蛋鸡脂肪肝出血综合征 发病机理的研究 胡国良
蛋鸡脂肪肝出血综合征 发病机理的研究 第一部分 : 研究背景 第二部分 : 试验研究 第三部分 : 结论与展望
研究背景 脂肪肝出血综合征 (Fatty Liver Hemorrhagic Syndrome,FLHS ) 又名脂肪肝综合征 (Fatty Liver Syndrome,FLS) 是一种营养代谢性疾病 主要导致蛋鸡不明原因的产蛋率下降和死亡率上升, 引起鸡肝脏发生脂肪变性 出血, 有时导致急性死亡为特征的营养代谢性疾病
大部分报道认为是由于机体脂类代谢紊 乱, 内源性甘油三酯 (TG) 在肝脏的 大量沉积造成 (why? how?)
脂蛋白都由载脂蛋白 甘油三脂 磷脂和胆固醇及其酯类物质组成 载脂蛋白除与脂类亲和外, 还是 (1) 某些酶的激活剂或抑制剂 ; (2) 细胞受体识别脂蛋白的标志 ; (3) 参与血清脂蛋白的分泌 故当载脂蛋白的结构 合成或分泌发生障碍时可导致疾病的发生
大量文献指出, 由于血脂含量随着人们饮食的变化, 其含量波动很大, 因此测定其蛋白部分即载脂蛋白及其亚类更为精确, 被称为测定人体内脂蛋白变化的第三个里程碑
1992 年研究鸡脂肪肝综合征中发现, 发生脂肪肝的病鸡其 HDL-Ch 含量降低, 而 LDL-Ch 含量升高, 且 HDL-Ch/LDL-Ch 比值越小, 其发生脂肪肝的危险性越大 这与人冠心病和动脉粥样硬化的 HDL-Ch 和 LDL-Ch 的变化有相似规律
卫生部北京老年医学研究所研究发现, 北京鸭不易患脂肪肝, 其烤鸭虽肥, 但人食用后, 不易产生冠心病和动脉硬化, 反而能防止该病的发生, 主要原因是由于该品种鸭的 HDL-Ch 含量较高, 而 LDL-Ch 含量较低
另外, 蛋鸡容易通过人工实验制造各种不同的高脂血症, 是研究人类动脉粥样硬化等心血管系统疾病的很好的模型 国外曾有人用高胆固醇的鸡作为研究 HDL 氧化状况的体内模型, 认为有以下优点 : (1) 容易产生高胆固醇血症 只需在日粮中添加 ; (2) 可进行动脉粥样硬化人工造病研究 ; (3) 与人 apoaⅠ 在体外分离研究时易形成 apoaⅠ 低聚体比较, 鸡的 apoaⅠ 可形成单体 因此认为鸡是进行人 HDL apo 胆固醇等脂类代谢紊乱性疾病的良好模型
因此, 无论对蛋鸡 FLHS 本身的发病机理, 如脂类代谢 肝损伤 自由基 载脂蛋白与脂肪肝的关系, 还是为人类相关疾病的基础研究, 都有必要进行该病的研究
试验研究 FLHS 人工病理模型的建立 FLHS 发病机理的研究 ( 一 ) FLHS 发病机理的研究 ( 二 ) 鸡血清 apoaⅠ AⅡ 的分离纯化及其抗血清的制备 ApoAⅠ ApoAⅡ 浓度测定方法的建立及其浓度的测定 高能低蛋白饲料对鸡肝脏 apoaⅠ 基因 mrna 表达的影响
实验一 FLHS 人工病理模 型的建立
实验鸡的选择 分组及管理 选择 14 周龄体重 1.4~1.5kg 的艾维因鸡 120 羽, 随机分成四组, 每组 30 羽 Ⅰ 组 : 为对照组, 喂基础日粮 Ⅱ 组 : 为菜籽饼中毒组 Ⅲ 组 : 为高能低蛋白组 Ⅳ 组 : 为高能高蛋白组
实验进程 预试期 : 历时 33 天 实验期 : 历时 50 天 调整期 : 历时 20 天
临床观察及指标测定 临床观察采食 饮水 精神状态 体况等血液常规测定 RBC Hb PCV 等血液临床生化指标的测定钙 无机磷 总蛋白 白蛋白 葡萄糖等病理剖检及组织学观察肝 肾 心等的脂肪变性程度
实验结果 临床表现 FLHS 发病鸡精神萎靡, 嗜睡喜卧, 鸡冠苍白, 腹部软绵 肥大 采食减少, 产蛋率和平均蛋种均有所下降
生产性能的变化 各组体重变化 1.75 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 1.7 体重 (kg) 1.65 1.6 1.55 1.5 1.45 1.4 0 10 20 30 40 50 70 时间 (d) 实验的第 30 天后, 除 Ⅱ 组的体重与对照 Ⅰ 组有极显著差异外 (P<0.01), 其它均无统计学意义的差异 (P>0.05) Ⅲ Ⅳ 组与 Ⅰ 组比较, 其体重呈现上升趋势, 而 Ⅱ 组则有所下降
各组产蛋率变化 93.00 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 88.00 产蛋率 (%) 83.00 78.00 73.00 68.00 63.00 58.00 0 10 20 30 40 50 70 时间 (d) 对照组相比较,Ⅱ Ⅲ Ⅳ 组其产蛋率显著下 降, 其中以 Ⅱ 组下降最早
各组蛋重变化 55.00 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 53.00 蛋重 (g) 51.00 49.00 47.00 45.00 43.00 0 10 20 30 40 50 70 时间 (d) 蛋重在第 20 天检测时,Ⅲ 组蛋重增加, 有显著差异 (P<0.05), 在第 40 天时表现为 Ⅲ 组 Ⅱ 组 >Ⅰ 组 Ⅳ 组, 其它均无统计学上差异 (P>0.05)
