药 学 学 报 Acta Pharmaceutica Sinica 2012, 47 (12): 1653 1659 1653 一 测 多 评 中 待 测 成 分 校 正 和 定 位 的 新 方 法 研 究 何 兵 1, 杨 世 艳 2*, 张 燕 3 ( 泸 州 医 学 院 1. 药 物 研 究 中 心, 2. 附 属 中 医 医 院, 3. 附 属 医 院, 四 川 泸 州 646000) 摘 要 : 研 究 一 测 多 评 中 待 测 成 分 的 一 种 新 的 校 正 模 式 和 色 谱 峰 定 位 方 法, 以 双 黄 连 口 服 液 为 研 究 对 象, 采 用 3 种 校 正 方 法 ( 多 点 校 正 斜 率 校 正 定 量 因 子 校 正 ) 建 立 双 黄 连 口 服 液 中 绿 原 酸 与 11 个 活 性 成 分 ( 新 绿 原 酸 隐 绿 原 酸 咖 啡 酸 连 翘 酯 苷 A 野 黄 芩 苷 异 绿 原 酸 B 异 绿 原 酸 A 异 绿 原 酸 C 黄 芩 苷 连 翘 苷 及 汉 黄 芩 苷 ) 之 间 的 相 对 校 正 因 子, 同 时 采 用 线 性 回 归 法 定 位 色 谱 峰, 实 现 只 用 一 个 对 照 品 测 定 双 黄 连 口 服 液 中 12 个 成 分 的 含 量 结 果 表 明 在 一 定 线 性 范 围 内, 以 3 种 校 正 方 式 所 得 校 正 因 子 计 算 结 果 与 外 标 法 或 线 性 回 归 法 并 无 显 著 性 差 异, 且 该 法 更 简 便 快 捷 结 果 准 确 可 靠 具 有 良 好 的 重 现 性 而 线 性 回 归 法 定 位 色 谱 峰 比 文 献 采 用 相 对 保 留 时 间 更 准 确 用 斜 率 和 定 量 因 子 校 正 控 制 中 药 质 量 的 方 法 可 行 且 结 果 准 确 关 键 词 : 相 对 校 正 因 子 ; 多 点 校 正 ; 斜 率 校 正 ; 定 量 因 子 校 正 ; 双 黄 连 口 服 液 中 图 分 类 号 : R917 文 献 标 识 码 : A 文 章 编 号 : 0513-4870 (2012) 12-1653-07 A new method of calibration and positioning in quantitative analysis of multicomponents by single marker HE Bing 1, YANG Shi-yan 2*, ZHANG Yan 3 (1. Center of Drug Research, Luzhou Medical College, Luzhou 646000, China; 2. Hospital (T.C.M.) Affiliated to Luzhou Medical College, Luzhou 646000, China; 3. Affiliated Hospital of Luzhou Medical College, Luzhou 646000, China) Abstract: This paper aims to establish a new method of calibration and positioning in quantitative analysis of multicomponents by single marker (), using Shuanghuanglian oral liquid as the research object. Establishing relative correction factors with reference chlorogenic acid to other 11 active components (neochlorogenic acid, cryptochlorogenic acid, cafferic acid, forsythoside A, scutellarin, isochlorogenic acid B, isochlorogenic acid A, isochlorogenic acid C, baicalin and phillyrin wogonoside) in Shuanghuanglian oral liquid by 3 correction methods (multipoint correction, slope correction and quantitative factor correction). At the same time chromatographic peak was positioned by linear regression method. Only one standard uas used to determine the content of 12 components in Shuanghuanglian oral liquid, in stead of needing too many reference substance in quality control. The results showed that within the linear ranges, no significant differences were found in the quantitative results of 12 active constituents in 3 batches of Shuanghuanglian oral liquid determined by 3 correction methods and external standard method (ESM) or standard curve method (SCM). And this method is simpler and quicker than literature methods. The results were accurate and reliable, and had good reproducibility. While the positioning chromatographic peaks by linear regression method was more accurate than relative retention time in literature. The slope and the quantitative factor correction controlling the quality of Chinese traditional medicine is feasible and accurate. Key words: relative correction factor; multipoint correction; slope correction; quantitative factor correction; Shuanghuanglian oral liquid 收 稿 日 期 : 2012-06-22; 修 回 日 期 : 2012-08-03. 