膳食機能性食品中特定成分之檢驗－膠囊錠狀食品中維生素檢驗方法之簡介

衛生福利部食品藥物管理署 103 年度食品檢驗業務推廣研討會 ( 二 ) 膳食機能性食品中特定成分之檢驗 - 膠囊錠狀食品中維生素檢驗方法之簡介 1 研究檢驗組食品化學科陳瑋芸技士 weiyun@fda.gov.tw

課程大綱市售膠囊錠狀食品相關背景介紹水溶性維生素檢驗方法脂溶性維生素檢驗方法 2

維生素是生物體所需要的微量營養成分, 而無法由生物體自行生產具調節生物體的新陳代謝功能, 適量攝取維生素可以維持身體健康 ; 過量攝取維生素可能導致中毒維生素 (Vitamin) 是由波蘭化學家卡西米爾馮克依拉丁文 vita( 生命 ) 與 -amin( 氨 ) 縮寫而得 3

市售膠囊錠狀食品相關背景介紹適用範圍 : 包含膜衣錠糖衣錠軟膠囊硬膠囊等依據食品添加物使用範圍及限量暨規格標準第八類營養劑共 318 種, 其包括胺基酸類,(amino acids) 維生素類 (vitamins) 礦物質類(minerals) 等食品加工過程中適量添加營養添加劑, 固然可以提高食品的營養價值, 滿足現代人對營養保健的需求, 但不當使用卻可能造成負面作用 4

檢驗方法及訓練主題類別檢驗方法屬性水溶性食品中水溶性維生素建議方法維生素之檢驗方法脂溶性維生素食品中脂溶性維生素之檢驗方法建議方法 5

水溶性維生素之物化特性 Thiamine( 維生素 B1, 硫胺明 ), 分子量為 300.81,CAS 號為 59-43-8 由嘧啶環和噻唑環結合而成, 在一般食品中常以磷酸化的型式存在因此在天然食品的分析常用酸在高溫環境下水解或使用酵素去除磷酸化進行分析維生素 B1 的 pka 為 4.8, 在酸性環境下較為穩定, 易溶於水, 微溶於乙醇, 並且常以鹽酸鹽的形式出現, 為白色結晶 Riboflavin( 維生素 B2, 核黃素 ), 外觀為黃色針狀結晶, 分子量為 376.36,CAS 號為 83-88-5 主要生理功用是作為輔酶, 促進代謝, 且常形成黃素腺嘌呤二核苷酸 (FAD) 和黃素單核苷酸 (FMN) 參與氧化還原反應而在天然食品的分析常用酸在高溫環境下水解或使用酵素使得維生素 B2 釋放, 進而分析維生素 B2 的 pka 為 10.2, 微溶於水且易受紫外光破壞 11

水溶性維生素之物化特性 Nicotinic acid( 菸鹼酸 ), 外觀為無色晶體, 分子量為 123.11,CAS 號為 59-67-6,pka 為 4.8 Nicotinamide( 菸鹼醯胺 ), 外觀為白色粉狀, 分子量為 122.12,CAS 號為 98-92-0,pka 為 3.35 兩者皆為可溶於水或酒精, 在酸或鹼性條件下皆較其他維生素穩定, 且較不怕光或熱的破壞菸鹼酸與菸鹼醯胺廣泛存在於動物或植物性食物中, 且常常與其他大分子結合, 在分析上常利用酵素或用酸水解的方式將菸鹼酸或菸鹼醯胺釋放, 進而分析 Nicotinic acid Nicotinamide 13

水溶性維生素之物化特性 Pantothenic aced( 維生素 B5, 泛酸 ), 外觀為白色粉末或淺黃色粘稠油狀物, 分子量為 219.23,CAS 號為 79-83-4,pka 為 4.4 泛酸的主要食物來源為肉類或全榖物, 常形成 Coenzyme A, 參與體內代謝作用分析上常利用酵素將泛酸釋放並利用微生物法分析泛酸易溶於水 Pyridoxine( 維生素 B6, 吡哆醇 ), 分子量為 169.18,CAS 號為 65-23- 6,pka 為 5.6 吡哆醇易溶於水於酒精, 在酸性條件下較穩定, 對光較為敏感吡哆醇廣泛存在於動物或植物性食物中, 尤其以白色肉類含量較高通常存在三種形式, 吡哆醇吡哆醛和吡哆胺, 在細胞中參與蛋白質胺基酸等代謝作用分析上常用微生物法分析或以化學試劑將醛和胺的形式轉換成吡哆醇進行分析 14 Pantothenic acid Pyridoxine hydrochloride

