荧光定量PCR

荧 光 定 量 PCR 荧 光 定 量 PCR 原 理 荧 光 定 量 PCR 最 早 称 TaqMan PCR, 后 来 也 叫 Real-Time PCR, 是 美 国 PE(Perkin Elmer) 公 司 1995 年 研 制 出 来 的 一 种 新 的 核 酸 定 量 技 术 该 技 术 是 在 常 规 PCR 基 础 上 加 入 荧 光 标 记 探 针 或 相 应 的 荧 光 染 料 来 实 现 其 定 量 功 能 的 其 原 理 是 : 随 着 PCR 反 应 的 进 行,PCR 反 应 产 物 不 断 累 计, 荧 光 信 号 强 度 也 等 比 例 增 加 每 经 过 一 个 循 环, 收 集 一 个 荧 光 强 度 信 号, 这 样 就 可 以 通 过 荧 光 强 度 变 化 监 测 产 物 量 的 变 化, 从 而 得 到 一 条 荧 光 扩 增 曲 线 图 一 般 而 言, 荧 光 扩 增 曲 线 可 以 分 成 三 个 阶 段 : 荧 光 背 景 信 号 阶 段, 荧 光 信 号 指 数 扩 增 阶 段 和 平 台 期 在 荧 光 背 景 信 号 阶 段, 扩 增 的 荧 光 信 号 被 荧 光 背 景 信 号 所 掩 盖, 无 法 判 断 产 物 量 的 变 化 而 在 平 台 期, 扩 增 产 物 已 不 再 呈 指 数 级 的 增 加,PCR 的 终 产 物 量 与 起 始 模 板 量 之 间 没 有 线 性 关 系, 根 据 最 终 的 PCR 产 物 量 也 不 能 计 算 出 起 始 DNA 拷 贝 数 只 有 在 荧 光 信 号 指 数 扩 增 阶 段, PCR 产 物 量 的 对 数 值 与 起 始 模 板 量 之 间 存 在 线 性 关 系, 我 们 可 以 选 择 在 这 个 阶 段 进 行 定 量 分 析 为 了 定 量 和 比 较 的 方 便, 在 实 时 荧 光 定 量 PCR 技 术 中 引 入 了 两 个 非 常 重 要 的 概 念 : 荧 光 阈 值 和 CT 值 ( 如 图 1 所 示 ) 荧 光 域 值 (threshold) 是 在 荧 光 扩 增 曲 线 上 人 为 设 定 的 一 个 值, 它 可 以 设 定 在 荧 光 信 号 指 数 扩 增 阶 段 任 意 位 置 上, 但 一 般 荧 光 域 值 的 缺 省 设 置 是 PCR 反 应 前 3 ~ 15 个 循 环 荧 光 信 号 标 准 偏 差 的 10 倍, 即 荧 光 域 值 Ct 值 是 指 每 个 反 应 管 内 的 荧 光 信 号 到 达 设 定 域 值 时 所 经 历 的 循 环 数 Ct 值 与 起 始 模 板 的 关 系

研 究 表 明, 每 个 模 板 的 Ct 值 与 该 模 板 的 起 始 拷 贝 数 的 对 数 存 在 线 性 关 系, 起 始 拷 贝 数 越 多,Ct 值 越 小, 反 之 亦 然 利 用 已 知 起 始 拷 贝 数 的 标 准 品 可 作 出 标 准 曲 线, 其 中 横 坐 标 代 表 起 始 拷 贝 数 的 对 数, 纵 坐 标 代 表 Ct 值 如 下 图 所 示 因 此, 只 要 获 得 未 知 样 品 的 Ct 值, 即 可 从 标 准 曲 线 上 计 算 出 该 样 品 的 起 始 拷 贝 数 荧 光 定 量 检 测 图 2. Ct 值 与 起 始 模 板 的 关 系 荧 光 定 量 检 测 根 据 所 使 用 的 标 记 物 不 同 可 分 为 荧 光 探 针 和 荧 光 染 料 荧 光 探 针 又 包 括 Beacon 技 术 ( 分 子 信 标 技 术, 以 美 