Application ote: 30130_C LTQ rbitrap 质 谱 仪 表 征 未 知 化 合 物 Kerstin Strupat, Thomas Moehring, Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germany Donald Daley, Russell Scammell, Argenta Discovery Limited, 8/9 Spire Green Centre, Flex Meadow, Harlow, Essex, CM19 5TR, UK 关 键 词 LC-ESI-MS/MS Mass Frontier MS/MS Small Molecules 目 标 建 立 表 征 未 知 化 合 物 的 工 作 流 程 ( 化 合 物 X) 对 化 合 物 X 进 行 定 性 和 定 量 分 析 获 取 数 据 的 步 骤 如 下 : 准 确 测 定 化 合 物 X 的 质 量 ; 并 在 除 质 量 外 其 它 条 件 未 知 的 情 况 下, 推 测 分 子 式 通 过 将 分 子 式 和 理 论 同 位 素 模 式 进 行 对 比, 在 除 质 量 外 其 它 条 件 未 知 的 情 况 下, 排 除 假 阳 性 瞬 态 干 扰 根 据 环 双 键 当 量 值 (RDB 当 量 值 ), 确 认 正 确 符 合 的 化 合 物 通 过 进 一 步 的 CID 和 HCD 的 MS/MS 得 到 结 构 信 息, 研 究 并 确 认 化 合 物 将 化 合 物 X 进 行 一 系 列 的 稀 释 进 行 定 量 分 析 该 研 究 方 法 中, 开 始 时 的 未 知 化 合 物, 随 后 通 过 准 确 的 MS 和 MS/MS 数 据 分 析 确 定 了 化 合 物 结 构, 并 最 终 通 过 亚 pg 级 上 样 量 分 析 进 行 定 量 前 言 噻 托 四 铵 盐 药 物 应 用 于 预 防 气 喘 呼 吸 急 促 和 慢 性 阻 塞 性 肺 病 (CPD) 患 者 的 呼 吸 图 1: 三 种 他 汀 类 化 合 物 的 化 学 结 构 困 难 CPD 包 括 一 系 列 影 响 肺 和 气 管 的 疾 病, 例 如 慢 性 支 气 管 炎 ( 通 向 肺 部 的 空 气 通 道 肿 胀 ) 和 肺 气 肿 ( 肺 中 气 囊 的 损 伤 ) CPD 被 列 入 包 括 心 脏 病 中 风 癌 症 和 阿 尔 采 末 病 在 内 的 五 大 杀 手 疾 病 之 一 噻 托 铵 盐 属 于 支 气 管 扩 张 药 物 类, 它 通 过 放 松 支 气 管 肌 肉, 扩 张 空 气 通 道, 使 呼 吸 顺 畅 详 情 请 见 :http://www.nlm.nih.gov/ medlineplus/druginfo/medmaster/a604018. html 该 化 合 物 的 阳 离 子 特 性 使 得 它 的 离 子 化 效 率 不 依 赖 电 离 源 和 PH 值, 从 而 使 它 成 为 研 究 仪 器 性 能 的 理 想 选 择 实 验 方 法 LC-ESI-MS 和 MS/MS 采 用 具 有 高 分 离 能 力 和 准 确 质 量 测 量 的 液 相 色 谱 - 电 喷 雾 离 子 化 (LC-ESI) 串 连 质 谱 仪 确 定 未 知 化 合 物 X 的 结 构 Thermo Scientific 公 司 生 产 的 LTQ rbitrap 质 谱 仪 是 组 合 式 质 谱 仪, 包 括 线 性 离 子 阱 和 轨 道 阱 质 量 分 析 仪 用 含 0.1% 甲 酸 的 乙 腈 / 水 (95/5) 配 制 储 备 液 用 于 定 量 分 析 将 该 储 备 液 稀 释 为 浓 度 为 10-10,000fg/μL 的 一 系 列 溶 液 液 相 泵 :Surveyor HPLC 泵 (Thermo Scientific 公 司 ) 色 谱 柱 : H y p e r s i l G L D ( T h e r m o S c i e n t i f i c 公 司 ), 2. 