基 金 项 目 : 泸 州 市 重 点 科 技 项 目 ( 泸 市 财 企 [2010]41 号 ); 泸 州 医 学 院 青 年 基 金 资 助 项 目 ( 泸 医 院 [2010]108 号 ). * 通 讯 作 者 Tel: 86-830-3161673, E-mail: lyhb2008@126.com
1654 药 学 学 报 Acta Pharmaceutica Sinica 2012, 47 (12): 1653 1659 目 前 中 药 质 量 标 准 研 究 逐 渐 向 指 纹 图 谱 和 多 指 标 成 分 同 时 检 测 发 展 [1], 这 也 是 中 药 走 向 国 际 的 必 然 然 而 在 多 指 标 质 量 控 制 模 式 中, 需 要 对 照 品 的 种 类 和 量 比 较 大, 且 部 分 对 照 品 价 格 较 昂 贵 供 应 量 较 [2] 少 王 智 民 等 提 出 了 一 测 多 评 的 多 指 标 质 控 模 式, 即 在 多 指 标 质 量 控 制 时, 利 用 中 药 有 效 成 分 内 在 函 数 关 系 和 比 例 关 系, 以 药 材 中 对 照 品 廉 价 易 得 的 典 型 成 分 为 内 标, 建 立 该 成 分 与 其 他 成 分 间 的 相 对 校 正 因 子, 再 通 过 校 正 因 子 同 步 计 算 出 其 他 成 分 的 含 量 在 方 法 实 施 时, 可 在 只 有 一 个 对 照 品 的 情 况 下, 实 现 这 些 成 分 的 同 步 含 量 测 定, 并 成 功 应 用 于 白 芷 丹 参 三 黄 片 赤 芍 田 基 黄 淫 羊 藿 连 翘 黄 芩 黄 连 人 参 和 三 七 等 药 材 的 质 量 控 制 [3, 4], 其 中 黄 连 药 材 的 一 测 多 评 方 法 被 2010 年 版 中 国 药 典 采 用 [5] [3, 4] 文 献 在 计 算 校 正 因 子 时, 普 遍 采 用 多 点 校 正, 实 验 发 现 采 用 标 准 曲 线 斜 率 校 正, 以 及 由 此 衍 生 出 来 的 定 量 因 子 校 正 将 更 为 快 捷, 其 结 果 并 无 显 著 差 异 由 于 不 同 实 验 室 仪 器 和 色 谱 柱 差 异 较 大, 导 致 保 留 时 间 出 现 漂 移, 文 献 普 遍 采 用 相 对 保 留 时 间 或 保 留 时 间 差 定 位 色 谱 峰, 但 有 些 结 果 可 能 出 现 较 大 偏 差, 实 验 以 线 性 回 归 法 定 位 色 谱 峰, 其 准 确 度 获 得 明 显 改 善 实 验 采 用 双 黄 连 口 服 液 为 研 究 对 象, 以 绿 原 酸 为 参 照 物, 采 用 3 种 校 正 方 法 建 立 其 与 新 绿 原 酸 隐 绿 原 酸 咖 啡 酸 异 绿 原 酸 A 异 绿 原 酸 B 异 绿 原 酸 C 黄 芩 苷 汉 黄 芩 苷 连 翘 苷 及 连 翘 酯 苷 A 之 间 的 相 对 校 正 因 子, 并 计 算 各 成 分 含 量, 同 时 采 用 外 标 法 和 线 性 回 归 法 同 步 测 定, 验 证 一 测 多 评 法 得 到 结 果 的 准 确 性 和 可 靠 性 材 料 与 方 法 仪 器 试 剂 与 药 品 DIONEX 高 效 液 相 色 谱 仪 ( 包 括 P680A 四 元 梯 度 泵, PDA-100 二 极 管 阵 列 检 测 器, TCC-100 柱 温 箱 和 Chromeleon 色 谱 工 作 站 ) Agilent 1100 高 效 液 相 色 谱 仪 ( 包 括 G1311A 四 元 泵 G1313A 自 动 进 样 器 G1315B 二 极 管 阵 列 检 测 器 G1316A 柱 温 箱 和 Agilent ChemStation 工 作 站 ) 色 谱 柱 : AkzoNobel Kromasil C 18, 绿 百 草 Kromasil C 18, 菲 罗 门 Luna C 18 (2), 迪 马 Platisil ODS ( 均 为 250 mm 4.6 mm, 5 µm) 新 绿 原 酸 ( 批 号 070915, neochlorogenic acid, NCA) 绿 原 酸 ( 批 号 080620, chlorogenic acid, CA) 隐 绿 原 酸 ( 批 号 080923, cryptochlorogenic acid, CCA) 咖 啡 酸 ( 批 号 071026, cafferic acid, CFA) 异 绿 原 酸 A ( 批 号 080530, isochlorogenic acid A, ICA A) 异 绿 原 酸 B ( 批 号 071129, isochlorogenic acid B, ICA B) 异 绿 原 酸 C ( 批 号 071115, isochlorogenic acid C, ICA C) 均 由 成 都 普 瑞 法 有 限 公 司 提 供 黄 芩 苷 ( 批 号 080721, baicalin, BC) 汉 黄 芩 苷 ( 批 号 071008, wogonoside, WG) 野 黄 芩 苷 ( 批 号 081126, scutellarin, ST) 连 翘 苷 ( 批 号 080710, phillyrin, PR) 连 翘 酯 苷 A ( 批 号 081015, forsythoside A, FT A) 由 成 都 曼 思 特 生 物 科 技 有 限 公 司 提 供 所 有 对 照 品 经 HPLC 峰 面 积 归 一 化 法 检 测 纯 度 均 在 98% 以 上 双 黄 连 口 服 液 [ 规 格 : 10 ml, 哈 药 集 团 三 精 制 药 股 份 有 限 公 司 生 产 (Sanchine), 批 号 为 09120951; 南 阳 新 生 制 药 有 限 公 司 生 产 (Xinsheng), 批 号 为 100604; 河 南 太 龙 药 业 股 份 有 限 公 司 (Taloph), 批 号 为 11030825] 混 合 对 照 品 溶 液 的 制 备 分 别 精 密 称 取 新 绿 原 酸 绿 原 酸 隐 绿 原 酸 咖 啡 酸 连 翘 酯 苷 A 野 黄 芩 苷 异 绿 原 酸 B 异 绿 原 酸 A 异 绿 原 酸 C 黄 芩 苷 连 翘 苷 及 汉 黄 芩 苷 对 照 品 适 量, 以 75% 甲 醇 溶 解 并 定 容, 制 成 质 量 浓 度 分 别 为 新 绿 原 酸 2.075 mg ml 1 绿 原 酸 2.067 mg ml 1 隐 绿 原 酸 2.046 mg ml 1 咖 啡 酸 0.393 mg ml 1 连 翘 酯 苷 A 1.452 mg ml 1 野 黄 芩 苷 0.326 mg ml 1 异 绿 原 酸 B 0.591 mg ml 1 异 绿 原 酸 A 0.305 mg ml 1 异 绿 原 酸 C 0.798 mg ml 1 黄 芩 苷 16.537 mg ml 1 连 翘 苷 1.525 mg ml 1 及 汉 黄 芩 苷 0.389 mg ml 1 的 混 合 对 照 品 储 备 液, 分 别 精 密 吸 取 0.1 0.5 1 2 3 4 和 5 ml, 置 25 ml 量 瓶 中, 以 75% 甲 醇 定 容 得 系 列 混 合 对 照 品 溶 液, 避 光 保 存 供 试 品 溶 液 的 制 备 精 密 吸 取 本 品 1.0 ml, 置 10 ml 棕 色 量 瓶 中, 加 75% 甲 醇 定 容, 以 0.45 µm 微 孔 滤 膜 过 滤 即 得 阴 性 对 照 溶 液 的 制 备 按 双 黄 连 口 服 液 样 品 制 备 方 法, 制 得 不 含 金 银 花 药 材 黄 芩 药 材 和 连 翘 药 材 的 空 白 对 照 品 溶 液, 按 供 试 品 溶 液 的 制 备 方 法 配 制 空 白 对 照 溶 液 色 谱 条 件 色 谱 柱 为 AkzoNobel Kromasil C 18 (250 mm 4.6 mm, 5 µm); 流 动 相 为 乙 腈 (A) 0.1% 磷 酸 水 溶 液 (B), 梯 度 洗 脱 0~30 min, 10%~35% A; 30~40 min, 35% ~80% A; 流 速 1.0 ml min 1 ; 分 段 变 波 长 测 定, 0~22 min 为 326 nm, 22~26 min 为 229 nm, 26~40 min 为 275 nm; 柱 温 30 ; 进 样 量 10 µl 线 性 与 范 围 分 别 精 密 吸 取 系 列 浓 度 的 混 合 对 照 品 溶 液 10 µl, 注 入 液 相 色 谱 仪, 记 录 色 谱 图 以 峰 面 积 (A) 为 纵 坐 标, 对 照 品 质 量 (C, µg) 为 横 坐 标, 绘 制 标 准 曲 线 同 系 列 对 照 品 制 备 方 法 逐 级 稀
何 兵 等 : 一 测 多 评 中 待 测 成 分 校 正 和 定 位 的 新 方 法 研 究 1655 释, 分 别 以 信 噪 比 3 和 10 考 察 检 测 限 和 定 量 限 精 密 度 取 同 一 混 合 对 照 品 溶 液, 连 续 进 样 6 次, 记 录 各 组 分 峰 面 积 稳 定 性 取 同 一 供 试 品 溶 液, 分 别 于 制 备 后 0 4 8 12 24 和 36 h 注 入 液 相 色 谱 仪, 记 录 各 组 分 峰 面 积 重 复 性 取 批 号 为 100604 的 样 品, 制 备 6 份 供 试 品 溶 液, 进 样 分 析, 计 算 新 绿 原 酸 绿 原 酸 隐 绿 原 酸 咖 啡 酸 连 翘 酯 苷 A 野 黄 芩 苷 异 绿 原 酸 B 异 绿 原 酸 A 异 绿 原 酸 C 黄 芩 苷 连 翘 苷 及 汉 黄 芩 苷 平 均 含 量 及 RSD 回 收 率 精 密 吸 取 批 号 为 100604 已 知 含 量 的 双 黄 连 口 服 液 9 份, 每 份 0.5 ml, 分 成 3 组, 每 组 3 份, 分 别 精 密 添 加 含 新 绿 原 酸 0.203 mg ml 1 绿 原 酸 0.192 mg ml 1 隐 绿 原 酸 0.169 mg ml 1 咖 啡 酸 0.030 mg ml 1 连 翘 酯 苷 A 0.171 mg ml 1 野 黄 芩 苷 0.026 mg ml 1 异 绿 原 酸 B 0.047 mg ml 1 异 绿 原 酸 A 0.019 mg ml 1 异 绿 原 酸 C 0.078 mg ml 1 黄 芩 苷 2.510 mg ml 1 连 翘 苷 0.125 mg ml 1 及 汉 黄 芩 苷 0.072 mg ml 1 的 混 合 对 照 品 溶 液 2 2.5 3 ml, 制 备 供 试 品 溶 液, 进 样 分 析, 并 分 别 计 算 回 收 率 耐 用 性 分 别 考 察 流 动 相 各 梯 度 点 比 例 变 化 ± 5% 水 相 ph 值 变 化 ± 0.2 柱 温 变 化 ± 5 检 测 波 长 变 化 ± 5 nm 流 速 变 化 ± 20% 以 及 采 用 3 根 不 同 色 谱 柱 AkzoNobel Kromasil C 18, 绿 百 草 Kromasil C 18, 菲 罗 门 Luna C 18 ( 均 为 250 mm 4.6 mm, 5 µm) 进 行 测 定 时, 仪 器 色 谱 行 为 的 变 化 检 测 同 一 批 双 黄 连 口 服 液 中 12 种 成 分 的 含 量 及 RSD, 并 考 察 其 分 离 度 拖 尾 因 子 和 理 论 塔 板 数 校 正 因 子 计 算 方 法 多 点 校 正 法 [3, 4] 参 照 文 献 以 多 个 浓 度 点 计 算 所 得 的 校 正 因 子 的 平 均 值 作 为 相 对 校 正 因 子 校 正 因 子 计 算 公 式 为 : f k/s = (C s A k ) / (C k A s ) 待 测 成 分 浓 度 计 算 公 式 为 : C k = (C s A k ) / (f k/s A s ) 两 