动 物 性 别 控 制 技 术 的 研 究 进 展 李 桂 钊 动 科 1071 [ 摘 要 ] 目 前 在 畜 牧 业 生 产 中 的 性 别 控 制 主 要 是 通 过 XY 精 子 分 离 和 早 期 胚 胎 性 别 鉴 定 来 实 现 的, 人 为 控 制 出 生 家 畜 的 性 别 可 以 降 低 生 产 成 本, 提 高 经 济 效 益 随 着 科 技 的 进 步 和 研 究 的 不 断 深 入, 家 畜 性 别 控 制 技 术 也 在 不 断 的 完 善 作 者 综 述 了 X Y 精 子 的 分 离 和 胚 胎 性 别 鉴 定 这 两 项 家 畜 性 控 技 术 的 发 展 历 程 和 研 究 状, 并 对 其 今 后 的 研 究 方 向 及 应 用 前 景 进 行 了 展 望 关 键 词 : 性 别 控 制 ; 精 子 分 离 ; 胚 胎 性 别 鉴 定 性 别 控 制 (Sex control) 是 指 通 过 人 为 地 干 预 或 操 作, 按 照 人 们 的 愿 望 繁 殖 所 需 性 别 后 代 的 生 物 技 术 由 于 畜 牧 生 产 中 许 多 重 要 的 经 济 性 状 都 与 性 别 有 关, 如 肉 蛋 乳 等 的 生 产 都 需 要 特 定 性 别 的 动 物 进 行 生 产, 所 以 对 畜 牧 业 生 产 有 着 重 要 意 义 1 性 别 决 定 的 机 理 1.1 性 别 决 定 基 因 SRF 基 因 [1] 自 从 Jacobs 等 1959 年 发 现 Y 染 色 体 是 性 别 决 定 因 子, 认 为 Y 染 色 体 有 决 定 睾 丸 分 化 的 基 因 (Testis determining factor,tdf), 以 后 人 们 先 后 研 究 了 Y 染 色 体 的 短 臂 H Y 抗 原 和 ZFY 基 因,Palmer 等 (1989) [2] 发 现, 决 定 动 物 性 别 的 基 因 是 Y 染 色 体 上 一 个 核 心 区 基 因, 并 将 其 命 名 为 SRY(Sex Determining Region of Y-Chromosome) 1991 年,Koopman 等 将 含 有 SRY 基 因 的 DNA 片 段 (14kb) 作 为 外 源 基 因 导 入 雌 性 鼠 胚 中, 结 果 引 起 部 分 性 反 转, 从 而 证 明 了 SRY 为 哺 乳 动 物 的 性 别 决 定 主 宰 基 因 哺 乳 动 物 胚 胎 发 育 的 早 期 阶 段 为 性 别 未 分 化 期, 性 腺 原 基 分 化 的 类 型 决 定 了 机 体 将 来 性 别 的 发 育 [3] 当 性 腺 原 基 被 某 中 信 息 诱 导 发 育 为 睾 丸, 支 持 细 胞 分 泌 抗 苗 勒 氏 管 因 子 () 抑 制 苗 勒 氏 管 发 育, 吴 尔 夫 氏 管 发 育 成 附 睾 和 输 精 管, 而 睾 丸 分 泌 的 雄 性 激 素 刺 激 阴 茎 阴 囊 和 雄 性 解 剖 学 的 其 他 部 分 的 发 育 如 果 性 腺 原 基 发 育 为 卵 巢, 由 卵 巢 分 泌 的 雌 激 素 则 使 苗 勒 氏 管 发 育 为 阴 道 子 宫 和 输 卵 管 等 [4] 然 而 诱 导 性 腺 原 基 的 信 息 究 竟 是 什 么 呢? 起 初, 人 们 认 为 是 Y 染 色 体 编 码 性 别 决 定 因 子, 这 种 因 子 特 异 的 决 定 睾 丸 的 发 育 这 种 性 别 决 定 因 子 又 称 为 睾 丸 决 定 因 子 [5,6] ( 人 体 中 为 testis determining factor, 简 称 TDF; 鼠 体 中 为 testis determining Y, 简 称 Tdy) 但 是 Y 染 色 体 上 的 基 因 众 多, 究 竟 何 为 TDF? 