蛋白質 緒論 蛋白質 1. 細胞的主要成份, 約佔總乾重的一半以上為細胞生物大分子中最重要者 - 擔任多種功能 * 2. 蛋白質是遺傳訊息的表現者蛋白質體計劃 (proteomics) - 了解蛋白質的特性與功能才可能回答有關生命奧秘的問題 - 未知功能的蛋白質仍佔多數 1
表四蛋白質的生物功能 生物功能催化功能結構功能運動功能運輸功能防禦保護功能儲存功能調節管制功能其它 例子酵素角蛋白, 膠原蛋白, 纖維蛋白肌紅蛋白, 肌動蛋白血紅素, 肌紅蛋白抗體, 補體, 凝血因子酪蛋白 ( 牛奶 ), 卵白蛋白, 儲鐵蛋白胰島素, 生長激素細菌毒素, 蛇毒蛋白 蛋白質的功能 催化 (~20%) 調節 (14%) 運輸 (5%) 儲存收縮運動結構 (5%) 訊息傳遞保護其他 (5%) 未知功能 (>40%) 2
3. 蛋白質為胺基酸構成的大生物分子由 20 種胺基酸構成的聚合物, 每種胺基酸的側鏈構造不同 * - 極性 : 親水帶電荷, 不帶電 - 非極性 : 疏水有些胺基酸經轉譯後修飾作用 (post-translational modification)* - 與功能有關 : 凝血因子, 膠原蛋白 4. 蛋白質的大小胰島素 (51 個胺基酸 ), 細胞色素 c (104 個胺基酸 ), 血紅素 (574 個胺基酸 ), 彈性蛋白 titin (26,926 個胺基酸 ) 側鏈為疏水, 非極性 側鏈為芳香族, 疏水 側鏈不帶電但具極性 側鏈帶正電荷 側鏈帶負電荷 組成蛋白質的 20 種胺基酸構造 3
特殊胺基酸 - 轉譯後修飾作用 5. 蛋白質的分類依外觀形狀與溶解度 * - 球狀蛋白, 纖維狀蛋白, 膜蛋白大部分功能性的蛋白質為球狀蛋白 依組成分 - 簡單蛋白 (simple protein) - 複合蛋白 (conjugated protein)* 4
蛋白質的分類 纖維狀蛋白 ( 膠原蛋白 ) 膜蛋白 ( 細菌視紫素 ) 球狀蛋白 ( 肌紅蛋白 ) 複合蛋白 脂蛋白 醣蛋白 血基質蛋白核黃蛋白 金屬蛋白 5
6. 纖維狀蛋白外觀為纖維狀或長條狀擔任結構, 支撐, 保護的角色 - 膠原蛋白 ( 皮膚, 韌帶, 軟骨等 ), 絲蛋白 ( 蠶絲 ), 角蛋白 ( 頭髮 ) 7. 球狀蛋白外觀為球形 - 立體結構緊密, 水分子不易進入 - 表面有極性 ( 親水性 ) 胺基酸的側鏈可與水接觸或與其他分子產生交互作用擔任功能性角色 - 其中以酵素最重要唯有酵素存在, 生命才得以發生與延續 8. 膜蛋白在水溶液中的溶解度極低位於膜構造的環境, 蛋白質表面多為非極性的胺基酸側鏈 - 些鑲嵌於膜的構造中, 有些附著於膜上, 有些懸掛於膜上 膜蛋白多為球狀蛋白 - 形成通道控制物質進出運輸蛋白, 離子通道 - 參與外界訊號的傳遞激素等受體蛋白 - 參與能量的產生呼吸鏈, ATP 合成酶 6
蛋白質的分離與純化 緒論 1. 蛋白質純化利用一系列步驟將非興趣的蛋白質自樣品中移除並保留特定蛋白質的過程 - 要分析特定蛋白質的結構與功能, 需將此蛋白質由其存在的環境 ( 如細胞抽取液 ) 中分離出 2. 純化蛋白質的用途純化所得的蛋白質組成均一, 可用於進行活性分析的生理生化研究, 析出晶體的結構研究, 工業上固定化酵素的應用 蛋白質分離與純化的原理 1. 分離的原理利用蛋白質分子量的大小, 帶電特性, 溶解度, 蛋白質與特定物質間的吸附作用等 2. 分子量大小透析 (dialysis)*, 超過濾 (ultrafiltration)* 分子篩 (molecular sieve) 或膠體過濾 (gel filtration) 管柱層析 (column chromatography)* 7
超過濾 透析 ( 半透膜 ) 分子篩, 膠體過濾管柱層析 8
3. 帶電特性離子交換 (ion exchange) 管柱層析法 * 等電點焦集 (isoelectric focusing)* - 等電點, pi 電泳 (electrophoresis) - SDS-PAGE (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis)* -2D 電泳 (two-dimensional gel electrophoresis)* - 毛細管電泳 (capillary electrophoresis) 離子交換管柱層析 9
等電點交集 SDS 的構造 膠體電泳 蛋白質 SDS-PAGE 可用於估測蛋白質分子量 10
依等電點分離 2D 電泳 依分子量分離 4. 溶解度鹽析法 (salting out)* 5. 非專一性的吸附作用如活性碳 6. 專一性的吸附作用專一性的吸附 - 抗體與抗原, 酵素與受質親和力管柱層析 * 11
鹽析法 親和力管柱層析 親和基 12
蛋白質的純化結果 蛋白質的結構 一級結構 1. ( 各 ) 多肽鏈中胺基酸的組成與排列次序 * 二級結構 1. 連接各胺基酸的肽鍵 (peptide bond) 間因氫鍵作用而形成重複出現的特殊結構 13