各组肝重, 腹脂及肝脏等级评分 时组间 ( 天 ) 别 70 20 30 50 数量 (n) 胴体重 (g) 肝重 (g) 肝重 / 胴体重 (%) 腹脂重 (g) 肝长 (cm) Ⅰ 2 1100 23.0 2.1 3.8 6.24 1 Ⅱ 2 1250 38.9 3.1 16.1 7.91 2 Ⅲ 2 1625 46.5 2.8 41.2 8.70 2.5 Ⅳ 2 1150 30.7 2.7 10.3 7.25 1.5 Ⅰ 2 1150 30.6 2.7 28.9 7.03 1 Ⅱ 2 1000 29.6 2.9 0 6.77 2.2 Ⅲ 2 1650 34.6 1.9 82.5 7.31 3 Ⅳ 2 1375 42.7 2.9 62.9 7.31 2.8 Ⅰ 2 1255 29.4 2.3 27.6 7.21 1.2 Ⅱ 2 1050 28.3 2.6 10.4 6.95 2.6 Ⅲ 2 1750 42.5 2.4 83.9 7.48 3.1 Ⅳ 2 1575 46.8 2.8 70.2 7.51 2.9 Ⅰ 2 1220 30.4 2.5 26.9 7.23 1.1 Ⅱ 2 1150 25.1 2.3 21.4 7.04 1.6 Ⅲ 2 1650 36.7 2.2 41.3 7.44 2.0 Ⅳ 2 1710 40.9 2.4 37.2 7.36 1.4 评分
血清钙浓度变化 血清无机磷浓度变化 10 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 4.3 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 血清钙浓度 (mmol/l) 9 8 7 6 5 4 血清无机磷浓度 (mmol/l) 3.8 3.3 2.8 2.3 3 0 10 20 30 40 50 70 时间 (d) 1.8 0 10 20 30 40 50 70 时间 (d) 三个试验组鸡钙 无机磷水平与对照组比较, 在第 10 天以后, 其含量均升高, 差异极显著 (P<0.01) 调整日粮 20 天后, 其钙 无机磷含量恢复到正常水平 说明了 FLHS 患鸡其钙 无机磷代谢的紊乱
血清总蛋白变化 血清总蛋白 (g/l) 70 68 66 64 62 60 58 56 54 52 50 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 0 10 20 30 40 50 70 时间 (d) 总蛋白, 除 Ⅳ 组在正常范围内偏高以外, 其它各组均无统计学上的差异
血清白蛋白变化 血清白蛋白 (g/l) 30 28 26 24 22 20 18 16 14 12 10 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 0 10 20 30 40 50 70 时间 (d) 白蛋白在第 20 天以后, 含量下降, 与对照相比,Ⅱ 组 Ⅲ 组 Ⅳ 组均差异极显著 (P<0.01), 其含量由小 到大为 :Ⅲ<Ⅱ<Ⅳ<Ⅰ
血清 A/G 值的变化 0.98 0.88 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 0.78 A/G 值 0.68 0.58 0.48 0.38 0.28 0.18 0 10 20 30 40 50 70 时间 (d) A/G 比例下降, 并随着病程加重而逐渐减少, 各试验组与 对照组比较差异均极显著 (P<0.01) 调整日粮 20 天后, 其 白蛋白, 球蛋白质含量以及 A/G 比例均有所改善
血糖的变化 16 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 15 血糖含量 (mmol/l) 14 13 12 11 10 9 8 0 10 20 30 40 50 70 时间 (d) 第 20 天开始, 试验组与第 Ⅰ 组比较,Ⅲ Ⅳ 组血糖升高 (P<0.05);Ⅱ 组血糖下降, 与 Ⅰ Ⅲ Ⅳ 组相比有极显著差异 (P<0.01) 调整日粮 20 天后, 其血糖含量能得到较好恢复
血液红细胞压积 32 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 31 血液红细胞压积 (%) 30 29 28 27 26 25 24 0 10 20 30 40 50 70 时间 (d) PCV 在第 40 天后,Ⅱ Ⅲ 组含量降低, 与第 Ⅰ Ⅳ 组比较有显著差异 (P<0.05),PCV 由大到小的排列为 Ⅰ Ⅳ>Ⅱ>Ⅲ
小 结 从生产性能 血液部分指标变化以及肝脏 病理组织切片观察等证明 : 用含 8% 菜籽饼 ( Ⅱ 组 ), 高能低蛋白 (3.02Mcal/kg( 14.3%, Ⅲ 组 ) 和高能高蛋白 (3.09Mcal/kg 17.4%,Ⅳ 组 ) 日粮均引起 FLHS 的发生 其中以 Ⅲ 组量严重,Ⅱ, 组次 之,Ⅳ, 组较轻
各试验发病组均有不同程度的肝肿大 增 重和出血, 产蛋率下降明显, 但体重增加可 能不明显 病理组织学检查表明,Ⅲ, Ⅳ 组 以脂肪变性为主, 肝细胞浆内充满脂肪滴, 严重时肝腺泡结构解体呈分散状态, 同时见 有一定程度的出血, 其中以 Ⅲ 组较严重,Ⅳ, 组次之 ;Ⅱ; 组则主要以肝出血为主, 并伴有 肝细胞的脂肪变性
