DNA 条 形 码 技 术 在 深 圳 鱼 肉 制 品 鉴 定 中 的 应 用 王 敏 1, 刘 荭 2, 黄 海 3, 赵 晓 萌 1, 石 琼 1, 何 舜 平 1,4, 孙 颖 (1. 深 圳 华 大 基 因 研 究 院, 广 东 深 圳 518083;2. 深 圳 出 入 境 检 验 检 疫 局 动 植 物 检 验 检 疫 技 术 中 心, 广 东 深 圳 518045; 3. 三 亚 市 南 繁 科 学 技 术 研 究 院, 海 南 三 亚 572000;4. 中 国 科 学 院 水 生 生 物 研 究 所, 湖 北 武 汉 430072) 摘 要 : 以 线 粒 体 细 胞 色 素 氧 化 酶 亚 基 I(COI) 基 因 为 目 标 基 因, 应 用 DNA 条 形 码 (DNA barcoding) 技 术 鉴 别 深 圳 批 发 市 场 和 超 市 零 售 鱼 肉 制 品 的 种 类 来 源, 判 别 其 产 品 标 签 是 否 正 确 本 次 调 查 的 77 份 鱼 肉 制 品 均 能 扩 增 出 特 异 性 条 带,28 份 样 品 与 产 品 标 签 标 示 不 符, 错 贴 率 高 达 36.36%, 其 中 所 有 标 示 龙 俐 鱼 的 商 品 竟 然 都 是 低 价 的 巴 丁 鱼 (Pangasianodon hypophthalmus) DNA 条 形 码 技 术 可 用 于 鱼 肉 制 品 的 来 源 物 种 鉴 定 关 键 词 :DNA 条 形 码 ;COI 基 因 ; 物 种 鉴 定 ; 鱼 肉 制 品 1, Identifying Fish Products in ShenZhen through DNA Barcoding WANG Min 1, LIU Hong 2, HUANG Hai 3, ZHAO Xiao-meng 1, SHI Qiong 1, HE Shun-ping 1,4, SUN Ying 1, (1. BGI, Shenzhen 518083, China; 2. Animal & Plant Inspection and Quarantine Technology Center, Shenzhen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shenzhen 518045, China; 3. Sanya Science & Technology Academy for Crop Winter Multiplication, Sanya 572000, China; 4. Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China) Abstract:In this study, DNA barcoding was used to identify the exact species of fish products from Shenzhen wholesale and retail markets and to check if these products were correctly labeled. Using mitochondrial cytochrome C oxidase subunit I (COI) gene as the target, and analyze the sequences of COI from different samples. Our results showed that all 77 examined samples were successfully amplified by PCR. However, up to 36.36%(28/77)of them were inconsistent with their label descriptions, in which all the products labeled with "Long Li fish" were actually the low-cost Pangasianodon hypophthalmus. As a simple, rapid and efficient technology, DNA barcoding can be widely used for species identification of fish products. Key words:dna barcoding; COI gene; species identification; fish products 中 图 分 类 号 :Q95 文 献 标 志 码 :B 1 我 国 是 鱼 肉 消 费 大 国, 鱼 肉 制 品 繁 多, 包 括 生 鱼 片 冷 冻 加 工 品 ( 鱼 片 或 鱼 段 ) 烤 鱼 片 和 鱼 糜 制 品 等 近 年 来, 鱼 肉 制 品 的 掺 假 行 为 频 频 曝 光, 给 人 们 的 健 康 造 成 严 重 威 胁 [1-3] 鱼 肉 制 品 错 贴 标 签 的 现 象 并 非 中 国 独 有, 一 些 欧 洲 国 家 的 商 贩 也 以 次 充 好, 赚 取 更 高 利 润 如, 在 抽 检 的 德 国 产 鲽 类 鱼 中,1/4 与 标 注 名 称 不 符 ;24% 的 西 班 牙 产 虾 肉 样 品 中 存 在 欺 诈 行 为 ; 在 奥 地 利, 一 些 价 格 昂 贵 的 比 目 鱼 挪 威 三 文 鱼 也 通 常 成 为 假 冒 的 对 象 [4] DNA 条 形 码 的 概 念 由 加 拿 大 生 物 学 家 Paul Hebert 在 2003 年 首 次 提 出 [5,6], 是 一 种 利 用 线 粒 体 细 胞 色 素 C 氧 化 酶 亚 基 I(Mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I,COI) 基 因 一 段 长 度 为 648 bp 的 片 段, 对 物 种 进 行 准 确 快 速 鉴 [7] 定 的 方 法 在 国 外,DNA 条 形 码 技 术 已 用 于 鱼 肉 制 品 的 真 假 鉴 别 Cawthom 等 利 用 DNA 条 形 码 技 术 研 究 南 非 市 场 的 鱼 类, 发 现 在 批 发 商 和 零 售 商 中 贴 错 标 签 的 比 例 差 别 巨 大 ;Laura [8] 利 用 DNA 条 形 码 技 术 对 意 大 利 市 场 上 的 69 份 [9] 鱼 类 样 品 进 行 分 析, 发 现 有 22 个 样 本 (32%) 存 在 错 贴 标 签 现 象 ;Wong 等 利 用 DNA 条 形 码 技 术 对 市 场 上 的 91 个 [10] 样 品 进 行 分 析, 发 现 有 25% 的 海 产 品 的 标 签 与 实 物 不 符 ;Holems 等 研 究 了 澳 大 利 亚 附 近 海 域 的 221 份 鱼 翅 样 品, 结 果 发 现 有 许 多 鲨 鱼 被 列 入 世 界 自 然 保 护 联 盟 (IUCN) 红 色 名 录, 一 种 鲨 鱼 为 极 度 濒 危 物 种 ; 美 国 OCEANA 在 2010-2012 期 间 通 过 DNA 条 形 码 技 术 研 究 全 美 境 内 1247 份 鱼 类 制 品, 发 现 有 三 分 之 一 的 商 品 存 在 错 贴 标 签 现 象 [11] 但 在 我 国,DNA 条 形 码 技 术 主 要 集 中 在 分 类 学 和 物 种 鉴 定 研 究 中 [12-15], 而 用 于 食 品 鉴 定 的 文 献 报 道 较 少, 在 鱼 肉 鉴 定 方 面 的 也 是 最 近 两 年 才 有 少 量 报 道 [16-18] 收 稿 日 期 :2015-1-29 基 金 项 目 : 深 圳 市 科 技 计 划 深 港 创 新 圈 项 目 (SGLH20131010105856414); 广 东 省 省 部 产 学 研 专 项 (2013B090800017) 作 者 简 介 : 王 敏 (1988 ), 男, 硕 士, 研 究 方 向 为 水 生 生 物 学 E-mail:wangmin2@genomics.cn 通 信 作 者 : 孙 颖 (1972 ), 女, 副 研 究 员, 博 士, 研 究 方 向 为 鱼 类 生 物 学 E-mail:yingsun09@163.com 1
[19] 本 研 究 参 照 Ward 等 的 方 法, 选 用 COI 基 因 的 通 用 引 物, 对 深 圳 市 场 冷 冻 鱼 冻 鱼 片 进 行 DNA 提 取 扩 增 和 测 序, 并 对 线 粒 体 COI 基 因 序 列 进 行 分 析 比 对, 旨 在 建 立 准 确 高 效 的 鱼 肉 制 品 的 鉴 定 方 法, 为 鱼 肉 制 品 进 出 口 检 验 监 管 和 市 场 安 全 监 管 等 方 面 的 应 用 提 供 技 术 支 持 1 材 料 与 方 法 1.1 材 料 与 试 剂 2013 年 3 月, 从 市 场 上 随 机 购 买 77 份 鱼 肉 样 品 其 中 59 份 整 鱼 和 冻 鱼 块 在 深 圳 梅 林 批 发 市 场 购 得, 其 余 18 份 鱼 片 和 鱼 柳 等 在 深 圳 各 超 市 购 得 无 水 乙 醇 氯 仿 异 戊 醇 和 异 丙 醇 ( 分 析 纯 ) 生 工 生 物 工 程 有 限 公 司 ;Tris- 饱 和 酚 (ph 8.0) 北 京 索 莱 宝 科 技 有 限 公 司 ;Taq DNA 聚 合 酶 dntps(2.5 mmol/l) DNA