几 十 年 来, 研 究 者 分 别 研 究 了 Y 染 色 体 短 臂 H-Y 抗 原 和 ZFY 基 因, 认 为 就 是 TDF, 但 是 都 被 后 来 的 研 究 所 否 定 直 到 1990 年,Sinclair [7] 将 此 基 因 定 位 于 自 拟 常 染 色 体 相 邻 的 35 kb 的 片 段, 并 将 其 命 名 为 SRY(sex determining regionof Y gene) Koopman(1991) [8] 将 含 有 SRY 的 14kbDNA 作 为 转 基 因 导 入 XX 雌 性 胎 鼠 中, 结 果 部 分 小 鼠 产 生 了 性 反 转, 从 而 证 实 了 SRY 基 因 就 是 TDF 基 因 2 性 别 控 制 的 途 径
性 别 控 制 是 一 项 历 史 悠 久 而 又 朝 气 蓬 勃 的 生 物 技 术 最 早 可 追 溯 到 2500 年 前 古 希 腊 德 谟 克 利 特, 在 20 世 纪, 随 着 孟 德 尔 遗 传 理 论 的 重 新 确 立, 人 们 提 出 性 别 由 染 色 体 决 定 的 理 论 1923 年 Painter 证 实 人 类 X 和 Y 染 色 体 的 存 在 1959 年 Welshons 和 Jacobs 等 提 出 Y 染 色 体 决 定 雄 性 的 理 论, 后 来 Jacobs 等 在 1966 年 发 现 雄 性 决 定 因 子 位 于 Y 染 色 体 短 臂 上,1990 年 英 国 学 者 Sinclair 和 Gubbay 发 现 了 Y 染 色 体 的 性 别 决 定 区 (sex deter-mining region of the Y,SRY) [9] 同 时 伴 随 着 人 工 授 精 和 胚 胎 移 植 技 术 的 发 展 和 应 用, 性 别 控 制 的 研 究 出 现 了 高 潮 就 目 前 的 研 究 内 容 看 最 主 要 的 有 两 条 途 径, 其 一 是 精 子 的 性 别 控 制, 其 二 是 胚 胎 的 性 别 鉴 定 2.1 精 子 的 性 别 控 制 人 们 已 确 认 动 物 的 性 别 是 由 X 和 Y 染 色 体 决 定 的 从 20 世 纪 50 年 代 开 始, 人 们 就 对 X 和 Y 精 子 的 大 小 带 电 荷 数 密 度 和 活 力 等 作 了 较 深 入 的 研 究 人 们 试 图 根 据 X 与 Y 精 子 之 间 的 生 物 学 差 异 识 别 带 有 不 同 染 色 体 的 精 子, 并 将 其 分 开, 进 行 人 工 授 精 从 而 控 制 家 畜 的 性 别 但 由 于 除 了 X 精 子 的 染 色 体 含 量 高 于 Y 精 子 和 Y 染 色 体 上 有 特 异 的 SRY 序 列 外, 两 种 精 子 在 其 他 方 面 没 有 明 显 差 异, 故 在 这 方 面 的 研 究 还 没 有 取 得 较 理 想 的 结 果 2.2 胚 胎 的 性 别 鉴 定 正 常 的 受 精 卵 从 卵 子 获 得 一 条 X 染 色 体, 从 精 子 获 得 一 条 X 或 Y 染 色 体, 以 此 决 定 胚 胎 的 性 别 人 们 开 始 运 用 细 胞 学 分 子 生 物 学 或 免 疫 学 方 法 对 哺 乳 动 物 附 植 前 的 胚 胎 进 行 性 别 鉴 定, 通 过 移 植 已 知 性 别 的 胚 胎 可 控 制 后 代 性 别 比 例 但 当 Y 染 色 体 上 SRY 基 因 被 发 现 后, 人 们 就 开 始 对 早 期 胚 胎 利 