N 端 C 端 多肽鏈的表示方式與方向性 - Serylglycyltyrosylalanylleucine, Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu, SGYAL 血紅素的四個結構層次 血紅素 Hemoglobin 14
2. 肽鍵的構造與特性 -C α -C o -N- C α - 具部份雙鍵特性 (partial double-bond character)* - 平面構造 (amide plane, peptide plane) 自由旋轉度 (Φ, Ψ) Ramachandran plot* - 甘胺酸 (glycine) - 脯胺酸 (proline) α- 螺旋破壞者 兩胺基酸以肽鍵連接 肽鍵因共振而無法自由旋轉, 具 部分雙鍵 特性 15
由 Ramachandran plots 預測的各種構造 實例 ( 兔的 pyruvate kinase), 排除 Gly 3. 典型的二級構造 α- 螺旋, β- 褶片 * - Pauling 與 Corey 因提出此類構造而同獲 1954 年諾貝爾化學獎 - 結構特性 - 特定蛋白質中特定二級構造的含量 * β- 轉折 * - 結構特性 16
Linus Pauling (1901-1994) -1954 年諾貝爾化學獎 Robert Corey (1897-1971) α- 螺旋構造 (1) 胺基酸的側鏈 Hydrogen bond Hydrogen bond 17
α- 螺旋構造 (2) R group R group ( 側鏈 ) 逆向平行 β- 褶片構造 同向平行 R group ( 側鏈 ) 18
β- 轉折構造 ( 較普遍 ) 多肽鏈中含 Pro 時, 其肽鍵具有 trans 與 cis 異構形式 19
Amino acid Residues ~ 100 129 124 α- 螺旋構造 40% 40% Very little 3. Supersecondary structures 結構模組, 結構區域 (motifs, folds) - 二級構造的組合功能區域 (domains) - 功能性 4. Random coil Unorganized structures Random coil is not random! 20
蛋白質中常見的摺疊模式 結構模組 結構模組 功能區域 兔的 pyruvate kinase 的特定功能區域是由數個結構模組組成的 球形蛋白具有緊密的構形 - 以人類血清白蛋白 (human serum albumin) 為例 Mr 64.500 kda, 585 胺基酸 residues in a single chain 21
三級結構 1. 已具有二級構造的多肽鏈因胺基酸側鏈間的交互作用而折疊扭轉成特有的緊密立體形狀 四級結構 1. 當具有生物功能的蛋白質 * 是由兩條或兩條以上的多肽鏈 ( 次單元 ) 組成時, 次單元在立體空間的相互關係 2. 形成四級構造的優點增加結構安定性遺傳物質能有效利用形成功能或活性部位調節與協同效應 22
蛋白質四個結構層次的關係 四級結構或超分子結構的優點 23
超分子結構 (supermolecular organization) 1. 細胞內不同的蛋白質 ( 具有三級或四級構造 ) 因行使功能而產生交互作用的實際狀態 2. 例子 Replisome (DNA 複製體 ) Proteasome ( 蛋白質降解體 )* Transcriptosome ( 轉錄體 ) Apoptosome ( 凋亡體 ) Inflammasome ( 發炎體 ) ATP synthasome (ATP 合成體 ) respirasome ( 呼吸體 ) 維持蛋白質結構的作用力 1. 共價作用力一級構造 : 肽鍵三級結構 : 雙硫鍵 * 2. 非共價作用力二, 三, 四級結構氫鍵, 離子鍵, 凡得瓦爾力, 疏水作用 - 弱的作用力大部份蛋白質只能在溫和的環境 ( 溫度, ph 值 ) 中發揮功能 3. 蛋白質的變性 (denaturation) 蛋白質因維持結構的作用力受破壞而失去特有的結構與活性 - 通常是蛋白質特有的形狀遭受破壞, 因此蛋白質變性有時是可逆的 24
牛胰臟分泌的 RNase 由 124 個胺基酸組成, 含有 4 個雙硫鍵 雙硫鍵 雙硫鍵的形成 4. 蛋白質結構與功能的密切關係由 Anfinsen 等人以核糖核酸水解酶 (RNase) 進行一系列的實驗證明 RNase* - 含 124 個胺基酸, 有 4 個雙硫鍵 - 以還原劑及尿素處理 RNase* 雙硫鍵被還原, 非共價作用力被破壞 -RNase 發生 變性, 喪失水解 RNA 的活性 - 在適當條件下移除還原劑及尿素時 RNase 的活性可完全恢復重新折疊的 RNase, 所測得的物理或化學特性均和原來酵素相同 25