式 中 f k/s : 校 正 因 子 ; C s : 参 照 物 质 浓 度 ; A s : 参 照 物 质 峰 面 积 ; C k : 其 他 对 照 组 分 浓 度 ; A k : 其 他 对 照 组 分 峰 面 积 ; C k : 待 测 组 分 浓 度 ; A k : 待 测 组 分 峰 面 积 应 用 此 法 需 先 获 得 一 个 参 照 物 的 浓 度 C s 和 峰 面 积 值 A s 斜 率 校 正 法 在 标 准 曲 线 A = ac + b 中, C = (A b) / a = A/a b/a, 由 于 b 值 通 常 为 误 差 引 起, 在 a/b 值 大 于 100 时, b/a 值 可 以 忽 略 不 计, 此 时 可 以 C = A/a 直 接 计 算 含 量 故 校 正 因 子 可 以 二 者 的 斜 率 a 之 比 直 接 计 算, 校 正 因 子 计 算 公 式 为 : f k/s = a k /a s, 即 可 以 参 照 物 快 速 推 算 其 余 待 测 化 学 成 分 的 含 量, 计 算 公 式 为 : C k = A k / (a s f k/s ) 式 中 a s : 参 照 物 斜 率 ; a k : 其 他 对 照 组 分 斜 率 应 用 此 法 需 先 建 立 参 照 物 的 标 准 曲 线 获 得 斜 率 a s 定 量 因 子 校 正 法 在 公 式 C k = A k / (a s f k/s ) 中, 当 在 同 一 实 验 室, 同 一 仪 器, 同 一 色 谱 条 件 时, 特 别 是 大 量 样 品 短 期 内 复 检 时, 由 于 a s 基 本 一 致, f k/s 也 是 固 定 值, 故 可 先 以 公 式 a k = a s f k/s 推 算 出 定 量 因 子 QF: a k, 直 接 以 待 测 样 品 峰 面 积 A k 即 可 快 速 推 测 其 含 量 计 算 公 式 为 : C k = A k / a k 应 用 此 法 需 先 获 得 a s 值, 并 保 证 a s 值 恒 定 定 量 因 子 a k 仅 对 同 一 仪 器 在 相 同 色 谱 条 件 短 期 内 保 持 恒 定, 不 同 仪 器 应 分 别 建 立 另 外 定 量 因 子 计 算 所 用 校 正 因 子 为 斜 率 校 正 法 所 得, 故 其 计 算 结 果 与 斜 率 校 正 法 一 致 色 谱 峰 定 位 方 法 [6] 王 龙 星 等 通 过 色 谱 热 力 学 分 析 发 现, 在 相 同 的 分 析 条 件 下, 即 使 采 用 不 同 的 液 相 色 谱 系 统 或 不 同 的 色 谱 柱, 组 分 的 保 留 时 间 存 在 简 单 的 线 性 关 系 采 用 已 有 的 5 个 对 照 品 做 内 标, 并 计 算 其 线 性 方 程 参 考 其 原 理, 假 设 5 个 点 均 落 在 线 性 方 程 上, 那 么 用 2 个 点 的 结 果 与 5 个 点 基 本 一 致 采 用 绿 原 酸 和 黄 芩 苷 两 点 校 正, 推 导 其 校 正 方 程, 利 用 该 校 正 方 程 可 以 快 速 推 测 各 成 分 理 论 出 峰 时 间, 快 速 定 位 色 谱 峰 通 过 该 法 计 算 出 理 论 出 峰 时 间 后, 若 该 色 谱 峰 临 近 还 有 其 他 色 谱 峰, 再 根 据 紫 外 吸 收 光 谱 整 体 峰 形 或 峰 面 积 百 分 比, 即 能 够 在 一 定 程 度 上 准 确 定 位 色 谱 峰 统 计 学 分 析 方 法 一 测 多 评 法 与 常 规 法 的 结 果 比 较, Pearson 相 关 系 数 方 差 分 析 及 t 检 验 结 果 1 分 析 方 法 验 证 1.1 系 统 适 应 性 及 专 属 性 实 验 新 绿 原 酸 绿 原 酸 隐 绿 原 酸 咖 啡 酸 连 翘 酯 苷 A 野 黄 芩 苷 异 绿 原 酸 B 异 绿 原 酸 A 异 绿 原 酸 C 黄 芩 苷 连 翘 苷 及 汉 黄 芩 苷 与 其 相 邻 色 谱 峰 的 分 离 度 均 大 于 1.5, 拖 尾 因 子 在 0.97~1.10 之 间, 理 论 塔 板 数 以 各 色 谱 峰 计 均 在 10 000 以 上 阴 性 对 照 在 相 应 位 置 处 未 见 色 谱 峰, 方 法 专 属 性 良 好 对 照 品 样 品 及 阴 性 对 照 HPLC 图 见 图 1 1.2 线 性 与 范 围 12 个 对 照 品 质 量 (C, μg) 与 对 应 的 色 谱 峰 面 积 (A) 线 性 回 归 方 程, 线 性 范 围 检 测 限 和 定 量 限 见 表 1 1.3 精 密 度 实 验 新 绿 原 酸 绿 原 酸 隐 绿 原 酸 咖 啡 酸 连 翘 酯 苷 A 野 黄 芩 苷 异 绿 原 酸 B 异 绿
1656 药 学 学 报 Acta Pharmaceutica Sinica 2012, 47 (12): 1653 1659 Figure 1 HPLC chromatograms of Shuanghuanglian oral liquid. A: Mixed reference substances; B: Sample; C: Negative sample without HoneySuchle Flowers; D: Negative sample without Radix Scutellariae; E: Negative sample without Fructus Forsythiae; 1: Neochlorogenic acid (NCA); 2: Chlorogenic acid (CA); 3: Cryptochlorogenic acid (CCA); 4: Cafferic acid (CFA); 5: Forsythiaside A (FT A); 6: Scutellarin (ST); 7: Isochlorogenic acid B (ICA B); 8: Isochlorogenic acid A (ICA A); 9: Isochlorogenic acid C (ICA C); 10: Baicalin (BC); 11: Phillyrin (PR); 12: Wogonoside (WG) Table 1 Results of linear