根据本实验的结果, 结合生产中发病的实 际情况, 在今后的研究中可选用高能低蛋白高能低蛋白日 粮复制人工病理模型
实验二 蛋鸡 FLHS 中 脂类变化 肝酶变化
血清脂类测定 TG T-Ch F-Ch,ChE HDL-Ch LDL- Ch 血清肝酶的测定 AST ALT AKP γ-gt OCT
实验结果 血清 T-Ch 含量变化 血清 ChE 含量变化 血清 T-Ch(mmol/L) 8.00 7.50 7.00 6.50 6.00 5.50 5.00 4.50 4.00 3.50 3.00 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 0 10 20 30 40 50 70 时间 (d) 血清 ChE(mmol/L) 4.80 4.30 3.80 3.30 2.80 2.30 1.80 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 0 10 20 30 40 50 70 时间 (d) Ⅱ Ⅲ Ⅳ 组其 T-Ch 在第 10 天后,ChE 在第 20 天后, 其含量升高, 与对照组 (Ⅰ 组 ) 比较有极显著差异 (P<0.01), 并随着病程的变化, 含量逐渐升高 在实验的第 20 天以后,Ⅱ Ⅲ 的 T-Ch 和 ChE 含量与 Ⅳ 组比较差异显著 (P<0.05); 但 Ⅱ Ⅲ 组之间无统计学差异 其中大到小的顺序为 Ⅲ Ⅱ>Ⅳ>Ⅰ
血清 F-Ch 含量变化 血清 ChE/T-Ch 变化 4.00 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 70 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 血清 F-Ch(mmol/L) 3.50 3.00 2.50 2.00 1.50 ChE 与 F-Ch 比值 65 60 55 50 1.00 0 10 20 30 40 50 70 时间 (d) 45 0 10 20 30 40 50 70 时间 (d) F-Ch 含量与 T-Ch 和 ChE 有相似的规律性,Ⅱ Ⅲ Ⅳ 组与 Ⅰ 组比较, 含量升高, 差异极显著 (P<0.01), 在实验的第 30 天后,Ⅱ Ⅲ 组的 F-Ch 含量与 Ⅳ 组比较差异极显著 (P<0.01); 在各试验组中,ChE/T-Ch 的比值下降
血清 TG 含量变化 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 6.00 血清 TG(mmol/L) 5.50 5.00 4.50 4.00 3.50 3.00 0 10 20 30 40 50 70 时间 (d) TG 含量, 各组各阶段均无统计学差异, 但在实验 中, 其含量有升高的趋势, 特别是 Ⅱ Ⅲ 组
血清 HDL-Ch 浓度的变化 血清 LDL-Ch 浓度的变化 血清 HDL-Ch(mmol/L) 4.80 4.30 3.80 3.30 2.80 2.30 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 血清 LDL-Ch(mmol/L) 12.00 11.00 10.00 9.00 8.00 7.00 6.00 5.00 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 1.80 0 10 20 30 40 50 70 时间 (d) 4.00 0 10 20 30 40 50 70 时间 (d) 在第 10 天时, 试验组 与对照组差异显著 ( p<0.05 ), 在第 20 天后, 差异极显著 (p<0.01) 在第 10 天时, 试验组与对 照组差异显著 (p<0.01), 之 后, 试验组与对照组比较, 差异极显著 (p<0.01)
血清 AKP 变化 血清 肝酶的变化 105 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 95 血清 AKP(IU/I) 85 75 65 55 45 35 0 10 20 30 40 50 70 时间 (d) AKP 在 20 天后, 发病组与对照组差异极显著 (p<0.01); 改正饲养日粮 20 天后, 除 Ⅱ 组恢复正常水平 外, 其它 Ⅲ Ⅳ 两组 AKP 值仍然升高
血清 ALT 变化 血清 AST 变化 血清 ALT(IU/I) 24 22 20 18 16 14 12 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 血清 AST(IU/I) 285 265 245 225 205 185 165 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 10 145 8 0 10 20 30 40 50 70 125 0 10 20 30 40 50 70 时间 (d) 时间 (d) ALT 各组间无差异 (P>0.01) AST 变化敏感, 各试验组与对照组差异显著 (P<0.05);Ⅱ 组与 Ⅲ Ⅳ 组比较, 第 10~30 天差异极显著 (P<0.01) 改正日粮 20 天后, 各试验组恢复到正常水平
