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1 66 Na + Ca 2+ ph 康 俊 霞 1, 康 永 锋 1,2, 包 斌 1,2, 陈 志 华 1, 谢 晶 1, 吴 文 惠 1,2, * (1. 上 海 海 洋 大 学 食 品 学 院, 上 海 ; 2. 上 海 海 洋 大 学 海 洋 科 学 研 究 院, 上 海 ) 通 过 差 示 扫 描 量 热 法 (DSC) 对 不 同 浓 度 的 Na + Ca 2+ 和 ph 值 对 鲸 鲨 皮 I 型 胶 原 蛋 白 和 鲸 鲨 皮 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 热 变 性 温 度 的 影 响 进 行 系 统 研 究 I 型 胶 原 蛋 白 的 特 征 性 紫 外 吸 收 波 长 位 于 nm,Ⅱ 胶 原 蛋 白 的 特 征 性 紫 外 吸 收 波 长 位 于 nm 和 nm 研 究 胶 原 蛋 白 的 聚 集 动 力 学 曲 线, 发 现 鲸 鲨 I 型 胶 原 蛋 白 和 鲸 鲨 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 浊 度 随 时 间 变 化 趋 势 均 呈 S 型, 其 聚 集 过 程 均 可 分 为 初 始 阶 段 和 生 长 阶 段 及 趋 于 稳 定 阶 段 通 过 高 灵 敏 度 差 示 量 热 扫 描 仪 对 鲸 鲨 I 型 胶 原 蛋 白 和 鲸 鲨 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 的 热 稳 定 性 进 行 表 征 鲸 鲨 I 型 胶 原 蛋 白 的 热 变 性 温 度 为 40, 鲸 鲨 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 热 变 性 温 度 为 62 较 低 浓 度 的 Na + Ca 2+ 使 I 型 胶 原 蛋 白 和 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 的 热 变 性 温 度 降 低, 这 可 能 是 由 于 金 属 离 子 的 加 入 影 响 了 胶 原 蛋 白 分 子 之 间 带 电 氨 基 酸 残 基 的 相 互 排 斥 作 用, 降 低 了 胶 原 蛋 白 的 热 稳 定 性 ; 较 高 浓 度 的 Na + Ca 2+ 使 I 型 胶 原 蛋 白 和 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 的 变 性 温 度 持 续 降 低, 这 可 能 是 由 于 金 属 离 子 与 胶 原 蛋 白 分 子 竞 争 水 分 子, 从 而 导 致 胶 原 蛋 白 的 不 稳 定 ; 继 续 增 加 Na + Ca 2+ 金 属 离 子 的 浓 度 时,I 型 胶 原 蛋 白 和 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 的 变 性 温 度 由 于 发 生 盐 析 而 增 加 I 型 胶 原 蛋 白 在 强 酸 强 碱 处 理 后, 蛋 白 的 吸 热 变 性 峰 变 小 甚 至 消 失 鲸 鲨 ; 胶 原 蛋 白 ; 热 变 性 温 度 ; 聚 集 动 力 学 曲 线 ; 差 示 扫 描 量 热 分 析 Effects of Metal Ions and ph on Thermal Stability of Whale Sharp (Rhincodon typus) Skin Collagen KANG Jun-xia 1, KANG Yong-feng 1,2,BAO Bin 1,2,CHEN Zhi-hua 1,XIE Jing 1, WU Wen-hui 1,2, * (1. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai , China; 2. Institute of Marine Science, Shanghai Ocean University, Shanghai , China) Abstract:Differential scanning calorimetry (DSC) analysis was used to systematically study the effect of different concentrations of Na +, Ca 2+ and H + on the thermal denaturation temperatures of type I and type II collagens from whale sharp skin. The type I collagen had maximum absorption at nm and the type II collagen at nm and