中国农学通报 2011,27(10):168-172 Chinese Agricultural Science Bulletin 白菜转脂蛋白基因 CaMBP10 的 RNAi 沉默体系的初步建立 张蕊, 胡文全, 谢万钦, 李翠凤 ( 南开大学生物化学与分子生物学系, 天津 300071) 摘要 : 为研究白菜转脂蛋白 CaMBP10 的体内功能, 构建含有该基因片段的 RNAi 质粒, 以农杆菌介导法对大白菜 津育 60 进行遗传转化, 通过对转基因植物在生物与非生物胁迫中表型变化的研究, 确定其体内功能 文章报告 RNAi 质粒的构建 鉴定及其转化植株基因组 DNA 中外源片段的鉴定 DNA 分析结果显示, 外源基因已成功插入了白菜基因组,RT-PCR 检测结果显示转化植株内源 CaMBP10 基因的表达明显降低, 为后续的转脂蛋白体内功能研究奠定了基础 关键词 : 转脂蛋白 ;CaMBP10;RNA 干扰 ; 遗传转化中图分类号 :Q781 文献标志码 :A 论文编号 :2010-2448 Prelimilary Establishment of RNAi-mediated Lipid Transfer Protein Gene CaMBP10 Silencing System in Chinese cabbage Zhang Rui, Hu Wenquan, Xie Wanqin, Li Cuifeng (Department of Biochemistry and Molecular Biology, Nankai University, Tianjin 300071) Abstract: In this paper, a RNAi approach was used in down-regulated CaMBP10 gene expression to study its functions in vivo. A 273 bp fragment of CaMBP10 cdna was cloned from Chinese cabbage JINYU 60 and inserted into the RNAi vector PTCK303. According to the results of detections, sense and anti-sense of CaMBP10 fragments had been cloned into RNAi victor between the left and right of an intro from rice. The Chinese cabbage JINYU 60 was transformed by Agrobacterium tumefaciens LBA4404 which harbored this anti-sense CaMBP10 gene. The result of RT-PCR analysis shows that the CaMBP10 gene expression was reduced in transgenic plants. This work would serve as a good base for following research. Key word: lipid transfer proteins (LTPs); CaMBP10; RNA interference; genetic transformation 0 引言 CaMBP10 是一种从大白菜 (Brassica compestris L. ssp. pekinensis Olsson) 中分离的钙调素结合蛋白 -10 (calmodulin-binding protein-10,cambp10) [1] 前期研究发现其通过与 CaM 的特异性结合对植物 NAD 激酶 [2] 的激活和类囊体蛋白的磷酸化等均有显著影响 近年来, 笔者克隆了 CaMBP10 cdna 全长, 并进行表达与鉴定 根据 DNA 序列比对 CD 蛋白质二级结构分析及体外的脂结合活性检测结果, 确认其是植物转脂 蛋白 (plant lipid transfer proteins LTPs) 家族成员 [3-4] 植物转脂蛋白 (lipid transfer proteins,ltps) 是一 类广泛存在于高等植物中的碱性小分子蛋白 体外研 究发现其能与磷脂和脂肪酸结合, 并在膜之间进行脂 类的转运, 由此而得名 [5] 近年来,LTPs 的多种生理功 