1 m m 5 0 m m 1.9μm 流 速 :100 μl/min 进 样 量 :20 μl 满 环 进 样 流 动 相 梯 度 如 下 : Time A% B% µl/min 0.00 95.0 5.0 100.0 1.00 95.0 5.0 100.0 8.00 10.0 90.0 100.0 10.00 10.0 90.0 100.0 10.10 95.0 5.0 100.0 12.00 95.0 5.0 100.0 表 1:LC 流 动 相 梯 度 定 量 实 验 中 MS 设 置 目 标 化 合 物 MS/MS 轨 道 阱 检 测 FTMS p norm 分 辨 率 15,000,MS/MS @ 392.1 CID( 碰 撞 诱 导 解 离 ) 碰 撞 能 3 5. 0 %, Q 0. 2 5, 驻 留 时 间 30.0ms, 分 离 宽 度 3.0u MS/MS 离 子 阱 检 测 ITMS p norm MS/MS @ 392.1 CID
碰 撞 能 3 5. 0 %, Q 0. 2 5, 驻 留 时 间 30.0ms, 分 离 宽 度 3.0u 定 性 结 果 定 量 分 析 使 用 的 是 配 有 Micro AS 自 动 进 样 器 和 Surveyor MS 泵 的 HPLC 系 统 定 量 实 验 所 采 用 的 流 速 和 梯 度 如 前 所 示 采 用 了 直 接 输 注 和 自 动 进 样 器 进 样 两 种 进 样 方 式 图 1 是 典 型 定 量 实 验 结 果 图 1 基 峰 中 的 插 图 显 示 了 LC 色 谱 峰 内 质 谱 测 量 的 重 现 性 该 LC 峰 中 可 以 完 成 20 次 质 谱 测 定 在 数 据 库 中 对 前 面 得 出 的 化 合 物 X 的 化 学 式 C 19 H 22 4 S 2 进 行 搜 索 在 http://chem.sis. nlm.nih.gov/chemidplus/ 的 搜 索 表 明, 噻 托 盐 只 有 溴 盐 一 种 形 式 与 之 相 符, 其 分 子 量 为 472.42( 见 图 4) 该 结 构 输 入 Mass Frontier 软 件, 通 过 获 得 化 合 物 X 的 MS/MS 数 据 (CID 和 HCD) 数 据 来 进 一 步 确 定 结 构, 如 图 5 所 示 碰 撞 诱 导 解 离 (CID) 图 5a: 轨 道 阱 分 析 仪 采 用 MS/MS@m/z 392 和 碰 撞 诱 导 解 离 (CID) 碎 片 技 术 检 测 准 确 确 定 碎 片 m/z 152 和 m/z 170, 并 分 别 推 断 出 一 种 分 子 式 结 构 定 名 由 Mass Frontier 完 成 高 能 碰 撞 解 离 (HCD) 图 5b: 轨 道 阱 分 析 仪 采 用 MS/MS@m/z 392 和 高 能 碰 撞 解 离 (HCD) 碎 片 技 术 检 测 准 确 确 定 碎 片 m/z 152 和 m/z 170, 并 分 别 推 断 出 一 种 分 子 式 可 以 观 察 到, 更 多 的 质 量 小 于 m/z 150 的 碎 片 可 以 明 显 的 由 结 构 式 得 出 结 构 定 名 由 Mass Frontier 完 成 图 1:1pg/μL 溶 液 的 基 峰 图 谱 准 确 质 量 测 量 RDBE 和 同 位 素 模 式 综 合 数 据 确 定 分 子 式 为 解 析 可 能 存 在 的 硫, 在 RP 100,000 @ m/z 400 条 件 下 对 化 合 物 X 进 行 质 谱 测 定 图 2 的 全 扫 描 图 中 的 插 图 为 m/z 394, 该 图 揭 示 了 硫 (S) 的 存 在 对 m/z 392 