用 特 异 性 DNA 探 针 或 PCR 技 术 进 行 鉴 定, 然 后 按 要 求 选 择 胚 胎 进 行 移 植, 从 而 达 到 控 制 后 代 性 别 的 目 的 3 性 别 控 制 的 方 法 3.1 X Y 精 子 的 分 离 Lush(1925) 利 用 精 子 分 离 的 方 法 进 行 性 别 控 制 研 究, 首 次 报 道 了 用 离 心 法 分 离 兔 X Y 精 子, 而 授 精 结 果 发 现 后 代 性 别 比 例 无 显 著 改 变 在 此 后 的 半 个 多 世 纪 里, 人 们 就 开 始 寻 找 分 离 X Y 精 子 的 有 效 方 法 人 们 先 后 采 用 了 多 种 技 术, 包 括 : 过 滤 法 密 度 梯 度 离 心 法 电 泳 技 术 免 疫 法 和 流 式 细 胞 分 离 技 术 等, 对 X Y 精 子 进 行 分 离, 但 绝 大 多 数 技 术 因 分 选 速 度 过 慢 纯 度 过 低 或 对 精 子 损 害 性 过 大 等 缺 陷 而 不 再 应 用, 只 有 流 式 细 胞 分 离 技 术 进 展 较 快, 成 为 目 前 唯 一 有 效 的 精 子 分 离 手 段 [10] 3.1.1 根 据 精 子 的 理 化 性 质 分 离 法 从 上 世 纪 70 年 代 开 始, 由 于 X Y 精 子 存 在 物 理 化 学 和 生 物 学 上 的 差 异, 人 们 一 直 试 图 依 据 这 些 微 小 的 差 异 将 X Y 精 子 分 离 人 们 分 别 采 用 了 沉 降 法 电 泳 法 密 度 梯 度 离 心 法 和 凝 胶 过 滤 法 等 各 种 技 术 分 离 精 子 并 进 行 临 床 实 验 但 许 多 研 究 结 果 表 明, 以 上 几 种 方 法 分 离 的 精 子 数 少 准 确 率 低 且 可 重 复 性 差, 所 以 现 在 很 少 应 用 3.1.2 以 长 臂 Y 染 色 体 为 标 记 分 离 法 Barlow 在 1970 年 以 长 臂 Y 染 色 体 为 标 记 对 X Y 精 子 进 行 分 离, 其 原 理 为 根 据 Y 精
子 具 有 长 臂 Y 染 色 体 的 特 征, 利 用 盐 酸 奎 纳 克 林 荧 光 监 测 技 术 来 分 离 精 子 [11] 由 于 精 液 准 备 程 度 的 变 化 性 和 连 续 观 察 与 识 别 荧 光 信 号 的 难 度 性, 许 多 人 对 此 法 的 效 率 和 重 复 性 持 怀 疑 态 度, 在 实 际 生 产 中 更 是 很 少 应 用 3.1.3 免 疫 分 离 精 子 法 该 方 法 是 利 用 H-Y 抗 体 检 测 精 子 质 膜 上 存 在 的 H-Y 抗 原, 以 此 来 分 离 X 精 子 和 Y 精 子 只 有 Y 精 子 才 能 表 达 H-Y 抗 原, 因 而, 利 用 H-Y 抗 体 精 子 质 膜 上 存 在 的 H-Y 抗 原, 再 通 过 一 定 的 程 序, 就 能 将 H-Y+(Y 精 子 ) 和 H-Y-(X 精 子 ) 精 子 分 离 将 所 需 性 别 的 精 子 进 行 人 工 授 精, 即 可 获 得 预 期 性 别 的 后 代 这 种 分 离 精 子 的 方 法 依 赖 于 H-Y 抗 血 清 的 制 备, 尤 其 是 抗 血 清 的 质 量 这 种 方 法 目 前 主 要 采 用 免 疫 亲 和 柱 层 析 法 H-Y 抗 血 清 直 接 输 入 法 和 免 疫 磁 珠 技 术 来 分 离 精 子 Bryant 等 (1980) [12] 应 用 H-Y 抗 体 免 疫 学 亲 和 柱 层 析, 首 次 成 功 地 分 离 了 人 和 小 鼠 的 