能先后被提出, 其中最重要的是 LTPs 参与了植物生物 [6] 和非生物胁迫应答反应, 并被命名为病程相关蛋 白 -14(pathogenesis-relatedprotein-14,PR-14) [7] CaMBP10 作为植物转脂蛋白, 体外分析显示其具 基金项目 : 国家自然科学基金 (30871614); 天津市自然科学基金 (08JCYBJC04100) 第一作者简介 : 张蕊, 女,1985 年出生, 内蒙古包头市人, 硕士, 研究方向 : 生化与分子生物学, 通信地址 :300071 南开大学生命科学学院,Tel: 022-23503585,E-mail:zhangrui1222@mail.nankai.edu.cn 通讯作者 : 李翠凤, 女,1949 年出生, 内蒙古呼和浩特市人, 教授, 研究方向 : 生物化学与分子生物学, 通信地址 :300071 南开大学生命科学学院,Tel: 022-23503585,E-mail:licf@nankai.edu.cn 收稿日期 :2010-08-16, 修回日期 :2010-11-27
张蕊等 : 白菜转脂蛋白基因 CaMBP10 的 RNAi 沉默体系的初步建立 169 有脂结合活性和抗真菌活性, 体内检测发现盐 旱和真 [8] 菌激发子均可诱导其过表达, 初步说明其参与了植物的生物和非生物胁迫反应 为了深入了解 CaMBP10 的体内功能, 笔者构建了 CaMBP10 的 RNAi 载体, 拟通过对转化植株表型变化的研究, 确定其体内功能 文章主要报告了 RNAi 载体的构建 鉴定及其转化苗外源基因的鉴定 靶基因沉默率的分析 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 植物材料市售大白菜 津育 60 种子 1.1.2 菌株与质粒 E.coli DH5α 菌株购于 Novagen 公 司, 农杆菌 LBA4404 及 SK - 载体为本实验室保存, PTCK303 载体由河北师范大学孙颖教授惠赠 1.1.3 试剂抗生素购于普博欣公司, 限制性内切酶购于 TAKARA 公司,T 4 DNA 连接酶 Taq DNA 聚合酶 RNase dntp RT-PCR 试剂盒均购于上海生工,DNA 回收试剂盒购于 Omega 公司 1.2 方法 1.2.1 RNAi 质粒的构建以 CaMBP10 cdna (AY618212.2) 为模板, 并根据其序列 ( 图 1) 设计 2 对 ( 正向和反向 ) 特异引物, 分别引入酶切位点, 通过 PCR 法扩增目的片段 1. GCT CTA AGC TGT GGA ACC GTT AGC GGT AAC TTG GCA GCA TGC ATT GGC TAC TTA ACC CAA A L S C G T V S G N L A A C I G Y L T Q 61. AAT GGG CCC CTT CCC AGA GGG TGC TGC ACC GGC GTT ACT AAT CTA AAC AAC ATG GCC CGT N G P L P R G C C T G V T N L N N M A R 121. ACA ACC CCG GAC CGT CAG CAA GCT TGC CGT TGT CTT GTA GGA GCC GCT AAC TCC TTC CCT T T P D R Q Q A C R C L V G A A N S F P 181. ACT CTC AAC GCT GCC CGA GCT GCT GGA CTT CCT AAG GCA TGT GGA GTC AAT ATT CCT TAC T L N A A R A A G L P K A C G V N I P Y 241. AAA ATC AGC AAA AGC ACC AAC TGC AAC AGC GTT AGG ATG GCGGC.GGTCG.GATGA AGAAA A GCGGA K I S K S T N C N S V R 下划线分别为上 下游引物, 方框内为终止密码子 图 1 CaMBP10 cdna 核苷酸序列及对应的氨基酸序列图 正向上游引物 :5 -GGACTAGTGCTCTAAGCTG TGGAACCG-3, 酶切位点 SpeⅠ; 正向下游引物 :5 -CCGAGCTCCCTAACGCTGT TGCAGTTG-3, 酶切位点 SacⅠ; PCR 反应条件为 :94 4 min,94 1 min,60 45 s, 72 1 min,30 个循环 ;72 10 min; 反向上游引物 :5 -GGGGTACCGCTCTAAGCTG TGGAACCG-3, 酶切位点 KpnⅠ; 反向下游引物 :'-CGGGATCCCCTAACGCTGTT GCAGTTG-3, 酶切位点 BamHⅠ PCR 反应条件同上 为了准确将目的片段插入 RNAi 载体 PTCK303 中, 先将上述扩增产物分别插入 SK 载体中 方法如下 : 回收 PCR 扩增的正 反向 CaMBP10 片段并分别用 SpeⅠ/SacⅠ,KpnⅠ/BamHⅠ 双酶切, 用 1% 琼脂糖凝胶电泳纯化和回收酶切产物 同时, 用两对相同酶对 SK 载体进行双酶切和电泳纯化 回收 分别用连接酶将回收的目的片段与线性化的载体连接, 转化至 DH5α 感受态细胞, 抗生素平板培养过夜 第二天挑取阳性克隆送公司进行序列测定 待测序结果正确后, 再分别将正 反向目的片段切下并插入 PTCK303 载体 图 2 PTCK303 CaM BP10 RNAi 质粒示意图的内含子两侧 先插入正向片段, 再插入反向片段 将构建好的 PTCK303-CaM BP10 RNAi 质粒 ( 图 2) 转入农杆菌 LBA4404 感受态细胞中, 提取质粒, 进一步进行酶切鉴定 1.2.2 大白菜 津育 60 遗传转化体系的建立首先对侵染所用农杆菌的浓度 侵染时间及共培养时间进行优化, 确定最佳的侵染条件 采用卡那霉素抑制农杆菌的生长, 潮霉素进行抗性筛选, 并通过正交试验优化
170 中国农学通报 http://www.casb.org.cn 卡那霉素和潮霉素的最适浓度 1.2.3 转基因植株基因组 DNA 的提取和外源片段的 PCR 检测采用 CTAB 法分别提取野生植株和转基因 植株叶片的基因组 DNA, 以 PTCK303 载体中内含子 345 363 序列 ( 内含子全长为 478 bp) 为特异性上游引 物, 配合反向目的片段引物, 以提取的 DNA 为模板进 行 PCR 扩增, 鉴定目的片段是否成功插入转化植株的 基因组 DNA 中 上游引物 :5 -TATGACAGTTCCACGGCAG-3 ( 内含子 345 363 序列 ) 下游引物 :5 - GCTCTAAGCTGTGGAACCG-3 ( 反向目的片段的上游引物 ) PCR 反应条件为 :94 4 min,94 1 min,60 45 s,72 1 min,30 个循环,72 10 min 1.2.4 半定量 RT-PCR 检测转基因植物内源 CaMBP10 基因的表达按 Trizol 试剂盒说明分别提取野生植株 和转化植株叶片的总 RNA,DNase 消化后以分光光度 计检测, 严格将总 RNA 的量控制在 1 μg/μl 取 250 ng 总 RNA 进行反转录, 以反转录 cdna 为模板, 用上述 CaMBP10 引物, 进行 RT-PCR 扩增 以 1% 琼 脂糖凝胶电泳检测 PCR 扩增产物, 用 Gel-Pro5. 软件对 RT-PCR 结果进行分析 2 结果与分析 2.1 重组 RNAi 质粒 PTCK303-CaMBP10 的鉴定 2.1.1 正向和反向 CaMBP10 的 PCR 扩增产物分析以 及 SK -CaMBP10 质粒的鉴定图 3A 3B 分别为正向 和反向 CaMBP10 片段的 PCR 扩增图谱 泳道 2 扩增 区带的位置显示, 目的片段的大小与预期结果一致 (273 bp) 将构建好的 SK -CaMBP10 质粒转化至 DH5α 感受 态细胞, 挑取阳性克隆进行序列测定, 结果显示插入的 外源片段序列正确 A A. 1:DNA Marker,2: 正向 CaMBP10 片段的 PCR 扩增区带 B. 1:DNA Marker,2: 反向 CaMBP10 片段的 PCR 扩增区带 图 3 正向和反向 CaMBP10 片段的 PCR 扩增图 2.1.2 PTCK303-CaMBP10 RNAi 质粒的鉴定分别提取含有正 反向插入片段的 SK 质粒, 双酶切后, 琼脂糖凝胶电泳纯化并回收酶切片段, 将其分别插入 RNAi 载体 PTCK303 的内含子两侧 图 4 显示 PTCK303-CaMBP10 质粒的酶切鉴定结果 分别用 2 对限制性内切酶 SpeⅠ/SacⅠ,KpnⅠ/BamHⅠ 双酶切, 酶切片段的大小与预期结果一致 ( 图 4, 泳道 3 4) 由于在正 反向插入片段中间有一段载体的内含子序列 (478 bp), 所以用 SpeⅠ/KpnⅠ 双酶切, 酶切片段的大小应为两段 CaMBP10 序列加中间的内含子序列 (1024 bp) 图 4 泳道 5 显示, 酶切片段的大小与预期结果相符, 表明 CaMBP10 基因已正确插入 PTCK303 载体中 1:DNA Marker,2:PTCK303-CaMBP10 重组质粒,3 4 分别为限制性内切酶 SpeⅠ/SacⅠ 和 KpnⅠ/BamHⅠ 的酶切结果 5: 包括内含子及两侧 CaMBP10 插入片段在内的酶切 (SpeⅠ/KpnⅠ,1024 bp) 结果 图 4 重组 RNAi 质粒 PTCK303-CaMBP10 的酶切鉴定 2.2 遗传转化体系的建立 2.2.1 农杆菌侵染的浓度及时间适宜的农杆菌浓度是转化成功的重要因素之一 浓度过低, 会影响侵染效率, 浓度过高, 过度繁殖的农杆菌会对外植体造成伤害 因此, 尝试了 4 种不同浓度进行侵染,OD 600 分别为 1.5 1.0 0.8 和 0.5 同时对侵染时间也进行了优化, 最终选择 OD 600 0.8 侵染 5 min, 共培养时间为 2 天 2.2.2 抗生素的使用浓度通过正交试验确定了抑制农杆菌生长的卡那霉素浓度为 400 mg/l 潮霉素的抗性筛选浓度确定为 5 mg/l 2.3 转基因植物的鉴定 2.3.1 转基因植物 DNA 中外源插入片段的鉴定分别以野生植株和转基因植株的基因组 DNA 为模板, 以载体内含子上的特定序列为上游引物, 配合反向目的片段的引物进行 PCR 扩增 由图 5 可知, 从转化苗 DNA 中扩增的外源片段 ( 反向 CaMBP10 插入片段 + 部分内含子序列, 共 406 bp) 与直接从 RNAi 质粒上扩增的该片段大小一致 ( 泳道 3 和泳道 2), 野生苗 DNA 中未见
张蕊等 : 白菜转脂蛋白基因 CaMBP10 的 RNAi 沉默体系的初步建立 171 1:DNA Marker,2: 重组 RNAi 质粒中 CaMBP10 插入片段 + 部分内含子序列的 PCR 结果 ( 阳性对照 ),3: 转基因植株 DNA 中的 CaMBP10 插入片段 + 部分内含子序列的 PCR 结果,4: 野生型植株 DNA 中 CaMBP10 插入片段 + 部分内含子序列的 PCR 结果 ( 阴性对照 ) 图 5 转基因苗 DNA 中外源基因的分析 相应的扩增区带 ( 泳道 4), 说明外源片段已整合到转基因白菜的基因组中 2.3.2 转基因植物内源 CaMBP10 表达量的鉴定分别提取野生白菜幼苗和转基因白菜苗的叶片总 RNA, 反转录为 cdna, 用 CaMBP10 的上 下游引物进行 RT-PCR 扩增 ( 以 actin 作为内参 ), 图 6 显示转基因苗中的 CaMBP10 基因已被部分沉默, 因而其表达量明显低于野生型白菜的表达量 Gel-Pro5. 软件的分析结果显示转基因苗的 CaMBP10 表达量比野生型白菜的表达量约降低 30% 左右 尽管 CaMBP10 基因的沉默率较低, 仍然为今后进一步提高基因沉默率的研究提供了有价值的实验数据, 也为后续的胁迫抗性研究奠定了良好的基础 3 讨论 RNA 干扰 (RNAi) 是通过外源或内源双链 RNA 在 A:RT-PCR 扩增图谱,1: 转基因苗中 CaMBP10 的表达量,2: 野生白菜中 CaMBP10 的表达量 (Actin 为内参 ) B:Gel-Pro5. 软件的分析结果,1 和 2 分别为转基因苗和野生白菜中 CaMBP10 表达量与 Actin 表达量的比值 图 6 转基因苗中 CaMBP10 基因表达量分析 细胞内诱导同源序列的基因表达受抑制的现象 当 RNAi 载体中的外源 DNA 导入细胞后, 生成双链 RNA 并被切割成 21~23 bp 的短核苷酸片段 该短核苷酸片段能特异地与同源 mrna 结合并使其降解, 从而导致内源特异性基因沉默, 使细胞表现出特定基因缺陷 [9] 的表型 因此,RNAi 是用来研究目的基因体内功能的重要技术 目前, 构建植物 RNAi 表达载体的方法 [10-11] 共有 3 种 :(1) 以酶切连接为基础的传统的 RNAi 表 [12] 达载体构建 ;(2) 以重组 PCR 技术为基础结合酶切连 [13] 接的植物 RNAi 表达载体构建 ;(3) 以同源重组为基 [14] 础的 RNAi 表达载体构建 笔者采用第 2 种方法成功构建了 CaMBP10 基因的 RNAi 沉默载体, 并认为此法简单可行, 易于构建各类表达载体 在载体的构建过程中, 通常是将目的基因片段直接插入到所需的载体中 由于笔者所用的载体 PTCK303 分子量较大 ( 为 