 在加入 泵抑制剂后四种抗生素 值均降低 # 倍 # 株 -,()* 未检测到外排泵阳性菌株!"!
期 刘泽世 呼 瑞 张 毅 等 非多重耐药及多重耐药鲍曼不动杆菌外排泵及其表达 2/ 表, 加入外排泵抑制剂 前后对 0 株 ' 药物 的影响 <<"""+"""+""++!"''1'+/ ()*' 抗菌药物耐药率 值 值 范围 %7 $ / 四环素四环素 E /2// $$/ 22 2 # 2 2# # 左氧氟沙星左氧氟沙星 E 22/ $#/ /# #2 # 2 2 2 庆大霉素庆大霉素 E /$// / # 2 2 # # # 头孢噻肟头孢噻肟 E /$// $/ 2 #2 # 2 22 2 +.-,- 株外排泵阳性 ' 和 +- 株 &' 外排泵基因型的检测 # 株外排泵 ()* 中外排泵基因检测有 株 "* 株 "( 株 "0 株 "3 株 "4 和 株 " 检出阳性率分别为 //#///# 株 -,()* 外排泵基因检测有 株 "* 株 表 -,- 株外排泵阳性 ' 和 +- 株 &' 外排泵基因型检测结果 <#<""!&+"&!!%"+"+# ()*#-,()* 外排泵基因型 外排泵基因阳性株数 ()* D/ 检出阳性率!"! "( 株 "02 株 "3 株 "4 和 株 " 检出阳性率分别为 $2 $ 耐药基因 "*"("0"3 " 序列与 5" *6 参考株序列核苷酸同源性均为 未发现基因变异现象 表 # -,()* D# 外排泵基因阳性株数 检出阳性率 "* / $ / "( /# 2 / $ "0 / "3 / 2 $ #$# $ "4 " /, 讨 论 近 年来 ) 已逐步成为引起院内感染最重要的机会致病菌 ) 在高水平基因组可塑性和内源性基因突变的影响下 菌体表面外排泵过度表达 排出诸如庆大霉素 氯霉素 喹诺酮类 红霉素 卡那霉素等药物 由于药物无法进入 ) 的菌体 故 ) 免于 /, 药物的杀灭 继而形成多重耐药株 引起 ) 多重耐药的主要外排泵包括 )")*)"3.)"4 )" 因此 上述外排泵在 -,()* 和 ()* 中的作用已逐渐成为 ) 是否形成多重耐药株的关键 本研究中 / 株 ()* 和 # 株 -,()* 的药敏结果显示 ()* 头孢吡肟 头孢噻肟 头孢曲松 头孢哌酮 舒巴坦的耐药率分别为 # /$2$$ 对哌拉西林 氨苄西林 舒巴坦 哌拉西林 他唑巴坦的耐药率分别为 2/2/ 对亚胺培南 美罗培南的耐药率分别为 #$# 对阿米卡星 庆大 值 值 霉素的耐药率分别为 2/$ 对环丙沙星 诺氟沙星 左氧氟沙星的耐药率分别为 22$# 22$#2 对四环素 复方新诺明 多黏菌素 * 的耐药率分别为 //-,()* 头孢吡肟 头孢噻肟 头孢曲松 头孢哌酮 舒巴坦的耐药率分别为 $$2$2 对哌拉西林 氨苄西林 舒巴坦 哌拉西林 他唑巴坦的耐药率分别为 2$$ 对亚胺培南 美罗培南的耐药率分别为 对阿米卡星 庆大霉素的耐药率分别为 2$ 对环丙沙星 诺氟沙星 左氧氟沙星的耐药率分别为 $ 22 对四环素 复方新诺明 多黏菌素 * 的耐药率分别为 22 与何振辉等报告的药敏结果基本一致 在分子解离状态下 是一种很强的解偶联剂 通过在膜磷脂两侧自由扩散而形成浓度差 这种浓度差可以减慢 : E 进入细胞膜时由跨膜电化学浓度梯度产生的 )< 的过程 )< 的减少使得菌体外排蛋白能量供应缺失 外排泵无法将药物从菌体内泵
