qrt-pcr 的原理及应用 邹海玥 13 级生物基地班 201300140153 实时荧光定量 PCR 技术 (real-time fluorescent quantitative PCR, qrt-pcr) 是由美国 Applied Biosystems 公司于 1996 年推出的核酸定量技术, 由于它实现了从定性到定量的跨越, 且具有定量准确高的优点, 现已成为分子生物学研究和医学研究等领域的一种热门技术, 该方法还具有重复性好 灵敏度高 特异性更强 速度快 自动化程度高 无污染性等优点 一 原理 qrt-pcr 技术是在 PCR 反应体系中加入荧光染料或探针, 由于荧光强度的增加与双链核酸的数量成正比, 随着反应的不断进行 产物的不断累积使得荧光信号强度跟随着增加, 将每经过一个循环收集到的一次荧光信号数据, 以循环次数为 X 轴 荧光信号强度为 Y 轴, 绘制成一条扩增曲线 ( 图 1) 扩增曲线可被划分为 3 个时期, 具体情况见图 1 在荧光信号指数增长期 : 即 ( 线性方程 ) 模板起始浓度的对数值与 Ct 值呈线性关系 为了能够对所检测样本进行比较, 就在荧光信号指数增长期设定一个荧光信号的阈值, 当 PCR 产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的循环数就是 Ct 值 Ct 值主要由扩增反应体系中模板的初始浓度决定的 qrt-pcr 就是运用这个原理来准确反映反应体系中模板的初始量
图 1 qrt-pcr 扩增曲线 在 PCR 扩增反应达到平台期前, 靶序列的扩增效率相对稳定, 原始模板以相对固定的指数形式增加 对于普通 PCR 来说, 产物在扩增过程中呈指数积累, 但是当产物积累到一定程度, 由于反应体系内引物,dNTPs 的消耗及酶活性的降低, 则进入了平台期 含量不同的起始模板, 其指数增长期所用的循环数是不同的, 因此在到达设定的循环数时,PCR 扩增是否处于平台期不得而知 因此用终点扩增产物的量来推算起始样品中模板的量难以得出可靠结果 荧光定量 PCR 在判定结果时, 用 CT(cycle threshold, CT) 值作为临界点, 该点位于 PCR 产物进入指数增长期的起始位置, 反应体系处于最佳状态, 最能稳定地反映出与起始模板数量上的关系 因此用 CT 值作为定量判断点比终点法准确的多 利用已知拷贝数的系列标准模板制成标准曲线, 其中横坐标代表起始拷贝数的对数 (log), 纵坐标代表 CT 值 log 浓度与 CT 值呈线性关系, 只要获得未知样品的 CT 值, 即可从标准曲线上计算出该样品的起始模板数 起始模板拷贝数越高, CT 值越小, 反之则越高 在扩增产物量一定的情况下, 起始模板数越多, 所需循环数就越少 其中 :1. 荧光曲线 : 随着 PCR 反应的进行, 扩增产物不断累加, 荧光信号强度不断增加 每经过一个循环, 收集一次荧光强度信号, 得到一条荧光曲线图 2. 荧光阈值 : 是在荧光曲线上人为设定的一个值, 它可以设定在指数扩增阶段任意位置上, 但实际应用时要结合扩增效率, 线形回归系数等参数来综合考虑 通常采用以 PCR 前 15 个循环的荧光信号为本底基线 (Baseline), 荧光阈值设定为 3~15 个循环荧光信号标准差的 10 倍 3. CT 值 :C 代表 PCR 循环 (Cycle),T 代表荧光阈值 (Threshold) CT 值是指在 PCR 过程中荧光信号到达设定荧光阈值时所经过的 PCR 循环数 以循环数为横坐标, 以一系列标准 DNA 分子的起始拷贝数的以 10 为底的对数为纵坐标作图, 可得到一条直线 未知样本中的靶序列可以通过对照这种标准曲线的方法来定量 二 检测模式 目前 qrt-pcr 最常用 使用最多的检测模式是 SYBR Green I 染料和 TaqMan 探针检测模式 1 SYBR Green I 检测模式
SYBR Green I 染料是一种双链核酸染料, 不与单链核酸结合, 与双链核酸结合 SYBR Green I 染料会发出荧光, 而不结合的 游离的 SYBR Green I 染料不会发出荧光, 因此检测到的荧光强度的增加与双链核酸的数量成正比 由于这种染料可以检测到全部的双链核酸, 它也可以嵌入到非特异产物和引物二聚体, 造成假阳性和定量误差, 但是, 这两个问题可以通过溶解曲线排除干扰, 因此能保证荧光信号与目的 PCR 产物的量成比例 2 TaqMan 探针检测模式 TaqMan 探针是一条由中间的特异性序列 5' 端的荧光报告基团和 3' 端的荧光淬灭基团组成的寡核苷酸链 当探针游离于反应体系中时, 由于报告基团和淬灭基团距离较近, 