H-Y 阳 性 和 阴 性 精 子 Zavos 等 (1982 )[13] 用 兔 子 生 产 抗 血 清 进 行 实 验, 把 H-Y 抗 血 清 注 入 母 兔 阴 道 15 min 后 输 精, 产 出 的 雌 性 兔 为 74.2%;1987 年 他 又 采 用 免 疫 过 滤 法 对 兔 子 和 牛 进 行 试 验, 结 果 后 代 中 雌 兔 为 78.9% 母 犊 为 74.4% Bradley(1989) [12] 用 免 疫 亲 和 柱 层 析 法 分 离 绵 羊 的 H-Y 阳 性 和 H-Y 阴 性 精 子, 发 现 未 结 合 到 层 析 柱 的 精 子 有 70%~80% 为 阴 性, 结 合 到 层 析 柱 上 而 后 被 洗 脱 下 来 的 精 子 75%~78% 为 阳 性 ; 而 对 照 组 的 H-Y 阳 性 和 H-Y 阴 性 精 子 分 别 为 43%~44% 和 56%~57% 王 光 亚 等 (1994) [14] 用 兔 H-Y 抗 血 清 进 行 试 验, 将 效 价 为 l 32 的 兔 H-Y 抗 血 清 输 入 发 情 母 兔 阴 道 内 l0~15 min 后 自 然 交 配, 所 生 2 只 小 兔 均 为 雌 兔 罗 承 浩 等 (2004) [15] 应 用 此 法 对 奶 牛 进 行 实 验, 结 果 表 明 比 自 然 产 母 犊 性 比 率 理 论 值 提 高 l0.7 个 百 分 点 但 由 于 H.Y 抗 原 是 一 种 弱 抗 原, 所 以 其 准 确 性 比 较 低 参 考 文 献 3.1.4 流 式 细 胞 分 离 仪 分 离 精 子 法 流 式 细 胞 光 度 法 是 目 前 分 离 X 精 子 和 Y 精 子 比 较 理 想 的 方 法, 借 助 流 式 细 胞 光 度 计 进 行 测 定, 其 理 论 依 据 是 X 与 Y 精 子 DNA 的 含 量 不 同 DNA 含 量 高, 当 用 专 用 荧 光 染 料 染 色 时, 其 吸 收 的 染 料 就 多, 发 出 的 荧 光 也 强, 反 之 发 出 的 荧 光 就 弱 这 种 分 离 方 法 开 创 了 精 子 分 离 的 新 局 面 Joh-son 等 [16] (1989) 用 分 离 的 兔 Y 精 子 在 子 宫 内 输 精 后, 预 测 雄 性 兔 比 例 为 81%, 实 际 亦 为 81%;X 精 子 输 精 后 预 测 雄 兔 的 比 例 为 14%, 实 际 产 雄 兔 的 比 例 为 6% 1991 年 他 用 经 使 用 该 法 分 离 的 猪 X 精 子 输 精 后, 获 得 74% 的 雌 性 仔 猪,Y 精 子 输 精 后 获 得 68% 的 雄 性 仔 猪 Gran 等 [17] (1993) 使 用 该 法 分 离 牛 精 子 用 于 体 外 授 精, 将 胚 胎 移 植 给 9 头 受 体 牛, 其 中 4 头 妊 娠 产 牛 犊 6 头,3 头 雌 性,3 头 雄 性, 均 与 预 测 性 别 相 符 Abeydeera 等 [18] (1998) 报 道, 利 用 该 法 分 离 的 猪 X 精 子 授 精, 产 雌 性 23 头, 雄 性 1 头, 准 确 率 为 97%; 利 用 分 离 的 Y 精 子 授 精, 产 雄 性 仔 猪 率 为 100% Seidel 等 [19] (1999) 报 道 了 使 用 牛 分 离 精 子 冷 冻 保 存 后 的 授 精 效 果, 后 代 性 别 准 确 率 在 90% 以 上 但 是 用 一 般 流 式 细 胞 分 类 器 分 离 精 子 时, 需 要 精 子 一 个 个 通 过, 这 样 就 必 须 稀 释 精 液, 造 成 精 子 的 运 动 能 力 下 降, 加 之 分 离 效 率 太 低, 目 前 还 无 法 应 用 于 实 际 生 产 但 是, 据 Johson(2000) [22] 报 道, 同 时 分 离 收 集 X 和 Y 精 子, 分 离 速 度 以 达 到 每 小 时 6,000,000 精 子 ; 若 只
