中国病理生理杂志, ( ): - 杂志网址 : : [ 文章编号 ] - ( ) - - 视网膜神经节细胞凋亡对延迟 * 整流钾电流的影响 赵瑛, 徐亚吉, 路雪婧, 段俊国 ( 成都中医药大学视觉生理重点实验室, 四川成都 ; 成都大学生理教研室, 四川成都 ) [ 摘要 ] 目的 : 观察视网膜神经节细胞 (, ) 凋亡对延迟整流钾电流 ( -, ) 的影响 方法 : 将原代培养 ~ 的 乳大鼠 分为对照组 加压. 组 加压 组 加压. 组和加压 组, 对照组为常规培养 ; 其它各组常规培养 后用自行设计的加压装置加压 -, 时间分别为.. 和, 通过连续波长多功能微孔板检测仪检测各组 线粒体的荧光强度 ; 通过全细胞膜片钳技术观察各组细胞膜电容 (, ) 的变化, 观察对照组与加压 组 和 的变化 结果 : 对照组 线粒体的荧光强度与加压. 组比较差异无统计学显著性, 而加压. 和 各组 线粒体的荧光强度显著低于对照组 ( <. ); 对照组 的细胞 与加压. 组比较差异无统计学显著性, 其余各组 的细胞 显著低于对照组 ( <. ) 与对照组比较, 加压 能使电流幅度显著增加, 在刺激电位为 ~ 时, 加压 组的电流密度明显大于对照组 ( <. ) 加压 组的 值明显高于对照组 ( <. ), 显著小于对照组 ( <. ), 两组间比较 值的差异无统计学显著性 结论 : 视网膜神经节细胞凋亡伴有 通道电导增加, 增大 [ 关键词 ] 延迟整流钾电流 ; 视网膜神经节细胞 ; 加压 ; 细胞凋亡 [ 中图分类号 ] ; [ 文献标志码 ] : -, -, -, - [ 收稿日期 ] - - [ 修回日期 ] - - *[ 基金项目 ] 国家科技部重大新药创制资助项目 ( - ); 四川省教育厅重点项目 ( ) 通讯作者 : - ; - : @ (,,, ;,,, - : @ ) [ ] : ( ) ( ) : ~ -,.,,.,.,,., ( ) - - :. ( <. )., ( <. ), ( <. ) - ( ) - - ( ) ( <. ), :
[ ] ; ; ; 青光眼是不可逆致盲性眼病, 病理基础是视网 膜神经节细胞 (, ) 凋亡, 视 野缺损, 因此探索 凋亡机理对预防和治疗青光 眼有重要意义 越来越多的研究表明, 细胞内钾离 子浓度降低是多种细胞凋亡途径的重要因素, 胞内 钾外流是引起老年痴呆患者海马神经元凋亡的关 [ ] 键, 随着凋亡细胞内 的丢失, 细胞内促凋亡因 [ ] 子 表达增加使细胞凋亡 我们前期的研究发 现, 青光眼大鼠的 促凋亡因子 增加, 凋亡 [ ] 抑制因子 - 的表达减少, 的凋亡增多 然而尚不清楚在凋亡过程中 的 电流是如何 变化的 为此, 本研究探讨压力诱导 凋亡时延 迟整流钾电流 (, ) 的变 化, 探索 凋亡的机理, 为防止青光眼视神经疾 病奠定基础 实验动物及分组 乳鼠 ( 出生 材料和方法 ~ ), 雌雄不拘, 由成都中医 药大学实验动物中心提供 将分离培养的乳鼠 分为对照组 加压. 组 加压 组 加压. 组和加压 组 对照组为常规培养 ; 其余 各组为常规培养 后用自行设计的加压装置加压, 时间分别为.. 和 主要试剂与仪器 多聚鸟氨酸 多聚赖氨酸 胰蛋白酶 - 和 ( ); 层黏连蛋 白 ( ); 胎牛血清 -. 单克隆抗体 和二甲基亚砜 ( ); 羊抗鼠 ( 北京中杉金桥生物科技有 限公司 ); 宁夏枸杞多糖 ( 由香港大学脑与认知科学 国家重点实验室馈赠 ) 膜片钳系 统 ( ); - 电极拉制仪 ( ); 倒置显微镜 ( ); 倒置显微成像系统 ( ); 体视显微镜 ( ) 方法 [ ]. 的培养用文献报道的方法分离培养 取出生 ~ 内的 乳鼠, % 乙醇消毒, 断颈处死, 无菌条件下取眼球, 置入含青霉素的 液中 在体视显微镜下沿角膜剪开, 去除晶状体和 玻璃体, 钝性分离视网膜 将视网膜放入终浓度. % 的胰蛋白酶中, 吸管轻轻吹打, 消化, 加入胎牛血清终止消化, 用 目无菌钢筛网过滤, 滤液离心 次,, 每次, 弃上清液 向沉淀中加入 培养液 ( 含 % % 胎牛血清 青霉素 链霉素 ), 吸管吹打使之分散均匀制成单细胞悬液 将视网膜细胞悬液加入经羊抗鼠 和小鼠抗大鼠 -. 