equations of 12 components Analyte Regression equation R Linear range/µg LOD/ng LOQ/ng NCA A = 52.728 3 C 0.343 8 0.999 7 0.083 4.150 0.27 0.92 CA A = 52.637 4 C 0.311 2 0.999 8 0.083 4.134 0.33 1.10 CCA A = 52.592 7 C 0.301 4 0.999 7 0.082 4.092 0.31 1.05 CFA A = 93.021 1 C 0.136 5 0.999 5 0.016 0.784 0.22 0.72 FT A A = 43.774 6 C 0.299 8 0.999 8 0.058 2.904 0.57 1.90 ST A = 46.837 6 C 0.109 2 0.999 8 0.013 0.652 0.43 1.43 ICA B A = 64.916 2 C 0.174 7 0.999 6 0.024 1.188 0.29 0.96 ICA A A = 64.997 7 C 0.198 3 0.999 6 0.012 0.610 0.29 0.96 ICA C A = 64.948 3 C 0.286 5 0.999 7 0.032 1.596 0.32 1.05 BC A = 22.817 8 C 0.179 5 0.999 8 0.661 33.074 0.29 0.96 PR A = 33.530 1 C 0.393 7 0.999 8 0.061 3.050 0.01 0.05 WG A = 66.885 0 C 0.224 7 0.999 6 0.016 0.778 0.01 0.02
何 兵 等 : 一 测 多 评 中 待 测 成 分 校 正 和 定 位 的 新 方 法 研 究 1657 原 酸 A 异 绿 原 酸 C 黄 芩 苷 连 翘 苷 及 汉 黄 芩 苷 峰 面 积 RSD 分 别 为 0.32% 0.21% 0.39% 0.45% 0.35% 0.46% 0.41% 0.49% 0.33% 0.19% 0.37% 和 0.43% (n = 6), 表 明 仪 器 精 密 度 良 好 1.4 稳 定 性 实 验 新 绿 原 酸 绿 原 酸 隐 绿 原 酸 咖 啡 酸 连 翘 酯 苷 A 野 黄 芩 苷 异 绿 原 酸 B 异 绿 原 酸 A 异 绿 原 酸 C 黄 芩 苷 连 翘 苷 及 汉 黄 芩 苷 峰 面 积 RSD 分 别 为 0.96% 0.83% 0.89% 1.13% 1.02% 1.47% 1.19% 1.23% 1.07% 0.93% 1.39% 1.65% (n = 6), 表 明 供 试 品 溶 液 在 36 h 内 稳 定 1.5 重 复 性 实 验 新 绿 原 酸 绿 原 酸 隐 绿 原 酸 咖 啡 酸 连 翘 酯 苷 A 野 黄 芩 苷 异 绿 原 酸 B 异 绿 原 酸 A 异 绿 原 酸 C 黄 芩 苷 连 翘 苷 及 汉 黄 芩 苷 平 均 含 量 (n = 6) 分 别 为 1.001 0.953 0.834 0.143 0.826 0.119 0.238 0.099 0.381 12.483 0.624 0.352 mg ml 1, RSD 分 别 为 0.76% 0.63% 0.69% 0.97% 0.88% 1.15% 0.93% 1.06% 0.98% 0.59% 0.75% 0.99% (n = 6), 表 明 本 法 重 复 性 良 好 1.6 回 收 率 实 验 新 绿 原 酸 绿 原 酸 隐 绿 原 酸 咖 啡 酸 连 翘 酯 苷 A 野 黄 芩 苷 异 绿 原 酸 B 异 绿 原 酸 A 异 绿 原 酸 C 黄 芩 苷 连 翘 苷 及 汉 黄 芩 苷 回 收 率 分 别 为 98.45% 99.33% 98.89% 98.25% 98.57% 97.90% 98.44% 97.72% 98.34% 99.10% 98.68% 98.02% RSD 分 别 为 1.03% 0.96% 0.92% 1.05% 1.26% 1.21% 1.17% 1.28% 1.09% 0.94% 0.93% 1.05% (n = 9) 表 明 本 法 具 有 良 好 的 回 收 率 1.7 耐 用 性 实 验 各 条 件 下 所 测 含 量 的 RSD < 1.83%, 分 离 效 果 理 想 因 此, 双 黄 连 口 服 液 中 的 12 个 活 性 成 分 含 量 测 定 条 件 较 宽, 具 有 较 好 的 耐 用 性 2 校 正 因 子 的 计 算 2.1 多 点 校 正 法 结 果 见 表 2 2.2 斜 率 校 正 法 及 定 量 因 子 校 正 法 结 果 见 表 3 标 准 曲 线 中 各 成 分 的 斜 率 值 实 际 上 就 是 其 定 量 因 子, 而 斜 率 值 实 际 上 也 是 其 紫 外 吸 收 系 数, 或 在 1 mg ml 1 浓 度 下, 进 样 量 为 10 µl 的 峰 面 积 值 如 绿 原 酸 的 标 准 曲 线 为 A = 52.650 3 C 0.182 0, 将 C 单 位 由 µg 改 为 mg ml 1, 则 标 准 曲 线 为 A = 526.503 C 0.182 0, 而 绿 原 酸 的 紫 外 吸 收 系 数 为 526.5 526.503 既 是 1 mg ml 1 下 进 样 10 µl 的 峰 面 积 值, 也 是 其 紫 外 吸 收 系 数 3 校 正 因 子 重 现 性 考 察 实 验 考 察 了 不 同 实 验 室 的 两 套 色 谱 系 统 (Dionex P680 和 Agilent 1100) 及 不 同 的 色 谱 柱 (Kromasil C 18, Luna C 18, Platisil, 均 为 250 mm 4.6 mm, 5 μm) 对 校 正 因 子 的 影 响, 结 果 其 RSD < 2.89% 表 明 相 对 校 正 因 子 在 不 同 实 验 室 不 同 色 谱 系 统 和 不 同 色 谱 柱 下 具 有 良 好 的 重 现 性 4 待 测 组 分 色 谱 峰 的 定 位 文 献 在 色 谱 峰 的 定 位 中, 普 遍 采 用 相 对 保 留 时 间 定 位 的 方 法 实 验 发 现, 在 相 同 色 谱 条 件 下, 不 同 