Anfinsen 等人的實驗 雙硫鍵的正確配對 Anfinsen 等人的實驗 - 所有處理皆不破壞連接各胺基酸間的共價鍵結蛋白質的一級構造不受影響 - 提出 蛋白質的一級構造決定蛋白質特定的立體構形 與 蛋白質的功能與其特有的結構有關 的論點 - 確立蛋白質結構與功能的關係, 促進以生物分子為基礎探討演化過程的研究 -Anfinsen 等人獲得 1972 年諾貝爾化學獎 26
蛋白質立體構造的摺疊 (protein folding) 1. Anfinsen 等人的實驗 All of the information necessary for folding the peptide chain into its native structure is contained in the amino acid sequence of the peptide 2. 蛋白質特有構形 (conformation) 的形成 * Levinthal s paradox (1968 年 ) - 假設一蛋白質含有 100 胺基酸如每一胺基酸只有兩種可能的空間分佈情形, 則有 2 100 個可能性若測試每一種可能需 10-13 sec, 則需 4 10 9 years, 但 in vivo 只需 ~ 5 sec 自然構形, 原始構形 (native conformation) - dynamic, flexible 蛋白質的摺疊 胰凝乳蛋白酶與甘胺酸 27
3. 摺疊的過程 * Overall energy minimum - 驅動力 (driving force) 亂度 (entropy) 疏水的胺基酸側鏈 (R groups) Funnel model* - Energy landscape 二級構造 功能區域 模擬的蛋白質摺疊過程 - 含 36 個胺基酸的蛋白質 villin 片段 ( 為 actin 接合蛋白, 存於小腸的 microvillin lining) - 模擬的摺疊過程需耗時 1 msec 28
Substantial exclusion of water - Occurs very early in the folding process The funnel represents a free energy surface or energy landscape for the folding process, the folding process is highly cooperative, rapid and reversible formation of local secondary structures followed by a slower phase to establish the partially folded intermediates that leads to the final tertiary structure 蛋白質摺疊的油滴模式 - The hydrophobic residues of a polypeptide chain tend to cluster together, somewhat like an oil drop, on the inside, or core, of a folded protein, driven away from the aqueous surroundings by the hydrophobic effect - The charged and uncharged polar side chains appear on the protein s surface where they can form stabilizing interactions with surrounding water and ions 29
疏水效應 4. 參與摺疊的蛋白質蛋白質在合成後, 並非皆能及時自發摺疊成正確構形, 蛋白質快速正確的摺疊需許多其他蛋白質協助分子伴護蛋白 (molecular chaperones) - 伴隨蛋白, 伴從蛋白 (chaperones, 被動角色 )* 與未摺疊或部份摺疊的蛋白質接合, 避免其黏集或被降解 in vivo 實驗顯示為蛋白質正確摺疊及形成四級構造所必需, 如 Hsp70s ( 熱休克蛋白 70) - 伴護蛋白 (chaperonins, 主動角色 )* 直接促進蛋白質的摺疊, 如 Hsp60s 30
Chaperone-mediated protein folding Chaperonin-mediated protein folding Chaperones 在蛋白質摺疊過程中的角色 (E. coli) 31
Chaperonins 在蛋白質摺疊過程中的角色 (E. coli) 其他 - Protein disulfide isomerase (PDI) 雙硫鍵的正確配對 - Peptide proyl cis-trans isomerase (PPI) 脯胺酸 32