国 人 Tagyi 为 代 表 ) TaqMan 探 针 ( 以 美 国 ABI 公 司 为 代 表 ) 和 FRET 技 术 ( 以 罗 氏 公 司 为 代 表 ) 等 ; 荧 光 染 料 包 括 饱 和 荧 光 染 料 和 非 饱 和 荧 光 染 料, 非 饱 和 荧 光 染 料 的 典 型 代 表 就 是 现 在 最 常 用 的 SYBR GreenⅠ; 饱 和 荧 光 染 料 有 EvaGreen LC Green 等 嵌 合 荧 光 染 料 法 (SYBR GreenⅠ) SYBR Green I 是 荧 光 定 量 PCR 最 常 用 的 DNA 结 合 染 料, 与 双 链 DNA 非 特 异 性 结 合 在 游 离 状 态 下,SYBR Green I 发 出 微 弱 的 荧 光, 但 一 旦 与 双 链 DNA 结 合, 其 荧 光 增 加 1000 倍 所 以, 一 个 反 应 发 出 的 全 部 荧 光 信 号 与 出 现 的 双 链 DNA 量 呈 比 例, 且 会 随 扩 增 产 物 的 增 加 而 增 加

图 3. SYBR Green I 荧 光 染 料 与 DNA 双 链 的 结 合 双 链 DNA 结 合 染 料 的 优 点 : 实 验 设 计 简 单, 仅 需 要 2 个 引 物, 不 需 要 设 计 探 针, 无 需 设 计 多 个 探 针 即 可 以 快 速 检 验 多 个 基 因, 且 能 够 进 行 熔 点 曲 线 分 析, 检 验 扩 增 反 应 的 特 异 性, 低 的 初 始 成 本, 通 用 性 好, 因 此 国 内 外 在 科 研 中 使 用 比 较 普 遍 荧 光 探 针 法 (Taqman 技 术 ) PCR 扩 增 时, 加 入 一 对 引 物 的 同 时 再 加 入 一 个 特 异 性 的 荧 光 探 针 该 探 针 为 一 直 线 型 的 寡 核 苷 酸, 两 端 分 别 标 记 一 个 荧 光 报 告 基 团 和 一 个 荧 光 淬 灭 基 团, 探 针 完 整 时, 报 告 基 团 发 射 的 荧 光 信 号 被 淬 灭 基 团 吸 收,PCR 仪 检 测 不 到 荧 光 信 号 ; PCR 扩 增 时 ( 在 延 伸 阶 段 ), Taq 酶 的 5' - 3' 酶 切 活 性 将 探 针 酶 切 降 解, 使 报 告 荧 光 基 团 和 淬 灭 荧 光 基 团 分 离, 从 而 荧 光 监 测 系 统 可 接 收 到 荧 光 信 号, 即 每 扩 增 一 条 DNA 链, 就 有 一 个 荧 光 分 子 形 成, 实 现 了 荧 光 信 号 的 累 积 与 PCR 产 物 形 成 完 全 同 步, 这 也 是 定 量 的 基 础 所 在 其 过 程 如 下 图 所 示 图 4. 荧 光 探 针 法 示 意 图

荧 光 定 量 PCR 的 应 用 分 子 生 物 学 研 究 1. 核 酸 定 量 分 析 对 传 染 性 疾 病 进 行 定 量 定 性 分 析, 病 原 微 生 物 或 病 毒 含 量 的 检 测, 比 如 甲 型 H1N1 流 感 检 测, 转 基 因 动 植 物 基 因 拷 贝 数 的 检 测,RNAi 基 因 失 活 率 的 检 测 等 2. 