血清 γ-gt 变化 190 170 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 血清 γ-gt(iu/dl) 150 130 110 90 70 50 30 0 10 20 30 40 50 70 时间 (d) Ⅲ 组 γ-gt 上升最早, 差异极显著 (P<0.01) 第 Ⅱ Ⅳ 组在第 20 天后, 也有较快上升, 与 Ⅰ 组比较差异极显著 (P<0.01) 在 30 天后, 第 Ⅱ 与第 Ⅳ 组之间比较差异显著 (P<0.05) 改正饲养日粮 20 天后, 试验 Ⅱ 组恢复正常范围
血清 OCT 变化 血清 OCT(IU/LY 分 ) 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 0 10 20 30 40 50 70 时间 (d) 试验 Ⅱ 组有一个较快的升高, 与其他三组比较, 差异极显著 (P<0.01); 而实验 Ⅲ Ⅳ 组在后阶段才有升高, 在 30 天时与对照组比较差异显著 (P<0.05), 以后差异极显著 (P<0.01) 改正饲养日粮 20 天后, 其 OCT 值恢复到正常水平
小 结 血清中 TG 含量正常或稍升高 T-Ch 和 ChE 升高, 但 ChE/T-Ch 比例下降 ( 低于 60%), 并随着病情的加重而日趋严重 血清中 HDL-Ch 含量下降,LDL-Ch 含量上升, 两者呈负相关性
肝酶活力变化除 ALT 外, 其它酶类 AST AKP γ-gt OCT 含量均升高, 是诊断 FLHS 的较敏感指标 在早期,AST 变化于所有组的 FLHS 都有比较敏感 ;OCT 对菜籽饼中毒引起的 FLHS 更敏感 ; 而 AKP 和 γ-gt 对高能低蛋白引起的 FLHS 较为敏感, 且两酶呈平行性关系
实验三 FLHS 与自由基关系研究 和探讨
实验方法与步骤 实验分组对照组 : 正常日粮 ; 试验组 : 高能低蛋白日粮饲养实验日龄相同 (140 天 ) 体重相近 (1.5~1.7kg) 的海兰褐壳蛋鸡 102 羽, 随机分成两组, 每组设三个重复, 每个重复 17 羽, 正试期 55 天 实验蛋鸡实行一鸡一笼, 自由采食和饮水
样品的测定 肝脂率的测定 索氏抽提法 血清中生化指标测定 ( 试剂盒 ) MDA SOD GSH-Px CAT LPS LPL TG HDL- Ch LDL-Ch 肝脏中生化指标测定 ( 试剂盒 ) NEFA MDA SOD CAT GSH-Px LPS LPL 病理切片观察 病理切片的制作按常规方法
腹脂变化 腹脂 (g) 70.00 65.00 60.00 55.00 50.00 45.00 40.00 35.00 30.00 25.00 20.00 试验组 对照组 0 15 25 35 45 55 时间 (d) 试验组和对照组腹脂重在前 15 天测定结果差异不显著 (P>0.05), 从 25 35 天时差异显著 (P<0.05), 以后差异 极显著 (P<0.01)
肝湿重变化 肝脂率变化 53.00 试验组 对照组 60 试验组 对照组 48.00 50 肝湿重 (g) 43.00 38.00 肝脂率 (%) 40 30 33.00 20 28.00 0 15 25 35 45 55 时间 (d) 10 0 15 25 35 45 55 时间 (d) 试验组和对照组比较, 肝湿重在实验期第 15 天差异不显著 ( P>0.05 ), 其他差异显著 (P<0.05); 试验组肝湿重在整个实验期呈增重趋势 ; 试验组和对照组比较, 肝脂率在实验期第 15 天差异不显著 ( P>0.05 ), 其他差异极显著 (P<0.01); 试验组肝脂率整个实验期呈逐渐递增趋势
肝脏匀浆蛋白质含量变化 1.20 试验组 对照组 肝脏匀浆蛋白质 (g/l) 1.10 1.00 0.90 0.80 0.70 0.60 0 15 25 35 45 55 时间 (d) 试验组和对照组比较, 肝脏匀浆蛋白质浓度在第 35 天 第 45 天和第 55 天测定结果差异显著 (P<0.05); 试验组肝 脏匀浆蛋白质浓度呈现下降趋势
血清 TG 含量变化 22.00 20.00 试验组 对照组 血清 TG(mmol/L) 18.00 16.00 14.00 12.00 10.00 8.00 6.00 0 15 25 35 45 55 时间 (d) 血清中 TG 试验组和对照组比较, 在第 35 天时差异显著 (P<0.05), 以后差异极显著 (P<0.01); 试验组在实验期的第 35 天前 TG 变化不明显, 从第 35 天后含量升高 对照组在实验过程中变化不明显
血清 LPS 活力变化 肝脏匀浆 LPS 活力变化 血清脂肪酶活力 (U/L) 200 180 160 140 120 100 80 60 40 试验组 对照组 肝脏匀浆脂肪酶 (U/gprot) 300.00 250.00 200.00 150.00 100.00 试验组 对照组 20 0 0 15 25 35 45 55 时间 (d) 50.00 0 15 25 35 45 55 时间 (d) 试验组和对照组比较, 血清中脂肪酶活力从第 25 天起差异极显著 (P<0.01), 肝脏匀浆中脂肪酶活力从第 35 天起差异极显著 (P<0.01); 实验期内试验组血清和肝脏匀浆中脂肪酶活力呈增高趋势
