AxyPrep 总 RNA 中量制备试剂盒 本试剂盒用于从各种动物组织 植物组织 细胞 细菌 酵母和丝状真菌中提取总 RNA 提取的总 RNA 分子完整 纯度高, 适用于 Northern Blot RT-PCR 体外翻译 Primer Extension S1 核酸酶作图 RNase 保护测定 构建 cdna 文库等各种分子生物学实验 一 试剂盒组成 贮存 稳定性 Cat. No. AP-MD-MS-RNA-2 AP-MD-MS-RNA-10 AP-MD-MS-RNA-25 制备次数 2 preps 10 preps 25 preps Midiprep RNA column 2 10 25 Lysate Filtration column 2 10 25 1.5 ml 离心管 4 20 50 塑料扳手 1 1 1 Buffer R-Ⅰ 10 ml 50 ml 125 ml Buffer R-Ⅱ 4 ml 20 ml 50 ml Buffer W1A concentrate 7.2 ml 48 ml 96 ml Buffer W2 concentrate 9.6 ml 48 ml 2 72 ml Buffer TE (nuclease-free) 6 ml 6 ml 10 ml 说明书 1 1 1 Midiprep RNA column: 中量制备管 室温密闭贮存 Lysate Filtration column: 过滤柱, 用于 DNA 和蛋白质的去除 室温密闭贮存 Buffer R-Ⅰ: 细胞裂解液 室温密闭贮存 Buffer R-Ⅱ: 中和液 室温密闭贮存 Buffer W1A concentrate: 洗涤液 使用前, 按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇 ( 可用 100% 乙醇或 95% 乙醇 ) 混合均匀, 室温密闭贮存 Buffer W2 concentrate: 去盐液 使用前, 按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇 ( 可用 100% 乙醇或 95% 乙醇 ) 混合均匀, 室温密闭贮存 Buffer TE (nuclease-free): 洗脱液 10 mm Tris-Cl,0.1 mm EDTA,pH 7.5 室温密闭贮存 二 注意事项 Buffer R-Ⅰ 和 Buffer W1A 含刺激性化合物, 操作时要戴乳胶手套和眼镜, 避免沾染皮肤 眼睛和衣服, 谨防吸入口鼻 若沾染皮肤 眼睛时, 要立即用大量清水或生理盐水冲洗, 必要时寻求医疗咨询 三 实验准备 1. 第一次使用时, 在 Buffer W1A concentrate 和 Buffer W2 concentrate 中按试剂瓶上指定体积加入无水乙醇或 95% 乙醇 Page 1
2. 所有试剂用 DEPC 处理过的溶剂配制 请选用 RNase-free 枪头和离心管, 以避免提取过程中 RNA 被 RNase 降解 四 操作步骤 不同的样品提取总 RNA 的操作中略有区别, 具体步骤分述如下 : 从动物组织中提取总 RNA 1. 取 30-300 mg 组织, 转移至预冷的研钵中, 加液氮研磨成粉末 * 请按下面说明使用组织的量 : RNA 丰富的组织 ( 如肝脏 ) RNA 含量低的组织 ( 如肌肉 ) 当使用的组织量小于 100 mg 时当使用的组织量大于 300 mg 时 不超过 300 mg 不超过 500 mg R-Ⅰ,R-Ⅱ 和异丙醇的使用量都减半 R-Ⅰ,R-Ⅱ 和异丙醇的使用量按比例增加 * 当组织的用量比较大时, 可以先切碎再加少量 Buffer R-Ⅰ, 然后用匀浆器或组织捣碎器快速充分匀浆, 并在步骤 2 加 Buffer R-Ⅰ 时扣除匀浆时已加的 Buffer R-Ⅰ 体积 Page 2
从植物组织中提取总 RNA 1. 取 80-500 mg 组织, 转移至预冷的研钵中, 加液氮研磨成粉末 * 请按下面说明使用组织的量 : 植物叶子植物纤维组织当植物叶组织量小于 200 mg 时当植物叶组织量大于 400 mg 时当植物纤维组织量大于 500 mg 时 通常用量 80-500 mg 通常用量 150-750mg R-Ⅰ,R-Ⅱ 和异丙醇的使用量都减半 R-Ⅰ,R-Ⅱ 和异丙醇的使用量按比例增加 R-Ⅰ,R-Ⅱ 和异丙醇的使用量按比例增加 * 当组织的用量比较大时, 可以先切碎再加少量 Buffer R-Ⅰ, 然后用匀浆器或组织捣碎器快速充分匀浆, 并在步骤 2 加 Buffer R-Ⅰ 时扣除匀浆时已加的 Buffer R-Ⅰ 体积 2. 加 4ml Buffer R-Ⅰ, 用装有 18-23 号针头的注射器反复抽吸 8-10 次, 转入 15 ml 离心管中 从细胞中提取总 RNA 本方案适用于从 1 10 7-2 10 8 的细胞中提取总 RNA 收集细胞, 并进行细胞计数, 如果细胞数小于 1 10 7,R-I,R-II 和异丙醇用量减半 如果细胞数大于 2 10 8,R-I,R-Ⅱ 和异丙醇按比例增加 1. 收集 1 10 7-2 10 8 的细胞,2,000 g 离心 5 min, 弃上清 Page 3