基 因 表 达 差 异 分 析 比 较 经 过 不 同 处 理 样 本 之 间 特 定 基 因 的 表 达 差 异 ( 如 药 物 处 理 物 理 处 理 化 学 处 理 等 ), 特 定 基 因 在 不 同 时 相 的 表 达 差 异 以 及 cdna 芯 片 或 差 显 结 果 的 确 证 3. SNP 检 测 检 测 单 核 苷 酸 多 态 性 对 于 研 究 个 体 对 不 同 疾 病 的 易 感 性 或 者 个 体 对 特 定 药 物 的 不 同 反 应 有 着 重 要 的 意 义, 因 分 子 信 标 结 构 的 巧 妙 性, 一 旦 SNP 的 序 列 信 息 是 已 知 的, 采 用 这 种 技 术 进 行 高 通 量 的 SNP 检 测 将 会 变 得 简 单 而 准 确 4. 甲 基 化 检 测 甲 基 化 同 人 类 的 许 多 疾 病 有 关, 特 别 是 癌 症,Laird 报 道 了 一 种 称 作 Methylight 的 技 术, 在 扩 增 之 前 先 处 理 DNA, 使 得 未 甲 基 化 的 胞 嘧 啶 变 成 尿 嘧 啶, 而 甲 基 化 的 胞 嘧 啶 不 受 影 响, 用 特 异 性 的 引 物 和 Taqman 探 针 来 区 分 甲 基 化 和 非 甲 基 化 的 DNA, 这 种 方 法 不 仅 方 便 而 且 灵 敏 度 更 高 医 学 研 究 1. 产 前 诊 断 : 人 们 对 遗 传 性 物 质 改 变 引 起 的 遗 传 性 疾 病 还 无 法 治 疗, 到 目 前 为 止, 还 只 能 只 能 通 过 产 前 监 测, 减 少 病 婴 出 生, 以 防 止 各 类 遗 传 性 疾 病 的 发 生, 如 为 减 少 X 连 锁 遗 传 病 患 儿 的 出 生, 从 孕 妇 的 外 周 血 中 分 离 胎 儿 DNA, 用 实 时 荧 光 定 量 PCR 检 测 其 Y 性 别 决 定 区 基 因 是 一 种 无 创 伤 性 的 方 法, 易 为 孕 妇 所 接 受 2. 病 原 体 检 测 : 采 用 荧 光 定 量 PCR 检 测 技 术 可 以 对 淋 球 菌 沙 眼 衣 原 体 解 脲 支 原 体 人 类 乳 头 瘤 病 毒 单 纯 疱 疹 病 毒 人 类 免 疫 缺 陷 病 毒 肝 炎 病 毒 流 感 病 毒 结 核 分 枝 杆 菌 EB 病 毒 和 巨 细 胞 病 毒 等 病 原 体 进 行 定 量 测 定 与 传 统 的 检 测 方 法 相 比 具 有 灵 敏 度 高 取 样 少 快 速 简 便 等 优 点 3. 药 物 疗 效 考 核 : 对 乙 型 肝 炎 病 毒 (HBV) 丙 型 肝 炎 病 毒 (HCV) 定 量 分 析 显 示 : 病 毒 量 与 某 些 药 物 的 疗 效 关 系 HCV 高 水 平 表 达, 干 扰 素 治 疗 作 用 不 敏 感, 而 HCV 低 滴 度, 干 扰 素 作 用 敏 感 ; 在 拉 米 夫 定 治 疗 过 程 中,HBV- DNA 的 血 清 含 量 曾 有 下 降, 随 后 若 再 度 上 升 或 超 出 以 前 水 平, 则 提 示 病 毒 发 生 变 异 4. 肿 瘤 基 因 检 测 : 尽 管 肿 瘤 发 病 的 机 理 尚 未 清 楚, 但 相 关 基 因 发 生 突 变 是 致 癌 性 转 变 的 根 本 原 因 已 被 广 泛 接 受 癌 基 因 的 表 达 增 加 和 突 变, 在 许 多 肿 瘤 早 期 就 可 以 出 现 实 时 荧