分 离 和 收 集 X 精 子, 则 分 离 速 度 可 达 到 每 小 时 18,000,000 精 子, 看 来, 用 于 生 产 实 践 为 期 已 不 远 如 果 结 合 显 微 注 射 技 术, 该 方 法 将 是 一 种 有 效 的 分 离 X Y 精 子 的 技 术 3.2 胚 胎 性 别 鉴 定 动 物 性 别 控 制 除 了 通 过 对 X Y 精 子 进 行 分 离 以 外, 还 可 以 通 过 对 其 胚 胎 进 行 性 别 鉴 定, 胚 胎 的 性 别 鉴 定 已 成 为 实 现 人 为 控 制 出 生 家 畜 性 别 的 主 要 途 径 之 一 现 在 能 够 实 现 胚 胎 性 别 鉴 定 的 技 术 很 多, 而 且 已 经 达 到 成 熟 但 是 这 些 方 法 存 在 准 确 率 不 高 费 时 或 试 验 费 用 昂 贵 等 不 足 随 着 研 究 的 深 入 和 现 代 分 子 新 技 术 的 出 现, 细 胞 遗 传 学 方 法 分 子 生 物 学 方 法 免 疫 学 方 法 和 生 物 化 学 微 量 分 析 法 等 方 法 对 胚 胎 性 别 鉴 定 较 为 有 效 准 确 和 快 速 的 并 且 具 有 一 定 发 展 和 推 广 前 景 3.2.1 细 胞 遗 传 学 方 法 通 过 核 型 分 析 对 胚 胎 进 行 性 别 鉴 定, 即 通 过 Y 染 色 体 的 核 型 鉴 定 来 达 到 鉴 定 胚 胎 性 别 的 方 法 此 方 法 是 取 一 小 部 分 滋 养 层 细 胞, 将 被 鉴 定 胚 胎 用 含 有 丝 分 裂 阻 滞 剂 ( 如 秋 水 仙 素 ) 的 培 养 液 培 养, 然 后 诱 使 细 胞 及 染 色 体 扩 展 并 加 以 固 定, 以 永 久 性 DNA 染 料 如 姬 姆 萨 液 染 色, 用 显 微 镜 检 查, 其 性 别 鉴 定 准 确 率 可 达 100% [21], 但 采 集 细 胞 鉴 定 时 对 胚 胎 具 有 很 大 损 伤, 同 时 由 于 Y 染 色 体 的 核 型 鉴 定 只 有 在 细 胞 分 裂 中 期 才 能 观 察 到, 所 以 难 度 极 大 且 费 时 多, 对 于 技 术 水 平 也 要 求 比 较 高, 所 以 不 适 用 于 生 产 实 际 3.2.2 分 子 生 物 学 方 法 分 子 生 物 学 方 法 是 近 十 几 年 发 展 起 来 的 一 种 利 用 雄 性 特 异 性 基 因 探 针 和 PCR 扩 增 技 术 鉴 别 家 畜 胚 胎 性 别 的 崭 新 方 法 它 具 有 灵 敏 准 确 特 异 快 速 等 特 点, 因 此 它 成 为 胚 胎 性 别 鉴 定 中 最 具 研 究 价 值 和 发 展 潜 力 的 技 术 方 法, 其 实 质 就 是 检 测 Y 染 色 体 上 的 SRY 基 因 的 有 无, 有 则 判 为 雄 性, 无 则 判 为 雌 性 3.2.2.1 雄 性 特 异 DNA 探 针 检 测 法 主 要 是 从 胚 胎 取 下 少 量 细 胞, 将 其 DNA 与 Y 染 色 体 特 异 标 记 的 DNA 序 列 ( 控 针 ) 杂 交, 结 果 如 果 为 阳 性, 则 为 雄 性 胚 胎, 否 则 为 雌 性 胚 胎 Leonard 等 (1987) [22] 首 次 鉴 定 牛 囊 胚 获 