nm. Aggregation dynamic analysis indicated that the turbidity of the type I and II collagens exhibited an S-shaped curve with 3 stages including initial stage, growth stage and stable stage. The thermal stability of the two types of collagens was examined by highsensitivity differential scanning calorimetry. The thermal denaturation temperatures of the type I and II collagens were at 40 and 62, respectively. Their thermal denaturation temperatures were reduced at low concentrations of Na + and Ca 2+. These results indicated that metal ions could affect charged residues in native collagen molecules, thus leading to the reduction in thermal denaturation temperature. At intermediate concentrations of Na + and Ca 2+, the thermal denaturation temperature of type I and II collagens revealed a continuous reduction, which suggested that the loss of thermal stability might be due to the competition for water molecules between metal ions and collagen. High concentrations of Na + and Ca 2+ resulted in an increase in collagen denaturation temperature due to protein salting out. Extreme ph treatment caused partial denaturation of collagen and the denaturation peak became smaller or even disappeared. Key words:rhincodon typus;collagen;thermal denaturation;aggregation dynamic curve;differential scanning calorimetry(dsc) 中 图 分 类 号 : Q518.4;S986.2 文 献 标 识 码 :A 文 章 编 号 : (2011) 收 稿 日 期 : 基 金 项 目 : 上 海 市 自 然 科 学 基 金 项 目 (10ZR ); 上 海 市 重 点 学 科 建 设 项 目 (J50704) 作 者 简 介 : 康 俊 霞 (1986 ), 女, 硕 士 研 究 生, 研 究 方 向 为 海 洋 天 然 产 物 化 学 kangkang @126.com * 通 信 作 者 : 吴 文 惠 (1965 ), 男, 教 授, 博 士, 研 究 方 向 为 海 洋 天 然 产 物 化 学 [email protected]

2 基 础 研 究 食 品 科 学 2011, Vol. 32, No 胶 原 蛋 白 (collagen) 主 要 存 在 于 动 物 的 结 缔 组 织 如 皮 肤 骨 软 骨 牙 齿 肌 腱 韧 带 而 具 有 一 定 的 结 构 与 机 械 力 学 性 质 如 张 力 强 度 拉 力 黏 弹 力 等 以 达 到 支 持 保 护 等 功 能, 并 具 有 连 接 各 种 组 织 和 支 撑 起 [1-3] 人 体 结 构 的 作 用 由 于 胶 原 蛋 白 具 有 较 好 的 功 能 性 而 广 泛 的 被 应 用 于 医 药 美 容 食 品 化 工 照 相 材 料 饲 料 等 行 业 近 年 来, 在 蛋 白 质 溶 液 体 系 热 力 学 参 量 的 测 量 中 差 示 扫 描 量 热 法 (differential scanning calorimetry,dsc) 的 [4] 应 用 十 分 广 泛 von Hippel 等 报 道 了 中 等 浓 度 的 中 性 盐 对 胶 原 蛋 白 稳 定 性 的 影 响, 发 现 变 性 温 度 与 离 子 浓 度 呈 线 性 相 关, 不 同 的 盐 减 少 或 增 加 胶 原 蛋 白 的 稳 定 性 