5. 與蛋白質摺疊缺失有關的疾病 The prion disease ( 普昂疾病 ) -Prion(proteinaceous infectious only) Prusiner, 1997 年諾貝爾生醫獎 Cystic fibrosis ( 纖維囊腫 ) - Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) 因胺基酸 (F508) 刪除突變, 導致摺疊過程的中間產物無法自 chaperones 脫離, CFTR 無法抵達其最終作用場所 Emphysema ( 肺氣腫 ) - α 1 -Antitrypsin 彈力蛋白 (elastin), elastase Stained section of cerebral cortex from autopsy of a patient with C-J disease shows spongiform degeneration 正常 異常 The propagation of infectious prion protein Occurs via conversion of normal prion protein (left) to a disease-causing form (right) 人類 PrP 蛋白單體 ( 左 ) 與雙聚體 ( 右 ) 形式 33
蛋白質結構與功能關係的研究實例 肌紅蛋白與血紅素 1. 肌紅蛋白 (myoglobin, Mb) 負責肌肉細胞內 O 2 的輸送與儲存, 屬功能性蛋白質含 153 個胺基酸與血基質 (heme)* 肌紅蛋白的結構 * - 由研判 X 光晶體繞射結果得知 - 整個分子為摺疊十分緊密的球狀, 其中 75% 為 α- 螺旋構造, 血基質約位於分子中心並以所含的 Fe +2 與 O 2 接合進行輸送及儲存 O 2 -Perutz 因此貢獻獲得 1962 年諾貝爾化學獎 肌紅蛋白 ( 抹香鯨 ) 的三級構造 血基質, 鐵紫素 Perutz ( 左, 血紅素 ) 與 Kendrew( 右, 肌紅蛋白 ) - 同獲 1962 年諾貝爾化學獎 34
2. 血紅素 (hemoglobin, Hb) 在肺與組織間擔任 O 2 的輸送 * 具有四級構造 * -Kendrew 因解出此構造而與 Perutz 同獲 1962 年諾貝爾化學獎 - 由兩個 α 次單元與兩個 β 次單元成一四面體的立體排列 - 組成的 α 次單元 ( 含 141 個胺基酸 ) 與 β 次單元 ( 含 146 個胺基酸 ) 的分子中心, 分別含血基質可與 O 2 接合 - α 次單元與 β 次單元的結構雖非完全相同但極類似 *, 其個別的立體構造也均與肌紅蛋白類似, 顯示高度相似的立體結構與其同為攜氧蛋白的功能有關 肌紅蛋白與血紅素 β 次單元的三級結構比較 35
鯨魚肌紅蛋白與人類血紅素 α 次單元與 β 次單元的胺基酸序列比對 3. 血紅素四級構造對其功能的影響不同的 O 2 濃度 (O 2 分壓, po 2 ) 下, O 2 和血紅素的接合關係呈現 S 型曲線 * - 與 O 2 與肌紅蛋白間的 雙曲線 型關係明顯不同 - 血紅素的 4 個次單元與 O 2 的接合具有正的協同作用, 即 O 2 與任一個次單元接合會加速 O 2 與其他次單元的接合 36
雙曲線 S 型曲線 血紅素與 O 2 的接合亦受到 po 2 與 ph 值 ( 波爾效應 ) 的影響 -po 2 愈高, ph 值愈高, 血紅素被 O 2 飽和 ( 接合 ) 的程度愈高在肺部, po 2 與 ph 值均高, 大部分血紅素均被 O 2 飽和在組織, po 2 低且 ph 值因代謝產物及 CO 2 而降低時, 血紅素與 O 2 的接合減弱, 因而可因應組織的需求而釋出 O 2 供利用 相同條件下 - 肌紅蛋白不具四級構造, 對 O 2 的接合不具協同作用, 也不受 po 2 或 ph 值的影響 37
ph 值對血紅素與 O 2 接合的影響 3. 血紅素與 O 2 的接合受 2,3-bisphosphoglycerate (2,3-BPG) 的調控對胎兒發育極為重要 - 成人血紅素 HbA (α 2 β 2 ), 2,3-BPG 接合至 β 次單元 - 胎兒血紅素 HbF (α 2 γ 2 ), 無 β 次單元, 對 2,3-BPG 親和性低, 對 O 2 親和性較成人血紅素高 38
正常人類血液中 BPG 的濃度 - ~ 5 mm at sea level - ~ 8 mm at high altitude 相同 ph 值與 2,3-BPG 濃度下, HbA 與 HbF 對氧分壓的飽和曲線 2,3-BPG 對血紅素與 O 2 接合的影響 T 構形 Positively charged groups BPG 與 deoxy 血紅素的接合 Binding pocket disappears R 構形 39