得 成 功, 其 准 确 率 为 95%(81/85) 但 由 于 DNA 杂 交 需 要 大 量 的 胚 细 胞 (15 个 或 更 多 ) 和 需 时 较 长 以 及 鉴 定 胚 胎 数 少, 并 且 此 法 技 术 要 求 较 高, 所 以 该 法 在 广 泛 应 用 上 受 到 一 定 限 制, 生 产 实 践 中 也 就 很 少 应 用 3.2.2.2 荧 光 原 位 杂 交 法 (FISH) FISH 其 主 要 有 荧 光 素 探 针 制 备 探 针 和 靶 DNA 的 变 性 与 杂 交 观 察 鉴 定 三 部 分 组 成 由 于 FISH 技 术 制 备 了 特 异 性 序 列 片 段 探 针, 而 且 杂 交 在 细 胞 内 进 行, 并 能 使 用 试 剂 而 发 光 显 色, 既 能 在 细 胞 分 裂 间 期 杂 交, 也 能 在 分 裂 中 期 杂 交, 所 以 具 高 效 性 和 底 的 错 误 率 [23], 因 此 具 有 广 泛 的 应 用 性 Santiaqomunne 等 (1993) [24] 用 绿 色 荧 光 素 标 记 Y 染 色 体 特 异 序 列 探 针, 红 色 荧 光 素 标 记 X 染 色 体 重 复 序 列 探 针, 对 处 于 4 天 前 8 细 胞 期 的 人 胚 胎 进 行 了 共 6 个 分 裂 球 双 探 针 FISH 检 测, 仅 使 用 6h 就 完 成 了 从 显 微 操 作 到 显 微 观 察 的 整 个 过 程, 准 确 检 测 了 胚 胎 性
别, 其 有 效 率 达 95.5%(65/68) Kawarasaki T [25] 等 用 FISH 技 术 以 染 色 体 Y- 探 针 和 切 割 胚 胎 进 行 杂 交 检 测 猪 胚 胎 性 别, 鉴 定 率 为 91%(85/97), 而 92%(60/65) 的 切 割 胚 体 外 发 育 48h 后 有 明 显 的 囊 胚 腔 和 内 细 胞 团, 在 移 植 的 12 头 受 体 中 产 出 12 头 与 鉴 定 结 果 一 致 的 仔 猪 此 方 法 具 有 高 效 快 速 准 确 的 特 点 其 不 足 之 处 DNA 探 针 特 异 性 不 强 荧 光 素 分 辨 率 低 且 对 胚 胎 毒 性 较 大 3.2.2.3 PCR 扩 增 法 [26] PCR 技 术 原 理 主 要 是 利 用 DNA 聚 合 酶 依 赖 于 DNA 的 特 性, 模 仿 体 内 的 复 制 过 程, 在 人 工 引 物 的 作 用 下 诱 发 聚 合 酶 反 应 其 全 过 程 包 括 DNA 模 板 变 性 退 火 延 伸 3 个 步 骤 的 若 干 次 循 环 然 后 将 扩 增 产 物 进 行 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 并 用 EB 染 色 后 再 进 行 紫 外 激 光 检 测, 出 现 特 异 带 的 是 雄 胚, 否 则 为 雌 胚 Herr 等 (1990) [27] 首 先 成 功 应 用 PCR 技 术 鉴 定 牛 羊 胚 胎 性 别 国 内 外 的 专 家 学 者 相 继 用 此 技 术, 通 过 扩 增 胚 胎 的 性 别 决 定 基 因 (SRY) 鉴 定 胚 胎 性 别, 由 于 SRY 基 因 的 核 心 序 列 在 哺 乳 动 物 高 度 保 守, 设 计 相 同 的 引 物 也 可 以 鉴 别 不 同 哺 乳 动 物 的 性 别, 产 犊 结 果 表 明 准 确 率 达 到 95%~100% 陈 从 英 等 (2003) [28] 利 用 此 技 术 对 牛 胚 胎 进 行 鉴 定, 其 结 果 达 到 100%(10/10) 