与 [5] 元 素 在 周 期 表 的 位 置 有 关 Regina 等 通 过 高 灵 敏 度 差 示 量 热 扫 描 仪 对 小 牛 皮 I 型 胶 原 蛋 白 在 NaCl NaSCN NaH2PO4 Na2HPO4 Na2SO4 NH4Cl CaCl2 等 多 种 盐 离 子 中 的 变 性 温 度 进 行 了 研 究, 发 现 在 浓 度 低 于 20mmol/L 范 围 内, 这 些 盐 离 子 都 降 低 小 牛 皮 I 型 胶 原 蛋 白 变 性 温 度 ; 约 在 20~500mmol/L 范 围 内, 不 同 的 盐 减 少 或 增 加 的 胶 原 蛋 白 稳 定 性 与 元 素 在 周 期 表 的 位 置 有 [6] 关 钟 朝 辉 等 采 用 旋 转 流 变 仪 系 统 考 察 了 浓 度 ph 值 剪 切 速 率 NaCl CaCl2 丙 三 醇 乙 醇 和 保 温 时 间 对 酶 溶 分 离 的 草 鱼 鱼 鳞 胶 原 蛋 白 黏 度 的 影 响, 并 通 [7] 过 黏 度 变 化 确 定 了 胶 原 蛋 白 的 变 性 温 度 Eva 等 用 DSC 的 方 法 研 究 了 环 状 肠 道 菌 素 As-48 的 热 变 性, 发 现 As-48 在 低 的 ph 值 及 离 子 强 度 下 有 强 的 热 稳 定 性, 即 使 温 度 [8] 在 100 以 上 其 结 构 也 不 会 被 破 坏 Takashi 等 研 究 了 疏 水 环 境 对 I 型 胶 原 蛋 白 稳 定 性 的 影 响, 发 现 由 有 机 化 合 物 加 入 而 造 成 的 疏 水 性 环 境 可 以 增 加 骨 胶 原 蛋 白 的 稳 定 性 及 黏 附 性 对 海 洋 生 物 来 源 的 不 同 种 类 的 胶 原 蛋 白 热 稳 定 性 的 研 究, 尤 其 是 通 过 DSC 研 究 离 子 强 度 对 鲨 鱼 胶 原 蛋 白 的 热 变 性 温 度 的 影 响, 国 内 外 还 未 见 报 道 本 实 验 通 过 DSC 法 对 不 同 浓 度 的 Na + Ca 2+ 和 ph 值 对 鲸 鲨 皮 I 型 胶 原 蛋 白 和 鲸 鲨 皮 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 热 变 性 温 度 的 影 响 进 行 系 统 地 研 究, 以 期 为 胶 原 蛋 白 在 组 织 工 程 材 料 中 的 应 用 提 供 参 考 1 材 料 与 方 法 1.1 材 料 与 试 剂 鲸 鲨 皮 I 型 胶 原 蛋 白 (Rhincodon typus type Ⅰ collagen) [9] 和 鲸 鲨 皮 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 (Rhincodon typus type Ⅱ collagen) [10] 电 泳 纯, 为 本 实 验 室 制 备 DSC 样 品 铝 皿 梅 特 勒 - 托 利 多 公 司 ;Tris-HCl 盐 美 国 Sigma 公 司 ; 其 他 化 学 试 剂 均 为 国 产 分 析 纯 1.2 仪 器 与 设 备 DSC823e 差 示 扫 描 量 热 仪 ( 配 有 Mettler Toledo Stare 系 统 ) 梅 特 勒 - 托 利 多 公 司 ;UV-2450 紫 外 - 可 见 分 光 光 度 计 日 本 岛 津 公 司 ;PHS-3C 精 密 ph 计 上 海 精 密 科 学 仪 器 公 司 1.3 胶 原 蛋 白 紫 外 光 谱 特 性 的 分 析 方 法 将 I 型 胶 原 蛋 白 和 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 样 品 溶 解 于 0.5mol/L 醋 酸 溶 液 中, 分 别 配 制 成 2g/L 胶 原 溶 液 以 0.5mol/L 醋 酸 溶 液 为 空 白 在 波 长 200~400nm 近 紫 外 光 区 用 UV 紫 外 分 光 光 度 计 进 行 快 速 扫 描 1.4 胶 原 蛋 白 的 浊 度 与 聚 集 特 性 的 分 析 方 法 参 照 文 献 [11] [7] 的 浊 度 测 定 方 法 进 行 将 胶 原 蛋 白 溶 于 低 浓 度 磷 酸 缓 冲 溶 液 (ph 7.0), 使 I 型 胶 原 蛋 白 和 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 的 质 量 浓 度 分 别 为 5mg/mL 和 20mg/mL 置 于 30 水 浴 中, 每 隔 3h 测 其 波 长 300nm 处 吸 光 度, 以 表 征 溶 液 中 胶 原 蛋 白 是 否 聚 集 1.5 胶 原 蛋 白 热 稳 定 性 的 测 定 用 去 离 子 水 配 制 质 量 浓 度 为 20mg/mL 的 胶 原 蛋 白 溶 液, 溶 液 中 NaCl CaC12 浓 度 分 别 为 mmol/L, 用 