Marker(DL100 bp) 广 州 瑞 真 生 物 科 技 有 限 公 司 ; 蛋 白 酶 K 德 国 Merck 公 司 ;EB 核 酸 染 料 生 工 生 物 工 程 ( 上 海 ) 股 份 有 限 公 司 1.2 仪 器 与 设 备 高 速 离 心 机 Eppendorf 公 司 ;PCR 仪 Life Technologies 公 司 ; 水 浴 锅 上 海 精 宏 ; 超 净 工 作 台 深 圳 市 优 之 净 环 境 科 技 有 限 公 司 ; 电 泳 仪 北 京 六 一 仪 器 厂 ; 凝 胶 成 像 系 统 上 海 天 能 科 技 有 限 公 司 ; 微 量 核 酸 蛋 白 测 定 仪 Implen 公 司 1.3 方 法 1.3.1 样 本 DNA 提 取 采 用 传 统 的 酚 - 氯 仿 法 取 10 mg 左 右 的 组 织 于 1.5 ml 的 离 心 管 中, 加 入 494 µl 的 DNA 裂 解 液 和 6 µl 的 蛋 白 酶 K(20 mg/ml); 将 离 心 管 于 56 恒 温 水 浴 锅 中 裂 解 3 小 时, 水 浴 完 后, 加 入 等 体 积 的 酚 : 氯 仿 : 异 戊 醇 (25:24:1), 摇 匀 至 乳 浊 液, 离 心 10 min,12000 r/min; 吸 取 上 清, 转 入 新 的 1.5 ml 离 心 管 中, 加 入 等 体 积 的 酚 : 氯 仿 : 异 戊 醇 (25:24:1), 摇 匀 至 乳 浊 液, 离 心 10 min,12000 r/min 吸 取 上 清, 转 入 新 的 1.5 ml 离 心 管 中, 加 入 两 倍 体 积 无 水 乙 醇 ( 提 前 预 冷 ), 颠 倒 混 匀,-20 静 置 30 min, 离 心 10 min,12000 r/min; 弃 去 上 清,75% 乙 醇 洗 涤 2 次 ; 烘 干 后 加 入 50 µl dh 2 O, 溶 解 DNA; 取 2 µl 制 备 1% 琼 脂 糖 凝 胶 进 行 电 泳 检 测, 同 时 吸 取 1 µl 稀 释 后 使 用 紫 外 分 光 光 度 计 进 行 检 测 ; 将 原 液 存 放 于 -20 冰 箱 保 存 1.3.2 COI 基 因 的 PCR 扩 增 和 测 序 鱼 类 通 用 引 物 [19] : FishF2_t1(5 -TGTAAAACGACGGCCAGTCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC-3 ), VF2_t1(5 -TGTAAAACGACGGCCAGTCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC-3 ); FishR2_t1(5 -TGTAAAACGACGGCCAGTCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC-3 ), FR1d_t1(5 -CAGGAAACAGCTATGACACCTCAGGGTGTCCGAARAAYCARAA-3 ) PCR 反 应 体 系 为 25 µl:10 PCR Buffer 为 2.5 µl,dntps(2.5 Mm)1.0 µl,takara Taq(5 U/µL)0.5 µl, 引 物 各 0.25 µl,dna 模 版 1.0 µl, 去 离 子 水 19.0 µl PCR 反 应 程 序 :94 5 min;94 30 s,52 40 s,72 1 min,35 个 循 环 ;72 10 min PCR 扩 增 完 成 后, 以 1% 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 PCR 产 物, 挑 选 扩 增 成 功 且 条 带 单 一 的 产 物 送 测 1.3.3 序 列 比 对 及 分 析 将 测 序 成 功 的 序 列 人 工 比 对 拼 接, 将 处 理 过 的 序 列 放 到 BOLD(http://www.boldsystems.org) 以 及 NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov) 网 站 的 数 据 库 对 样 品 的 COI 序 列 进 行 鉴 定 以 及 相 似 度 分 析, 再 将 整 理 后 的 序 列 和 GenBank 下 载 的 相 关 序 列 应 用 DNAMAN7.0 软 件 进 行 多 序 列 比 对, 分 析 相 关 序 列 的 同 源 性 2 结 果 与 分 析 2. 1 样 品 DNA 浓 度 及 纯 度 电 泳 检 测 显 示,DNA 质 量 正 常 ; 紫 外 分 光 光 度 计 检 测 OD 260 /OD 280 在 1.8~2.0 之 间, 满 足 常 规 PCR 反 应 的 要 求 2. 