张 建 新 等 (2004) [29] 通 过 试 验 研 究 证 明 以 打 孔 法 对 早 期 桑 葚 胚 进 行 采 样 并 进 行 性 别 鉴 定 是 比 较 可 行 的 方 法, 其 准 确 率 达 到 100%(20/20) 该 技 术 灵 敏 度 高, 可 重 复 性 好, 该 技 术 建 立 后 很 快 被 用 于 胚 胎 的 性 别 鉴 定 但 是 该 技 术 容 易 造 成 污 染, 同 时 耗 时 长 所 以 还 需 进 一 步 的 改 进 3.2.2.4 LAMP 法 与 PCR 技 术 同 属 于 基 因 扩 增 技 术 的 LAMP [30] 法 是 一 种 全 新 的 基 因 扩 增 法 由 于 双 链 DNA 在 65 左 右 处 于 动 态 平 衡 状 态, 任 何 一 条 引 物 对 双 链 DNA 的 互 补 部 位 进 行 碱 基 配 对 时, 一 条 链 就 会 脱 落 变 成 单 链 LAMP 法 就 是 利 用 这 一 特 点, 对 目 标 基 因 的 6 个 区 段 设 定 雄 性 特 异 性 以 及 雌 雄 共 同 引 物 (4 种 ), 利 用 特 殊 的 链 置 换 型 DNA 聚 合 酶, 在 65 的 恒 温 条 件 下 对 胚 细 胞 中 的 雄 性 特 异 性 核 酸 序 列 和 雌 雄 共 有 核 酸 序 列 进 行 扩 增 反 应, 最 后 通 过 反 应 过 程 中 获 得 的 副 产 物 焦 磷 酸 镁 形 成 的 白 色 沉 淀 的 浑 浊 度 来 进 行 早 期 胚 胎 性 别 的 鉴 定 从 反 应 开 始 到 性 别 判 定 完 成 约 40 min 王 海 浪 利 用 此 法 对 牛 早 期 胚 胎 进 行 检 测, 其 性 别 符 合 率 达 到 100%, 与 H.Hirayama,S. 等 鉴 定 113 头 奶 牛 胚 胎 性 别 符 合 率 58 枚 雄 性,55 枚 雌 性 结 果 相 符 [31] LAMP 反 应 是 相 当 灵 敏 的 反 应 只 要 混 入 及 其 少 量 的 目 标 基 因 以 外 的 基 因 DNA 或 其 他 检 品 的 扩 增 产 物, 也 可 能 造 成 误 判 所 以 LAMP 技 术 具 有 PCR 技 术 相 似 的 缺 点, 就 是 极 高 的 灵 敏 度 而 容 易 受 到 污 染 的 干 扰 比 较 胚 胎 性 别 鉴 定 的 各 种 方 法, 应 用 PCR 技 术 LAMP 法 进 行 胚 胎 性 别 鉴 定, 具 有 灵 敏 快 捷 简 便 实 用 等 特 点, 但 灵 敏 度 高 本 身 又 是 该 技 术 的 缺 点, 由 于 操 作 过 程 极 易 遭 到 污 染, 因 此 在 操 作 过 程 中, 一 定 要 严 格 遵 守 操 作 规 则, 以 防 止 外 源 污 染 综 上 所 述, 哺 乳 动 物 性 别 控 制 技 术 近 年 来 已 取 得 了 很 大 的 进 展, 精 子 分 离 技 术 虽 然 不 直 接 害 胚 胎, 但 其 准 确 率 不 高, 到 目 前 为 止 只 有 流 式 细 胞 仪 可 将 X Y 精 子 高 效 地 分 开, 但 其 价 格 昂