水溶性維生素之物化特性 Folic acid( 維生素 B9, 葉酸 ), 分子量為 441.4,CAS 號為 59-30-3,pka 為 4.7 葉酸微溶於水, 不溶於有機溶劑, 在鹼性環境中較為穩定, 在酸性高溫環境下容易降解葉酸在許多動物或植物中皆可發現, 並常形成不同的形式, 分析上常以微生物法分析或利用酵素的作用將葉酸釋放, 並利用高效液相層析進行分析 Folic acid 15

水溶性維生素之物化特性 Ascorbic acid( 維生素 C, 抗壞血酸 ), 為一強還原劑, 分子量為 176.12, CAS 號為 50-81-7,pka 為 4.2 維生素 C 易溶於水, 在酸性環性下較穩定, 在鹼性環境容易降解, 且光氧熱和金屬離子皆會造成維生素 C 的破壞維生素 C 的主要來源為新鮮的蔬果分析的方法滴定法, 或利用衍生進行螢光分析 Ascorbic acid 16

標準原液的配製標準品取樣量 (mg) Vit C 菸鹼酸菸鹼醯胺 Vit B1 Vit B6 泛酸葉酸 Vit B2 100 10 10 5 定容溶劑 DI water DI water ph 9.0 磷酸緩衝溶液定容體積 (ml) * 理論配製濃度 (μg/ml) DI water 10 10 10 100 10000 1000 1000 50 若標準品含有鹽基, 則實際配製濃度理論配製濃度水溶性維生素之分子量 = 含鹽基之水溶性維生素之分子量於 -18 避光貯存 21

混合標準溶液之配製標準原液濃度 (μg/ml) 添加量 (μl) 定容溶劑及體積配製溶度 (μg/ml) Vit C 菸鹼酸菸鹼醯胺 Vit B1 Vit B6 泛酸葉酸 Vit B2 10000 1000 1000 1000 50 100 500 1000 50 2000 0.4% L- 半胱胺酸溶液定容至 10 ml 100 50 100 5 10 再以 0.4% L- 半胱胺酸溶液稀釋成 100X 75X 50X 25X 10X 及 2X 22

隨機取 10 顆膠囊或錠劑磨成細粉均勻混合, 精秤檢體 0.2 g 置於 50 ml 容量瓶中加入 10% 半胱胺酸溶液 2 ml 以 ph 2.5 ± 0.1 之磷酸緩衝溶液約 45 ml 溶解超音波混合震盪萃取 20 分鐘置於室溫冷卻後, 以去離子水定容至 50 ml 以 0.45 μm nylon 濾膜過濾, 供作檢液 HPLC-DAD 23 水溶性維生素同步分析檢液調製流程

層析圖譜泛酸 210 nm Vit C 240 nm Vit B1 泛酸之標準品圖譜維生素 C 及維生素 B1 之標準品圖譜 260 nm 280 nm 菸鹼酸菸鹼醯胺 Vit B2 葉酸菸鹼酸菸鹼醯胺及維生素 B2 之標準品圖譜葉酸之標準品圖譜 27

層析圖譜 290 nm Vit B6 圖十六維生素 B6 之標準品圖譜 28

食品中水溶性維生素之檢驗方法 - 注意事項購買之水溶性維生素標準若含有鹽基, 若標準品含有鹽基, 理論配製濃度水溶性維生素之分子量則實際配製濃度 = 含鹽基之水溶性維生素之分子量標準原液解凍使用後即刻丟棄, 勿重複冷凍與解凍混合標準溶液, 臨用時配製, 並於 12 小時內使用完畢 0.4% L- 半胱胺酸溶液, 臨用時調製分析結果易受環境中 ph 值影響, 因此移動相之 ph 值須確實配製專用同一管柱進行分析若更換管柱時滯留時間有所影響, 可增加管柱平衡時間維生素 C 容易氧化, 批次分析須於 16 小時內完成移動相使用磷酸鹽緩衝溶液, 置換移動相時應避免鹽類析出 29

脂溶性維生素之物化特性 Retinol( 維生素 A, 視網醇 ), 分子量為 286.45,CAS 號為 68-26-8 Retinyl acetate( 醋酸視網酯 ), 分子量為 328.49,CAS 號為 68-26-8 Retinyl palmitate ( 棕櫚視網酯 ), 分子量為 524.86,CAS 號為 79-81-2, retinol 維生素 A 為淡黃色脂溶性, 不溶 retinyl acetate 於水, 容易氧化, 且在高溫環境下, 紫外光會加速維生素 A 的破壞維生素 A 在天然食物中常以棕櫚酯及醋酸酯的形式存在, 分析常以鹼水解的方式將酯化形式轉換成視網醇進行分析 32 retinyl palmitate