4. 與血紅素相關的疾病鐮形細胞貧血症 (sickle-cell anemia)* - Molecular disease ( 由 Pauling 於 1949 年提出 ) - Sickle-cell hemoglobin (HbS) β 次單元的 Glu6 ( 側鏈帶負電 ) 置換為 Val6 ( 側鏈為疏水 ) 地中海型貧血症 (Thalassemias) - α-thalassemias ( 甲型, β 4 或 γ 4 ) α 次單元缺失 - β-thalassemias ( 乙型 ) β 次單元缺失 表面疏水的區塊 溶解度差 正常與鐮形細胞貧血症患者的紅血球 鐮形細胞貧血症患者紅血球內的血紅素 40
角蛋白, 膠原蛋白與絲纖維蛋白 1. 均為扮演結構功能的纖維狀蛋白通常由規則性的二級結構組合形成特殊的構造 - 具有較強韌, 較穩定的特性, 符合擔任保護與支撐的生物功能 2. 角蛋白由兩股 α- 螺旋相互纏繞形成 coiled coils* - 一級構造具有 (a-b-c-d-e-f-g) n, 其中 a 與 d 為非極性胺基酸頭髮的構造 * - 共價的 cross-links - 燙髮 (permanent wave) 的原理 Cysteine ( 具 -SH) 頭髮的構造 頭髮的橫切面 燙髮的生化基礎 41
3. 膠原蛋白基本構造為特殊的三股螺旋狀構造 * 1/3 為甘胺酸 (glycine), 富含脯胺酸 (proline) - 一級構造具 Gly-X-Y, 其中 X 為 Pro, Y 為 Pro 或 Hyp Gly 佔 35%, Pro 或 Hyp 佔 21% Hyp (hydroxylation of Pro) - 轉譯後修飾作用 - 酵素活性仰賴維生素 C ( 抗壞血酸 ) 維生素 C 嚴重缺乏導致壞血病 (scurvy) Ehlers-Danlos syndrome - 甘胺酸置換成側鏈較大的胺基酸習慣性脫臼 甘胺酸 膠原蛋白纖維的結構 膠原蛋白的結構 42
4. 絲纖維蛋白為 β- 褶片構造, 層層相疊 * 富含甘胺酸 (glycine), 甲胺酸 (alanine) - 每兩個胺基酸就有一個甘胺酸出現 纖維狀蛋白會形成特殊的結構都是因其特殊的一級構造, 即特定的胺基酸組成與排列 - 再次驗證 Anfinsen 等人對蛋白質結構的形成與結構功能關係的論點 絲的構造 絲纖維蛋白為層層 β- 褶片相疊的構造, 富含甘胺酸 Gly 與甲胺酸 Ala 43
蛋白質構形的變化 蛋白質的構形 1. 蛋白質分子為 dynamic 的 2. 球形蛋白分子振動, 如胺基酸側鏈的擺動 * - Subtle, 如 breathe 構形變化 (conformational change)* - Dramatic, 與活性有關例子 - 酵素 : 受質 - 血紅素 :O 2 - 肌肉收縮 : 肌凝蛋白, 肌動蛋白, Ca +2 44
氧的接合蛋白 1. 肌紅蛋白 (Mb) 與血紅素 (Hb) 2. O 2 的接合部位鐵紫素, 血基質 (heme, Fe +2 ) - 與 O 2 接合的能力受蛋白質結構影響游離的血基質 - CO binding : O 2 binding = 25,000 : 1 含血基質的蛋白 (Mb, Hb)* - CO binding : O 2 binding = 200 : 1 血基質 肌紅蛋白 Protoporphyrin IX 45
Steric effects caused by ligand binding to the heme of myoglobin Distal 肌紅蛋白 游離的血基質 Proximal 血紅素中的血基質 3. 肌紅蛋白與血紅素的功能受結構影響生物功能 * - 氧儲存 : 氧輸送結構 * - 三級構造 : 四級構造 (α 2 β 2 ) 與氧的接合 * - 無協同性 ( 雙曲線 ) : 具協同性 ( S 形曲線 ) - 不受調節 : 受調節 46
4. 血紅素的構形變化 * T 構形 (T state, tensed 或 taut) - 分子結構較緊縮 - Deoxy form, 對 O 2 親和力弱 R 構形 (R state, relaxed) - 分子結構較膨鬆 - Oxy form, 對 O 2 親和力強 47
不接氧 接氧 T 構形 R 構形 Porphyrin is slightly Puckered, heme iron protrude on His F8 side Heme assumes a more Planar conformation, shift the position of His F8 and F helix 血紅素接 O 2 時血基質鄰近區域構形的改變 48