报告基团发射的荧光信号会被淬灭基团吸收而检测不到荧光信号 在 PCR 反应退火或延伸的阶段, 探针会与模板特异性杂交, 聚合酶的 5' 3' 外切酶活性会将 5' 端连接的荧光基团从探针上切割下来, 检测到荧光信号, 产生的荧光信号和样本中扩增产物的量成比例 三 定量方法 qrt-pcr 定量方法可以分为 : 绝对定量和相对定量 1 绝对定量 绝对定量是指用已知的标准曲线来推算未知样本的量 Ct 值在荧光信号指数增长期与模板起始浓度的对数值呈线性关系, 使用经系列稀释的已知起始拷贝数的标准品绘制标准曲线, 将未知样品的 Ct 值代入线性方程中, 就可以计算出未知样品中所含的模板量 未知样本的浓度是通过标准曲线来确定, 可见合适的标准品是绝对定量准确的关键 合适标准品的要求 : 标准品定量必须准确 ; 标准品与未知样本扩增效率应一致 ; 另外, 未知样本的量必须位于标准品测试范围之内, 否则模板起始浓度的对数值与 Ct 值可能不成线性关系 2 相对定量 相对定量是指目的基因相对于参照样本在一定样本中的量的变化 它所关注的是目的基因转录水平变化了多少倍, 而非转录了多少 常用的相对定量计算方法有 : 双标准曲线法 比较 2 - Ct 法和 Pfaffl 法 (1) 双标准曲线法 双标准曲线法首先要选择和制备目的基因和内参基因的标准品, 然后将标准品倍比稀释, 绘制标准曲线 根据绘制的两条标准曲线分别得出目的基因和内参基因的转录量, 并用内参进行均一化 然后选定一个参照样品用于分析转录差异, 即用目的基因在其它样品中的表达量是参照样品中表达量的 n 倍来表示 当标准品内参基因与目的基因扩增效率不一致时, 可用此方法进行相对定量 (2) 比较 2 - Ct 法 一 Ct 比较 2 法假设每个循环增加一倍的产物, 即 X=X 0 2 n (X: 产物分子数 ;X 0 : 起始分子数 ;2: 扩增效率 ;n: 循环次数 ) 由于假设的前提, 此方法仅适用于目的基因和内参基因的扩增效率基本一致且都接近 1, 否则将影响转录量的估计 (3)Pfaffl 法
此法是针对目的基因和内参基因的扩增效率不同或无法达到 1 进行改良的 四 qrt-pcr 试验结果的影响因素 qrt-pcr 分析对象有 DNA 和 cdna, 若以 DNA 为模板进行定量分析, 只要 DNA 模板纯度高且完整性好 引物设计特异性强 反应体系适宜, 就可以顺利完成定量试验 若以 RNA 为研究对象, 影响实验结果的因素很多 1 RNA 的纯度和完整性 RNA 样品的质量间接影响定量结果, 一旦 RNA 发生降解或者 RNA 样品中存在抑制剂, 定量结果就不能正确反应样品中 mrna 的量 所以在 RNA 提取过程中要避免 RNase 的污染, 防止 RNA 的降解, 这可以在反转录之前分别通过紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测其纯度 浓度和完整性, 以保证 RNA 样品的纯度和完整性 2 基因组 DNA 污染 RNA 样品中污染基因组 DNA 也是一类影响定量结果的常见因素 由于基因组 DNA 在定量 PCR 过程中也会扩增, 产生荧光信号, 影响定量的准确性 一般通过以下两种方法解决这个问题 : 利用 DNase 消化去除 DNA, 但是在 DNase 处理过程中会增加 RNA 降解和引入其它污染物的可能性, 影响定量的准确性 ; 设计跨外显子的引物, 只限于己知外显子和内含子的基因, 且跨外显子的引物不一定有特异性强 扩增效率高的特点 3 反转录效率 只有高的反转录效率, 才能使尽可能多的 mrna 反转录成 cdna, 才能使 cdna 的定量结果准确反映 mrna 的转录量 解决这个问题最关键的是选择合适的 高效的且稳定性好的反转录酶 常用的反转录酶有 :AMV-RT 和 MMLV-RT, AMV-RT 酶活性很强, 但它能获得的 cdna 的分子量不如 MMLV-RT, 所以常用 MMLV-RT 来反转录 引物的合成和特异性也很关键, 常用的反转录引物有 3 种 : 随机引物,Oligo dt, 特异引物 单独使用随机引物或特异引物时不能获得全部的反转录信息, 而 Oligo dt 引物只适用于真核生物 因此我们将随机引物和特异引物或随机引物和 Oligo dt 结合来进行反转录 4 PCR 扩增 为了使 PCR 产物只有目标特异产物, 必须保证引物的高特异性和 PCR 反应体系和程序 ( 引物退火温度, 引物浓度, 模板量 ) 的最优, 另外,DNA 聚合酶应该是热启动酶, 这样才能使扩增特异性得到保证 5 内参基因的选择 内参基因是指在细胞中表达量不易受外界影响且比较稳定的基因, 因此在检测基因转录水平变化时常用它来做参照物, 以消除 RNA 上样量 上样过程中存在的实验误差, 保证实验结果的准确性 但是稳定的内参基因并不多, 多数内参基因在不同的组织 细胞及不同条件下的转录量均非恒定, 甚至差别很大 因此, 要保证 qrt-pcr 结果的准确性, 必须选择合适的内参基因 (1) 内参基因的作用