类 型 色 谱 柱, 其 相 对 保 留 时 间 有 的 差 异 较 小, 但 有 些 差 异 较 大, 特 别 是 距 参 照 峰 绿 原 酸 较 远 的 汉 黄 芩 苷, 采 用 绿 百 草 Kromasil 菲 罗 门 Luna 及 迪 马 Platisil 与 AkzoNobel Kromasil 分 离 其 相 对 保 留 时 间 RSD 分 别 为 6.11% 6.54% 和 19.51% 在 这 种 情 况 下, 利 用 相 对 保 留 时 间 很 难 准 确 定 位 可 见 该 法 仅 用 于 相 同 填 料 或 色 谱 行 为 极 为 相 似 的 色 谱 柱 Table 2 Relative correction factors with reference to chlorogenic acid at different wavelengths by multi-point correction Volume/µL NCA CA CCA CFA FT A ST ICA B ICA A ICA C BC PR WG 0.5 0.973 1.000 0.961 1.808 0.819 0.838 1.231 1.162 1.242 0.439 0.628 1.203 1 0.989 1.000 0.991 1.758 0.830 0.858 1.211 1.178 1.237 0.438 0.625 1.230 2 1.014 1.000 1.001 1.776 0.826 0.880 1.235 1.207 1.228 0.437 0.628 1.237 3 1.003 1.000 0.997 1.753 0.829 0.887 1.222 1.219 1.218 0.434 0.628 1.265 4 0.995 1.000 1.010 1.762 0.827 0.887 1.237 1.229 1.226 0.437 0.634 1.264 5 1.005 1.000 0.993 1.770 0.833 0.888 1.230 1.231 1.238 0.432 0.637 1.268 x 0.997 1.000 0.992 1.771 0.827 0.873 1.228 1.205 1.231 0.436 0.630 1.244 RSD/% 1.43 0 1.69 1.12 0.57 2.34 0.79 2.36 0.74 0.58 0.74 2.09 Table 3 Relative correction factors and relative quantitative factors with reference to chlorogenic acid at different wavelengths by slope correction Analyte NCA CA CCA CFA FT A ST ICA B ICA A ICA C BC PR WG λ/nm 326 326 326 326 326 326 326 326 326 229 229 275 RCF 1.002 1.000 0.999 1.767 0.832 0.890 1.233 1.235 1.234 0.433 0.637 1.271 QF 52.742 7 52.637 4 52.584 8 93.010 4 43.794 3 46.847 3 64.902 0 65.007 2 64.954 6 22.792 0 33.530 0 66.902 2
1658 药 学 学 报 Acta Pharmaceutica Sinica 2012, 47 (12): 1653 1659 采 用 王 龙 星 提 出 的 方 法, 建 立 各 待 测 成 分 保 留 时 间 校 正 方 程, 计 算 其 理 论 保 留 时 间, 并 考 察 不 同 实 验 室 不 同 仪 器 不 同 色 谱 柱 之 间 的 差 异, 结 果 除 新 绿 原 酸 稍 大 外 ( 新 绿 原 酸 各 条 件 下 相 对 保 留 时 间 均 为 0.73), 其 余 保 留 时 间 RSD 普 遍 在 2% 以 内, 上 述 汉 黄 芩 苷 的 保 留 时 间 RSD 分 别 为 0.11% 0.01% 0.06%, 最 大 的 为 Platisil 分 离 的 异 绿 原 酸 A, 为 3.36% 而 在 不 同 实 验 室, 汉 黄 芩 苷 保 留 时 间 的 RSD 仍 能 保 持 在 0.08% 左 右, 而 随 着 线 性 方 程 选 点 数 的 增 加, 所 有 保 留 时 间 RSD 均 能 降 到 2% 以 内 通 过 理 论 保 留 时 间 和 实 测 保 留 时 间 的 比 较, 再 根 据 紫 外 吸 收 光 谱 整 体 峰 形 或 峰 面 积 百 分 比, 即 能 够 在 一 定 程 度 上 准 确 定 位 色 谱 峰 5 一 测 多 评 法 与 常 规 法 结 果 的 比 较 研 究 分 别 精 密 吸 取 对 照 品 溶 液 和 供 试 品 溶 液 进 样 分 析, 记 录 新 绿 原 酸 绿 原 酸 隐 绿 原 酸 咖 啡 酸 连 翘 酯 苷 A 野 黄 芩 苷 异 绿 原 酸 B 异 绿 原 酸 A 异 绿 原 酸 C 黄 芩 苷 连 翘 苷 及 汉 黄 芩 苷 的 峰 面 积, 分 别 用 线 性 回 归 法 外 标 法 和 3 种 一 测 多 评 法 计 算 其 含 量, 结 果 见 表 4 为 确 认 一 测 多 评 的 准 确 性, 将 5 种 方 法 计 算 结 果 经 Pearson 相 关 系 数 分 析, 结 果 5 种 方 法 之 间 及 5 种 方 法 与 其 平 均 值 之 间 的 相 关 系 数 均 大 于 0.999 9, 说 明 5 种 方 法 得 到 的 含 量 相 似 性 极 高 再 从 含 量 之 间 的 相 对 误 差 来 看, 均 在 3% 以 内 同 时 经 方 差 分 析 或 两 两 之 间 t 检 验, P 值 远 大 于 0.05, 说 明 5 种 方 法 计 算 结 果 并 无 显 著 性 差 异 可 见 斜 率 校 正 和 定 量 因 子 校 正 在 中 药 多 指 标 成 分 质 量 评 价 中 的 应 用 是 可 行 的 讨 论 对 于 校 正 因 子 的 计 算, 文 献 普 遍 采 用 多 点 校 正, 求 平 均 值 的 方 法, 但 其 有 个 弊 