血清 LPL 活力变化 肝脏匀浆 LPL 活力变化 血清 LPL(U/L) 3.50 3.00 2.50 2.00 1.50 1.00 试验组 对照组 肝脏匀浆 LPL(U/gprot) 7.00 6.00 5.00 4.00 3.00 2.00 试验组 对照组 0.50 0 15 25 35 45 55 时间 (d) 1.00 0 15 25 35 45 55 时间 (d) 实验期内试验组血清和肝脏匀浆 LPL 活力呈增高趋势
血清 HDL-Ch 含量变化 血清 LDL-Ch 含量变化 血清 HDL-Ch (mmol/l) 4.5 4 3.5 3 2.5 试验组 对照组 血清 LDL-Ch(mmol/L) 11 10 9 8 7 6 5 试验组 对照组 2 0 15 25 35 45 55 时间 (d) 4 0 15 25 35 45 55 时间 (d) 实验期内试验组血清中 HDL-Ch 含量逐渐降低, 血 清中 LDL-Ch 含量逐渐升高, 两者呈负相关
血清 SOD 活力变化 肝脏匀浆 SOD 活力变化 血清 SOD 活力 (U/ml) 35.00 30.00 25.00 20.00 15.00 10.00 试验组 对照组 0 15 25 35 45 55 时间 (d) 肝脏匀浆 SOD 活力 (U/mgprot) 19.00 18.00 17.00 16.00 15.00 14.00 13.00 12.00 试验组 对照组 0 15 25 35 45 55 时间 (d) 试验组和对照组比较, 血 清中 SOD 活力从第 45 天起, 其 测定结果差异极显著 (P<0.01), 其他差异不显著 ( P>0.05 ); 试验组血清中 SOD 活力逐渐递减 ; 试验组和对照组比较, 肝脏匀浆中 SOD 活力在第 25 天差异显著 (P<0.05), 其他差异不显著 (P>0.05); 试验组匀浆中超氧化物歧化酶活力变化有下降的趋势
血清 GSH-Px 活力变化 肝匀浆中 GSH-Px 活力变化 2500.00 试验组 对照组 270.00 试验组 对照组 血清 GSH-Px(U/ml) 2000.00 1500.00 1000.00 500.00 肝脏匀浆 GSH-Px(U/mgprot) 220.00 170.00 120.00 70.00 0.00 0 15 25 35 45 55 20.00 0 15 25 35 45 55 时间 (d) 时间 (d) 试验组和对照组比较, 血清中 GSH-Px 活力第 15 天时差异显著 (P<0.05), 其他差异极显著 (P<0.01); 试验组血清中 GSH-Px 活力逐渐降低 试验组和对照组比较, 肝脏匀浆中 GSH-Px 活力在 15 天至 35 天时差异极显著 (P<0.01), 其他差异不显著 (P>0.05)
血清 CAT 活力变化 肝脏匀浆 CAT 活力变化 血清 CAT(U/ml) 5.50 5.00 4.50 4.00 3.50 3.00 2.50 试验组 对照组 肝脏匀浆 CAT(U/mgprot) 38.00 36.00 34.00 32.00 30.00 28.00 26.00 24.00 22.00 20.00 试验组 对照组 2.00 0 15 25 35 45 55 18.00 0 15 25 35 45 55 时间 (d) 时间 (d) 血清中 : 试验组和对照组 CAT 活力差异不显著 ; 试验组 CAT 在整个实验过程中呈递减 试验组和对照组比较, 在 25 天 45 天和 55 天的三次采样测定结果差异显著 (P<0.05), 其他差异不显著 (P>0.05); 试验组呈先增高后降低的趋势
血清 MDA 含量变化 肝脏匀浆 MDA 含量变化 血清 MDA(nmol/ml) 12.00 10.00 8.00 6.00 4.00 2.00 试验组 对照组 肝脏匀浆 MDA(nmol/mgprotl) 14.00 12.00 10.00 8.00 6.00 4.00 试验组 对照组 0.00 0 15 25 35 45 55 2.00 0 15 25 35 45 55 时间 (d) 时间 (d) 试验组和对照组比较, 血清中丙二醛含量在 45 天时差异显著 (P<0.05), 在 55 天时差异极显著 (P<0.01); 肝匀浆中丙二醛含量在 15 天 25 天时差异显著 (P<0.05), 以后差异极显著 (P<0.01); 试验组血清和匀浆中丙二醛含量呈升高趋势
血清 NEFA 含量变化 肝脏匀浆 NEFA 含量变化 2000.00 试验组 对照组 1800.00 试验组 对照组 血清 NEFA(μmol/L) 1800.00 1600.00 1400.00 1200.00 1000.00 800.00 600.00 400.00 肝脏匀浆 NEFA(μmol/gprot) 1600.00 1400.00 1200.00 1000.00 800.00 600.00 200.00 0 15 25 35 45 55 400.00 0 15 25 35 45 55 时间 (d) 时间 (d) 试验组和对照组比较, 血清和肝脏匀浆中游离脂肪酸含 量从 25 天起差异极显著 (P<0.01); 实验期内试验组血清和 肝脏匀浆中游离脂肪酸含量增高