14621 bp), 且无公共测序引物, 自行设计的测序引物可能会在退火温度等方面同测序公司的标准化程序存在差异, 难以保证获得正确的测序结果 因此, 采用了亚克隆的方法, 即先将目的片段克隆至 SK - 载体中, 待序列测定正确后再将其切下, 亚克隆至 PTCK303 载体, 构建了重组 PTCK303-CaMBP10 RNAi 质粒 通过对重组质粒和再生植株的分子检测, 证明使用该法构建的重组质粒正确无误, 并已成功插入白菜基因组 DNA 中, 为目的基因体内功能的研究奠定了基础 但由于目的基因的沉默率仍然较低 (30%), 尚需进一步改进 参考文献 [1] 尚克进, 凌启阆, 李翠凤, 等. 一种新的植物钙调素结合蛋白. 生物化学与生物物理学报,1991,23:416-422.
172 中国农学通报 http://www.casb.org.cn [2] 李翠凤, 向左云, 凌启阆. 等.CaMBP-10 对类囊体膜蛋白磷酸化的影响. 中国科学 :C 辑,1998,28:64-70. [3] Liu H, Xue L, Li C F, et al. Calmodulin-binding protein BP-10, a probable new member of plant nonspecific lipid transfer protein superfamily. Biochem Biophys Res Commun, 2001,285:633-638. [4] Li C F, Xie W Q, Bai W Y, et al. Calmodulin binds to maize lipid transfer protein and modulates its lipids-binding ability. FEBS J, 2008, 275:5298-5308. [5] Kader J C. Lipid-transfer proteins in plants. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol,1996,47:627-654. [6] Kader J C. Lipid transfer proteins: a puzzling family of plant proteins. Trends Plant Sci,1997,2:66-70. [7] Van Loon L C, Van Strien E A. The family of pathogenesis-related proteins, their activities, and comparative analysis of PR1-type proteins. Physiol Mol Plant Pathol,1999,55:85-97. [8] 胡文全, 谢万钦, 李翠凤, 等. 外源茉莉酸和真菌激发子诱导白菜 CaMBP10 的表达. 植物病理学报,2009,39:328-332. [9] Bass B L. Double stranded RNA as a template for gene silencing. Cell,2000,101:235-238. [10] 马建, 魏益凡, 厉志, 等. 植物 RNA 干扰表达载体构建方法的研究. 安徽农业科学,2009,37(8):8364-8366. [11] 化占勇, 刘雅莉, 徐伟荣, 等. 同源重组快速构建百合 LCHS2 基因 RNAi 表达载体及其鉴定. 中国农学通报,2010,26(2):38-44. [12] Lucia C P, Roger B D, Elizabeth C, et al. Inverted repeat PCR for the rapid assemble of constructs to induce RNA interference. Plant and cell physiology, 2005,46(11):1872-1878. [13] Xiao Y H, Yin M H, Hou L, et al. Direct amplification of intro containing hairpin RNA construct from genomic DNA. Bio Techniques,2006,41:548-552. [14] 徐品三, 尹雅蕾, 李玉花. 百合无症病毒 SP 基因的克隆 RNAi 载体的构建. 园艺学报,2009,366:885-890.