2 COI 基 因 的 扩 增 和 克 隆 本 研 究 设 计 的 引 物 扩 增 目 标 片 段 约 为 750 bp, 经 1% 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 的 PCR 扩 增 产 物 分 子 量 与 设 计 相 符 ( 见 图 1) 将 DNA 片 段 纯 化 后 送 北 京 六 合 华 大 基 因 科 技 股 份 有 限 公 司 测 序, 所 有 77 份 获 得 测 序 序 列, 且 经 过 序 列 比 对 后 相 似 度 均 在 98% 以 上, 说 明 DNA 条 形 码 技 术 可 以 精 准 地 对 各 种 冻 鱼 鱼 片 以 及 鱼 柳 样 品 进 行 鉴 定 2
1000bp 500bp 目 的 片 段 1000bp 500bp 目 的 片 段 2.3 标 签 符 合 性 分 析 图 1 不 同 鱼 类 样 品 COI 基 因 的 扩 增 条 带 Fig.1 COI gene amplification from different commercial fish products 批 发 市 场 购 买 的 59 份 样 品, 经 基 因 测 序 后 其 序 列 与 NCBI 数 据 库 比 对 分 析 后 的 相 似 度 汇 总 于 表 1 研 究 表 明, 有 20 份 存 在 标 签 贴 错 的 混 乱 现 象, 误 贴 率 为 33.9%, 其 中 大 多 数 是 由 于 卖 家 没 有 专 业 的 分 类 知 识 所 致 除 了 金 线 鱼 (Nemipterus virgatus) 标 为 黄 花 鱼 ( 序 号 31) 蛇 鲻 (Saurida elongata) 标 为 九 江 鱼 ( 序 号 41) 这 2 份 样 品 存 在 严 重 的 错 标 外, 其 他 错 标 可 能 是 由 于 鱼 的 外 形 不 易 辨 别 而 导 致 的 商 品 错 标 如 众 多 标 有 池 鱼 的 商 品 是 花 腹 鲭 (Scomber australasicus) 和 日 本 鲭 (Scomber japonicus) 两 种 不 同 的 鱼 ; 标 有 金 线 鱼 红 衫 鱼 和 红 三 鱼 的 多 属 于 同 一 种 鱼 ; 史 氏 低 鳍 鲳 (Peprilus snyderi) 在 形 态 学 上 和 南 鲳 (Psenopsis anomala) 比 较 相 似 ; 长 尾 大 眼 鲷 (Priacanthus tayenus) 也 经 常 被 渔 民 当 作 红 衫 鱼 红 尾 圆 鲹 (Decapterus akaadsi) 与 花 腹 鲭 和 日 本 鲭 虽 然 在 种 属 差 别 很 大, 但 是 形 态 上 都 是 长 梭 形, 比 较 容 易 被 商 贩 误 以 为 是 池 鱼 表 1 批 发 市 场 样 品 鉴 定 结 果 Table.1 Identification results obtained from wholesalers 序 号 商 品 名 称 NCBI 比 对 结 果 相 似 度 (%) 1 黄 鳍 鲷 Acanthopagrus latus 黄 鳍 鲷 黄 鳍 棘 鲷 100 2 黄 鳍 鲷 Acanthopagrus latus 黄 鳍 鲷 黄 鳍 棘 鲷 99.8 3 秋 刀 鱼 Cololabis saira 秋 刀 鱼 100 4 秋 刀 鱼 Cololabis saira 秋 刀 鱼 100 5 秋 刀 鱼 Cololabis saira 秋 刀 鱼 100 6 秋 刀 鱼 Cololabis saira 秋 刀 鱼 100 7 秋 刀 鱼 Cololabis saira 秋 刀 鱼 100 8 秋 刀 鱼 Cololabis saira 秋 刀 鱼 99.7 9 秋 刀 鱼 Cololabis saira 秋 刀 鱼 100 10 秋 刀 鱼 Cololabis saira 秋 刀 鱼 99.2 11 池 鱼 Decapterus akaadsi 红 尾 圆 鲹 100 12 大 黄 鱼 Larimichthys crocea 大 黄 鱼 大 黄 花 鱼 黄 瓜 鱼 100 13 大 黄 鱼 Larimichthys crocea 大 黄 鱼 大 黄 花 鱼 黄 瓜 鱼 100 14 大 黄 鱼 Larimichthys crocea 大 黄 鱼 大 黄 花 鱼 黄 瓜 鱼 98.1 15 黄 花 鱼 Larimichthys crocea 大 黄 鱼 大 黄 花 鱼 黄 瓜 鱼 100 3