2 西安交通大学学报 医学版 第 卷 出至菌体外 本实验选取了 ) 耐药率最高的 # 种抗菌药物 四环素 左氧氟沙星 庆大霉素 头孢噻肟作为外排底物 通过比较加入 泵抑制剂前后 / 株 ()* 及 # 株 -,()* 对抗菌药物 的变化 实验结果表明 四环素 值降低 # 倍及以上共有 株 左氧氟沙星的药敏结果中 值降低 # 倍及以上共有 # 株 庆大霉素 值降低 # 倍及以上共有 $ 株 头孢噻肟 值降低 # 倍及以上共有 / 株 最终筛选出 # 株 ) 在加入 泵抑制剂后 # 种抗生素 值均降低 # 倍 # 株 -,()* 未检测到外 # 排泵阳性菌株 与徐轶等报道的 逆转泛耐药鲍曼不动杆菌耐药性的趋势较为一致 说明泵抑制剂 可以体外抑制外排泵 提升药物对 ()* 的体外抗菌活性 本研究对 # 株外排泵阳性株进行外排泵基因检测 得到 株 "* 株 "( 株 "0 株 "3 株 "4 和 株 " 检出阳性率 / 本研究中 "* 的出现几乎伴随着 "( 和 "0 的出现 这 与 )(:)- 等的 "( 和 "0 协同参与 ", )* 的过度表达 引起调控蛋白转录活性增强 增加耐药几率的研究结果一致 研究中 "3 的存在表明 )"3. 过度表达 其可以影响 ) 对, 内酰胺类药物 氯霉素 四环素 林可霉素 喹诺酮类药物 新生霉素 利福平的敏感性 同时 )"3.)")* 协同参与对 $ 替加环素的耐药 研究中未检测到 "4 的存在 与 7- 等发现当 "4 存在于 ) 基因组 中时 ")* 无法与其共同存在与同一株 ) 中的结论一致 研究中 " 的存在 表明 " 外排系统过度表达 其可以引起 ) 对喹诺酮类 庆大霉素 卡那霉素 红霉素 氯霉素敏感性降低 尽管在 # 株 -, ()* 未检测到外排泵阳性菌株的存在 但外排泵基因检测有 株 "* 株 "( 株 "02 株 "3 株 "4 和 株 " 检出阳性率为 2 尽管统计学表明除 "( 之外 其余阳性率有明显差异 但由于在 -,()* 菌体表面检测到有外排泵基因的存在 可以证明虽然主动外排泵是 ) 发生耐药的主要因素 但只单纯检测 ) 是否存在主动外排泵基因并不能区分菌株是否多重耐药 因此 ) 发生多重耐药是否与外排泵基因的表达水平或与其他耐药机制相互作用有关仍需进一步证实 参考文献 )(, $3,!455 4$&)) *""# + &5 /# 6 (##+& $5(5$6$6)261+)$61)'1!)6(1+,)3)'1! &)#/## "!"#)++ #" &)#!"1#22+2#& ).'4 )$!(56 336)(&1# ### +" "##&1# 6 $/2+& # 陈佰义 何礼贤 胡必杰 等 & 中国鲍曼不动杆菌感染诊治与防控专家共识 & 中华医学杂志 /+2$& $ 刘泽世 & 泛耐药鲍曼不动杆菌与其主动外排泵蛋白的相关性研究 & 河北医科大学 #&!)(6)'1)!1(+153335(%)31' 3)!+ *(('+ )")* )#/#/"/ )"($-+# &)#/)##2//2+ #& 6)$36 4.65)'2$&'#+"+ +#" )" )#/#+ #')&)#/)# #2#$#+#$$& 26576' 44)'27&$" # #-)")*)"1, )"")/!## &$2$+$2& / 宋彩虹 陆水英 张秀瑜 等 & 鲍曼不动杆菌临床分离株的耐药性及同源性分析 & 中国微生态学杂志 $+#& )*)33)6!53)71$5455($&)# ##/##" #" "+ '- 4 &)#/ )$$/ 2+2$& ())!56)' 2$(1'1%)$)' %*2*(4$.)&!+ #"###0 ))"#/""## &)#/ $///+/$& 何振辉 严俭敏 钟瑞雪 等 & 鲍曼不动杆菌的临床分布 耐药表型分析及防治对策 & 中华疾病控制杂志 #2#+2& 卢灵锋 李光荣 向成玉 等 & 鲍曼不动杆菌 "* 基因检测及外排泵抑制剂对其药物敏感性的影响 & 国际检验医学杂志 $$+$& # 徐轶 章白苓 章洁苓 等 & 泛耐药鲍曼不动杆菌主动外排泵 "* 基因表达及耐药性研究 & 实验与检验医学 $ +& $54'$5(%)31'(165' *&+"" /## )#/# & )#/ )$$/#+/$& 31'331'2*318&/" ")*"""1,"# +#/+ ## )#/#/+)#/###### &1)#/)/+& $.1,!!5(2)'+31''33$,)(35$',!&+ "#)*+") " ###### " "#& )#/ )$$/+/#& 编辑 卓选鹏!"!