DSC 测 定 不 同 浓 度 的 NaCl 和 CaC12 对 I 型 胶 原 蛋 白 和 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 热 变 性 温 度 的 影 响 配 制 质 量 浓 度 为 20mg/mL 的 胶 原 蛋 白 溶 液, 然 后 用 5mol/L 乙 酸 及 6mol/L 氢 氧 化 钠 调 节 其 ph 值 为 3 和 11, 用 DSC 测 定 ph 值 对 I 型 胶 原 蛋 白 和 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 热 变 性 温 度 的 影 响 所 有 样 品 均 是 在 起 始 温 度 为 25, 终 止 温 度 为 125, 温 度 变 化 率 为 10 /min 的 条 件 下 进 行 DSC 扫 描 实 验 取 T d 为 热 变 性 温 度,T p 为 熔 融 温 度 2 结 果 与 分 析 2.1 鲸 鲨 Ⅰ 型 胶 原 蛋 白 和 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 的 紫 外 光 谱 特 性 蛋 白 质 分 子 中 有 生 色 基 团 能 够 吸 收 一 定 波 长 范 围 的 紫 外 光, 胶 原 蛋 白 含 有 酪 氨 酸 和 苯 丙 氨 酸, 这 两 种 氨 基 酸 具 有 敏 感 的 发 色 团, 它 们 的 最 大 紫 外 吸 收 波 长 分 别 为 283nm 和 251nm [12] 在 200~400nm 的 波 长 范 围 内 对 鲸 鲨 Ⅰ 型 胶 原 蛋 白 和 鲸 鲨 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 的 稀 溶 液 进 行 了 扫 描, 结 果 如 图 1 2 所 示 吸 光 度 波 长 /nm 图 1 鲸 鲨 皮 I 型 胶 原 蛋 白 的 紫 外 吸 收 光 谱 图 Fig.1 UV-visible spectrum of type I collagen from whale sharp skin

3 68 吸 光 度 波 长 /nm 图 2 鲸 鲨 皮 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 的 紫 外 吸 收 光 谱 图 Fig.2 UV-visible spectrum of type II collagen from whale sharp skin 2.3 鲸 鲨 Ⅰ 型 胶 原 蛋 白 和 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 的 热 变 性 分 析 当 温 度 升 高 到 胶 原 蛋 白 的 热 变 性 温 度 以 上 时, 胶 原 蛋 白 吸 收 能 量 超 过 分 子 间 作 用 力 时, 分 子 中 的 氢 键 结 构 发 生 变 形, 溶 剂 水 分 子 作 为 氢 键 的 受 体 或 供 体, 与 蛋 白 质 分 子 骨 架 及 侧 链 上 的 基 团 竞 争 形 成 氢 键, 最 终 导 致 胶 原 蛋 白 三 股 螺 旋 链 被 破 坏, 使 得 包 埋 在 胶 原 蛋 白 结 构 内 部 的 疏 水 性 基 团 暴 露 出 来, 易 于 聚 集 变 性, 胶 原 [6,16] 蛋 白 链 从 伸 展 的 纤 维 状 态 转 变 成 无 规 则 卷 曲 状 态 A 从 鲸 鲨 I 型 和 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 的 紫 外 扫 描 光 谱 图 可 以 观 察 到, 其 紫 外 最 大 吸 收 波 长 分 别 在 nm 和 nm, 属 于 胶 原 蛋 白 的 典 型 特 征 紫 外 吸 收 光 谱, 表 明 鲸 鲨 胶 原 蛋 白 芳 香 族 氨 基 酸 含 量 较 少 鲸 鲨 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 在 nm 有 非 常 明 显 的 紫 外 吸 收 峰, 这 可 能 是 部 分 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 嵌 有 糖 链 导 致 吸 收 峰 部 分 偏 移 2.2 鲸 鲨 胶 原 蛋 白 的 聚 集 动 力 学 曲 线 分 析 T d Ti T f Ts T r T p B A300nm Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 Ⅰ 型 胶 原 蛋 白 T f T d Ti T p 时 间 /h 图 3 鲸 鲨 皮 胶 原 蛋 白 聚 集 动 力 学 曲 线 Fig.3 Aggregation kinetic curves of type I and II collagens from whale sharp skin 在 蛋 