试验组病理解剖学变化 脂肪稀少 肝色正常 第 0 天剖解图片 第 15 天剖解图片
变黄趋势 变黄 边缘钝圆 脂肪增多 第 25 天剖解变化 第 35 天剖解变化
脂肪肥厚 质脆如泥 第 45 天剖解变化 出血点斑 第 55 天剖解变化 脂肪沉积
试验组肝脏组织学变化 肝窦清晰 肝窦模糊出现空泡 第 0 天肝脏组织学变化 第 15 天肝脏组织学变化
结缔肿胀 空泡增多 第 25 天肝脏组织学变化 第 35 天肝脏组织学变化
空泡增大 空泡充盈 第 45 天肝脏组织学变化 第 55 天肝脏组织学变化
小 结 采用高能低蛋白日粮饲喂蛋鸡再一次成功的建立蛋鸡 FLHS 病理模型 实验蛋鸡表现为生产性能下降 肝脂蓄积, 血清 TG 和 LDL-Ch 升高,HDL-Ch 下降, 并出现典型 FLHS 病变
蛋鸡发生 FLHS 时, 血清和肝脏匀浆中脂 肪酶 脂蛋白脂酶活力升高
蛋鸡 FLHS 发展过程中, 机体 NEFA 和 MDA 含量升高, 对机体产生损伤 ; 机体抗氧化酶 SOD GSH-Px CAT 活力降低, 表明机体抗氧化能力降低 证明自由基在 FLHS 的发生 发展过程中起重要作用
实验四 鸡血清 apoaⅠ AⅡ 的分离纯化及其抗血清的制备
ApoAⅠ 的分离纯化步骤 实验动物的选取 血清的收集 HDL 的制备 磷钨酸沉淀法 脱脂 HDL 溶液 的透析和浓缩 脱脂 HDL 的溶解 HDL 的脱脂 丙酮 / 乙醇 (1:1( ) apoai 的提取 纯度的鉴定 分子量测定
鸡 apoaⅠ AⅡ 是血清 HDL 的主要成分, 约占其蛋白成分的 90% 为了更好探讨 FLHS 形成的内在机制, 对鸡血清 apoaⅠ apoaⅡ 进行分离纯化及其抗血清的制备, 为后续研究的进行做好准备
ApoAⅠ 的分离纯化步骤 实验动物的选取 血清的收集 HDL 的制备 磷钨酸沉淀法 脱脂 HDL 溶液 的透析和浓缩 脱脂 HDL 的溶解 HDL 的脱脂 丙酮 / 乙醇 (1:1( ) apoai 的提取 纯度的鉴定 分子量测定
实验结果 apoai 的提取 sephadex G-150 柱层析图 吸光值 280nm (Absorbance) 0.2 0.1 0 I II III 0 10 20 30 40 50 60 70 80 收集管数 (Fraction Number) 脱脂后的 HDL 过 sephadex G-150 凝胶层析 柱蛋白吸收峰形图
apoai 纯度的鉴定 Rabbit Phosphorylase B Bovine Serum Albumin Rabbit Actin Bovine Carbonic Anhydrase apo AI Trypsin Inhibitor Hen Egg White Lysozyme 1 2 低分子量标准蛋白分子与纯化后 apo AI 的电泳对照图
apoai 分子量测定 logm.w 5 4.8 4.6 4.4 4.2 4 兔磷酸化酶 B (97400Da) 牛血清白蛋白 (66200Da) 兔肌动蛋白 (43000Da) 牛碳酸酐酶 (31000Da) apoa-1 胰蛋白酶抑制剂 (20100Da) 鸡蛋清溶菌酶 (14400 Da) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 Rf 蛋白分子量与电泳迁移率的关系 y = -1.1538x + 5.0091 R 2 = 0.9912 纯化后 apo AI 的分子量测定的标准曲线
ApoAⅡ 的分离纯化步骤 脱脂 HDL 溶液 apoaii 的提取 apoaii 纯度的鉴定 二次层析分离 apoaⅡ 分子量测定
实验结果 一次层析蛋白吸收峰形图 DEAE sepharose-6b 柱层析图 0.2 吸光值 280 nm (Absorbance) 0.1 0 I Ⅱ Ⅲ 0 10 20 30 40 50 60 70 80 收集管数 (Fraction Number) HDL 经 DEAE Sepharose CL-6B 柱层析后出现三个 主要紫外线吸收峰, 经 Urea-SDS-PAGE 电泳检测得知 apoaⅡ 在峰 Ⅱ 中
二次层析蛋白吸收峰形图 吸光值 280nm (Absorbance) 0.12 0.08 0.04 0 Ⅱ I III Ⅲ 0 10 20 30 40 50 60 70 80 I II 收集管数 (Fraction Number) 过 DEAE Sepharose CL-6B 柱第 Ⅱ 峰收集蛋白过 sephadex G-150, 峰 Ⅲ 是 apoaⅡ 纯品 峰 Ⅱ 是 apoaⅠ, 峰 Ⅰ 主要是清蛋白和未解聚的 apoaⅠ
apoaii 纯度的鉴定 Rabbit Phosphorylase B Bovine Serum Albumin Rabbit Actin Bovine Carbonic Anhydrase Trypsin Inhibitor Hen Egg White Lysozyme apoai apoaii 1 2 3 低分子量标准蛋白分子与纯化后 apo AII 的电泳对照图