提 出 的 分 子 式 在 ± 5ppm 的 公 差 范 围 内 考 虑 了 C H 和 最 多 2 个 S 化 合 物 X 所 包 含 元 素 列 于 表 2 如 表 3 所 示, 假 如 所 观 察 到 的 m/z 392 是 ESI 典 型 的 MH 离 子, 那 么 RDBE 值 只 能 是 一 个 单 电 荷 离 子 x.5 图 三 对 这 七 个 建 议 结 构 和 原 始 文 件 数 据 进 行 了 对 比 图 1 所 示 的 RDBE 值 为 x 5 的 推 断 结 构 是 在 分 辨 率 135,000,392@FWHM 的 条 件 下 模 拟 的 表 2 所 示 的 推 断 分 子 式 的 元 素 组 成 是 在 分 辨 率 为 135,000,392@FWHM 的 条 件 下 模 拟 的 没 有 S 的 结 构 推 断 可 以 立 刻 被 排 除 (32S 和 34S 可 以 引 起 A2 及 以 上 离 子 的 裂 峰 ); 只 有 一 个 S 的 情 况 也 可 以 通 过 与 原 始 数 据 信 息 对 比 而 排 除 ( 见 A3 离 子 和 A4 离 子 ) 对 比 显 示, 化 合 物 X 作 为 MH 离 子 正 确 的 化 学 式 是 C 19 H 22 4 1 S 2 图 2:m/z 391.5-395.5 范 围 内 质 谱 图, 插 图 为 m/z 394 Isotope Min Max RDB equiv. Mass 14 0 10 0.5 14.003 16 0 15 0.0 15.995 12 C 0 30 1.0 12.000 1 H 0 60-0.5 1.008 32 S 0 2 0.0 31.972 表 2: 涉 及 的 元 素 m/z Theo. Mass Delta (ppm) RDB equiv. Composition 392.09769 392.09761 0.13 10.5 C 18 H 18 9 1 392.09829-1.62 6.5 C 11 H 18 7 32 7 S 1 392.09696 1.79 1.5 C 10 H 22 11 32 3 S 1 392.09848-2.09 9.5 C 19 H 22 4 32 1 S 2 392.09644 3.10 19.5 C 23 H 14 32 5 S 1 392.09895-3.28 15.5 C 19 H 14 5 5 392.09579 4.76 10.5 C 15 H 18 2 32 7 S 2 表 3: 由 氮 规 则 得 到 的 元 素 组 成
FTMS p ESI Full ms2 392.10@cid35.00 [105.00-420.00] C 9 H 14 1 1 152.10651-3.2 ppm C 9 H 16 2 1 170.11711 2.5 RDBE -2.6 ppm H S H S m/z 392.098 i S H S m/z 392.098 rh R m/z 152.107 Proposed fragmentation pathway for fragment ion m/z 152. 150 200 250 300 350 400 m/z 图 5a: 轨 道 阱 分 析 仪 采 用 MS/MS@m/z 392 和 碰 撞 诱 导 解 离 (CID) 碎 片 技 术 检 测 FTMS p ESI Full ms2 392.10@hcd100.00 [50.00-1000.00] C 6 H 8 1 94.06480-3.4 ppm C 7 H 7 91.05390 4.5 ppm -3.5 ppm H C 6 H 10 1 112.07534 2.5 RDBE -3.1 ppm C 8 H 12 1 122.09608-2.8 ppm C 9 H 12 1 134.09604 4.5 RDBE -2.9 ppm C 9 H 14 1 1 152.10657-2.7 ppm C 9 H 16 2 1 170.11716 C19 H 22 4 1 S 2 2.5 RDBE 392.09802-2.3 ppm 9.5 RDBE -1.0 ppm H 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 m/z 50 100 150 200 250 300 350 400 m/z 图 5b: 轨 道 阱 分 析 仪 采 用 MS/MS@m/z 392 和 高 能 碰 撞 解 离 (HCD) 碎 片 技 术 检 测