白 质 研 究 中, 浊 度 常 作 为 蛋 白 质 聚 集 的 指 标, [13] 蛋 白 质 聚 集 后 颗 粒 直 径 变 大, 浊 度 升 高 因 此 测 定 反 应 过 程 中 溶 液 的 吸 光 度 可 以 动 态 地 跟 踪 聚 集 过 程 中 聚 集 体 的 大 小 随 时 间 变 化 趋 势 如 图 3 所 示, 鲸 鲨 I 型 胶 原 蛋 白 和 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 浊 度 随 时 间 变 化 趋 势 均 呈 S 型, 其 聚 集 过 程 均 可 分 为 初 始 阶 段 和 生 长 阶 段 及 趋 于 稳 定 阶 [14] 段 这 与 Sai 等 报 道 的 青 蛙 皮 酸 溶 性 胶 原 蛋 白 和 经 胃 蛋 白 酶 处 理 后 青 蛙 皮 酸 溶 性 胶 原 蛋 白 的 聚 集 特 性 以 及 [15] Sivakumar 等 报 道 的 鱿 鱼 和 鲨 鱼 软 骨 胶 原 蛋 白 的 聚 集 动 力 学 曲 线 相 类 似 随 着 质 量 浓 度 的 增 大, 溶 液 中 胶 原 蛋 白 分 子 增 多, 其 分 子 聚 集 的 机 会 增 多 鲸 鲨 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 (20mg/mL) 其 质 量 浓 度 远 大 于 鲸 鲨 I 型 胶 原 蛋 白 (5mg/mL), 继 续 放 置 24h 后 I 型 胶 原 蛋 白 会 形 成 不 规 则 的 絮 状 聚 集 体, 而 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 并 未 出 现 这 可 能 是 由 于 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 嵌 有 糖 链, 阻 碍 了 胶 原 蛋 白 分 子 的 进 一 步 聚 集 T s. 变 性 外 推 起 始 温 度 ;T r. 外 推 终 止 温 度 ;T d. 变 性 温 度 ; T i. 熔 融 外 推 起 始 温 度 ;T f. 熔 融 外 推 终 止 温 度 ;T p 熔 融 的 峰 温 ;A. 鲸 鲨 I 型 胶 原 蛋 白 ;B. 鲸 鲨 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 图 4 I 型 胶 原 蛋 白 和 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 的 DSC 曲 线 Fig.4 DSC curves of type I and II collagens from whale sharp skin 从 图 4 可 知, 在 升 温 过 程 中 鲸 鲨 I 型 和 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 均 有 两 个 吸 热 峰, 此 时 ΔH 为 正, 对 温 度 敏 感 鲸 鲨 I 型 胶 原 蛋 白 第 1 个 吸 热 峰 位 于 温 度 约 为 40 处, 鲸 鲨 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 第 1 个 吸 热 峰 位 于 温 度 约 为 62 处, 这 是 胶 原 蛋 白 的 热 变 性 过 程 第 2 个 吸 热 峰 鲸 鲨 I 型 胶 原 蛋 白 位 于 温 度 约 为 114 处, 鲸 鲨 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 位 于 温 度 约 为 115 处, 这 是 热 变 性 后 的 胶 原 蛋 白 进 一 步 升 温 热 降 解 过 程 从 鲸 鲨 I 型 胶 原 蛋 白 和 鲸 鲨 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 的 DSC 曲 线 可 以 明 显 看 出,Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 的 变 性 温 度 要 高 于 I 型 胶 原 蛋 白 这 是 由 于 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 连 接 有 糖 链 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 通 过 其 糖 对 多 肽 链 骨 架 的 氢 键 作 用, 从 [17] 而 使 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 空 间 构 象 更 加 稳 定 这 与 陈 慧 等 所 报 道 的 氧 化 乳 糖 自 身 的 耐 热 性, 在 受 热 时 可 支 撑 胶 原 的 组 织 结 构 及 构 象 转 变, 从 而 使 胶 原 蛋 白 的 耐 热 稳 定 性 增 强 的 结 论 相 类 似 这 与 蛋 白 经 糖 基 化 其 稳 定 性 [12,18] 增 强 的 结 论 相 一 致