单克隆抗体包被的培养皿中, 在 % 培养箱中孵育, 使视网膜 与 -. 单克隆抗体充分结合 去除悬液, 用无血清 培养液反复漂洗, 清除培养皿表面未黏附细胞 用. % 胰蛋白酶消化黏附的细胞, 小牛血清终止消化 收集细胞, 离心, 去上清, 加入含胎牛血清的 培养液, 用吸管反复吹打, 使细胞分散均匀, 制成细胞悬液, 计数, 将细胞悬液按每孔 个接种于经多聚鸟氨酸 层黏连蛋白包被的 孔板中, 置于培养箱中培养. 线粒体膜电位的检测用. % 胰蛋白酶消化黏附的细胞, 小牛血清终止消化, 收集细胞, 离心, 加入 液使细胞悬浮, 将悬液加入酶标板中, 静置 贴壁, 加入已配置好的 μ, 每孔 μ, 使终浓度至. μ, 孵育, 用 洗涤 次, 用连续波长多功能微孔板检测各组 线粒体膜荧光强度, 激发光波长为, 发射光波长为, 重复 次实验. 全细胞膜片钳记录在室温条件 ( ~ ) 下记录各组 的膜电容 (, ) 以及对照组与加压 组的 采样频率为, 低通滤波频率, 保持电位钳制在, 以 的阶跃, 从 去极化至, 钳 制时间为 电极液 ( ): -., 用 调节 值至. ; 细胞浴液 ( ):...., 用 调节 值至. 统计学处理采用. 和. 软件进行数据处理并作图, 采用. 软件进行统计学分析,
实验数据以均数 ± 标准差 ( ± ) 表示, 两组间比较采用独立样本 检验, 多组间进行比较采用单因素方差分析 ( - ), 各组均数间两两比较采用 法, 以 <. 为差异有统计学意义 结 果 加压对 线粒体膜电位的影响 线粒体膜电位与 荧光强度成正 比, 因此可通过 荧光强度间接观察线 粒体膜电位的变化 对照组与加压. 组比较差 异无统计学显著性, 加压 组 加压. 组和加 压 组显著低于对照组 ( <. ), 见图 - - ± = * <., ** <. 图 加压时间延长引起 线粒体膜电位减小 加压对细胞 的影响 为了观察加压诱导凋亡细胞体积的变化, 我们 在电生理实验中观察了加压不同时间的细胞, 对照组和加压. 组细胞的 差异无统计学显著性, 加压. 和 组细胞的 均显著低于对照组 ( <. ), 而加压. 和 组细胞的 差异无统计学显著性, 见图 凋亡的 的改变加压 能使 发生凋亡, 因此, 本研究采用全细胞电压钳制脉冲刺激模式记录对照组和加压 组 的 选择胞体光泽好 细胞膜光滑 立体感强的细胞进行实验 与对照组比较, 加压 能使电流幅度显著增加 各阶跃电压下的电流大小以电流密度 ( 电流 膜电容 ) 表示, 做电流 - 电压 ( - ) 曲线, 与对照组比较, 在刺激电位为 ~ 时, 加压组的电流密度明显大于对照组, 差异有统计学显著性 ( <. ), 见图 - - ± = 图 加压时间延长引起细胞膜电容减小 凋亡的 从 的动力学改变 * <. 电流 - 电压曲线中获得数据并转化为电导 值, 以标准化电导值对膜电位作图, 用 方 程 = { [ ( ) ] } 拟合, 得到最 大电导值 ( ) 电流激活曲线 半数激活电压 ( ) 和斜率 值 加压 组的 与对照组的 比较差异有统计学显著性 ( <. ), 加压 组的 与对照组比较差异有统计学显著性 ( <. ); 两组比较 值间的差异无统计学显著性, 见 图 表 讨 论 青光眼是全世界第二位致盲性眼病, 据流行病 学调查显示, 目前, 我国 岁以上人群中, 青光眼患 者达到 万人, 且青光眼患者数量呈逐年上升的 [ ] 趋势, 青光眼的主要病理变化是视网膜神经节细 胞的凋亡及视神经的永久性损害, 视野缺损, 因此, 探索青光眼视网膜神经节细胞凋亡的机制尤为 重要 细胞凋亡是细胞死亡的主要形式之一, 诱导凋 亡的方法根据研究者们研究的对象和目的而采取不 同的方法, 国内外研究己证实外来机械压力可导致 [ ] [ - ] 淋巴细胞凋亡, 神经节细胞的损伤或凋亡 本 实验室早已建立了成熟的加压诱导 细胞凋亡 的方法, 发现加压 能诱发 凋 [ ] 亡, 采用加压的方法诱导 凋亡模拟了眼球在 高压状态下引起 凋亡及损伤的情况 线粒体在细胞凋亡过程中发挥积极主动的调控 作用, 而且处于多种凋亡调控通路和信号的中心地 [ ] 位 正常的线粒体膜电位是生存所必须的, 当细