图 3: 七 种 化 学 式 及 原 始 数 据 左 侧 为 同 位 素 模 式, 右 侧 为 A1, A2, A3 和 A4 离 子 图 4: 化 合 物 X 结 构 搜 索 噻 托 溴 铵 是 唯 一 一 个 符 合 结 构 式 C 19 H 22 4 1 S 2 的 化 合 物 该 结 构 符 合 表 3 中 RDB 当 量 为 9.5 的 结 构 式 的 双 键 数 目 以 及 未 成 对 电 子 数
定 量 结 果 采 用 了 适 用 于 两 种 不 同 目 标 化 合 物 MS/MS 方 法 的 稀 释 液 进 行 实 验 图 6a 中 列 出 了 目 标 离 子 MS/MS 和 轨 道 阱 检 测 的 三 组 数 据 右 侧 的 校 正 曲 线 给 出 了 测 试 点 (10 fg/μl 到 10 pg/μl) 的 概 观 蓝 色 的 插 入 校 正 曲 线 显 示 了 从 10 fg/μl( 柱 上 200 fg) 到 100 fg/μl ( 柱 上 2 pg) 的 详 图 图 中 的 细 节 也 可 见 图 6b 表 格 数 据 目 标 离 子 MS/MS 和 离 子 阱 检 测 结 果 见 图 7 Retrieval from 3 data sets 图 6a: 系 列 稀 释 液 用 于 目 标 离 子 MS/MS 方 法 以 及 三 组 数 据 目 标 离 子 MS/MS 轨 道 阱 检 测,FTMS p norm 分 辨 率 15,000/7,500,MS/MS @ 392.1,CID, 碰 撞 能 35.0%,Q 0.25, 碰 撞 时 间 30.0ms, 分 离 宽 度 3.0u. 图 6b: 图 6a 中 三 组 数 据 的 结 果 列 表 图 7: 目 标 离 子 MS/MS 方 法 定 量 测 量 结 果 以 及 一 组 数 据 目 标 离 子 MS/MS 离 子 阱 检 测 ;ITMS p norm,ms/ms @ 392.1,CID, 碰 撞 能 35.0%,Q 0.25, 碰 撞 时 间 30.0ms, 分 离 宽 度 3.0u.
结 论 采 用 准 确 质 量 测 量, 结 合 RDBE 和 同 位 素 模 式 鉴 别, 确 定 了 化 合 物 X 的 分 子 式 C 19 H 22 4 1 S 2 使 用 互 联 网 数 据 库 搜 索, 结 合 已 得 到 的 分 子 式, 确 定 噻 托 为 唯 一 符 合 的 化 合 物 将 所 获 得 的 碰 撞 诱 导 解 离 和 高 能 碰 撞 阱 解 离 的 MS/MS 数 据, 结 合 碎 片 规 则 应 用 于 Mass Frontier, 进 一 步 确 定 了 化 合 物 为 噻 托 CID 和 HCD 碎 片 由 Mass Frontier 确 定 完 成 将 系 列 稀 释 液 应 用 于 目 标 离 子 MS/MS@ m/z 392 方 法, 用 离 子 阱 和 轨 道 阱 分 析 仪 分 别 检 测 m/z 152 和 m/z 170 碎 片, 实 验 证 明 200fg 柱 上 量 噻 托 就 可 以 得 到 可 靠 的 标 准 曲 线, 仅 仅 相 当 于 浓 度 10 fg/μl 的 噻 托 溶 液 20μL 满 环 进 样 C/MS application notes at: www.thermo.com/appnotes Page 4 of 8