贵, 所 以 不 适 用 于 大 规 模 的 生 产 实 际 从 胚 胎 性 别 鉴 定 的 整 个 历 史 进 程 来 看, 用 分 子 体 生 物 学 方 法 进 行 准 确 高 效 的 胚 胎 性 别 鉴 定 是 可 行 的, 但 从 胚 胎 上 切 取 部 分 细 胞, 而 后 经 冷 冻, 解 冻 会 对 胚 胎 造 成 一 定 的 损 害, 所 以, 今 后 应 该 在 对 性 别 决 定 更 深 的 研 究, 着 重 对 那 些 快 速 准 确 经 济 的 性 别 鉴 定 方 法, 以 便 更 好 地 应 用 4 前 景 展 望 综 上 所 述, 关 于 X Y 精 子 分 离 技 术 和 胚 胎 性 别 鉴 定 技 术 的 研 究, 虽 然 已 开 展 了 一 些 工 作 并 取 得 了 一 些 进 展, 但 很 多 问 题 有 待 解 决, 如 流 式 细 胞 仪 分 离 速 度 慢 仪 器 昂 贵 和 部 分 精 子 类 型 不 能 被 识 别 而 影 响 其 在 生 产 中 的 应 用, 按 照 目 前 的 分 离 速 度, 要 获 得 一 次 输 精 剂 量 的 牛 精 子, 需 花 费 近 20 h 的 时 间, 如 此 长 的 分 离 时 间 直 接 影 响 精 子 的 活 率, 导 致 受 胎 率 下 降 ; 再 如 PCR 扩 增 法 胚 胎 取 样 受 实 验 员 试 验 技 术 的 影 响 胚 胎 冷 冻 和 解 冻 处 理 后 对 胚 胎 移 植 成 功 率 的 影 响 等 笔 者 相 信, 随 着 研 究 的 不 断 深 入, 技 术 的 不 断 发 展, 流 式 细 胞 仪 也 在 不 断 更 新 换 代, 分 离 精 子 的 速 度 必 将 逐 渐 提 高, 从 流 式 细 胞 仪 的 发 展 速 度 看 推 广 前 景 良 好, 同 时 结 合 体 外 受 精 和 显 微 授 精 技 术 的 研 究, 来 提 高 精 子 的 利 用 率, 可 以 增 加 流 式 细 胞 仪 的 实 际 应 用 价 值 ;PCR 扩 增 法 的 整 个 操 作 可 在 几 分 钟 内 完 成, 在 生 产 中 应 用 非 常 方 便, 而 且 胚 胎 性 别 鉴 定 的 PCR 试 剂 盒 已 经 出 现, 但 在 实 际 应 用 中 成 本 问 题 是 必 须 要 考 虑 的, 所 以 首 先 在 大 家 畜 和 珍 贵 动 物 上 应 用 的 可 能 性 较 大 需 要 提 出 的 是 在 完 善 和 改 进 上 述 两 种 性 控 技 术 的 过 程 中, 可 以 寻 找 其 他 的 方 法 回 避 技 术 中 复 杂 的 步 骤 如 日 本 荣 研 化 学 株 式 会 社 研 制 出 Loopamp 牛 胚 胎 性 别 鉴 定 试 剂 盒, 运 用 了 新 的 基 因 扩 增 技 术 LAMP(loop-mediated isotheral amplification) 法, 这 种 方 法 通 过 检 测 反 应 过 程 中 获 得 的 副 产 物 焦 磷 酸 镁 所 形 成 的 白 色 沉 淀 的 混 浊 度 来 判 定 结 果, 简 化 了 PCR 扩 增 结 果 的 检 测 方 法 家 畜 性 别 控 制 的 研 究 是 家 畜 繁 育 的 一 项 重 要 课 题, 具 有 很 大 的 理 论 意 义 和 实 际 应 用 价 值 通 过 X Y 精 子 的 分 离 和 胚 胎 性 别 鉴 定 可 以 有 效 地 进 行 家 畜 性 别 的 控 制 家 畜 性 别 控 制 技 术 将 成 为 家 畜 繁 育 的 一 项 常 规 技 术, 对 各 项 育 种 技 术 的 发 展 和 应 用 都 具 有 重 要 的 促 进 作 用, 对 优 良 家 畜 的 繁 殖 和 增 加 畜 产 品 的 产 量, 均 具 有 巨 大 的 经 济 意 义 因 此, 需 要 我 们 研 究 者 的 继 续 努 力 和 政 府 的 大 力 支 持, 加 快 家 畜 性 控 技 术 的 研 究 和 推 广 步 伐, 这 也 是 家 畜 生 产 者 所 期 望 的
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