5. 血紅素為異位蛋白 (allosteric protein) Allos (Greek: other), Stereos (Greek: solid or shape) 活性部位 (active site) - 血紅素 : O 2 ( 酵素 : 受質 ) 協同性調節部位 (regulatory site) - 調節劑 (modulator) 阻礙劑 (inhibitor): 2,3-BPG, H +, CO 2 活化劑 (activator) T 構形 Positively charged groups Binding pocket disappears 2,3-BPG 接合至 T 構形 R 構形 49
蛋白質結構的測定與預測 緒論 1. 不同的胺基酸數目, 不同組成與排列會生成不同的蛋白質 2. 不同蛋白質因不同構造而有不同的生物功能研究蛋白質的一級構造對蛋白質的功能研究日漸重要 一級構造的測定 1. 一級構造的測定是求出多肽鏈中胺基酸的組成與排列次序 2. 胺基酸的組成分析利用由 1972 年諾貝爾化學獎得主 Stein & Moore 所開發的胺基酸分析儀 - 蛋白質酸水解 * 可提供的資訊 * 50
蛋白質的酸水解 9.55% 胺基酸的組成分析 1.18% 胺基酸的組成分析 : Frequencies of various amino acids in proteins 數據來自超過 10 萬個蛋白質的胺基酸組成, 共約 4 千萬個胺基酸 (the SWISS-PROT protein knowledgebase) 51
Cytochrome c: 50/104 (48%) Chymotrypsin: 126/245 (51%) Aliphatic, Aromatic 疏水性 52
3. 胺基酸的排列順序利用胺基酸定序儀取得 Sanger* - 因決定胰島素分子的構造並提出分析蛋白質一級構造的方法而獲得 1958 年諾貝爾化學獎 現今 - 大多數蛋白質的胺基酸序列可由基因的核苷酸序列推知 Sanger 因提出分析 DNA 序列的方法再獲得 1980 年諾貝爾化學獎 - 一級構造的分析對研究蛋白質是否具有轉譯後的修飾作用仍深具價值 牛胰島素的定序 - 耗時約 10 年, 使用約 100 克的蛋白質 Frederick Sanger (1918~) - 1958 年諾貝爾化學獎 ( 蛋白質定序 ) - 1980 年諾貝爾化學獎 (DNA 定序 ) 53
蛋白質定序步驟 * - 純化 - 次單元的分離 -N 端與 C 端胺基酸的定性 - 多肽鏈分割成小片段 - 胺基酸自動定序 - 序列重組 - 雙硫鍵定位 * 蛋白質雙硫鍵的破壞 54
N 端胺基酸定性 FDNB 胺基酸定序反應 PITC 專一性, 可預測 55
Edman degradation 蛋白質定序過程 56
雙硫鍵的定位 - Diagonal electrophoresis ( 對角線電泳 ) 4. 其他方法質譜分析法 (mass spectrometry)* - 離子化, 質量電荷比 ( 電場 ) - Fenn & Tanaka (2002 年諾貝爾化學獎 ) 生物資訊學 57
蛋白質的電噴灑質譜分析 (1) A Protein solution is dispersed into charged droplets by passage through a needle under a high-voltage electric field (2) The droplets evaporate and ions enter the mass spectrometer for m/z measurement 蛋白質的質譜分析圖譜 The spectrum generated and a computer-generated transformation of the spectrum 58
串聯的質譜分析 二級 三級與四級結構的研究 1. 利用物理的方法利用蛋白質分子對偏極光的轉向能力 * 或核磁共振 * 的原理估測二級構造中 α- 螺旋或 β- 褶片的含量利用 X 光繞射法 * 研究蛋白質結晶的構造 - 取得蛋白質的三級與四級結構等 59
CD 光譜分析 Standard γ β α 2D 核磁共振圖譜 One-dimensional NMR spectrum of a globin from a marine blood worm 60
X 光晶體繞射法 以 X 光晶體繞射法研究抹香鯨肌紅蛋白結構的過程 蛋白質結構的預測 1. Anfinsen 等人的實驗證明 蛋白質的一級構造決定蛋白質的立體結構, 而蛋白質的立體結構又與其功能息息相關 - 如能由蛋白質的一級構造預測蛋白質的立體結構, 將加速蛋白質體計劃的研究 61
2. 由蛋白質的一級構造預測二級構造目前多以分析已知結構的蛋白質中, 各類二級構造所出現的胺基酸種類為準 * - 由 Chou 與 Fasman 於 1974 年提出對每一種胺基酸出現在各類二級構造中的相對頻率給予特定數值 ( 如 P α, P β, P t ), 經計算後可預測蛋白質的二級構造 此法經已知結構的蛋白與預測結果比對驗證, 其準確性可達 95% 以上 特定胺基酸出現在三種常見二級結構的相對機率 62