apoaii 分子量测定 y = -1.3475x + 5.074 logm.w 4.9 4.7 4.5 4.3 4.1 兔磷酸化酶 B (97400Da) 牛血清白蛋白 (66200Da) 兔肌动蛋白 (43000Da) 牛碳酸酐酶 (31000Da) 胰蛋白酶抑制剂 (20100Da) 鸡蛋清溶菌酶 (14400 Da) R 2 = 0.9948 3.9 apoaii 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 Rf 蛋白分子量与电泳迁移率的关系 纯化后 apo AII 的分子量测定的标准曲线
apoai 抗血清的制备 用 apoai 制品免疫新西兰雄兔 ( 体重 2.5kg 左右 ), 分四次进行, 每两周加强免疫一次 第一次用 apoai 0.5mg 与等体积的完全弗氏佐剂充分乳化成油包水状 ( 即乳化后的白色混合物滴在水面上不散开为合格 ), 分多次多点注入每侧脚掌皮下 以后逐次增用蛋白质 0.25mg, 并改用不完全弗氏佐剂, 于两腿内侧肿大淋巴结注入 最后一次免疫后第十天检测抗体效价达 1 16 即颈动脉放血, 分离血清, 加 NaN 3 后 -20 保存
兔抗鸡 apoai 血清的效价测定 兔抗鸡 apoai 抗血清的效价测定. 中间孔为 apoai 制品,1~6 孔为抗血清的稀释倍数, 依次分别为 1:2,1:4,1:8,1:16,1:32,1:64
apoai 抗血清纯度鉴定 apoai 对兔抗鸡全血清的免疫电泳 兔抗鸡 apoai 抗血清与本实验制备的 apoai 和鸡混合血清的双向免疫扩散试验
ApoAⅡ 抗血清的制备 采用 apoaii 制品免疫新西兰雄兔 ( 体重 2.5Kg 左右 ), 每两周加强免疫 1 次 第 1 次用 apoaii 蛋白 1.0mg 与等体积的完全弗氏佐剂 ( 适当增加卡介苗的用量 ) 充分乳化成油包水状 ( 即乳化后的白色混合物滴在水面上不散开为合格 ), 多次多点皮内或皮下微量注射 以后逐次增用蛋白质 0.25mg, 于两腿内侧肿大淋巴结注入 最后 1 次免疫后第 10d 检测抗体效价达 1 8, 即颈动脉放血, 分离血清, 加 NaN 3 后 -20 保存备用
兔抗鸡 apoaii 抗血清的效价测定 兔抗鸡 apoaii 抗血清的效价测定 中间孔为 apoaii 制品,1~6 孔为抗血清的稀释倍数, 依 次为 1:2,1:4,1:8,1:16,1:32,1:64
apoaii 抗血清纯度鉴定 1 2 4 3 鸡混合血清对兔抗鸡 apoaii 血清的免疫电泳 兔抗鸡 apoaii 抗血清与本实验制备的 apoaii 和鸡混合血清的双向免疫扩散试验
apoai 标准参考血清的制备 鸡空腹 12~24h, 采集血液, 按常规方法分离血清 Bradford 法标定的 apoai 蛋白 (3.156mg/ml) 为第一标准, 用免疫透射比浊 单向免疫扩散和火箭免疫电泳法标定的鸡混合血清平均值 (3.425mg/ml) 为标准参考血清 加 0.02% NaN 3, 分装,-20 保存, 作为参考标准血清
apoaii 标准参考血清的制备 鸡空腹 12~24h, 采集血液, 按常规方法分离血清 Bradford 法标定的 apoaii 蛋白 (1.102mg/ml) 为第一标准, 用免疫透射比浊 单向免疫扩散和火箭免疫电泳法标定的鸡混合血清平均值 (1.112mg/ml) 为标准参考血清 加 0.02% NaN 3, 分装,-20 保存, 作为参考标准血清
小 结 本实验研究表明, 采用本实验介绍的方法能很好的分离纯化 apoaⅠ apoaⅡ, 方法简单, 不需特殊仪器, 在一般实验室条件下就能进行, 且回收率较高, 均能达到电泳纯和免疫纯, 很好的满足了后续实验工作的需要
对 apoaⅠ apoaⅡ 的分子量进行了测 定, 标准曲线相关性良好
弗氏佐剂充分乳化的鸡血清 apoaⅠ apoaⅡ 对新西兰雄兔进行每七天一次的皮下免疫, 所制得的高免血清效价好, 特异性高, 符合接下来建立其浓度免疫测定法研究的需要
ApoAⅠ ApoAⅡ 浓度 测定方法的建立及其浓度的测定
选用和比较 : 单向免疫扩散 免疫透射比浊 火箭免疫电泳作为本研究的实验方法 常用的免疫分析法有单向免疫扩散法 火箭免疫电泳法 放射免疫分析 酶标记免疫分析 荧光标记免疫分析及免疫比浊法等
单向免疫扩散测定法 抗体凝胶板的制做 加样与扩散 数据的测量及处理
透射免疫比浊测定法 抗血清预处理 血清样品稀释 样品自身浊度测定 终点浊度测定 计 算
火箭免疫电泳测定法 血清标本的稀释 火箭电泳测定 标准曲线的绘制 计 算
方法的选取 以上实验研究表明, 免疫透射比浊 单向免疫扩散和火箭免疫电泳三种方法都能较准确的对 apoaⅠ apoaⅡ 浓度进行测定 虽然在前期准备比较充分的情况下, 免疫透射比浊法速度最快, 但样品和抗血清预处理花费的时间较长, 且不易保存 火箭免疫电泳同样花费的时间也较长, 且电泳受时间和温度等因素的影响, 所以为了今后临床中更方便, 简洁的检测, 本实验选用单向免疫扩散法对 apoaⅠ apoaⅡ 浓度进行测定