光 定 量 PCR 不 但 能 有 效 地 检 测 到 基 因 的 突 变, 而 且 可 以 准 确 检 测 癌 基 因 的 表 达 量 目 前 用 此 方 法 进 行 过 端 粒 酶 htert 基 因 慢 性 粒 细 胞 性 白 血 病 WT1 基 因 肿 瘤 ER 基 因 前 列 腺 癌 PSM 基 因 肿 瘤 相 关 的 病 毒 基 因 等 多 种 基 因 的 表 达 检 测 注 意 事 项 1. 在 实 验 过 程 中 要 防 止 RNA 的 降 解, 保 持 RNA 的 完 整 性 在 总 RNA 的 提 取 过 程 中, 注 意 避 免 mrna 的 断 裂 2. 为 了 防 止 非 特 异 性 扩 增, 必 须 设 阴 性 对 照 3. 内 参 的 设 定 : 主 要 为 了 用 于 靶 RNA 的 定 量 常 用 的 内 参 有 GAPDH( 甘 油 醛 -3- 磷 酸 脱 氢 酶 ) β-actin(β- 肌 动 蛋 白 ) 等 其 目 的 在 于 避 免 RNA 定 量 误 差 加 样 误 差 以 及 各 PCR 反 应 体 系 中 扩 增 效 率 不 均 一, 各 孔 间 的 温 度 差 等 所 造 成 的 误 差 4.PCR 不 能 进 入 平 台 期, 出 现 平 台 效 应 与 所 扩 增 的 目 的 基 因 的 长 度 序 列 二 级 结 构 以 及 目 标 DNA 起 始 的 数 量 有 关 故 对 于 每 一 个 目 标 序 列 出 现 平 台 效 应 的 循 环 数, 均 应 通 过 单 独 实 验 来 确 定 5. 防 止 DNA 的 污 染 : 1) 采 用 DNA 酶 处 理 RNA 样 品 2) 在 可 能 的 情 况 下, 将 PCR 引 物 置 于 基 因 的 不 同 外 显 子, 以 消 除 基 因 和 mrna 的 共 线 性

SYBR 实 时 荧 光 定 量 预 混 试 剂 Real SYBR Mixture(With ROX) 产 品 编 号 规 格 价 格 HS0613-1 20 ul 100 次 300 元 HS0613-2 20 ul 500 次 1200 元 产 品 包 装 试 剂 盒 组 成 HS0613-1 (100 preps) HS0613-2 (200 preps) 2 SYBR Mixture (with ROX) 1 ml 5 ml DEPC-H 2 O 1 ml 5 ml 保 存 条 件 -20 避 光 保 存 产 品 简 介 SYBR Mixture(With ROX) 是 专 用 于 染 料 法 (SYBR GreenⅠ) 实 时 荧 光 定 量 PCR 的 预 混 体 系, 包 含 DNA Polymerase PCR 优 化 的 稳 定 剂 和 增 强 剂 dntps SYBR Green I 荧 光 染 料 Mg 2+ 和 ROX 校 正 染 料, 操 作 简 单 方 便, 主 要 用 于 基 因 组 DNA 靶 序 列 和 RNA 反 转 录 后 cdna 靶 序 列 的 检 测 产 品 特 点 1. 高 灵 敏 度 : 荧 光 染 料 SYBR Green I 可 以 与 所 有 的 双 链 DNA 结 合, 可 以 精 确 定 量 低 拷 贝 模 板 ; 2. 高 特 异 性 : 独 特 的 PCR 缓 冲 体 系 与 热 启 动 酶 的 组 合, 有 效 抑 制 非 特 异 性 的 PCR 扩 增 ; 3. 误 差 小 : 所 含 的 ROX 染 料 可 校 正 定 量 PCR 仪 孔 与 孔 之 间 产 生 的 荧 光 信 号 误 差 产 品 应 用 该 试 剂 盒 确 保 DNA 或 cdna 模 板 的 准 确 定 量, 适 用 于 各 种 类 型 荧 光 定 量 PCR 仪