3. 三級構造的預測較為複雜目前仍仰賴計算機龐大的資料存取與計算能力 (computerbased calculation, 以 energy minimum 為原則 ), 配合進一步分析已知結構的蛋白質中不同層級的細部構造 (knowledge-based method, database) - 尚未能精準有效的預測結果 63
蛋白質的結構與演化 緒論 1. 分析不同蛋白質的胺基酸組成與序列, 可推斷蛋白質是否源自同一祖先 ( 即同源蛋白 ) 2. 肌紅蛋白與血紅素的研究即是一例 肌紅蛋白與血紅素的研究 1. 肌紅蛋白的結構與血紅素的 α 次單元或 β 次單元的結構均非常類似, 且同具有攜氧的功能極可能源自一個共同的祖先 * - 一原始的球蛋白 肌紅蛋白與血紅素的 α 次單元或 β 次單元的胺基酸序列比較 64
肌紅蛋白與血紅素的 α 次單元及 β 次單元極可能源自一個共同的祖先 - α 次單元與 β 次單元約 140 個胺基酸中有 64 個相同 - 肌紅蛋白與 α 次單元有 38 個胺基酸相同 肌紅蛋白與血紅素的 α 次單元或 β 次單元的立體結構比較 細胞色素 c 的研究 1. 比較不同來源的細胞色素 c 的胺基酸序列說明蛋白質的結構研究對演化關係建立的重要性細胞色素 c - 是粒線體電子傳遞鏈的成分對細胞的存活極為重要 2. 分析得自酵母菌至人類等 40 多種來源的細胞色素 c 雖然蛋白質的一級構造不盡相同但卻有令人訝異的相似處 - 細胞色素 c 平均含有 104 個胺基酸中有 28 個完全相同 * 目前已知此 28 個胺基酸和細胞色素 c 的功能有密切關係, 只要任一個胺基酸被其他種類的胺基酸取代時皆會影響細胞色素 c 的功能 65
不同物種間細胞色素 c 胺基酸序列差異的程度比較 3. 比較不同物種的細胞色素 c 的胺基酸序列不同物種間的序列差異程度與其親緣關係有一定的比例關係 * - 如人的細胞色素 c 胺基酸序列與黑猩猩的完全相同 - 與其他哺乳類有 10 個胺基酸的差異 - 與爬蟲類有 14 個差異, 與魚類, 軟體動物, 昆蟲與酵母或高等植物則分別有 18 個, 29 個, 31 個與 40 個以上的差異 66
4. 由分析細胞色素 c 的胺基酸序列差異所架構的 演化樹 (phylogenetic tree, 系統發生樹 ) 和使用傳統方法所建立的演化關係極為符合 * 衍生出利用分析特定蛋白質的胺基酸序列以建構演化關係的分子演化學 (molecular evolution) - Divergent evolution ( 趨異演化 ) - Convergent evolution ( 趨同演化 ) 由分析細胞色素 c 建構的演化樹 67
蛋白質與其它分子的交互作用 緒論 1. 蛋白質在表現生物功能時需和其它分子有直接的接觸此類接觸通常是緊密且專一的, 會形成大的複合體 - 如調控基因表現的核酸蛋白 - 如細胞辨識的醣蛋白與坐落在細胞膜上的脂蛋白此類接觸雖然與細胞的繁殖, 生長, 發育等不同的活性有關, 但其間的交互作用與專一的辨識過程均十分相似 - 與特定蛋白質產生專一性接合的分子統稱為親和基 (ligand) 如酵素的受質或產物, 輔因子, 阻害劑或活化劑, 甚至運輸蛋白所輸送的物質等 親和基的接合作用 1. 特定蛋白質與親和基的接合通常具有專一性專一性 - 兩者構造的互補 - 兩者接合可產生新的安定作用力 2. 蛋白質與親和基間的接合多經由非共價的作用力, 為一可逆的過程每個蛋白質與特定親和基的接合可發生在蛋白質內的一個部位或多個部位 - 多個部位中, 與同一種親和基接合的能力或親和力 (affinity) 可能相同或不同, 可產生接合協同性 (binding cooperativity) 此種關係稱為 homotropic 效應, 如血紅素與 O 2 的接合 68
一個蛋白質中也可有不同親和基種類的接合部位 - 不同親和基接合部位在親和基接合時會有相互溝通的特性此種關係稱為 heterotropic 效應, 如血紅素與 O 2 的接合受 2,3-BPG 與波爾效應的影響 異位效應 (allostery) 1. 異位效應蛋白質的不同部位間的相互影響 - 為具有四級結構之蛋白質所特有 2. 具異位效應的蛋白質含有不同的次單元一為催化次單元, 是反應受質接合的部位一為調節次單元, 是調節物質接合的部位當兩種不同親和基接合部位因親和基接合而引發構型改變, 進而彼此溝通 - 以血紅素攜氧特性與影響攜氧能力的因子研究為此效應的最佳例子 69
蛋白質活性的調節 緒論 1. 影響蛋白質活性的因子除溫度, ph, 受質, 輔因子或調節劑濃度等外, 尚有三個較為重要的機制 切除活化 1. 例子消化酵素, 凝血因子與一些激素 - 蛋白質通常合成時是不具活性的先質 (precursors) 2. 切除活化作用 * 當需要時會因一小段肽鏈被切除而具有活性 - 為一不可逆的調節方法 胰蛋白酶 腸道生肽脢 胰凝乳脢原的切除活化 70