端, 如 果 有 一 两 个 点 有 较 大 偏 差 ( 特 别 是 第 一 个 和 最 后 一 个 点 ), 其 会 影 响 整 个 平 均 值, 从 而 导 致 计 算 值 有 一 定 偏 差 而 采 用 标 准 曲 线 斜 率 之 比 计 算 校 正 因 子, 即 使 有 几 个 点 有 较 大 偏 差, 其 对 整 个 标 准 曲 线 斜 率 影 响 不 大, 相 对 多 点 校 正 更 科 学 合 理 另 外 斜 率 校 正 无 需 逐 个 浓 度 计 算 校 正 因 子 求 平 均 值, 直 接 以 标 准 曲 线 斜 率 计 算, 相 对 更 快 捷 而 从 表 4 可 见, 二 者 所 计 算 的 结 果 并 无 显 著 差 异 定 量 因 子 计 算 所 用 校 正 因 子 为 斜 率 校 正 法 所 得, 故 其 计 算 结 果 与 斜 率 校 正 法 一 致 由 于 相 同 浓 度 参 照 物 于 不 同 实 验 室 不 同 仪 器 其 峰 面 积 有 一 定 差 异, 特 别 是 不 同 仪 器 峰 面 积 计 算 方 式 不 一 致, 从 而 导 致 定 量 因 子 出 现 一 定 差 异, 故 定 量 因 子 每 台 仪 器 需 单 独 建 立 但 在 同 一 实 验 室, 同 一 仪 器, 同 一 色 谱 条 件, 特 别 是 大 量 样 品 短 期 内 复 检 时, 由 于 a s 基 本 恒 定, 定 量 因 子 计 算 含 量 非 常 快 捷 有 效 HPLC 定 量 方 法 中 一 般 以 线 性 回 归 法 计 算 结 果 最 为 准 确, 当 标 准 曲 线 的 a/b 值 大 于 100 时, 可 采 用 外 标 一 点 法 计 算 含 量, 外 标 法 也 是 应 用 最 为 普 遍 的 定 量 方 法 当 外 标 法 所 选 的 浓 度 点 越 接 近 标 准 曲 线, 则 二 者 含 量 计 算 结 果 越 接 近 而 一 测 多 评 法 ( 斜 率 校 正 及 定 量 因 子 校 正 ) 实 际 上 是 舍 弃 标 准 曲 线 中 截 距 的 计 算 结 果, 只 要 a/b 值 越 大, 则 二 者 含 量 计 算 结 果 越 接 近 一 测 多 评 法 ( 多 点 校 正 ) 则 要 求 每 个 浓 度 点 均 尽 量 落 在 标 准 曲 线 附 近, 特 别 是 最 低 和 最 高 浓 度 点, 即 所 得 校 正 因 子 不 宜 相 差 太 大, 不 然 会 导 致 平 均 Table 4 Determination results of 12 components in Shuanghuanglian oral liquid (n = 3, RSD < 3%, mg ml 1 ) Analyte ESM Sanchine (09120951) Xinsheng (100604) Taloph (11030825) SCM (MPC) (SC) (QFC) ESM SCM (MPC) (SC) (QFC) ESM SCM (MPC) NCA 1.141 1.147 1.147 1.140 1.140 1.001 1.008 1.007 1.001 1.001 0.842 0.849 0.847 0.842 0.842 CA 0.936 0.941 0.936 0.935 0.935 0.953 0.959 0.953 0.953 0.953 0.727 0.732 0.727 0.726 0.726 CCA 0.864 0.868 0.869 0.862 0.862 0.834 0.838 0.839 0.832 0.832 0.728 0.732 0.732 0.726 0.726 CFA 0.202 0.202 0.200 0.201 0.201 0.143 0.143 0.142 0.142 0.142 0.343 0.342 0.340 0.340 0.340 FT A 0.532 0.537 0.533 0.530 0.530 0.826 0.829 0.828 0.822 0.822 1.810 1.809 1.814 1.802 1.802 ST 0.132 0.134 0.134 0.132 0.132 0.119 0.121 0.121 0.119 0.119 0.124 0.126 0.126 0.123 0.123 ICA B 0.371 0.370 0.369 0.367 0.367 0.238 0.238 0.237 0.236 0.236 0.325 0.325 0.324 0.322 0.322 ICA A 0.193 0.194 0.196 0.191 0.191 0.099 0.100 0.100 0.097 0.097 0.179 0.180 0.181 0.176 0.176 ICA C 0.758 0.752 0.750 0.747 0.747 0.381 0.380 0.377 0.376 0.376 0.664 0.659 0.656 0.654 0.654 BC 10.338 10.348 10.289 10.352 10.352 12.483 12.494 12.424 12.500 12.500 13.099 13.109 13.036 13.116 13.116 PR 0.362 0.369 0.361 0.357 0.357 0.624 0.627 0.622 0.615 0.615 0.545 0.549 0.544 0.537 0.537 WG 0.220 0.222 0.223 0.218 0.218 0.352 0.353 0.357 0.350 0.350 0.207 0.209 0.210 0.205 0.205 (SC) (QFC)