:, ; : ; : ( )- ( ) ± = * ** <., <. 图 加压 组与对照组 的变化 - - ± = 图 加压 组和对照组的电导 - 电压曲线 表 两组 的动力学特征 ( ± ) ( ) ( ) ± ± ± ± * ± ± ** * <, ** <. 胞受到凋亡诱导因素作用后, 线粒体膜受到破坏使 其膜电位降低, 导致线粒体内促凋亡蛋白分子释放, 使细胞凋亡 是一种可透过细胞膜 的阳离子荧光染料, 是一种线粒体跨膜电位的指示 剂, 荧光与线粒体膜电位呈线性关系 我们的研究显示随着加压时间大于, 荧光强度降低, 该研究结果与凋亡的大脑纹状体 [ ] 神经细胞内 颗粒荧光强度降低, 缺 氧诱导的大鼠皮层神经细胞线粒体膜电位降低一 [ ] 致 荧光强度的降低可能与加压引起 线粒 体膜完整性破坏有关, 从线粒体中释放出活性氧 ( -, ) - - 等促 [ - ] 凋亡蛋白可能引起压力诱导的 凋亡 我 们的研究还发现, 加压. 会引 起 的 的差异, 细胞 变小, 而加压. 与加压 无明显 间接反映了细胞体积的大小, 这与 细胞凋亡时细胞体积变小的基本形态学特性一致 我们的这些研究结果也再次证明了加压
可引起 凋亡 大量的研究发现, 多种细胞凋亡伴有细胞内钾 离子的外流增加, 本研究发现加压引起细胞 增大, 左移变小, 增加, 这一研究结果与文献报道的 [ ] 神经细胞凋亡时外向钾电流增加一致, 说明 凋亡也伴有外向钾电流增加, 增加的原因可能 是细胞膜上的 通道数开放增多, 电导增大, 但并 不能说明通道开放的速度增快 此外, 外向钾电流 的增加, 细胞内容物减少, 促进了细胞体积变小, 这 也可能是细胞凋亡时体积变小的原因 然而, 凋亡时外向钾电流增加是否是 凋亡的必要条 件, 钾通道在 凋亡过程中的作用是什么 哪种 类型的钾通道参与 凋亡我们还要做进一步的 研究 致谢 : 感谢苏国辉院士为本研究提供宁夏枸杞多糖 [ 参考文献 ] [ ] 金宏伟 电压依赖性钾通道在老年痴呆相关的神经细 胞凋亡中的作用研究 [ ] 北京 : 中国协和医科大学, [ ] 杨巧云 钾离子调节转录因子活性参与神经元凋亡机 制的探讨 [ ] 上海 : 中国科学院上海生命科学研究院 神经科学研究所, [ ] 赵瑛, 刘立夏, 黄燕, 等 枸杞多糖对高眼压大鼠视 网膜神经节细胞的影响 [ ] 中医眼耳鼻喉杂志,, ( ): - [ ] 张虹, 钟杰, 李贵刚, 等 压力对大鼠纯化视网膜神 经节细胞存活及轴突生长的影响 [ ] 中华眼科杂志,, ( ): - [ ],,, : - [ ],, ( ): - [ ],,, - - [ ],, ( ): - [ ],,, [ ],, ( ): - [ ],,, - - - - [ ],, ( ): - [ ] 曾洁萍 及其成分对体外培养鼠视网膜神经节细胞影响的实验研究 [ ] 成都 : 成都中医药大学, [ ],, - : [ ],, ( - ): - [ ], - - - [ ],, ( ): - [ ] 魏楚蓉, 刘路宽, 田立兵, 等 硫化氢对缺氧诱导的大鼠皮层神经元损伤的保护作用 [ ] 中国病理生理杂志,, ( ): - [ ] 应俊, 潘若望, 王茂峰, 等 藻蓝蛋白诱导喉癌 - 细胞凋亡的实验研究 [ ] 中国病理生理杂志,, ( ): - [ ] 刘俊, 张雪林, 任永生, 等 表达下调通过活化 依赖的线粒体通路诱导 阳性胃癌细胞凋亡 [ ] 中国病理生理杂志,, ( ): - [ ],,, - - [ ],, ( ): - ( 责任编辑 : 卢萍, 罗森 )