血液凝固反應 B 型血友病 A 型血友病 凝血酶原 凝血酶 血纖維蛋白 血纖維蛋白原 細胞凋亡反應 Procaspases Caspases 71
異位調節作用 1. 例子多種代謝路徑的調控方式 - 調節酵素, 異位酵素 2. 異位調節作用當調節劑接合到蛋白質的調節部位後, 引發該部位的構型發生改變, 此改變因四級結構中不同次單元的相互接觸而傳達到催化部位, 因而改變催化部位的特性使蛋白質 ( 酵素 ) 的活性改變 - 對受質的親和力 (K m 值 ) 較普遍 - 催化的效率 (V max 值 ) 3. 代謝路徑的產物回饋抑制調控 調節部位 催化部位 活化劑 阻害劑 異位蛋白與調節劑接合後改變蛋白質 ( 酵素 ) 的活性 72
阻害劑 異白胺酸合成的回饋抑制調控 共價修飾作用 1. 例子肝糖代謝的調控 2. 共價修飾作用蛋白質因特定胺基酸被接上特定的化學基團後而改變其活性 - 此修飾作用屬共價鍵結, 因此活性變化之間需其它酵素參與 - 此機制通常是細胞代謝受激素調節的結果訊號放大效果 73
肝糖磷解酶 肝糖合成酶 藉由蛋白質激酶與蛋白質磷酸水解酶調控蛋白質活性 74
Amplification of signal 磷酸化 磷酸化 其他 1. 與其他蛋白質的接合作用蛋白質激酶 A (protein kinase A, PKA) - 調節次單元調鈣蛋白 (calmodulin) -Ca 2+ 2. 蛋白質的分佈 (protein compartmentation, protein localization) 葡萄糖運輸蛋白 75
蛋白質激酶 A 的活化 蛋白質的新陳代謝 細胞內蛋白質的新陳代謝 ( 分解 ) 1. 蛋白質雖有許多驚人的特性, 卻非 長生不老 隨著 年紀 的增長, 蛋白質會累積多種化學反應的發生而造成生物活性的喪失 - 如蛋白質內硫原子的氧化, 天門冬醯胺酸與麩醯胺酸支鏈的去醯胺作用, 碳的異構化作用, 胺基與糖萄糖間的非酵素反應 ( 最普遍 ) 等 - 不正常或老化的蛋白質需持續被移走 76
2. 特定蛋白質的量在細胞內為動態平衡蛋白質是持續地被製造與被分解蛋白質持續地被分解 - 一般的新陳代謝 - 移除外來的蛋白質 - 對環境的調適因應養份不足與不同發育階段的需求等 影響蛋白質分解速率的因子 1. 蛋白質分解 ( 水解 ) 的過程需能量的投入具一級反應的動力特性被分解的蛋白質分子是隨機選取 2. 正常細胞內不同的蛋白質有不同的分解速率蛋白質的半生期 (half-life) - 細胞內分解速率較快的蛋白質 ( 半生期較短 ) 具有的特性通常分子量較大, 等電點為酸性在細胞代謝功能上擔任關鍵的調節角色在試管內對熱或蛋白質水解酵素的處理較敏感 77
哺乳類細胞內蛋白質的半生期 酵素或蛋白質種類 半生期 (hr) c-myc, c-fos, p53 oncogene products 0.5 RNA polymerase I 1.3 Tyrosine aminotransferase 2.0 Deoxythymine kinase 2.6 Phosphoenolpyruvate carboxykinase 5.0 Aldolase 118 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 130 Lactate dehydrogenase (isozyme 5) 144 Cytochrome c 150 3. 近年研究發現蛋白質 N 端的胺基酸種類及特定序列 (PEST) 的數目與蛋白質的半生期有密切的關係穩定 ( 半生期 > 20 hr) - Met, Ser, Gly, Ala, Thr, Val 不穩定 ( 半生期 7 ~ 30 min) - Arg, Lys, Asp, Leu, Phe 高度不穩定 ( 半生期 2 ~ 3 min) - Ile, Glu, Pro, Tyr, Gln PEST 序列 (Pro, Glu, Ser, Thr) - 10 ~ 60 residues 78
蛋白質分解的機制 1. 細胞內蛋白質的分解主要經由兩個途徑 2. 溶體, 溶酶體 (lysosomes) 系統負責外來或不正常的蛋白質代謝 3. 細胞液的蛋白質降解體 (proteasome) 系統負責一般正常蛋白質代謝 - Proteasome-mediated proteolysis Ciechanover, Hershko & Rose, 2004 年諾貝爾化學獎 - 泛素 (ubiquitin) 與 ubiqutination 多種蛋白質參與 ( 酵素 E1, E2, E3), 需 ATP - 26S proteasome* 26S 蛋白質降解體的構造 蛋白質降解體系統的蛋白質水解 79