4 基 础 研 究 食 品 科 学 2011, Vol. 32, No 离 子 强 度 对 鲸 鲨 胶 原 蛋 白 热 变 性 温 度 的 影 响 Na + 和 Ca 2+ 对 鲸 鲨 I 型 和 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 热 变 性 温 度 的 影 响 1mol/L NaCl 0mol/L NaCl 0.1mol/L NaCl [5] 白 这 与 Regina 等 报 道 的 小 牛 皮 胶 原 蛋 白 在 盐 离 子 中 [6] 的 热 稳 定 性 变 化 及 钟 朝 辉 等 所 研 究 的 草 鱼 皮 胶 原 蛋 白 变 性 温 度 受 NaCl CaC12 浓 度 的 影 响 相 一 致 这 也 证 明 了 [19] Oobatake 等 所 报 道 的 蛋 白 质 和 溶 剂 的 相 互 作 用 在 决 定 天 然 蛋 白 质 的 构 象 和 稳 定 性 中 起 重 要 作 用 ph 值 对 鲸 鲨 胶 原 蛋 白 热 变 性 温 度 的 影 响 图 5 Na + 浓 度 对 I 型 胶 原 蛋 白 热 变 性 温 度 的 影 响 Fig.5 Effect of NaCl concentration on thermal denaturation temperature of type I collagen from whale sharp skin 热 变 性 热 变 性 Ⅰ 型 胶 原 蛋 白 75 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 NaCl 55 CaCl 浓 度 /(mmol/l) NaCl CaCl 浓 度 /(mmol/l) 图 6 Na + 和 Ca 2+ 离 子 强 度 对 胶 原 蛋 白 热 变 性 温 度 的 影 响 Fig.6 Effect of Na + intensity and Ca 2+ ion intensity on thermal denaturation temperature of collagen from whale sharp skin 由 图 5 6 可 知, 在 相 对 低 浓 度 NaCl CaC12 溶 液 中 I 型 和 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 热 变 性 温 度 均 降 低, 这 可 能 是 由 于 盐 离 子 的 加 入 影 响 了 胶 原 蛋 白 分 子 之 间 带 电 氨 基 酸 [5-6] 残 基 的 相 互 排 斥 作 用, 降 低 了 胶 原 蛋 白 的 热 稳 定 性 当 进 一 步 加 大 NaCl CaC12 浓 度,I 型 和 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 的 变 性 温 度 仍 降 低, 这 可 能 是 由 于 NaCl CaC12 与 胶 原 蛋 白 分 子 骨 架 及 侧 链 上 的 基 团 竞 争 水 分 子 形 成 氢 键, 这 使 得 胶 原 蛋 白 间 的 氢 键 易 于 被 破 坏 当 继 续 增 加 盐 离 子 的 浓 度 时 胶 原 蛋 白 的 变 性 温 度 会 迅 速 增 加, 在 这 个 浓 度 范 围 内 胶 原 蛋 白 发 生 了 盐 析 和 聚 集, 其 热 稳 定 性 与 高 稳 定 性 的 胶 原 纤 维 相 类 似, 要 明 显 高 于 溶 解 态 的 胶 原 蛋 A B C A.Ⅰ 型 胶 原 蛋 白 的 DSC 曲 线 ;B. ph3 的 酸 溶 液 处 理 后 Ⅰ 型 胶 原 蛋 白 的 DSC 曲 线 ;C. ph11 的 碱 溶 液 处 理 后 Ⅰ 型 胶 原 蛋 白 的 DSC 曲 线 图 7 ph 值 对 鲸 鲨 Ⅰ 型 胶 原 蛋 白 DSC 的 影 响 Fig.7 Effect of ph on DSC curve of type I collagen from whale sharp skin 差 示 扫 描 量 热 仪 通 过 测 量 蛋 白 变 性 时 的 热 量, 直 观 反 映 蛋 白 的 变 性 过 程 只 要 条 件 一 定, 蛋 白 在 DSC 图 [20] 上 有 固 定 的 吸 热 峰 如 果 蛋 白 在 测 定 前 已 经 变 性, 则 在 DSC 图 上, 蛋 白 的 吸 热 峰 变 小 位 移 或 消 失 如 图 9B C 所 示 在 加 热 过 程 中 强 酸 强 碱 处 理 后 Ⅰ 型 胶 原 蛋 白 的 吸 热 变 性 峰 消 失, 其 原 因 可 能 是 在 极 端 ph 值 条 件 下, 胶 原 蛋 白 分 子 表 面 的 负 电 荷 增 多, 电 荷 间 强 烈 的 排 斥 作 用 使 得 埋 藏 在 胶 