何 兵 等 : 一 测 多 评 中 待 测 成 分 校 正 和 定 位 的 新 方 法 研 究 1659 值 出 现 较 大 偏 差, 从 而 影 响 计 算 结 果 一 测 多 评 中 色 谱 峰 的 定 位, 文 献 均 采 用 相 对 保 留 时 间 或 保 留 时 间 差 定 位 的 方 法, 但 在 实 验 中 发 现, 随 着 各 色 谱 峰 保 留 时 间 远 离 参 照 峰 绿 原 酸, 其 相 对 保 留 时 间 RSD 逐 渐 增 大, 甚 至 超 过 5%, 而 保 留 时 间 差 波 动 更 大 在 这 种 情 况 下, 利 用 相 对 保 留 时 间 很 难 准 确 定 位 实 验 采 用 线 性 回 归 法, 以 参 照 峰 绿 原 酸 和 另 一 易 辨 认 色 谱 高 峰 黄 芩 苷 的 保 留 时 间 推 导 校 正 方 程, 采 用 该 法 可 快 速 准 确 定 位 色 谱 峰, 经 校 正 后, 理 论 保 留 时 间 和 实 测 保 留 时 间 无 明 显 差 异, 其 RSD 除 新 绿 原 酸 稍 大 外, 其 余 均 低 于 5%, 得 到 明 显 改 善 如 原 装 Kromasil 和 Platisil 分 离 的 汉 黄 芩 苷, 校 正 前 其 相 对 保 留 时 间 RSD 为 19.51%, 校 正 后 为 0.06% 对 于 新 绿 原 酸, 由 于 其 出 峰 时 间 短, 反 而 不 适 合 该 法 未 校 正 前, 其 相 对 保 留 时 间 均 为 0.73, 故 新 绿 原 酸 可 单 独 采 用 相 对 保 留 时 间 校 正 在 一 测 多 评 的 应 用 中, 应 注 意 只 有 当 每 个 色 谱 峰 的 测 定 都 免 除 了 干 扰 的 情 况 下 本 方 法 才 能 适 用, 不 然 会 导 致 计 算 结 果 出 现 误 差 以 斜 率 校 正 的 一 测 多 评 法 在 中 药 多 指 标 成 分 检 测 中 可 进 一 步 推 广 应 用, 从 文 中 可 见, 只 要 获 得 对 照 品 斜 率 之 比, 即 可 以 一 现 有 成 分 斜 率 快 速 推 算 其 余 成 分 的 含 量, 而 对 照 品 的 斜 率 ( 吸 收 系 数 ) 之 比 往 往 可 以 从 文 献 中 快 速 查 得 但 此 时 应 尽 量 保 证 色 谱 条 件 与 文 献 尽 量 一 致, 特 别 是 测 定 波 长 另 外 需 注 意 所 参 照 文 献 数 据 具 有 可 靠 性 实 验 中 发 现, 虽 采 用 近 似 色 谱 条 件, 但 某 些 成 分 斜 率 之 比 往 往 同 部 分 文 献 有 一 定 差 异, 这 主 要 由 以 下 原 因 造 成 : 对 照 品 生 产 厂 商 与 批 次 不 一 致, 导 致 其 纯 度 不 一 致 ; 对 照 品 放 置 时 间 不 一 致, 降 解 不 一 致, 导 致 其 纯 度 不 一 致 ( 应 注 意 某 些 对 照 品 即 使 降 解 了 也 不 一 定 会 多 出 色 谱 峰 ); 不 同 实 验 室 天 平 精 度 不 一 致, 以 及 人 为 的 称 量 误 差 导 致 单 位 浓 度 峰 面 积 不 一 致 ; 色 谱 条 件 特 别 是 测 定 波 长 不 一 致, 导 致 峰 面 积 不 一 致 ; 每 台 仪 器 自 身 的 精 度 氘 灯 能 量 等 不 尽 相 同 均 会 导 致 斜 率 之 比 不 一 致 故 若 以 参 照 文 献 斜 率 之 比 推 算 含 量, 可 获 得 粗 略 估 算 结 果, 在 尽 量 排 除 上 述 误 差 的 情 况 下 可 获 得 较 准 确 的 计 算 结 果, 若 以 自 身 建 立 的 斜 率 之 比 则 可 获 得 精 确 计 算 结 果 可 见 斜 率 校 正 的 一 测 多 评 法 在 中 药 多 指 标 成 分 检 测 中 具 有 广 阔 的 适 用 性 和 应 用 前 景 References [1] Zhang P, Yang Y, Yan D, et al. Application of multi-target ingredients determination and fingerprint analysis in preparation and quality control of Chinese medicine [J]. China J Tradit Chin Med Pharm ( 中 华 中 医 药 杂 志 ), 2010, 25: 120 123. [2] Wang ZM, Gao HM, Fu XT, et al. Multi-components quantitation by one marker new method for quality evaluation of Chinese herbal medicine [J]. China J Chin Mater Med ( 中 国 中 药 杂 志 ), 2006, 31: 1925 1928. [3] He FC, Li SX, Zhao ZQ, et al. Simultaneous quantitative analysis of four lignanoids in Schisandra chinensis by quantitative analysis of multi-components by single marker [J]. Acta Pharm Sin ( 药 学 学 报 ), 2012, 47: 930 933. [4] Zhu JJ, Wang ZM, Kuang YH, et al. A quantitative method using one marker for simultaneous assay of ginsenosides in Panax ginseng and P. notoginseng [J]. Acta Pharm Sin ( 药 学 学 报 ), 2008, 43: 1211 1216. [5] State Pharmacopoeia Commission of the People s Republic of China. Pharmacopoeia of the People s Republic of China ( 中 华 人 民 共 和 国 药 典 ) [S]. Vol I. Beijing: China Medicinal Science and Technology Press, 2010: 285. [6] Wang LX, Xiao HB, Liang XM. A new method to improve the reproducibility of retention time on reversed phase C 18 columns in different laboratories [J]. Chin J Anal Chem ( 分 析 化 学 ), 2003, 31: 1232 1236.