比较不同样品中目的基因的转录水平, 关键是保证反应时使用相同细胞数的 RNA, 只有将这些数据归一到以拷贝 / 细胞或拷贝 / 基因组为单位后, 才有比较意义 但是保证反应时使用相同细胞数的 RNA 很难, 即使采用相同的细胞数提取 RNA, 也不能保证 RNA 提取效率和 PCR 扩增效率均相同, 同时也不能保证相同体积上样量有相同细胞数的 RNA, 况且要保证不同管的上样量相等也很难 内参基因转录水平稳定的特性使得内参基因可以对加入到反转录反应中的 RNA 进行均一化处理, 保证定量 PCR 结果的准确性 (2) 内参基因的筛选方法 常用的内参基因有 :ACTB GAPDH 18S rrna tubulin RPⅡ 和 cyclophilin 等, 但是并不是每个内参基因在不同细胞类型 不同组织 不同试验处理条件下都能稳定表达, 因此必须对候选内参基因的转录稳定性进行分析 A. 通过 genorm 宏程序筛选内参基因 2002 年 Vandesompele 等推出基于 Excel 平台的 genorm 宏程序, 该程序的计算原理是基于两个理想内参基因的表达量比值在所有样本中应当一致,M 值代表某一个内参基因与其他所有内参基因的平均配对变异程度,M 值越小代表基因表达稳定性越高, 该程序通过逐步排除有最高 M 值的内参基因最终会得到两个最稳定的内参基因, 同时还能确定最适合的内参基因数目 按照这种算法, 两个内参基因表达量比值有变化时, 说明了其中一个基因或者两个基因不是稳定表达的 ; 当两个内参基因表达量比值没有变化时, 并不能直接认为两个内参基因表达稳定, 因为 genorm 宏程序的计算原理不能准确筛选出存在共调节的候选内参基因中最稳定的内参基因 B. 通过 NormFinder 宏程序筛选内参基因 2004 年 Andersen 等推出基于 Excel 平台的 NormFinder 宏程序, 它是通过计算候选内参基因的组内及组间估计变异度的方式来判断内参基因的稳定性, 变异度越小基因转录越稳定 NormFinder 宏程序的计算原理决定了它可准确筛选出共调节候选内参基因中最稳定的内参基因, 弥补了 genorm 宏程序的缺陷 C. 通过其他的软件程序筛选内参基因 2004 年 Pfaffl 等推出基于 Excel 平台的 BestKeepe 宏程序, 其原理是将所有的候选内参基因进行重复配对相关分析来确定最优的内参基因 由于每个宏程序都有它的优点和缺点, 因此, 可以将宏程序结合起来使用, 发挥各宏程序优点, 弥补各宏程序缺点, 准确筛选出最稳定的内参基因
图 2 哺乳动物常用内参基因 五 qrt-pcr 应用 qrt-pcr 技术的主要作用 : 对 DNA RNA 样品进行定性和定量分析, 基于这个功能,qRT-PCR 被广泛运用于基础科学研究 医学研究 食品安全研究 动物疾病检测等各领域 在基础科学研究领域中, 我们常常需要知道核酸的浓度, 以备进行下一步的研究, 常用的方法是琼脂糖凝胶电泳和分光光度计, 但前者靠主观判断, 造成的偏差较大 ; 后者很容易受样品中杂质的影响 当我们需要知道核酸的精确浓度时, 实时定量 PCR 就是首选, 因为它具有灵敏度高 特异性强 准确性等特点 在医学研究领域中, 采用 qrt-pcr 对病原 DNA 进行定性和定量的检测, 为临床诊断提供强有力的依据 现 qrt-pcr 已经应用于比如各型肝炎 艾滋病病毒 禽流感 结核 性病等传染病病毒的诊断 在食品安全研究领域中, 转基因食品是利用新兴的生物技术创造的产品, 也是一种新生事物, 自然, 它的安全性成为人们关注的焦点 而 qrt-pcr 技术可以运用于检测转基因食品的安全性 有人构建了转基因番茄 ZenecaB,Da,F 品系的质粒标准分子及其实时荧光定量 PCR 检测体系, 为转基因番茄 Zeneca B,Da,F 品系转基因成分的监测建立了可行的可供使用的定性与定量检测体系 在动物疾病研究领域中,qRT-PCR 技术是动物疾病诊断中最具发展前途的方法, 有人为了能快速 准确地诊断猪瘟病毒石门系强毒, 根据 23 株 Shimen 毒株的全基因组序列, 设计 1 对特异的荧光定量引物, 建立猪瘟石门系强毒株 SYBR GreenⅠ 染料法实
时荧光定量 PCR 快速检测方法, 为猪瘟的预防与控制提供了有效的技术手段