原 蛋 白 分 子 内 部 的 疏 水 基 团 暴 露, 最 终 导 致 胶 原 蛋 白 发 生 变 性 酸 碱 环 境 使 蛋 白 的 [21] 分 子 结 构 和 功 能 性 质 发 生 一 定 变 化 3 结 论 鲸 鲨 皮 I 型 胶 原 蛋 白 和 鲸 鲨 皮 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 的 紫 外 最 大 吸 收 波 长 比 较 接 近, 分 别 为 nm 和 nm, 鲸 鲨 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 的 特 征 性 吸 收 峰 位 于 nm, 该 吸 收 峰 的 形 成 与 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 连 接 糖 链 有 关 这 些 特 征 性 吸 收 峰 可 作 为 鉴 定 I 型 胶 原 蛋 白 和 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 的 指 标 之 一 鲸 鲨 I 型 胶 原 蛋 白 和 鲸 鲨 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 浊 度 随 时 间 变 化 趋 势 均 呈 S 型 鲸 鲨 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 其 浓 度 远 大 于 I 型 胶 原 蛋 白 浓 度 的 情 况 下, 放 置 一 段 时 间 后, 鲸 鲨 I 型 胶 原 蛋 白 会 形 成 不 规 则 的 絮 状 聚 集 体 而 鲸 鲨 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 并 未 出 现 推 测 连 接 于 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 分 子 结 构 上 的 糖 链 阻 碍 了 分 子 聚 集 而 使 得 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 溶 液 稳 定 胶 原 蛋 白 的 热 变 性 温 度 受 分 子 结 构 和 环 境 条 件 的 影 响, 连 接 糖 链 的 鲸 鲨 Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 比 不 连 接 糖 链 的 鲸 鲨 I 型 胶 原 蛋 白 和 热 变 性 温 度 高, 具 有 相 对 稳 定 的 分 子 结 构 基 础 ; 无 论 含 有 糖 链 或 不 含 有 糖 链 的 胶 原 蛋 白 其 热 变

5 70 性 温 度 受 高 价 金 属 离 子 的 影 响 比 低 价 金 属 离 子 的 影 响 大, 金 属 离 子 对 不 含 有 糖 链 的 胶 原 蛋 白 的 热 变 性 温 度 的 影 响 比 含 有 糖 链 的 胶 原 蛋 白 的 影 响 大 ;I 型 胶 原 蛋 白 在 强 酸 强 碱 处 理 后, 蛋 白 的 吸 热 变 性 峰 变 小 甚 至 消 失 酸 碱 环 境 使 蛋 白 的 分 子 结 构 和 功 能 性 质 发 生 一 定 变 化 ; 外 界 环 境 条 件 对 胶 原 蛋 白 热 变 性 温 度 的 影 响 要 通 过 胶 原 蛋 白 分 子 结 构 的 变 化 发 挥 作 用 参 考 文 献 : [1] 鸿 巢 章 二, 桥 本 用 久. 水 产 利 用 化 学 [M]. 北 京 : 中 国 农 业 出 版 社, 1994: 50. [2] 姚 理 荣, 林 红, 陈 宇 岳. 胶 原 蛋 白 纤 维 的 性 能 与 应 用 [J]. 纺 织 学 报, 2006, 27(9): [3] 李 国 英, 张 忠 楷. 胶 原 的 形 态 分 类 及 其 生 理 机 能 [J]. 陕 西 科 技 大 学 学 报, 2004, 22(3): [4] von HIPPEL P H, WONG K Y. The effect of ions on the kinetics of formation and the stability of the collagen-fold[j]. Biochemistry, 1962, 1(4): [5] REGINA K P, RUMIANA K. Thermal stability of calf skin collagen type I in salt solutions[j]. Biochimica et Biophysica Acta, 1996, 1297 (2): [6] 钟 朝 辉, 李 广 美. 草 鱼 鱼 鳞 酶 溶 性 胶 原 蛋 白 粘 度 特 性 及 变 性 温 度 研 究 [J]. 