实验结果 单向免疫扩散效果图 单向免疫扩散效果图, 从左到右稀释倍数分别是 :1 1 1 2 1 4 1 6 1 8, 最右孔是样品 1 2 稀释孔
标准曲线 扩散环的半径 (cm) 1.05 0.95 0.85 0.75 0.65 0.55 y = 0.1882x + 0.4713 R 2 = 0.9985 扩散环的半径 (cm) 0.75 0.65 0.55 0.45 0.35 y = 0.3625x + 0.2528 R 2 = 0.9982 0.45 0.1 0.6 1.1 1.6 2.1 2.6 3.1 apoai 的稀释浓度 (mg/ml) 0.25 0.01 0.21 0.41 0.61 0.81 1.01 1.21 1.41 apoaii 的稀释浓度 (mg/ml) apoaⅠ 浓度测量的标准曲线 apoaⅡ 浓度测量的标准曲线
血清 apoaⅠ 含量变化 血清 apoaⅡ 含量变化 血清 apoaⅠ 含量 (mg/ml) 2.90 2.70 2.50 2.30 2.10 1.90 1.70 1.50 试验组 对照组 0 15 25 35 45 55 血清 apoaⅡ 含量 (mg/ml) 1.40 1.35 1.30 1.25 1.20 1.15 1.10 1.05 1.00 0.95 0.90 试验组 对照组 0 15 25 35 45 55 时间 (d) 时间 (d) 实验期第 35 天起试验组血清中 apoaⅠ 和 apoaⅡ 含量比对照组低 (P<0.05)
小 结 使用单向免疫扩散法对 apoaⅠ apoaⅡ 浓度进行测定, 标准曲线相关性良好 (apoaⅠ:r2=0.9985 apoaⅡ:r2=0.9982 ), 回归方程为 :apoaⅠ: y=0.1882x+0.4713 apoaⅡ:y=0.3625x+0.2528
高能低蛋白饲料诱发的 FLHS 蛋鸡血清中 apoaⅠ apoaⅡ 的含量随着病情的严重逐渐下降 分别从 (mg/ml ) 2.42±0.11 1.30±0.12 下降到 1.64±0.07 0.95±0.04
高能低蛋白饲料对鸡肝脏 apoaⅠ 基因 mrna 表达的影响 --- 半定量 PCR 方法
实验步骤与方法 样品的采集总 RNA 的提取总 RNA 的电泳 PCR 反应 反转录 (RT) PCR 引物设计 DNA 片段回收及测序 PCR 条件的优化 PCR 扩增 电泳及灰度分析 数据处理
实验结果 RT-PCR 扩增结果 M A M B 344 bp 204 bp 目的基因 RT-PCR 产物电泳图谱 Marker 泳道从上到下依次是 (bp):2000 1000 750 500 250 100 左图是 apoaⅠ 基因扩增产物, 右图是 β-actin 基因扩增产物
肝脏 apoaⅠmrna 表达变化 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 试验组和对照组 apoaⅠ mrna 的 RT-PCR 产物电泳图 (n=6) 泳道 1: Mark,DL2000; 泳道 2~7,8~13 分别为 对照组和试验组
小 结 试验组和对照组肝脏组织中 apoaⅠ β- actin mrna 的表达情况结果表明, 扩增出的目的条带为 204bp 和 344bp 的基因片断, 测序报告所得的结果和参照基因的同源性分别达到 98% 和 100%,PCR 成功扩增出了目的片断
半定量 RT-PCR 表明试验组肝脏中 apoaⅠmrna 对 β-actin mrna 的相对丰度均显著低于对照组, 说明高能低蛋白饲料可降低鸡肝脏的 apoaⅠ mrna 的表达 返回
结论 根据实验的结果, 结合生产中发病的实际情况, 在今后的 FLHS 研究中可选用高能低蛋白日粮复制病理模型 FLHS 能导致机体脂类代谢障碍和肝特异酶活性变化, 引起肝脏病理损伤
高能低蛋白日粮引起的 FLHS 病鸡血清和肝脏匀浆中 NEFA 和 MDA 含量升高, 抗氧化酶 :SOD GSH-Px CAT 活力降低, 表明机体抗氧化能力降低 证明自由基在 FLHS 的发生 发展过程中起重要作用
首次在国内通过磷钨酸沉淀, 经 sephadex G-150 凝胶柱反复层析或 DEAE Sepharose CL-6B 离子交换层析进行鸡血清 apoaⅠ 和 apoaⅡ 的分离纯化 测定了分子量, 制备兔抗鸡 apoaⅠ 和 apoaⅡ 血清, 并自行标定标准血清
首次在国内建立了单向免疫扩散 免疫透射比浊和火箭免疫电泳三种测定鸡血清 apoaⅠ 和 apoaⅡ 的方法 对高能低蛋白饲料诱发的 FLHS 血清中 apoaⅠ apoaⅡ 的含量测定结果表明, 随着病情的发展, 血清中 apoaⅠ apoaⅡ 的含量逐渐下降
应用半定量 RT-PCR 方法测定了 FLHS 患鸡肝脏 apoaⅠ mrna 的表达, 结果说明高能低蛋白饲料可降低鸡肝脏 apoaⅠ mrna 的表达
今后可能研究的方向 ApoA 与 FLHS 关系的进一步研究 ; ApoB 及其他载脂蛋白在 FLHS 发病中的作 用及关系研究 ; ApoA 和 apob 在正常机体及 FLHS 中的基因 表达与调控 ; ApoA 和 apob 与相关受体关系及其调节 ; 利用蛋鸡进行人类脂肪代谢障碍病为研究 模型的研究