16 黄 花 鱼 17 黄 花 鱼 Larimichthys crocea 大 黄 鱼 大 黄 花 鱼 黄 瓜 鱼 99.1 Larimichthys crocea 大 黄 鱼 大 黄 花 鱼 黄 瓜 鱼 100 18 海 鲈 鱼 Lateolabrax japonicus 鲈 鱼 花 鲈 海 鲈 鱼 100 19 海 鲈 鱼 Lateolabrax japonicus 鲈 鱼 花 鲈 海 鲈 鱼 99.8 20 乌 头 鱼 Mugil cephalus 鲻 鱼 乌 头 乌 鲻 100 21 乌 头 鱼 Mugil cephalus 鲻 鱼 乌 头 乌 鲻 100 22 乌 头 鱼 Mugil cephalus 鲻 鱼 乌 头 乌 鲻 100 23 乌 头 鱼 Mugil cephalus 鲻 鱼 乌 头 乌 鲻 100 24 乌 头 Mugil cephalus 鲻 鱼 乌 头 乌 鲻 100 25 红 三 鱼 Nemipterus virgatus 金 线 鱼 红 衫 红 三 100 26 红 衫 鱼 Nemipterus virgatus 金 线 鱼 红 衫 红 三 100 27 金 线 鱼 Nemipterus virgatus 金 线 鱼 红 衫 红 三 100 28 红 衫 鱼 Nemipterus virgatus 金 线 鱼 红 衫 红 三 98.1 29 红 三 鱼 Nemipterus virgatus 金 线 鱼 红 衫 红 三 99.8 30 金 线 鱼 Nemipterus virgatus 金 线 鱼 红 衫 红 三 99.1 31 黄 花 鱼 Nemipterus virgatus 金 线 鱼 红 衫 红 三 100 32 多 宝 鱼 Paralichthys olivaceus 牙 鲆 多 宝 鱼 比 目 鱼 100 33 白 姑 鱼 Pennahia argentata 白 姑 鱼 100 34 南 鲳 35 南 鲳 Peprilus snyderi 史 氏 低 鳍 鲳 99.1 Peprilus snyderi 史 氏 低 鳍 鲳 98.7 36 大 眼 鲷 Priacanthus tayenus 长 尾 大 眼 鲷 大 眼 鲷 100 37 红 衫 鱼 Priacanthus tayenus 长 尾 大 眼 鲷 大 眼 鲷 99.6 38 南 鲳 Psenopsis anomala 刺 鲳 南 鲳 100 39 海 鲂 鱼 Pseudocyttus maculatus 斑 点 拟 短 棘 海 鲂 海 鲂 鱼 99.8 40 海 鲂 鱼 Pseudocyttus maculatus 斑 点 拟 短 棘 海 鲂 海 鲂 鱼 100 41 九 江 鱼 42 池 鱼 43 池 鱼 44 池 鱼 45 池 鱼 46 池 鱼 47 池 鱼 48 泥 蜢 49 泥 蜢 50 泥 蜢 Saurida elongata 长 体 蛇 鲻 蛇 鲻 100 Scomber australasicus 花 腹 鲭 花 池 鱼 100 Scomber australasicus 花 腹 鲭 花 池 鱼 100 Scomber japonicus 日 本 鲭 白 腹 鲭 花 池 鱼 100 Scomber japonicus 日 本 鲭 白 腹 鲭 花 池 鱼 100 Scomber japonicus 日 本 鲭 白 腹 鲭 花 池 鱼 100 Scomber japonicus 日 本 鲭 白 腹 鲭 花 池 鱼 100 Siganus canaliculatus 黄 斑 蓝 子 鱼 泥 蜢 99.8 Siganus fuscescens 褐 蓝 子 鱼 泥 蜢 99.8 Siganus fuscescens 褐 篮 子 鱼 泥 蜢 99.2 51 马 面 鲀 Thamnaconus septentrionalis 绿 鳍 马 面 鲀 马 面 鲀 99.5 52 大 眼 金 枪 鱼 Thunnus obesus 大 眼 金 枪 鱼 金 枪 鱼 100 53 金 鲳 鱼 Trachinotus ovatus 卵 形 鲳 鲹 金 鲳 98.3 54 金 鲳 鱼 Trachinotus ovatus 卵 形 鲳 鲹 金 鲳 100 55 金 鲳 鱼 Trachinotus ovatus 卵 形 鲳 鲹 金 鲳 100 56 金 鲳 鱼 Trachinotus ovatus 卵 形 鲳 鲹 金 鲳 99.8 57 鲳 鱼 58 鲳 鱼 Trachinotus ovatus 卵 形 鲳 鲹 金 鲳 100 Trachinotus ovatus 卵 形 鲳 鲹 金 鲳 100 59 带 鱼 Trichiurus lepturus 带 鱼 白 带 99.6 注 : 带 表 示 错 贴 和 误 贴 标 签 样 本 4