从细菌中提取总 RNA 1. 收集 2 10 9-1 10 10 的细菌,6,000 g 离心 10 min, 弃上清 用 100 μl PBS 充分悬浮菌体并转移至预冷的研钵中, 加液氮研磨成粉末 * 请进行细菌计数, 对于大肠杆菌而言,1 10 9 /ml 细菌的 OD 600 1 如果细菌量小于 2 10 9,R-I,R-Ⅱ 和异丙醇用量减半 如果细菌量大于 1 10 10,R-I,R-Ⅱ 和异丙醇按比例增加 Page 4
从酵母中提取总 RNA 本方案用于从 2 10 7-5 10 8 的酵母细胞中提取 RNA 请进行酵母细胞计数, 也可用如下方法估算 : 对于一般酵母培养物而言,3 10 7 /ml 酵母细胞的 OD 600 1 如果酵母量小于 2 10 7,R-I,R-II 和异丙醇用量减半 如果酵母量大于 5 10 8,R-I,R-II 和异丙醇按比例增加 酵母的破碎和裂解方法有两种 : 机械法 ( 如下 a) 和酶法 ( 如下 b) 机械法采用加液氮研磨的方法, 酶法用 Lyticase 破壁形成原生质体 步骤 1-4 根据酵母的破碎和裂解方式不同可以选择 a 或 b 两种实验方法 a. 机械法 1a. 收集 2 10 7-5 10 8 的酵母细胞,6,000 g 离心 10 min, 弃上清 用 100 μl PBS 充分悬浮酵母细胞并转移至预冷的研钵中, 加液氮研磨成粉末 2a. 加 4ml Buffer R-Ⅰ, 用装有 21-25 号针头的注射器反复抽吸 8-10 次, 转入 15ml 离心管中 3a. 加 1.5ml Buffer R-Ⅱ, 漩涡振荡 15-30 s,8,000 g 离心 10 min 4a. 转移上清到过滤柱中, 插入注射器芯, 垂直向下缓慢推注, 使滤过液流入 15 ml 离心管中, 滤过液加 2.5ml 异丙醇, 混和均匀 b. 酶法配置 Buffer YE: 1 M 山梨糖醇 0.1 M EDTA, ph 7.5 使用前加入 0.1% (V/V) 的 β- 巯基乙醇 1b. 收集 2 10 7-5 10 8 的酵母细胞到 15ml 离心管中,6,000 g 离心 10 min, 弃上清 用 10ml 含有 Lyticase 的 Buffer YE 充分悬浮酵母细胞 30 C 保温 20-30 min, 并不时轻柔颠倒以形成原生质体 3,000 g 离心 5 min, 弃上清 * Lyticase 用量按每 1 10 7 酵母细胞加 50 单位计算 2b. 加 4ml Buffer R-Ⅰ, 用装有 21-25 号针头的注射器反复抽吸 8-10 次, 转入 15ml 离心管中 3b. 加 1.5ml Buffer R-Ⅱ, 漩涡振荡 15-30 s,8,000 g 离心 10 min 4b. 转移上清到过滤柱中, 插入注射器芯, 垂直向下缓慢推注, 使滤过液流入 15 ml 离心管中, 滤过液加 2.5ml 异丙醇, 混和均匀 步骤 5-10 为 a( 机械法 ) 或 b( 酶法 ) 两种实验方法共用 Page 5
从丝状真菌中提取总 RNA 1. 取 100-500 mg 菌丝体, 转移至预冷的研钵中, 加液氮研磨成粉末 * 请按下面说明使用组织的量 : 当使用的组织量小于 100mg 时 当使用的组织量大于 500mg 时 R-I,R-Ⅱ 和异丙醇的使用量都减半 R-I,R-Ⅱ 和异丙醇的使用量按比例增加 Page 6
五 流程图 加样品和 4ml Buffer R-I 裂解 加 1.5ml Buffer R-Ⅱ 8,000 g 离心 10 min 中和 转移上清至过滤柱中推注收集滤过液 DNA 蛋白质去除 加 2.5ml 异丙醇 结合 加 5ml Buffer W1A 加 7ml Buffer W2 加 7ml Buffer W2 结合 洗涤 加 0.3ml Buffer TE (nuclease-free) ( 或 RNase-free 水 ) 洗脱 Page 7