脂溶性維生素之物化特性 Ergocalciferol ( 維生素 D2), 分子量為 396.66, CAS 號為 50-14-6 Cholecalciferol ( 維生素 D3), 分子量為 384.65, CAS 號為 67-97-0 維生素 D 為脂溶性, 不溶於水, 對熱與鹼性條件較為穩定 Ergocalciferol Cholecalciferol 33

脂溶性維生素之物化特性維生素 E 包含生育醇 (Tocoperol) 與三烯生育醇 (Tocotrienol), 其中生育醇與三烯生育醇各有 α β γ 及 δ 不同形式, 而維生素 E 中以 α- 生育醇的生物活性最高 α- 生育醇包含 d-α- 生育醇 (d-αtocoperol) dl-α- 生育醇 (dl-αtocoperol) 乙酸 d-α- 生育醇酯 (d-α-tocopheryl acetate) 及乙酸 dl-α- 生育醇酯 (dl-αtocopheryl acetate) 維生素 E 為脂溶性, 在室溫下為淡黃色油狀液體, 不溶於水, 容易氧化, 對熱或酸的環境下較穩定 dl-α-tocoperol dl-α-tocopheryl acetate 34

標準原液的配製標準品取樣量 (mg) 定容溶劑定容體積 (ml) 配製濃度 (μg/ml) Vit A Vit A acetate Vit A palmitate Vit D2 Vit D3 Vit E Vit E acetate 10 10 100 0.025% BHT 之乙醇 10 10 10 1000 1000 10000 於 -18 避光貯存 38

混合標準溶液的配製標準原液濃度 (μg/ml) Vit A Vit A acetate Vit A palmitate Vit D2 Vit D3 Vit E Vit E acetate 1000 1000 10000 添加量 (ml) 0.25 0.5 1 定容溶劑及體積配製溶度 (μg/ml) 0.025% BHT 之乙醇定容至 10 ml 25 50 1000 以 0.025% BHT 之乙醇溶液稀釋成 100X 75X 50X 25X 10X 及 2X 39

重複此步驟二次隨機取 10 顆膠囊或錠劑磨成細粉均勻混合, 精秤檢體 0.5 g 加入 75% DMSO 2 ml, 室溫超音波混合震盪 30 分鐘加入 4 ml 正己烷 4300 g, 離心 5 分鐘以 2 ml 含有 250 ppmbht 的乙醇溶液回溶 40 脂溶性維生素同步分析檢液調製流程

移動相溶液 :A 液 ( 甲醇 ) 及 B 液 ( 去離子水 ) 以下列條件進行梯度分析時間 (min) 流速 (ml/min) A (%) B (%) 0 25 1 93 93 7 7 25 26 1 93 100 7 0 26 40 2 100 100 0 0 40 41 1 100 93 0 7 41 45 1 93 93 7 7 註 : 上述測定條件分析不適時, 可依所使用之儀器, 設定適合之測定條件附註 : 1. 本檢驗方法之定量極限, 維生素 A 維生素 A 醋酸酯及維生素 A 棕櫚酸酯均為 0.002 mg/g, 維生素 D 2 及維生素 D 3 均為 0.004 mg/g, 維生素 E 及維生素 E 醋酸酯均為 0.08 mg/g 2. 標準溶液之配製及檢液之調製需全程避光 3. 食品中有影響檢驗結果之物質時, 應自行探討 43

不同溫度對於 retinyl palmitate 滯留時間之影響 44

層析圖譜 264 nm Vit D2 Vit D3 圖十二維生素 D 2 及維生素 D 3 之標準品圖譜 280 nm Vit E Vit E acetate 45 圖十四維生素 E 及維生素 E acetate 之標準品圖譜

層析圖譜 325 nm Vit A Vit A acetate Vit A palmitate 圖十四維生素 A 維生素 A acetate 及維生素 A palmitate 之標準品圖譜 46

食品中脂溶性維生素之檢驗方法 - 注意事項混合標準品溶液臨用時配製, 並於 12 小時內使用完畢不同管柱溫度會影響 vit A palmitate 的滯留時間, 管柱溫度需控制在 50±3 o C 0.025%BHT 之乙醇溶液, 臨用時調製使用玻璃滴管吸取上層液, 並將上層液合併於玻璃試管中, 再進行吹氮若更換管柱時滯留時間有所影響, 可增加管柱平衡時間 47

謝謝聆聽 51

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