超 市 购 买 的 18 份 鱼 片 和 鱼 柳 样 品 经 基 因 测 序, 其 序 列 与 NCBI 数 据 库 比 对 分 析 后 的 相 似 度 汇 总 于 表 2 其 中, 超 过 三 分 之 一 的 样 品 存 在 以 价 格 较 低 的 鱼 标 成 价 格 较 高 的 鱼 的 现 象 龙 俐 鱼 一 般 指 舌 鳎 科 舌 鳎 属 的 几 种 鱼 类, 如 半 滑 舌 鳎 (Cynoglossus semilaevis); 然 而 此 次 调 查 所 有 标 有 龙 俐 鱼 的 商 品 竟 然 都 是 低 价 的 巴 丁 鱼 (Pangasianodon hyp ophthalmus); 而 罗 非 鱼 (Oreochromis niloticus) 也 被 标 为 价 格 较 高 的 鲷 鱼 ; 纯 正 鳕 鱼 一 般 为 大 西 洋 鳕 鱼 (Gadus m orhua) 格 陵 兰 鳕 鱼 (Gadus ogac) 和 太 平 洋 鳕 鱼 (Gadus macrocephalus) 三 种, 虽 然 细 鳞 壮 鳕 (Albatrossia pector alis) 不 能 被 当 作 传 统 意 义 上 的 鳕 鱼, 也 勉 强 可 以 叫 鳕 鱼, 然 而 一 些 商 家 竟 然 将 马 舌 鲽 鱼 (Reinhardtius hippoglossoid es) 标 为 鳕 鱼 片 ; 白 鲳 在 一 些 地 方 也 被 标 为 金 鲳 即 卵 形 鲳 鲹 (Trachinotus ovatu) 表 2 超 市 样 品 鉴 定 结 果 Table.2 Identification results obtained from supermarket 序 号 商 品 名 NCBI 比 对 结 果 相 似 度 (%) 1 鳕 鱼 片 Albatrossia pectoralis 细 鳞 壮 鳕 100 2 阿 拉 斯 加 黑 鳕 鱼 片 Anoplopoma fimbria 裸 盖 鱼 黑 鳕 99.1 3 野 生 黑 鱈 Anoplopoma fimbria 裸 盖 鱼 黑 鳕 99.3 4 大 西 洋 银 鳕 鱼 Dissostichus eleginoides 小 鳞 犬 牙 南 极 鱼 银 鳕 99.6 5 海 晨 行 银 鳕 鱼 片 Dissostichus eleginoides 小 鳞 犬 牙 南 极 鱼 银 鳕 99.8 6 银 鳕 鱼 Dissostichus eleginoides 小 鳞 犬 牙 南 极 鱼 银 鳕 99.6 7 银 鳕 鱼 Dissostichus eleginoides 小 鳞 犬 牙 南 极 鱼 银 鳕 99.6 8 真 鳕 鱼 柳 Gadus ogac 格 陵 兰 鳕 99.8 9 大 西 洋 真 鳕 鱼 片 10 鲷 鱼 11 鮰 鱼 段 12 龙 俐 鱼 13 龙 俐 鱼 14 龙 俐 鱼 柳 Reinhardtius hippoglossoides 马 舌 鲽 99.4 Oreochromis niloticus 吉 富 罗 非 鱼 100 Pangasianodon hypophthalmus 低 眼 巨 鲇 巴 丁 鱼 99.8 Pangasianodon hypophthalmus 低 眼 巨 鲇 巴 丁 鱼 99.8 Pangasianodon hypophthalmus 低 眼 巨 鲇 巴 丁 鱼 100 Pangasianodon hypophthalmus 低 眼 巨 鲇 巴 丁 鱼 100 15 狭 鳕 鱼 柳 Theragra finnmarchica 挪 威 狭 鳕 99.6 16 野 生 狭 鳕 Theragra finnmarchica 挪 威 狭 鳕 99.3 17 金 枪 鱼 丁 Thunnus albacares 黄 鳍 金 枪 鱼 金 枪 鱼 100 18 白 鲳 Trachinotus ovatus 卵 形 鲳 鲹 金 鲳 99.8 注 : 带 表 示 错 贴 和 误 贴 标 签 样 本 3 讨 论 3.1 市 场 错 贴 标 签 的 种 类 各 种 因 素 都 可 能 造 成 商 品 错 标 现 象 第 一, 渔 民 由 于 缺 乏 专 业 的 分 类 学 知 识 导 致 鱼 从 刚 捕 捞 上 来 就 被 贴 错 标 签 [7], 这 种 情 况 主 要 由 于 鱼 的 形 态 比 较 相 似 导 致, 在 此 次 调 查 中 这 类 现 象 普 遍 存 在, 如 花 腹 鲭 日 本 鲭 以 及 红 尾 圆 鲹 被 标 为 池 鱼, 而 金 线 鱼 则 被 标 上 金 线 鱼 红 衫 鱼 和 红 三 鱼 等 多 种 商 标 第 二, 有 些 鱼 的 形 态 相 差 甚 远, 但 鱼 肉 无 法 区 分, 使 得 一 些 价 格 较 低 的 鱼 可 能 被 标 成 价 格 较 高 的 鱼 这 种 行 为 不 仅 在 国 内 时 常 发 生, 在 欧 美 等 众 多 发 达 国 家 也 存 在, 一 