食 品 与 发 酵 工 业, 2006, 32(6): [7] EVA S C, VLADIMIR V F, GALVEZ A, et al. The denaturation of circular enterocin AS-48 by urea and guanidinium hydrochloride[j]. Biochimica ET Biophysica Acta, 2002, 1598: [8] TAKASHI N, TOMOHIRO M, KAORI S, et al. New Index for the stability of a type I collagen affected by hydrophobic environment[j]. Detal Materials, 2007, 26(3): [9] 吴 文 惠, 姝 亚, 包 斌, 等. 温 和 条 件 下 分 离 马 胶 鲨 皮 胶 原 蛋 白 的 方 法 及 其 部 分 特 性 研 究 [J]. 中 华 航 海 医 学 与 高 气 压 医 学 杂 志, 2007, 14 (3): [10] 王 彦 宏, 朱 平, 冷 南, 等. Ⅱ 型 胶 原 蛋 白 的 提 取 纯 化 和 鉴 定 [J]. 第 四 军 医 大 学 学 报, 2002, 23(19): [11] 李 卫 林, 曹 健, 汤 克 勇. 胶 原 蛋 白 结 构 和 稳 定 性 关 系 研 究 [J]. 中 国 皮 革, 2005, 34(23): [12] LIU H Y, LI D, GUO S D. Studies on collagen from the skin of channel catfish(ictalurus punctaus)[j]. Food Chemistry, 2007, 101: [13] THORARINSDOTTIR K A, ARASON S, GEIRSDOTTIR M B, et a1. Changes in myofibrillar proteins dsuring processing of salted cod (Gadus morhua) as determined by electrophoresis and differential scanning calorimetry[j]. Food Chemistry, 2002, 77(3): [14] SAI K P, BABU M. Studies on Rana tigerina skin collagen[j]. Comparative Biochemistry and Part and Molecular Biology, 2001, 128: [15] SIVAKUMAR P, CHANDRAKASAN G. Occurrence of a novel collagen with three distinct chains in the cranial cartilage of the squid Sepia officinalis: comparison with shark cartilage collagen[j]. Biochimica et Biophysica Acta, 1998, 1381(2): [16] TAKAKI K, DAISUKE LH, SHINICHI A, et al. Self-complementary peptides for the formation of collagen-like triple belical supramolecules [J]. Bioorganic Medicinal Chemistry, 2005, 23(15): [17] 陈 慧, 王 亚 娟, 单 志 华. 氧 化 乳 糖 - 金 属 配 合 物 提 高 胶 原 的 稳 定 性 [J]. 皮 革 科 学 与 工 程, 2007, 17(5): [18] 李 兴, 林 哲 甫. 多 元 醇 和 糖 类 对 菠 萝 蛋 白 酶 热 稳 定 性 的 影 响 [J]. 中 国 生 物 制 品 学 杂 志, 2001, 14(4): [19] OOBATAKE M, OOI T. Hydration and heat stability effects on protein unfolding[j]. Progress in Biophysics and Molecular Biology, 1993, 59 (3): [20] HORDUR G K, HERBERT O H. Changes in conformation and subunit assembly of cod myosin at low and high ph and subsequent refolding [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2003, 51(24): [21] 付 湘 晋, 许 时 婴. 酸 碱 处 理 对 鲢 鱼 肌 原 纤 维 蛋 白 热 变 性 聚 集 胶 凝 性 质 的 影 响 [J]. 食 品 科 学, 2008, 29(6):