SYBR 一 步 法 荧 光 定 量 PCR 试 剂 盒 (With ROX) SYBR One Step RT-qPCR Kit (with ROX) 产 品 编 号 规 格 价 格 产 品 包 装 HS0614 20 ul 100 次 1300 元 试 剂 盒 组 成 HS0614 (100 preps) 2 SYBR One Step RT-qPCR Buffer (with ROX) 1 ml One Step RT-qPCR Enzyme Mix DEPC-H 2 O 50 ul 1 ml 保 存 条 件 -20 避 光 保 存 产 品 简 介 本 产 品 是 一 步 法 Real-Time qrt-pcr 专 用 试 剂 盒 使 用 本 产 品 进 行 Real Time qrt-pcr 反 应, 逆 转 录 和 定 量 PCR 在 同 一 反 应 体 系 中 进 行, 反 应 过 程 中 无 需 添 加 试 剂, 无 需 打 开 管 盖, 避 免 了 污 染 的 同 时 提 高 了 实 验 效 率 产 品 特 点 1. 方 便 快 捷 : 反 转 录 和 PCR 在 一 个 反 应 管 中 完 成, 最 大 限 度 的 避 免 污 染 ; 2. 高 灵 敏 度 : 荧 光 染 料 SYBR Green I 可 以 与 所 有 的 双 链 DNA 结 合, 可 以 精 确 定 量 低 拷 贝 模 板 ; 3. 误 差 小 : 所 含 的 ROX 染 料 可 校 正 定 量 PCR 仪 孔 与 孔 之 间 产 生 的 荧 光 信 号 误 差

TaqMan 实 时 荧 光 定 量 预 混 系 统 TaqMan Mixture (With ROX) 产 品 编 号 规 格 价 格 HS0615-1 20 ul 100 次 300 元 HS0615-2 20 ul 500 次 1200 元 产 品 包 装 试 剂 盒 组 成 HS0615-1 (100 preps) HS0615-1 (500 preps) 2 TaqMan Mixture (with ROX) 1 ml 5 ml DEPC-H 2 O 1 ml 5 ml 保 存 条 件 -20 避 光 保 存 产 品 简 介 TaqMan Mixture(With ROX) 是 专 用 于 探 针 法 实 时 荧 光 定 量 PCR 的 预 混 体 系, 包 含 DNA Polymerase PCR 优 化 的 稳 定 剂 和 增 强 剂 dntps Mg 2+ 和 ROX 校 正 染 料, 操 作 简 单 方 便, 主 要 用 于 基 因 组 DNA 靶 序 列 和 RNA 反 转 录 后 cdna 靶 序 列 检 测, 如 基 因 表 达 分 析, 拷 贝 数 分 析,SNP 基 因 型 分 析 等, 适 用 于 不 同 类 型 探 针 法 荧 光 定 量 产 品 特 点 1. 高 灵 敏 度 : 可 以 精 确 定 量 低 拷 贝 模 板 ; 2. 高 特 异 性 : 最 大 限 度 的 减 少 引 物 二 聚 体 和 非 特 异 性 产 物 ; 3. 有 效 性 : 扩 增 效 率 高,CT 值 更 低

TaqMan 探 针 一 步 法 荧 光 定 量 PCR 试 剂 盒 (With ROX) TaqMan One Step RT-qPCR Kit (with ROX) 产 品 编 号 规 格 价 格 产 品 包 装 HS0616 20 ul 100 次 1300 元 试 剂 盒 组 成 HS0616 (100 preps) 2 One Step RT-qPCR Buffer (with ROX) 1 ml One Step RT-qPCR Enzyme Mix DEPC-H 2 O 50 ul 1 ml 保 存 条 件 -20 避 光 保 存 产 品 简 介 本 产 品 适 用 于 探 针 法 进 行 一 步 法 Real-Time qrt-pcr 的 专 用 试 剂 盒 使 用 本 产 品 进 行 Real Time qrt-pcr 反 应 时, 逆 转 录 和 定 量 PCR 在 同 一 反 应 体 系 中 进 行, 反 应 过 程 中 无 需 添 加 试 剂, 无 需 打 开 管 盖, 避 免 了 污 染 的 同 时 提 高 了 实 验 效 率 本 产 品 的 检 测 灵 敏 度 高, 荧 光 信 号 强, 信 噪 比 高, 非 常 适 合 于 RNA 病 毒 等 微 量 RNA 的 检 测 产 品 特 点 1. 