些 渔 业 厂 商 甚 至 有 意 将 低 价 鱼 贴 上 名 贵 鱼 肉 的 标 签, 以 赚 取 更 高 利 润 [4,20-22] 在 我 们 对 收 集 的 样 品 进 行 检 测 后 发 现, 被 误 标 鱼 类 多 集 中 在 高 价 值 经 济 鱼 类, 如 罗 非 鱼 片 代 替 鲷 鱼, 巴 丁 鱼 代 替 龙 俐 鱼 鮰 鱼, 鲽 鱼 代 替 鳕 鱼 等 此 外, 一 些 禁 止 销 售 的 鱼 类, 也 会 发 生 贴 错 标 签 现 象 [23] [24] Birstein 等 利 用 DNA 条 形 码 分 析 发 现 23% 的 鱼 子 酱 标 注 的 鱼 类 名 称 错 误, 部 分 商 品 涉 及 濒 危 鱼 类 成 分 ; 商 贩 也 会 把 濒 危 和 受 保 护 的 物 种 贴 成 市 场 可 以 销 售 的 商 品 标 签, 例 如 Liu [25] 研 究 了 台 湾 境 内 548 份 鱼 翅 样 品, 结 果 显 示 有 2.5% 的 鲨 鱼 物 种 是 濒 危,50% 易 危,24.5% 近 危, 仅 有 23% 的 物 种 是 非 濒 危 物 种 的 错 贴 标 签 还 可 能 导 致 一 些 鱼 类 引 发 的 食 物 中 毒 [26], 我 国 沿 海 地 区 的 一 些 餐 馆 会 把 许 多 有 毒 的 5
河 豚 当 作 无 毒 的 河 豚 贩 卖, 最 后 导 致 悲 剧 的 发 生 [1] ; 此 次 我 们 尚 未 检 测 到 濒 危 物 种 和 禁 止 销 售 的 鱼 类 3.2 鱼 肉 真 伪 鉴 别 方 法 通 常 人 们 在 买 鱼 时 对 鱼 肉 好 坏 的 鉴 别 方 法 主 要 是 凭 借 感 觉 经 验 以 及 喜 好 程 度 进 行 评 判, 但 是 这 样 不 能 有 效 地 分 辨 鱼 的 种 类 研 究 表 明, 通 过 近 红 外 光 谱 法 可 对 鱼 糜 中 水 分 和 蛋 白 质 含 量 进 行 快 速 无 损 检 测 [27,28] Mounier [29] 研 究 发 现, 变 性 高 效 液 相 色 谱 (DHPLC) 是 一 种 快 速 有 效 的 肉 类 成 分 鉴 定 技 术, 可 判 断 鱼 糜 及 蟹 棒 中 成 分 组 成 酶 联 免 疫 吸 附 测 定 法 (ELISA) 也 被 广 泛 应 用 到 果 汁 饮 料 奶 类 产 品 和 动 物 源 性 成 分 的 检 测 和 鉴 别, 并 且 具 有 高 灵 敏 度 和 特 异 性 [30] 等 电 聚 焦 法 和 双 向 电 泳 法 可 以 对 不 同 种 类 冷 冻 虾 鲈 鱼 进 行 鉴 定 [31,32] 随 着 分 子 生 物 技 术 的 快 速 发 展, 近 年 来 DNA 鉴 别 法 越 来 越 常 见, 限 制 性 片 段 长 度 多 态 性 聚 合 酶 链 反 应 (PCR-RFLP) 技 术 可 以 对 肉 类 制 品 进 行 正 确 鉴 别 [33-35] [34], 如 Hsieh 等 利 用 PCR-RFLP 技 术 可 以 对 热 处 理 (121, 10~90 min) 的 河 豚 鱼 制 品 进 行 正 确 鉴 别 扩 增 片 段 长 度 多 态 性 (AFLP) 分 子 标 记 技 术 鉴 别 鱼 肉 品 种 早 有 报 道, 如 Zhang [36] 采 用 AFLP 和 变 性 梯 度 电 泳 (DGGE) 鉴 别 虹 鳟 鱼 和 大 西 洋 鲑 鱼, 结 果 表 明 AFLP 具 有 更 高 的 灵 敏 度, 可 以 [37] 对 鲑 鱼 进 行 准 确 鉴 定 Maldini 等 研 究 表 明,AFLP 分 子 标 记 技 术 可 以 用 于 32 种 冷 冻 鱼 类 和 家 畜 品 种 的 准 确 鉴 别, 也 可 以 用 于 热 处 理 海 产 品 的 鉴 别 最 近 几 年 来,DNA 条 形 码 技 术 也 已 被 越 来 越 多 应 用 到 食 品 鉴 定 中 [7-11,16-18,23-25,38] 3.3 DNA 条 形 码 技 术 的 优 势 与 传 统 形 态 鉴 定 相 比 较,DNA 条 形 码 技 术 具 有 诸 多 优 势 : 鉴 定 不 依 赖 形 态 特 征, 不 受 个 体 差 异 的 影 响, 能 够 鉴 定 到 种 的 水 平 [39,40], 对 实 验 人 员 的 操 作 技 能 要 求 低 等 特 点 使 得 物 种 鉴 定 过 程 变 得 简 单 有 效 和 统 一 与 一 般 的 蛋 白 质 鉴 定 方 法 相 比, 由 于 DNA 比 蛋 白 质 的 耐 热 性 强, 但 是 通 过 优 化 手 段 仍 然 可 以 从 加 工 产 品 中 提 取 小 片 段 的 DNA [41] ; DNA 本 身 的 复 杂 性 也 可 以 能 提 供 更 多 信 息 ; 而 且 DNA 条 形 码 技 术 不 受 组 织 类 型 年 龄 及 状 态 等 因 素 的 影 响 因 此, 该 技 术 具 有 更 高 的 特 异 性 灵 敏 度 和 可 靠 性 与 其 他 DNA 鉴 别 方 法 比 较,DNA 条 形 码 技 术 具 有 操 作 简 单 可 靠 快 捷 以 及 应 用 广 泛 等 优 势 PCR-RFLP 在 物 种 鉴 定 中 已 成 为 一 个 重 要 的 方 法, 但 由 于 物 种 的 种 内 变 异 可 能 导 致 在 鉴 定 过 程 中 出 现 误 判 ;AFLP 虽 然 相 对 可 靠 操 作 简 便, 但 AFLP 也 会 发 生 谱 带 错 配 或 缺 失, 而 且 其 成 本 也 比 DNA 条 形 码 技 术 高 [42] ;SSR 标 记 的 等 位 基 因 数 目 多 带 型 复 杂, 从 而 导 致 难 以 判 型, 给 DNA 指 纹 识 别 自 动 化 和 规 模 化 带 来 困 难 [43] 3.4 展 望 尽 管 DNA 条 形 码 技 术 具 有 许 多 优 势, 然 而, 在 食 物 鉴 定 方 面 还 存 在 一 些 挑 战 在 食 物 加 工 过 程 中 往 往 会 因 为 高 温 等 导 致 DNA 降 解, 以 及 植 物 油 添 加 剂 和 调 味 料 的 加 入 对 DNA 提 取 和 扩 增 有 很 大 影 响, 这 就 需 要 对 一 些 步 骤 进 行 各 种 优 化 ; 另 外, 一 些 鱼 丸 或 肉 丸 可 能 不 是 来 自 单 个 物 种, 这 就 无 法 对 食 物 种 源 进 行 准 确 鉴 定 此 外, 由 于 食 物 的 种 类 繁 多, 目 前 的 DNA 条 形 码 数 据 库 虽 然 物 种 量 比 较 丰 富 但 还 远 远 不 够 完 善, 因 此, 在 用 公 共 数 据 库 进 行 比 对 分 析 时 可 能 存 在 一 些 困 难 目 前, 我 国 对 DNA 条 形 码 技 术 的 应 用 主 要 集 中 在 分 类 学 和 物 种 鉴 定 研 究 中 [12-15], 在 应 用 领 域 处 于 刚 刚 起 步 的 阶 段 今 后,DNA 条 形 码 技 术 在 进 出 口 物 种 鉴 定 外 来 入 侵 物 种 监 管 和 食 品 鉴 定 等 方 面 将 会 发 挥 越 来 越 重 要 的 作 用 参 考 文 献 : [1] 闽 东 日 报. 春 季 河 豚 鱼 毒 性 最 强 谨 防 误 食 中 毒 [EB/OL].[2013-3-29]. http:// www.shuichan.cc/news_view-124743.html. [2] 时 代 商 报. 挪 威 三 文 鱼 九 成 是 假 冒 [EB/OL]. [2013-3-20]. http://news.lnd.com.cn/htm/2011-01/18/content_1701745.htm. [3] 东 方 网. 超 市 油 鱼 当 鳕 鱼 卖 马 伊 俐 发 微 博 称 女 儿 吃 油 鱼 腹 泻 [EB/OL]. [2012-4-20]. http://www.cnchu.com/viewnews-83238.html. [4] 人 民 网. 鱼 肉 造 假 在 欧 美 更 严 重 : 美 国 纽 约 海 鲜 39% 涉 假 [EB/OL]. [2013-2-21]. http://www.farmer.com.cn/xwpd/gjdt/201302/t20130221_810789.htm. [5] HEBERT P D N, CYWINSKA A, BALL S L, et al. Biological identifications through DNA barcodes [J]. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences, 2003, 270: 313-321. doi: 10.1098/ rspb.2002.2218. [6] HEBERT P D N, RATNASINGHAM S, DEWAARD J R. Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit I divergences among closely related species [J]. Proceedings. Biological Sciences, 2003, 270 (1): 96-99. doi: 10.1098/rsbl.2003.0025. 6
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