快 速 : 可 以 快 速 准 确 地 对 RNA 病 毒 等 微 量 RNA 进 行 分 析 ; 2. 方 便 : 在 一 管 内 连 续 完 成 反 转 录 和 定 量 PCR 扩 增, 最 大 限 度 避 免 污 染 ; 3. 高 效 : 高 效 的 反 转 录 酶 和 热 启 动 聚 合 酶 保 证 扩 增 的 高 效 率 和 高 特 异 性 ; 4. 稳 定 : 实 验 结 果 稳 定 重 复 性 好 荧 光 定 量 PCR 常 见 问 题 分 析 Q:CT 值 出 现 过 晚 A-1: 扩 增 效 率 低, 反 应 条 件 不 够 优 化 设 计 更 好 的 引 物 或 探 针 ; 改 用 三 步 法 进 行 反 应 ; 适 当 降 低 退 火 温 度 ; 增 加 镁 离 子 浓 度 等

A-2: PCR 各 种 反 应 成 分 的 降 解 或 加 样 量 的 不 足 A-3: PCR 产 物 太 长 一 般 采 用 80-150bp 的 产 物 长 度 Q: 无 CT 值 ( 信 号 ) 出 现 A-1: 反 应 循 环 数 不 够 一 般 都 要 在 35 个 循 环 以 上, 可 根 据 实 验 情 况 增 加 循 环 ( 如 至 45cycles), 但 高 于 45 个 循 环 会 增 加 过 多 的 背 景 信 号 A-2: 检 测 荧 光 信 号 的 步 骤 有 误 一 般 SG 法 采 用 72 延 伸 时 采 集,Taqman 法 则 一 般 在 退 火 结 束 时 或 延 伸 结 束 采 集 信 号 A-3: 引 物 或 探 针 降 解 可 通 过 PAGE 电 泳 检 测 其 完 整 性 A-4: 引 物 或 探 针 的 设 计, 如 探 针 高 于 引 物 的 温 度 不 够, 造 成 探 针 未 杂 交 上 而 产 物 已 延 伸 的 情 况 A-5: 模 板 量 不 足 对 未 知 浓 度 的 样 品 应 从 系 列 稀 释 样 本 的 最 高 浓 度 做 起 A-6: 模 板 降 解 避 免 样 品 制 备 中 杂 质 的 引 入 及 反 复 冻 融 的 情 况 Q: 标 准 曲 线 的 线 性 关 系 不 佳 A-1: 加 样 存 在 误 差, 使 得 标 准 品 不 呈 梯 度 A-2: 标 准 品 出 现 降 解 应 避 免 标 准 品 反 复 冻 融, 或 重 新 制 备 并 稀 释 标 准 品 A-3: 引 物 或 探 针 不 佳 重 新 设 计 更 好 的 引 物 和 探 针 A-4: 模 板 中 存 在 抑 制 物, 或 模 板 浓 度 过 高 Q: 阴 性 对 照 也 出 现 明 显 的 起 飞 A-1: mix 或 水 被 污 染 A-2: 引 物 二 聚 体 的 出 现 用 SG 法 在 35cycles 以 后 阴 性 出 现 起 飞 属 正 常 情 况, 可 配 合 熔 解 曲 线 进 行 分 析 A-3: 反 应 过 程 中 探 针 的 降 解 用 PAGE 电 泳 对 探 针 进 行 检 测 A-4: 如 果 使 用 了 ROX 校 正, 则 可 能 是 ROX 的 降 解 所 造 成 Q: 在 溶 解 曲 线 前 是 否 插 入 一 个 同 溶 解 程 序 初 始 温 度 相 同 的 一 个 保 温 过 程 A: 如 果 在 熔 解 曲 线 前 没 有 一 个 保 温 过 程, 则 曲 线 会 在 前 几 个 循 环 非 常 陡 峭, 使 真 正 的 熔 解 峰 型 几 乎 看 不 到 Q: 熔 解 曲 线 不 止 一 个 主 峰 A-1: 引 物 设 计 不 够 优 化 应 避 免 引 物 二 聚 体 和 发 夹 结 构 的 出 现 A-2: 引 物 浓 度 不 佳 适 当 降 低 引 物 的 浓 度, 并 注 意 上 下 游 引 物 的 浓 度 配 比 A-3: 镁 离 子 浓 度 过 高 适 当 降 低 镁 离 子 浓 度, 或 选 择 更 合 适 的 mix 试 剂 盒

A-4: 模 板 有 基 因 组 的 污 染 RNA 提 取 过 程 中 避 免 DNA 的 引 入, 或 通 过 引 物 设 计 避 免 非 特 异 扩 增 Q: 扩 增 效 率 低 A-1: 反 应 试 剂 中 部 分 成 分 特 别 是 荧 光 染 料 降 解 A-2: 反 应 条 件 不 够 优 化, 可 适 当 降 低 退 火 温 度 或 改 为 三 步 扩 增 法 A-3: 反 应 体 系 中 有 PCR 反 应 抑 制 物 一 般 是 加 入 模 板 时 所 引 入, 应 先 把 模 板 适 度 稀 释, 再 加 入 反 应 体 系 中, 减 少 抑 制 物 的 影 响 Q: 实 验 重 复 性 不 好 A-1: 加 样 不 准 确 A-2: 仪 器 在 样 品 上 温 度 条 件 有 差 异, 即 温 度 均 一 性 不 好 A-3: 模 板 浓 度 低 样 品 初 始 浓 度 越 低, 重 复 性 越 差, 应 减 少 样 品 的 稀 释 倍 数 Q: 变 性 温 度 是 否 合 适 A: 大 部 分 的 双 链 DNA 在 95 C 就 开 始 解 链 了, 在 有 些 情 况 下 在 90 至 94 C 都 不 能 很 好 地 变 性 DNA 由 于 部 分 变 性, 参 加 反 应 的 探 针 和 引 物 相 应 的 减 少 了, 因 此 反 应 效 率 会 下 降 Q: 变 性 时 间 是 否 合 适 A: 15 到 20 秒 对 于 变 性 扩 增 子 是 足 够 了, 然 而, 长 一 点 的 产 物, 可 能 会 需 要 30 秒,60 秒 的 变 性 时 间 通 常 是 不 需 要 的 Q: 退 火 温 度 和 时 间 是 否 合 适 A: 检 查 引 物 和 探 针 的 Tm 值,SYBRGreenI 的 退 火 时 间 大 约 20 到 35 秒, 双 标 记 探 针 通 常 是 两 步 法, 退 火 和 延 伸 合 并 为 一 步, 时 间 大 约 是 45 到 60 秒, 温 度 通 常 在 60 C, 对 于 FRET 探 针 退 火 步 骤 大 约 20 到 30 秒 Q: 在 哪 一 步 骤 采 集 信 号 A: SYBRGreenI 应 当 在 72 C, 此 时 绝 大 部 分 的 DNA 是 双 链 状 态, 如 上 所 述, 双 标 记 探 针 通 常 是 两 步 检 测, 因 此 信 号 采 集 应 该 在 退 火 延 伸 的 整 合 步 骤 对 于 FRET 检 测, 数 据 应 该 在 退 火 步 骤 检 测 如 果 对 于 信 号 采 集 点 不 确 定, 可 以 多 点 采 集 作 对 比 如 果 监 控 屏 幕 检 测 不 到 信 号, 检 查 程 序 设 定 是 否 存 在 至 少 一 个 的 信 号 采 集 点